KR102356510B1 - 수지상 세포 효능 분석 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 DC의 효능을 결정하는 방법에 관한 것으로, 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제와 인큐베이션하여 수지상 세포를 자극하는 단계, 자극된 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 단계를 포함한다. 이로서 수지상 세포가 T-세포 및 자연살해(NK) 세포를 활성화시키는 능력이 큰지 여부를 결정할 수 있다. 본 발명은 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제로 수지상 세포를 자극하는 단계를 포함한 수지상 세포를 자극하는 방법을 또한 포함한다.
Description
본 발명은 DC의 효능을 결정하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제와 인큐베이션하여 수지상 세포를 자극(stimulate, 이하, ‘활성화’로도 해석 가능)하고, 자극된 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 단계를 포함한다. 이로서 수지상 세포가 T-세포 및 자연살해(NK) 세포를 활성화시키는 능력이 큰지 여부를 결정할 수 있다. 본 발명은 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제로 수지상 세포를 자극하는 단계를 포함한 수지상 세포를 자극하는 방법을 또한 포함한다.
항원-로딩된 수지상 세포(Antigen-loaded dendritic cells)는 천연 T 세포 및 자연살해(NK) 세포를 프라이밍할 수 있어서 항-종양 면역요법에서 백신으로 사용될 수 있거나 만성 바이러스 감염의 치료에 이용될 수 있다. 상기 종양-백신은 세포 독성 T 림프구를 자극함으로써 질병 관련 항원에 대한 T 세포 반응의 증가를 유도한다(Subklewe 외).
임상 시험은 DC-기반 면역 요법이 안전하고 시험관 내에서 변형된 수지상 세포의 투여가 특이적 면역 강화를 초래한다는 것을 보여 주었다.
과거에 면역 모니터링은 T 세포의 반응 측면에만 집중된 반면 면역 반응의 DC 측면은 대부분 간과되었다. 이는 분석을 위한 관련 DC 기능을 결정하는데 있어서의 어려움에 부분적으로 기인할 수 있다. 암 면역요법 환경에서 T 세포를 최적으로 활성화하려면 DC가 3 가지 신호를 전달해야한다. 먼저, 정확한 항원이 MHC 복합체에 의해 적절한 양으로 제시되어 TCR을 유발해야한다(신호 1); 둘째, T 세포에 양성 공자극을 제공하기 위해 DC 표면에 있는 음성 조절 분자보다 우세하도록 CD80/CD86과 같은 공자극 분자를 활성화해야 하며(신호 2), 세 번째로 사이토카인 IL-12의 생활성 형태가 IL-10의 부재 하에 분비되어 Th1/Tc1 방향으로 T-세포를 분극시켜야 한다(신호 3). 신호 1 및 신호 2는 유세포 분석을 이용하여 모니터링할 수 있다. 신호 3은 CD40/CD40L 결합을 통해 DC-T 세포 상호 작용을 모방함으로써 측정될 수있다.
그러나, 투여를 위해 생성된 수지상 세포의 질은 서로 다를 수 있다. 수지상 세포의 상기 변이는 T 세포 및 자연살해 세포(NK 세포)를 활성화시키는 이들의 능력에 영향을 미친다.
수지상 세포의 질은 세포의 기원, 분화 및 성숙 상태에 의존한다. 같은 성숙 프로토콜과 정상적인 건강한 도너를 사용하더라도 T 세포 활성화 능력은 개인마다 크게 다르다.
따라서, 강력한 백신으로서 사용하기 위해 수지상 세포의 적합성을 모니터링할 필요가 있다.
신뢰할 수 있는 백신 요법을 제공하기 위해 수지상 세포 효능을 테스트하는 방법이 필요하므로, 상기 테스트는 강력하고 비용 효과적이며 양호한 제조 표준(GMP)에 따라 수행될 수 있는 것이 바람직하다.
DC 백신의 효능에 대한 표준 분석은 수지상 세포의 표면에서 CD80의 상향 조절이다. 상기 분석은 규제 당국에 의해 수용되지만 수지상 세포의 진정한 작용성을 반영하지는 못한다. CD80 테스트는 저 IL-12 및 고 IL-10을 분비하는 DC 세포와, 우수한 T 세포 NK 활성화 능력을 나타내며 고 IL-12 및 저 IL-10을 분비하는 수지상 세포를 구별하지 못한다.
T 세포 활성화를 유도하기 위해 수지상 세포가 활성화되어야 한다. 수지상 세포 효능을 측정하는 표준 분석에서, 수지상 세포는 조사된 CD40L을 발현하는 L929 마우스 섬유 아세포와 함께 배양된다. 수지상 세포의 CD40과 마우스 섬유 아세포 상에 발현된 CD40L의 상호 작용을 통해, 수지상 세포가 활성화된다.
조사된 마우스 섬유 아세포와 수지상 세포의 공동 배양은 힘들고 시간 소모적이며 비용이 많이 들며 표준화하기가 어렵고 GMP 표준에 적용하기가 어렵기 때문에 상기 접근법은 불리하다. 또한, 방사선 유닛이 필요하다.
사이토카인에 대한 표준 단일 세포 분석은 유세포 분석을 통한 세포 내 염색 및 검출이다. 한 번의 분석으로 IL-12 및 Il-10을 검출할 수 있다. 상기 접근법의 문제점은 세포 내 염색이 실제 분비를 나타내는 것이 아니라 자극 시 유도된 세포 내 사이토카인 수준만을 측정한다는 것이다. 따라서, 세포 간 사이토카인의 검출이 이들 사이토카인이 상기 세포에 의해 분비되는 것을 의미하지는 않는다. 세포에서 자극 전에 사이토카인이 이미 저장되어 있으면 실제 분비를 추정할 수 없다. 측정된 수준이 유의하게 증가한 경우에만 자극으로 인해 사이토카인의 상향 조절이 있음을 간접적으로 추정할 수 있다. 분비된 사이토카인의 실제 수준은 검출되지 않는다. 사이토카인 수준이 변하지 않으면 사이토카인의 증가가 없거나 증가가 있어도 세포 내 사이토카인의 분해만큼 빠르기 때문에 증가가 검출되지 않을 수 있다. 성숙한 DC는 정상적으로 장기간에 걸쳐 IL-10을 저장할 수 있으며, IL-10이 분비되면 유동 세포 분석 데이터와 같은 세포 내 염색 데이터에는 반영되지 않는다.
