KR20110047279A - 인간 혈액 유래의 ｃｄ4＋ｃｄ25＋ 조절성 ｔ 세포 - Google Patents

인간 혈액 유래의 ｃｄ4＋ｃｄ25＋ 조절성 ｔ 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 억제성 및/또는 조절성 인간 CD4+CD25+ T 세포, 그를 확장하는 방법 및 조절제제로서 상기 억제성 및/또는 조절성 인간 CD4+CD25+ T 세포 및 그의 확장된 T 세포의 용도를 제공한다.

Description

인간 혈액 유래의 ＣＤ4＋ＣＤ25＋ 조절성 Ｔ 세포{ＣＤ4＋ＣＤ25＋ regulatory T cells from human blood}
본 발명은 억제성 및/또는 조절성 인간 CD4+CD25+ T 세포, 그를 확장하는 방법 및 조절제로서 상기 억제성 및/또는 조절성 인간 CD4+CD25+ T 세포 및 그의 확장된 T 세포의 용도를 제공한다.
면역학적 자기-관용(self-tolerance)은 자가면역의 예방과 면역 항상성의 유지에 핵심적이다. 면역 체계가 자기와 비자기(non-self)를 구별할 수 있는 능력은 중추(central) 및 말초(peripheral) 관용의 기작에 의하여 조절된다. 중추 관용은 발생의 초기 단계에서 흉선의 자기 반응성 T 림프구를 제거하는 것과 관련된다 (Rocha,. B. 및 von Boehmer, H., Science 251:1225-1228 (1991); Kisielow, P, 등, Nature 333:742-746 (1988)). T 세포 무력화(anergy) 및 무시(ignorance)를 포함한 여러 가지 말초 관용의 기작이 개시된 바 있다 (Rocha, B. 및 von Boehmer, H., Science 251:1225-1228 (1991); Kisielow, P. 등, Nature, 333:742-746 (1988); Schwartz, R. H., Science 248:1349-1356 (1990); Miller, J. F. A. P. 및 Heath, W. R., Immunol. Rev. 133:131-150 (1993)). 설치류에서 10년 이상 행하여진 연구의 결과 다른 관용 기작을 회피한 자기 반응성 T 세포의 효과기 기능(effector function) 뿐만 아니라 그의 활성화를 적극적이고 우세하게 예방하는 "전문적인(professional)" 조절성/억제성 T 세포 중의 독특한 CD4+CD25+ 집단이 존재한다는 확고한 증거가 제시되었다 (Sakaguchi, S, 등, 3. Immunol. 155:1151-1164 (1995); Takahashi, T. 등, Int. Immunol. 10: 1969-1980 (1998); Itoh, M. 등, J. Immunol. 162:5317-5326 (1999)). 이들 세포를 제거 또는 불활성화시키면 중증 자가면역 질환이 유발되고, 알로항원(alloantigen) 및 심지어는 종양(tumor)에 대한 면역 반응을 증진시킨다는 것이 또한 밝혀졌다 (Sakaguchi, S. 등, J. Immunol. 155:1151-1164 (1995); Itoh, M. 등, J. Immunol, 162:5317-5326 (1999); Shimizu, J. 등, J. Immunol. 163:5211-5218 (1999)). 최근의 연구에 의하면, 상기 CD4+CD25+ 조절성 T 세포는 다소 균질한 집단을 구성하고 (Thornton, A. M., Shevach, E, M., J. Immunol. 164:183-190 (2000)), 흉선으로부터 유래하고 (Itoh, M, 등, J. Immunol. 162:5317-5326 (1999)), TCR을 통한 자극에 대하여 천연적으로 비증식성이나 (즉, 무력하나(anergic)), 억제성이 되고 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식을 저해하기 위하여는 그들의 TCR을 통한 활성화가 필요하다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 일단 활성화되면, 그들의 조절성/억제자(supressor) 기능은 완전히 항원-비특이적이고, 사이토카인-독립적이나 세포 접촉에 의존적이다 (Thornton, A. M., Shevach, E. M., J. Immunol, 164:183-190 (2000)). 억제의 정확한 기작, 특히 T-T 상호작용에 관련된 세포 표면 및/또는 단기 용해성 분자는 앞으로 그 특성이 밝혀져야 한다. 새로운 인 비트로 데이터에 의하면, 상기 CD4+CD25+ T 세포가 반응세포(reponders)의 IL-2 생산을 저해함으로써 반응세포의 증식을 저해한다는 것이 암시된다 (Thornton, A, M., Shevach, E. M., J. Exp. Med. 188:287-296 (1998)). 최근의 인 비보 연구에 의하면, CD4+CD25+ T 세포의 기능은 CD4+CD25+ T 세포 상에서 구성적으로 발현되는 것으로 밝혀진 CTLA-4/CD152 분자를 통한 신호전달에 핵심적으로 의존한다는 것이 암시된다 (Read, S., 등, J. Exp. Med. 192:295-302 (2000); Salomon, B. 등, Immunity 12:431-440 (2000); Takahashi, T. T., 등, J. Exp. Med. 192:303-310 (2000)).