따라서, 우수한 제조 표준(GMP)에 따라 수행될 수 있고 IL-12 및 IL-10의 분비를 직접 측정하는 강력하고 비용 효율적이며 간단한 방법으로 수지상 세포 효능을 테스트하는 방법이 필요하다.
따라서, 본 발명의 제 1 측면은 DC의 효능을 결정하는 방법으로,
(a) 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제와 인큐베이션하여 수지상 세포를 자극하는 단계;
(b) (a) 단계의 상기 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 단계;
를 포함한다.
상기 방법은 수지상 세포 효능의 정확한 예측을 허용하는 마커 사이토카인 IL-12 및 IL-10의 실제 분비 수준을 측정하기 때문에 T-세포 및 NK 세포 면역 반응을 유도하는 수지상 세포의 능력을 정확하게 예측할 수 있게 한다. 또한 상기 방법은 강력하고 단순하며 비용 효과적이다.
"수지상 세포의 효능(potency of dendritic cell)"은 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 수지상 세포의 능력을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 높은 효능을 갖는 수지상 세포는 상기 수지상 세포가 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시킬 수 있음을 의미한다. 특히, 본 발명의 맥락에서 고 효능 수지상 세포는 T 세포를 Th1/Tc1 표현형으로 분극시킬 수 있고/있거나(이는 T 세포에 의한 IFNγ의 분비 및 같은 세포에 의한 IL-4의 발현이 없거나 감소된 것을 특징으로 함) NK 세포를 활성화시켜 높은 수준의 CD69를 발현하고 IFNγ를 분비하게 할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 측정은 단일 세포 수준에서 수행된다. 종래 기술에서 사용된 분석은 오직 벌크 배양에서 세포 마커를 측정하기 때문에 이종 집단의 정확한 분석을 제공할 수 없다. 상기 결과로부터, 적은 수의 세포만이 많은 양의 사이토카인을 생산하는지, 또는 많은 수의 세포가 적은 양의 주어진 분석물을 생산하는지가 명확하지 않다. 또한 세포가 동시에 두 가지 분석물 모두를 생산하는지 검출할 수 없다.
이종 수지상 세포 집단의 효능 상태를 구체적으로 결정하기 위해, 단일 세포 측정이 유리하다
바람직한 구현예에서, TLR7/8 작용제는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올(R848)이다.
가용성 CD40L 및 R848의 조합물과 수지상 세포의 인큐베이션은 성숙 조건이 상이한, 예를 들어 상이한 성숙 칵테일과 인큐베이션된 수지상 세포에 대해 CD40L-형질 감염된 L929 세포로의 자극을 모방하기 때문에 특히 유리하다. 따라서 CD40L 및 R848은 보편적인 수지상 세포 자극 조성물을 대표한다.
본 방법은 IL-12 및 IL-10의 분비 프로파일에 기초한 수지상 세포 효능의 분류 단계 (c)를 추가로 포함할 수 있다. 이에 의해, 1 이상의 IL-12 대 IL-10 분비의 비율을 나타내는 수지상 세포는 T 세포 및 자연살해(NK) 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포로 분류된다.
T-세포 및 NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포는 CD80의 고 발현 수준, CD86의 고 발현 수준, CD14의 저 발현 수준 및 B7H1의 저 발현 수준 표현형을 가질 수 있다.
T-세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포는 T 세포를 Th1/Tc1 표현형으로 분극시킬 수 있다. 상기 Th1/Tc1 표현형은 T 세포에 의한 IFNγ의 분비 및 IL-4의 발현이 없거나 감소된 것을 특징으로 한다.
NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포는 NK 세포를 활성화시켜 높은 수준의 CD69를 발현하고 IFNγ를 분비하게 할 수 있다.
특히, 본 방법의 단계 (b)는,
i) IL-10에 대한 1 차 결합 단백질 및 IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질과 함께 수지상 세포를 배양하는 단계;
ii) 2 차 결합 단백질에 의해 1 차 결합 단백질에 대한 마커 단백질의 결합을 검출하는 단계;
를 포함한다.
전형적으로, 자극은 CD40L 및 TLR7/8 작용제가 수지상 세포에 결합함으로서만 발생한다.
본 발명의 방법에서, CD40L은 세포주에 의해 수지상 세포에 제시되지 않는다. 수지상 세포는 CD40L의 가용성 형태와의 배양에 의해 활성화되기 때문에, CD40L을 발현하는 L929 마우스 섬유 아세포와 같은 다른 세포주와 수지상 세포를 공배양할 필요는 없다. 따라서, 힘들고 시간 소모적이며 표준화하기 어려운 세포 배양을 피할 수 있다. 더욱이, 이것은 L929 마우스 세포가 계속 증식하지 않도록 하기 위해, 사실상 L929 세포가 인간 수지상 세포를 과도하게 자라게하여 분석을 수행할 수 없게 만드는, 방사선 단계를 적용할 필요가 없다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에 대해 모든 병원에 존재하는 것이 아닌 방사선 유닛은 필요하지 않다.
일부 구현예에서, IL-10 및 IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질은 담체에 고정된다. 이에 의해, 상기 담체는 IL-10 및 IL-12에 대한 1 차 결합 단백질로 균일하게 코팅될 수 있다. 이를 통해 단일 세포 수준에서 IL-10과 IL-12의 분비를 측정할 수 있다. 전형적으로, 담체는 다중-웰 플레이트이다. 일반적으로, 1 차 결합 단백질은 항체이다. 2 차 결합 단백질도 항체일 수 있다. 2 차 결합 단백질은 검출 라벨로 표지될 수 있다. 전형적으로, 2 차 결합 단백질은 형광 작용기 또는 라벨로 표지된다.
일반적으로, 본 발명의 방법에 사용된 수지상 세포는 성숙 수지상 세포이다. 본 발명에 따른 방법으로 자극될 때 성숙 수지상 세포는 IL-12 대 IL-10의 필요한 비율을 발현한다.
수지상 세포의 성숙은 예를 들어 성숙 칵테일과의 인큐베이션으로 발생할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 방법에 사용된 수지상 세포는 IL1ß, TNFα, INFγ, TLR7/8 작용제 및 프로스타글란딘 E2를 포함하는 성숙 칵테일로 성숙된다.
보다 바람직하게는 본 발명의 방법에 사용된 수지상 세포는,
단핵구 제공 단계;
단계 i)의 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF와 함께 인큐베이션하는 단계;
단계 ii)의 단핵구를 IL1ß, TNFα, INFγ, TLR7/8 작용제 및 프로스타글란딘 E2를 포함하는 성숙 칵테일과 조합하여 IL-4 및 GM-CSF와 함께 인큐베이션하는 단계;
로 성숙된다.
단계 ii)의 인큐베이션은 2 일 이상 지속될 수 있다. 단계 iii)의 인큐베이션은 12 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 동안 지속될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 수지상 세포를 자극하는 방법으로
a) 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
b) 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제로 수지상 세포를 자극하는 단계;
를 포함한다.
따라서, 본 발명은 수지상 세포를 자극하기 위한 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제의 용도와 관련이 있다.
본 발명의 다른 측면은 키트로서,
- TLR7/8 작용제;
- 가용성 CD40L;
- IL-10에 특이적인 1 차 결합 단백질;
- IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질;
- IL-10에 특이적인 2 차 결합 단백질; 및
- IL-12에 특이적인 2 차 결합 단백질;
을 포함한다.
예를 들어, 상기 키트는 하기 성분:
(i) TLR7/8 작용제 및 CD40L을 포함하는 조성물;
(ii) IL-10에 특이적인 1 차 결합 단백질 및 IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질을 포함하는 조성물; 및
(iii) IL-10에 특이적인 2 차 결합 단백질 및 IL-12에 특이적인 2 차 결합 단백질을 포함하는 조성물;
을 포함할 수 있다.
1 차 결합 단백질은 바람직하게는 항체일 수 있고/있거나 2 차 결합 단백질은 항체이다. 전형적으로, TLR7/8 작용제는 R848이다.
도 1: DC 자극
도 1a: 3 가지 신호가 최적의 DC 자극에 필요하다.
DC는 T 세포의 강력한 활성제이며 DC 및 T 세포 사이의 상호 작용을 통해 이펙터 T 세포의 특성에 영향을 미친다. 최적의 활성화를 위해 3 가지 신호가 DC에 의해 전달되어야 한다
신호 1: MHC/펩티드 및 대응 TCR을 통한 항원 제시
신호 2: CD28이 관여하는 공자극 신호 CD80/CD86의 활성화
신호 3: 활성화 사이토카인 예를 들어 IL-12의 분비 및 억제 사이토카인 예를 들어 IL-10의 부재; De Koker, 2011로부터 조정.
도 1b:
통상적인 신호 3 분석에서 DC는 인간 CD40L을 발현하는 뮤린 섬유 아세포 세포주 L929와 24 시간 동안 공배양된다. 배양 상청액으로 분비된 사이토카인 IL-12p70 및 IL-10을 상업적 샌드위치 ELISA(예를 들어 R&Dsystems)로 결정한다.
상기 분석은 방사선 유닛을 필요로 하고, 힘든 세포 배양이 수반되며, 상기 분석을 GMP 설비에서 이용하기 어렵게 만들기 때문에 불리하다. 또한, 상기 분석은 단일 세포 수준에 특이적이다.
도 2 내지 도 5: IL-10/IL-12 ELISA에서 수지상 세포의 통상적인 자극 대 CD40L 자극의 비교
도 2는 통상적인 신호 3 분석과 비교한 MDG 칵테일로 성숙되고 R848, IFN-γ 및 LPS의 상이한 조합으로 CD40L로 자극된 DC에서 IL-10/IL-12의 분비를 도시한다(IL-10/IL-12 ELISA).
도 3은 Jonuleit 성숙 DC로 수행된 같은 실험을 도시한다. 두 가지 분석 모두에서 CD40L 자극만이 이용된 경우 CD40L 자극은 IL-10에 대해서는 아니나 IL-12 분비와 관련하여 통상적인 신호 2 분석과 비교할 만한 결과를 나타낸다(IL-10/IL-12 ELISA).
도 4 및 도 5는 R848이 미성숙 DC(iDC) 및 Jonuleit 성숙 DC에서 특히 최적의 IL-10 분비를 위해 공자극 시약으로서 필요함을 나타낸다. 도 4는 IL-10/IL-12 ELISA 데이터를 도시한다. 도 5는 본 발명의 방법에 의해 수행된 데이터를 도시한다(ELISPOT Sig.3 CD40L)
도 6 내지 도 8: 유동 세포 분석이 아닌 이중 색상 IL-10/IL-12 ELISPOT은 ELISA와 비교할 만한 수지상 세포의 효능을 나타낸다
도 6은 IL-12 및 IL-10에 대한 2 개의 상이한 도너의 ELISPOT 데이터를 도시한다. 자극은 R848과 함께 20000 개의 세포 및 1 μl CD40L/100 μl([v/v]) 배지로 수행되었다. 도너 1은 IL-10을 많이 생산한 반면, 도너 2는 주로 IL-12를 생산한다.
도 7은 통상적인 신호 3 분석에서 같은 도너를 도시한다. 두 가지 분석 모두는 매우 비교할 만한 결과를 나타낸다. dc IL-10/IL-12 ELISPOT과는 대조적으로, 세포 내 IL-12 및 IL-10의 유동 세포 분석은 IL-10에 대해서는 아니나 IL-12 분비 데이터에 대해서만 비교할 만한 데이터를 보여줄 수 있다. 이는 세포 내 IL-10 저장에 기인할 것이다.