비록 설치류에서 상기 CD4+CD25+ T 세포 집단이 자발적 자가면역 질환의 예방에 핵심적인 "전문적" 조절성/억제자 T 세포의 독특한 계통(lineage)을 구성한다는 것이 수년간 명확하였을 지라도 (Sakaguchi, S., 등, J. Immunol. 155:1151-1164 (1995)), 비슷한 기능적 특성을 보이는 CD4+ T 세포가 인간에게도 천연적으로 존재하는지는 오늘날까지 알려지지 않았다. 예를 들면, 생쥐의 항-CD25 및/또는 항-CTLA-A4 mAb 처리에 의하여 생쥐의 인 비보에서 이들 세포를 제거 및/또는 기능을 손상시키면 다양한 자발적 자가면역 질환 및 종양의 거부반응이 유도된다. 기작은 이들 세포를 제거/손상시키면 이들 세포가 자가반응성 T 세포를 음성 조절(negative control)하는 것이 제거되어 자가반응성 T 세포가 활성적으로 되도록 하는 것이다. 만약 이들 생쥐 내로의 입양면역 전달(adoptive transfer)에 의하여 상기 CD4+CD25+ T 세포를 생쥐에 되돌려 주면 조절이 회복되고 자가면역성/종양 거부반응이 중단된다.
상기한 바와 같이, 비슷한 기능적 특성을 보이는 CD4+ T 세포가 인간에게도 천연적으로 존재하는지는 오늘날까지 전형 알려지지 않았다. 조절성 특성을 가지나, CD4+CD25+ T 세포가 없는 인간 T 세포를 제조하는 것이 당업계에 알려져 있다. E. g. Jonuleit, H. 등, J. Exp. Med. 192:1213-1222 (2000)에는 미성숙 수지상 세포(dendritic cell)로 반복적으로 자극함으로써 인간 나이브 T 세포로부터 조절성 T 세포를 유도하는 것이 개시되어 있다. 이 연구의 대부분은 진짜 나이브 T 세포의 가장 풍부한 원천인 제대 혈액 (cord blood)으로부터 얻은 T 세포를 가지고 수행되었다. CD4+CD25+ T 세포는 초기 시점부터 인간 혈액에 구성적으로(constitutively) 검출가능하다는 것에 주목하여야 한다. Jonuleit 등의 연구 대상은 천연적으로 존재하는 집단이 아니다. De Jong, P. 등, Int. Immunol. 6:631-638 (1994)에는 TGF-β1이 나이브 및 기억 CD4+ T 세포에 미치는 효과가 개시되어 있다. 일차 활성화된 CD45 RA+ CD4+ T 세포에 대한 자극적 효과와 함께, 분별적 효과가 관찰되었다. CD45 RO+ CD4+ T 세포 또는 이차 자극된 CD45 RO+ 세포의 증식은 억제되었다. CD45 RA+ T 세포의 경우, TGF-β는 CD25의 형광(fluorescens) 평균을 증가시킨다. 개시된 효과는 순전히 T 세포의 증식과 관련되는 것이다. TGF-β처리된 나이브 T-세포의 조절성 능력은 개시되지 않았다.