도 8은 같은 도너 세포의 IL-12 및 IL-10의 ELISA 또는 상응하는 세포 내 유동 세포 분석(FACS) 염색으로 검출된 통상적인 신호 3 분석 후에 IL-12 및 IL-10 분비 비교를 도시한다. FACS로 검출된 바와 같은 세포 내 염색 결과는 특히 IL-10과 관련하여, ELISA로 검출된 바와 같은 분비에 필적하지 못한다. 이는 FACS는 세포 내에 저장된 총 IL-10을 측정하는 반면 ELISA는 분비된 IL-10을 검출한다는 사실로 설명될 수 있다.
도 9 단일 세포 IL-10/IL-12 분석(ELISPOT) 상단 열에서 첫 번째 그림은 IL12를 생산하는 성숙 수지상 세포(발명자의 칵테일로 성숙)의 스팟 수, 두 번째 그림은 같은 웰에서 IL-10을 생산하는 세포의 스팟 수, 세 번째 그림은 이중 양성인 세포의 스팟 수를 나타낸다. 하단 두 번째 열에서, 미성숙 수지상 세포에 대한 각각의 데이터가 도시된다(인간 IL-10/IL-12 이중-색상 ELISPOT 키트(CTL); 세포 수: 20,000 개의 세포/웰, 1.1 μl/110 μl CD40L+R848). 상기 결과는 미성숙 DC(iDC)가 건강한 도너에서 IL-10의 주요 공급원임을 명백하게 보여준다.
도 1a: 3 가지 신호가 최적의 DC 자극에 필요하다.
DC는 T 세포의 강력한 활성제이며 DC 및 T 세포 사이의 상호 작용을 통해 이펙터 T 세포의 특성에 영향을 미친다. 최적의 활성화를 위해 3 가지 신호가 DC에 의해 전달되어야 한다
신호 1: MHC/펩티드 및 대응 TCR을 통한 항원 제시
신호 2: CD28이 관여하는 공자극 신호 CD80/CD86의 활성화
신호 3: 활성화 사이토카인 예를 들어 IL-12의 분비 및 억제 사이토카인 예를 들어 IL-10의 부재; De Koker, 2011로부터 조정.
도 1b:
통상적인 신호 3 분석에서 DC는 인간 CD40L을 발현하는 뮤린 섬유 아세포 세포주 L929와 24 시간 동안 공배양된다. 배양 상청액으로 분비된 사이토카인 IL-12p70 및 IL-10을 상업적 샌드위치 ELISA(예를 들어 R&Dsystems)로 결정한다.
상기 분석은 방사선 유닛을 필요로 하고, 힘든 세포 배양이 수반되며, 상기 분석을 GMP 설비에서 이용하기 어렵게 만들기 때문에 불리하다. 또한, 상기 분석은 단일 세포 수준에 특이적이다.
도 2 내지 도 5: IL-10/IL-12 ELISA에서 수지상 세포의 통상적인 자극 대 CD40L 자극의 비교
도 2는 통상적인 신호 3 분석과 비교한 MDG 칵테일로 성숙되고 R848, IFN-γ 및 LPS의 상이한 조합으로 CD40L로 자극된 DC에서 IL-10/IL-12의 분비를 도시한다(IL-10/IL-12 ELISA).
도 3은 Jonuleit 성숙 DC로 수행된 같은 실험을 도시한다. 두 가지 분석 모두에서 CD40L 자극만이 이용된 경우 CD40L 자극은 IL-10에 대해서는 아니나 IL-12 분비와 관련하여 통상적인 신호 2 분석과 비교할 만한 결과를 나타낸다(IL-10/IL-12 ELISA).
도 4 및 도 5는 R848이 미성숙 DC(iDC) 및 Jonuleit 성숙 DC에서 특히 최적의 IL-10 분비를 위해 공자극 시약으로서 필요함을 나타낸다. 도 4는 IL-10/IL-12 ELISA 데이터를 도시한다. 도 5는 본 발명의 방법에 의해 수행된 데이터를 도시한다(ELISPOT Sig.3 CD40L)
도 6 내지 도 8: 유동 세포 분석이 아닌 이중 색상 IL-10/IL-12 ELISPOT은 ELISA와 비교할 만한 수지상 세포의 효능을 나타낸다
도 6은 IL-12 및 IL-10에 대한 2 개의 상이한 도너의 ELISPOT 데이터를 도시한다. 자극은 R848과 함께 20000 개의 세포 및 1 μl CD40L/100 μl([v/v]) 배지로 수행되었다. 도너 1은 IL-10을 많이 생산한 반면, 도너 2는 주로 IL-12를 생산한다.
도 7은 통상적인 신호 3 분석에서 같은 도너를 도시한다. 두 가지 분석 모두는 매우 비교할 만한 결과를 나타낸다. dc IL-10/IL-12 ELISPOT과는 대조적으로, 세포 내 IL-12 및 IL-10의 유동 세포 분석은 IL-10에 대해서는 아니나 IL-12 분비 데이터에 대해서만 비교할 만한 데이터를 보여줄 수 있다. 이는 세포 내 IL-10 저장에 기인할 것이다.
도 8은 같은 도너 세포의 IL-12 및 IL-10의 ELISA 또는 상응하는 세포 내 유동 세포 분석(FACS) 염색으로 검출된 통상적인 신호 3 분석 후에 IL-12 및 IL-10 분비 비교를 도시한다. FACS로 검출된 바와 같은 세포 내 염색 결과는 특히 IL-10과 관련하여, ELISA로 검출된 바와 같은 분비에 필적하지 못한다. 이는 FACS는 세포 내에 저장된 총 IL-10을 측정하는 반면 ELISA는 분비된 IL-10을 검출한다는 사실로 설명될 수 있다.
도 9 단일 세포 IL-10/IL-12 분석(ELISPOT) 상단 열에서 첫 번째 그림은 IL12를 생산하는 성숙 수지상 세포(발명자의 칵테일로 성숙)의 스팟 수, 두 번째 그림은 같은 웰에서 IL-10을 생산하는 세포의 스팟 수, 세 번째 그림은 이중 양성인 세포의 스팟 수를 나타낸다. 하단 두 번째 열에서, 미성숙 수지상 세포에 대한 각각의 데이터가 도시된다(인간 IL-10/IL-12 이중-색상 ELISPOT 키트(CTL); 세포 수: 20,000 개의 세포/웰, 1.1 μl/110 μl CD40L+R848). 상기 결과는 미성숙 DC(iDC)가 건강한 도너에서 IL-10의 주요 공급원임을 명백하게 보여준다.
본 발명을 바람직한 구현예들 중 일부와 관련하여 상세히 기재하기 전에, 하기의 일반적인 정의가 제공된다.
하기에서 예시적으로 기재된 바와 같이 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다.
본 발명은 특정 구현예와 관련하여 그리고 특정 도면을 참조하여 기재될 것이지만, 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구 범위에 의해서만 한정된다.
용어 "~을 포함하는(comprising)"은 본 기재 및 청구 범위에서 사용된 경우, 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "~로 이루어진(consisting of)"은 용어 "~을 포함하는(comprising of)"의 바람직한 구현예로 간주된다. 이하, 어떤 그룹이 적어도 특정 수의 구현예를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 바람직하게는 상기 구현예들만으로 이루어진 군을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 목적을 위해, "수득된(obtained)"이라는 용어는 "수득 가능한(obtainable)"이라는 용어의 바람직한 구현예인 것으로 간주된다. 이후에 예를 들어 항체가 특정 공급원으로부터 수득 가능한 것으로 정의될 경우, 이는 또한 상기 공급원으로부터 수득된 항체를 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
단수 명사를 언급할 때 부정 관사 또는 정관사, 예를 들어 "a", "an" 또는 "the"가 사용된 경우, 이는 특별히 다른 언급이 없는 한 상기 명사의 복수를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 용어 "약(about)"또는 "대략(approximately)"은 해당 특징의 기술적 효과를 여전히 보장하기 위해 당업자가 이해하게 되는 정확도의 간격을 나타낸다. 상기 용어는 전형적으로 표시된 수치로부터 ± 10 % 및 바람직하게는 ± 5 %의 편차를 나타낸다.
기술 용어는 상식적으로 사용된다. 특정 용어가 특정한 의미를 전달하는 경우, 용어의 정의는 하기에서 상기 용어가 사용된 문맥 안에서 제공될 것이다.
일반적으로, 본 발명은 DC의 효능을 결정하는 방법과 관련이 있고,
(a) 가용성 CD40L 및 선택적으로 TLR7/8 작용제와 함께 인큐베이션하여 수지상 세포를 자극하는 단계;
(b) 단계 (a)의 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 단계;
를 포함한다.
특히, 본 발명은 DC의 효능을 결정하는 방법과 관련이 있고,
(a) 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제와 함께 인큐베이션하여 수지상 세포를 자극하는 단계;
(b) 단계 (a)의 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 단계;
를 포함한다.
수지상 세포는 세포의 표면에서 CD40을 발현한다. CD40-CD-40L 상호 작용은 수지상 세포를 자극한다. “가용성(soluble) CD40L”은 막 결합체 CD40L의 변형된 버전(CD154 또는 CD40 리간드로도 명명)을 지칭한다. 상기 용어 “가용성 CD40L”은 막 관통 도메인을 함유하지 않는 CD40L의 절단된 버전을 포함한다. 상기 용어 “가용성 CD40L”은 MEGACD40L(Enzo Life Science GmbH, Lorrach, Germany)과 같은 Adiponectin/ACRP30/AdipoQ의 콜라겐 도메인을 통해 인공적으로 연결된, CD40L 올리고머, 특히 변형된 CD40L 올리고머, 예컨대 3량체 CD40 리간드 분자를 또한 포함한다. 가용성 CD40L은 CD40L의 천연 막-보조 응집을 자극할 수 있다. CD40L은 10 ng/ml 내지 100 μg/ml, 바람직하게는 1 ng/ml 내지 10 μg/ml, 예컨대 1 μg/ml의 농도로 사용될 수 있다. CD40L과의 인큐베이션은 12 시간 이상, 바람직하게는 12 시간 내지 48 시간, 보다 바람직하게는 약 24 시간 동안 지속될 수 있다.
TLR7/8은 Toll-유사 수용체 7/8로도 명명된다. 바람직하게는 TLR7/8 작용제는 국제 특허출원 공개번호 WO 00/47719에 기재되고 Invivogen(미국, 샌 디에고)사로부터 수득 가능한 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올(R848)인 TLR7/8 작용제이다. TLR7/8 작용제, 바람직하게는 R848은 0.2 내지 5 μg/ml, 바람직하게는 0.5 μg/ml 내지 2 μg/ml, 보다 바람직하게는 1 μg/ml의 농도로 사용될 수 있다. TLR7/8 작용제, 특히 R848과의 인큐베이션은 12 시간 이상, 바람직하게는 12 시간 내지 48 시간, 보다 바람직하게는 약 24 시간 동안 지속될 수 있다.
TLR7/8 작용제 및 CD40L은 수지상 세포에 조합하여 또는 순차적으로 첨가될 수 있다.
이들의 성숙 조건에 있어 상이한, 예를 들어 상이한 성숙 칵테일과 인큐베이션된 수지상 세포에 대한 CD40L-형질 감염된 L929 세포로의 자극을 모방하기 때문에, CD40L 및 TLR7/8 작용제 조합물과의 인큐베이션은 특히 유리하다. 따라서 CD40L 및 TLR7/8 작용제는 보편적인 수지상 세포 자극 조성물을 대표한다.
중요하게는, 본 발명은 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정한다. 이는 배지 내로 분비된 IL-12 및 IL-10 분자가 측정되고 세포 내 IL-12 및 IL-10 함량이 측정된 것이 아님을 의미한다. 상기에 이미 기재된 바와 같이, 인터루킨의 세포 내 함량은 반드시 분비된 수준에 상응하지는 않는다. 이는 특히 IL-10에 적용된다.
전형적으로, 수지상 세포는 IL-10 1 차 결합 단백질 및 IL-12 1 차 결합 단백질로 코팅된 담체 플레이트 상에 플레이팅될 수 있다. CD40L 및 선택적으로 TLR7/8 작용제를 함유하는 자극 용액은 수지상 세포를 플레이팅하기 전 또는 후에 첨가될 수 있다. 인큐베이션 시간 후, 2 차 결합 단백질이 첨가된다. 인큐베이션 시간은 6 내지 48 시간, 바람직하게는 12 내지 36 시간, 가장 바람직하게는 24 시간일 수 있다.
따라서, 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 것은 마커 단백질의 검출을 매개하는 IL-10 및 IL-12에 대한 특이적 결합 단백질과 함께 인큐베이션하여 마커 단백질을 검출하는 것과 관련이 있다. 따라서, 결합 단백질은 특정 기질을 사용하여 마커 단백질의 검출을 가능하게 하는 반응을 촉진하는 효소 또는 형광 라벨, 예를 들어 IL-10에 대한 호스 래디쉬 퍼옥시다제 및 IL-12에 대한 알칼리성 포스파타제와 같은 라벨에 의해 변형될 수있다.
바람직한 구현예에서, 측정은 단일 세포 수준에서 수행된다. 단일 세포 수준에서 인터루킨 분비를 측정할 수 있는 임의의 방법이 적용될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 벌크 배양에서 인터루킨 분비, 즉 세포 집단에서 인터루킨의 총량을 측정하지 않고, 세포 당 개별적으로 인터루킨 분비를 측정한다. 상기에서 이미 지적한 바와 같이, 상이한 인터루킨 분비를 나타내는 세포를 함유한 이종 세포 집단의 인터루킨 상태가 보다 상세하게 분석될 수 있기 때문에 이는 유리하다.
따라서, 바람직한 구현예는 DC의 효능을 결정하는 방법과 관련이 있고, 상기 방법은
(a) 가용성 CD40L 및 R848과 인큐베이션하여 수지상 세포를 자극하는 단계;
(b) 단계 (a)의 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 단계;
를 포함하고,
여기서 상기 분석은 단일 세포 수준에서 수행된다.
상기 방법은 IL-12 및 IL-10의 분비 프로파일에 기초한 수지상 세포 효능의 분류 단계 (c)를 추가로 포함할 수 있다. 다시 말해서, 상기 방법은 수지상 세포가 T-세포 및 또는 NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰지 여부를 분류하는 단계 (c)를 포함한다. 이로서, IL-12 대 IL-10 분비의 비율이 1 이상을 나타내는 수지상 세포를 T-세포 및 NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포로 분류한다. 바람직하게는 IL-12 대 IL-10 분비의 비율이 5 이상, 예컨대 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상을 나타내는 수지상 세포를 T-세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포로 분류한다. IL-12 대 IL-10의 비율은 전형적으로 10,000 미만, 예컨대 5,000 미만, 1,000 미만, 또는 500 미만이다.
반대로, IL-10 대 IL-12 분비의 비율이 1 이상을 나타내는 수지상 세포를 면역 반응을 억제하는 수지상 세포로 분류한다.
바람직한 구현예는 DC의 효능을 결정하는 방법과 관련이 있고, 상기 방법은
(a) 가용성 CD40L 및 R848과 인큐베이션하여 수지상 세포를 자극하는 단계;
(b) 단계 (a)의 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 단계;
(c) 상기 수지상 세포가 T-세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰지 여부를 분류하는 단계;
를 포함하고,
여기에서 IL-12 대 IL-10 분비의 비율이 1 이상을 나타내는 수지상 세포를 T-세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포로 분류하고;
여기에서 상기 분석은 단일 세포 수준에서 수행된다.
T-세포 및 NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포는 CD80 고 발현 수준, CD86 고 발현 수준, CD14 저 발현 수준 및 B7H1 저 발현 수준의 표현형을 가질 수 있다(Lichtenegger 외; Kenneth Murphy & Casey Weaver: Janeway’s Immunobiology).
T-세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포는 Th1/Tc1 표현형으로 T 세포를 분극시킬 수 있다. 상기 Th1/Tc1 표현형은 T 세포에 의한 IFNγ의 분비 및 IL-4의 발현이 없거나 감소된 발현을 특징으로 한다. NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포는 NK 세포를 활성화하여 CD69를 높은 수준으로 발현하고 IFNγ를 분비하게 할 수 있다(Kenneth Murphy & Casey Weaver: Janeway’s Immunobiology).
전형적으로, 자극은 수지상 세포에 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제의 결합에 의해서만 발생한다. 이는 수지상 세포를 자극하기 위해 다른 자극, 예를 들어 다른 분자와의 인큐베이션이 필요하지 않음을 의미한다. 특히, 막 관통 단백질 CD40L은 CD40L을 발현하는 조사된 L929 마우스 섬유 아세포와 같은 세포막에 고정된 막 관통 형태로 수지상 세포에 제시될 필요가 없다. 따라서, 상기 방법은 방사선 단계를 포함할 필요가 없다.
특히, 상기 방법의 단계 (b)는
IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질 및 IL-10에 대한 1 차 결합 단백질과 수지상 세포를 인큐베이션하는 단계;
2 차 결합 단백질에 의해 상기 1 차 결합 단백질에 대한 마커 단백질의 결합을 검출하는 단계;
를 포함한다.
상기 단계 ii)의 검출은 마커 단백질 및 1 차 결합 단백질의 복합체에 대한 2 차 결합 단백질의 결합일 수 있다. 대안적으로, 2 차 결합 단백질은 1 차 결합 단백질에만(1 차 결합 단백질과의 상호 작용없이) 결합할 수 있다. 상기의 경우에, 단계 ii) 전의 세척 단계로 인해, 1 차 결합 단백질과 결합하지 않은 마커 단백질은 제거된다.
일부 구현예에서, IL-10 및 IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질은 담체에 고정된다. 이에 의해, 담체는 IL-10 및 IL-12에 대한 1 차 결합 단백질로 균일하게 코팅될 수 있다. 이를 통해 단일 세포 수준에서 IL-10과 IL-12의 분비를 측정할 수 있다. 전형적으로, 담체는 다중-웰 플레이트이다. 일반적으로, 1 차 결합 단백질은 항체이다. 2 차 결합 단백질도 항체일 수 있다.
2 차 결합 단백질은 검출 라벨로 표지될 수 있다. 전형적으로, 2 차 결합 단백질은 마커 단백질의 검출을 허용하는 반응을 촉진시키는 효소에 의해 변형되거나 형광 표지된다.
일반적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 수지상 세포는 성숙 수지상 세포이다. CD40L (및 TLR7/8 작용제)로 자극될 때 성숙 수지상 세포는 IL-12 대 IL-10의 필요한 비율을 발현한다. 수지상 세포의 성숙은 예를 들어 성숙 칵테일과의 인큐베이션에 의해 발생할 수 있다.
전형적으로, 성숙 수지상 세포는
단핵구 제공 단계;
단계 i)의 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF와 함께 인큐베이션하는 단계;
단계 ii)의 단핵구를 성숙 칵테일과의 조합으로 IL-4 및 GM-CSF와 함께 인큐베이션하는 단계;
를 포함한 방법으로 생성될 수 있다.
성숙 칵테일은 IL-β, TNF-α, IFN-γ, TLR7/8 작용제, PGE2 및 TLR3 작용제 또는 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다. TLR7/8 작용제는 R848 또는 CL075일 수 있다. TLR3 작용제는 폴리(I:C)일 수 있다. 특정 구현예에서, 성숙 칵테일은 IL1ß, TNFα, INFγ, TLR7/8 작용제 및 프로스타글란딘 E2의 조합물을 포함할 수 있다. TLR7/8 작용제는 R848 또는 CL075일 수 있다.
바람직하게는 TLR7/8 작용제는 R848이다.
성숙 칵테일은 1-50 ng/ml TNFα, 1-50 ng/ml IL-1ß, 500-10,000 U/ml INFγ, 0.2-5 μg/ml TLR7/8 작용제 및 50-5,000 ng/ml 프로스타글란딘 E2 PG 및 선택적으로 10-50 ng/ml TLR3 작용제를 포함할 수 있고; 보다 바람직하게 상기 칵테일은 10 ng/ml TNF-α, 10 ng/ml IL-1β, 5,000 U/ml IFNγ, 1 ug/ml R848 및 250 ng/ml 프로스타글란딘 E2를 포함할 수 있다.
단계 ii)의 인큐베이션은 3 일 동안 지속될 수 있다. 단계 iii)의 인큐베이션은 24 시간 이상 동안 지속될 수 있다.
대안적으로, Jonuleit 칵테일도 사용될 수 있다. Jonuleit 칵테일은 Jonuleit 외에 기재되어 있고 TNFα, IL-lβ, IL-6 및 프로스타글란딘 E2를 포함한다. 특히, Jonuleit 칵테일은 10 ng/ml TNF-알파, 10 ng/ml IL-lβ, 15 ng/ml IL-6 및 1000 ng/ml 프로스타글란딘 E2를 포함한다.
수지상 세포는 도너 유래 항원 제시 세포, 예를 들어 수지상 세포로 성숙되는 단리된 단핵구일 수 있다. 성숙 수지상 세포는 본 발명의 방법에 의해 최적으로 자극될 수 있다.
전형적으로, 수지상 세포는 자가 조직 세포, 즉 본 발명의 교시에 따라 처리된 환자로부터 수득된 뒤 같은 환자에게 재투여된 세포이다. 예를 들어, 단핵구는 환자로부터 단리되고, 수지상 세포로 성숙되고, 원하는 항원을 발현하도록 본 명세서에 기개된 바와 같이 처리된 뒤 같은 환자에게 투여된다.
당업자는 수지상 세포에 대한 성숙 프로토콜을 알고 있다. 급성 골수성 백혈병의 면역요법에 이용하기 위한 수지상 세포의 성숙은 문헌[Subklewe 외]에 개시되어 있고; 수지상 세포에 대한 3 일 성숙 프로토콜은 문헌[Burdek 외]에 기재되어 있다.
단핵구는 예를 들어 말초 혈액 단핵 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 수지상 세포를 자극하는 방법과 관련이 있고, 상기 방법은,
a) 수지상 세포를 제공하는 단계; 및
b) 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제로 수지상 세포를 자극하는 단계;
를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 키트와 관련이 있고, 상기 키트는
- TLR7/8 작용제;
- 가용성 CD40L;
- IL-10에 특이적인 1 차 결합 단백질;
- IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질;
- IL-10에 특이적인 2 차 결합 단백질; 및
- IL-12에 특이적인 2 차 결합 단백질;
을 포함한다.
마커 단백질에 특이적(IL-12 또는 IL-10 중 하나)인 2 차 결합 단백질은 마커 단백질 및 1 차 결합 단백질의 복합체에 결합할 수 있거나 또는 1 차 결합 단백질에만(1 차 결합 단백질과 상호 작용없이) 결합할 수 있다.
예를 들어, 상기 키트는 하기 성분:
(i) TLR7/8 작용제 및 CD40L을 포함하는 조성물;
(ii) IL-10에 특이적인 1 차 결합 단백질 및 IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질을 포함하는 조성물; 및
(iii) IL-10에 특이적인 2 차 결합 단백질 및 IL-12에 특이적인 2 차 결합 단백질을 포함하는 조성물;
을 포함할 수 있다.
1 차 결합 단백질은 바람직하게는 항체일 수 있고/있거나 2 차 결합 단백질은 항체이다. 전형적으로, TLR7/8 작용제는 R848이다.
상기 용어 “결합 단백질(binding protein)”은 항체 및 이의 결합 단편뿐만 아니라 다른 분자, 예컨대 비항체 단백질 스캐폴드 단백질 및 앱타머도 포함한다.
항체는 중쇄를 기초로 5 가지 주요 클래스, IgM(μ), IgD(δ), IgG(y), IgA(α) 및 IgE(ε) 항체로 분화될 수 있고, IgG 항체가 가장 큰 비율을 차지한다. 면역글로불린은 또한 경쇄에 기초하여 아이소타입 κ 및 λ로 분화될 수 있다.
실험
MDG 또는 Jonuleit 칵테일로 성숙된 수지상 세포 및 CD40L 단독 자극 및 R848/IFNγ 및 LPS와 결합한 자극
단핵구를 부착 분리로 단리하고난 뒤 IL-4 및 GMSCF를 이용하여 3 일 동안 수지상 세포를 생성하였다. 그 후 수지상 세포를 MDG 칵테일 및 IL-4 및 GMCSF로 24 시간 동안 성숙시켰다. Jonuleit 칵테일의 경우 세포를 IL-4 및 GMSCF를 이용하여 6 일 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 Jonuleit 칵테일 (및 IL-4 및 GMCSF)과 함께 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 분석에 대해, 냉동 수지상 세포를 분석 전 날 해동하여 사용하였고 분석이 시작될 때까지 DC 배지에서 인큐베이션하였다. 자극은 96 웰 플레이트에서 24 시간 동안 수행되었다. 따라서, 11,000 개의 수지상 세포가 웰 당(per well) 시딩되었다. 110 μl DC 배지(1.5 % 인간 혈청을 갖는 VLE RPMI 1640) 중의 1.1μl CD40L, 1 μg/ml LPS 및 R848을 첨가하였다.
인간 IL-10, IL12p70 각각의 프로토콜에 따라 Elisa 분석을 DuoSet ELISA-Kit(R&D Systems, Inc, Minneapolis, USA)로 수행하였다.
IL-10/IL-12 Elispot 분석
인간 IL-10/IL-12 이중-색상 ELISPOT 키트(C.T.L. Cellular technology Limited, Cleaveland, USA)의 프로토콜에 따라 IL-10/IL-12 Elispot 분석을 수행하였다
Jonuleit 칵테일
10 ng/ml TNFα, 10 ng/ml IL-lß, 15 ng/ml IL-6 및 1,000 ng/ml 프로스타글란딘 E2 (= PGE2)
MDG 칵테일
10 ng/ml TNF-α,10 ng/ml IL-1β, 5,000 U/ml IFNγ, 1 μg/ml R848 및 250 ng/ml 프로스타글란딘 E2.
참조 문헌
Burdek “Three-day dendritic cells for vaccine developement: Antigen uptake; processing and presentation”Journal of Translational Medicine (2010) 8:90
De Koker, 외 “Designing polymeric particles for antigen delivery” Chem Soc Rev 2011 40(1):320-39; 2011)
Jonuleit 외 "Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.” Eur J Immunol., (1997), vol. 27(12): 3135-42
Lichtenegger “CD86 and IL-12p70 are key players for T Helper 1 polarization and Natural Killer Cell Activation by Tell-Like Receptor-Induced Dendritic Cells” PLOS ONE, vol. 7(9) (e44266)
Murphy K. & Weaver C.: Janeway’s Immunobiology 9th Edition, Garland Science
Subklewe 외 “New generation dendritic cell vaccine for immunotherapy of acute myeloid leukemia.” Cancer Immunol Immunother (2014) 63: 1093-1103
Claims (28)
- 수지상 세포(dendritic cell; DC)의 효능을 결정하는 방법으로서,
(a) 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제(agonist)와 인큐베이션하여 수지상 세포를 자극하는 단계;
(b) 단계 (a)의 상기 수지상 세포로부터 마커 단백질 IL-10 및 IL-12의 분비를 측정하는 단계 - 여기에서, 상기 측정은 단일 세포 수준에서 수행됨 - ; 및
(c) 상기 IL-12 및 IL-10의 분비 프로파일에 기초하여 상기 수지상 세포 효능을 분류하는 단계 - 여기에서 IL-12 대 IL-10 분비의 비율이 1 이상을 나타내는 수지상 세포는 T-세포 및 자연살해(Natural Killer, NK) 세포를 활성화시키는 능력이 큰 수지상 세포로 분류됨 - ;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 TLR7/8 작용제는 4-아미노-2-에톡시메틸-α,α-디메틸-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올(R848)인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 2 항에 있어서,
T-세포 및 NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 상기 수지상 세포는 CD80의 고 발현 수준, CD86의 고 발현 수준, CD14의 저 발현 수준 및 B7H1의 저 발현 수준 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 3 항에 있어서,
T-세포를 활성화시키는 능력이 큰 상기 수지상 세포는 T 세포를 Th1/Tc1 표현형으로 분극시키는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 Th1/Tc1 표현형은 상기 T 세포에 의한 IFNγ의 분비 및 IL-4의 발현이 없거나 감소된 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 5 항에 있어서,
NK 세포를 활성화시키는 능력이 큰 상기 수지상 세포는 NK 세포를 활성화시켜 CD69를 높은 수준으로 발현하고 IFNγ를 분비하게 하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단계 (b)는
i) IL-10에 대한 1 차 결합 단백질 및 IL-12에 특이적인 1 차 결합 단백질과 상기 수지상 세포를 인큐베이션하는 단계;
ii) 2 차 결합 단백질에 의해 상기 1 차 결합 단백질에 대한 상기 마커 단백질의 결합을 검출하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 자극은 상기 수지상 세포에 가용성 CD40L 및 TLR7/8 작용제의 결합에 의해서만 발생하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 8 항에 있어서,
CD40L은 세포주에 의해 상기 수지상 세포에 제시되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 9 항에 있어서,
상기 수지상 세포는 상이한 세포주와 공배양되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 10 항에 있어서,
방사선 단계가 적용되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 11 항에 있어서,
상기 1 차 결합 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 2 차 결합 단백질은 항체인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 13 항에 있어서,
상기 2 차 결합 단백질은 형광 표지된 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 수지상 세포는 성숙 수지상 세포인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제 15 항에 있어서,
상기 수지상 세포의 성숙은 성숙 칵테일과 인큐베이션하여 발생하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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