놀랍게도 CD4+CD25+, 주로 CD45RO+ T 세포(CD4+ T 세포의 평균 6%)(이하 간단히 "CD4+CD25+ T 세포"라 한다)가 인간 혈액, 구체적으로 건강한 성인 자원자의 말초 혈액에 존재한다는 것이 이제 밝혀졌다. 과거에 상기 표현형(즉, 억제성/조절성 CD4+CD25+ T 세포)을 보이는 T 세포가 수년 동안 알려져 왔으나, 통상적인 기억 세포인 것으로 오해되었다(Kanegane, H. 등, Int. Immunol. 3:1349-1356 (1991); Taka, K. 등, Immunol. 72.15-19 (1990); Jackson, A. L. 등, Clin. Immunol. Innunopathol. 54:126-133 (1990)). 종전의 보고와는 대조적으로 상기 인간 CD4+CD25+ T 세포는 통상적인 기억세포라기 보다는 오히려 상기 세포의 설치류의 대응세포(counterpart)와 동일한 기능적 특성을 보이는 조절성 세포이다. 예를 들면, CD4+CD25+ T 세포의 인 비보 억제 활성에 필수적인 CTLA-4 (CD152)는, 구성적으로 발현되며, 자극 후에 강하게 상향조절(upregulation)된 상태로 유지된다. 상기 세포는 상기 세포의 TCR을 통한 자극에 대하여는 비증식성이나, 무력화 상태(angergic state)가 IL-2 및 IL-15에 의하여 부분적으로 반전된다. 타생(allogeneic)(자생(syngeneic)은 아님) 성숙 수지상 세포 또는 플레이트-결합 항 CD3 + 항 CD28로 자극되었을 때 상기 CD4+CD25+ T 세포는 IL-10을 방출하였고, 공동배양(coculture) 실험에서는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화 및 증식을 억제하였다. 억제는 IL-10에 독립적이나, 생쥐에서 처럼 접촉에 의존적이었다. 조절성 CD4+CD25+ T 세포를 확인하는 것은, 특히 자가면역, 이식 및 암과 관련하여 인간에서의 관용의 연구에 대하여 중요한 의미를 갖는다.
본 발명은
(1) 억제성 및/또는 조절성 인간 CD4+CD25+ T 세포;
(2) 엑스 비보(ex vivo) 및 인 비보(in vivo)에서 CD4+CD25+ T 세포를 T 세포 자극제 또는 항원제공세포로 자극하는 단계를 포함하는, 상기 (1)에서 정의된 바와 같은 CD4+CD25+ T 세포를 확장하는 방법;
(3) 상기 (2)에서 정의된 바와 같은 방법, 바람직하게는 상기 (2)에서 정의된 바와 같은 엑스 비보 방법에 의하여 얻어진 확장된 인간 CD4+ CD25+ T 세포;
(4) 상기 (1) 또는 (3)에서 정의된 바와 같은 인간 CD4+ CD25+ T 세포를 포함하는 약제학적 조성물;
(5) 조절성 약물을 제조하기 위한 상기 (1) 또는 (3)에서 정의된 바와 같은 CD4+ CD25+ T 세포의 사용;
(6) (i) CD4+CD25+ T 세포 상의 CD4 및/또는 CD25, 및/또는 CTL-A4 (CD152)에 특이적으로 결합하는 제제(agent)/리간드, 바람직하게는 항-CD4 및/또는 항-CD25, 및/또는 항-CTL-A4 항체를 이용하는 단계; 및/또는
(ii) 상기 (2)에서 정의된 바와 같은 자극제 또는 항원제공세포를 이용하는 단계를 포함하는, 엑스 비보 또는 인 비보에서 인간 혈액 및 다른 조직으로부터 유래한 CD4+CD25+ T 세포를 확인, 모니터링 및/또는 제거하는 방법;
(7) 인 비보에서 조절성 CD4+CD25+ T 세포를 유도하기 위한 제제(agent)를 제조하는데, 바람직하게는 환자의 자가면역 질환을 치료하기 위한 제제를 제조하는데 상기 (2)에서 정의된 바와 같은 T 세포 자극제 또는 항원제공세포의 사용;
(8) (a) 다른 성장 인자 및/또는 기능적으로 변형시키는 (저해/증진시키는)/ 아포토시스 또는 항-아포토시스 인자를 확인하는 분석에;
(b) CD4+CD25+ T 세포 상의 신규한 분자를 확인하는 것을 포함한 상기 CD4+CD25+ T 세포에 의하여 발현된 분자, 또는 약제학적으로 활성인 분자를 제공하는지를 확인하는 데에; 또는
(c) 조절성 CD4+CD25+ T 세포의 전구 세포 또는 자손을 확인하는 데에 상기 (1) 또는 (3)에서 정의된 바와 같은 CD4+CD25+ T 세포의 사용;
(9) 입양면역 전달 치료를 위한 제제, 비한정적으로 자가면역 질환을 포함한 증진된 면역성과 관련된 질병을 치료하기 위한 제제, 또는 이식편대숙주병, 이식 거부반응과 같은 이식 반응을 예방/치료하기 위한 제제를 제조하는데 상기 (1)의 부유 CD4+CD25+ T 세포 또는 상기 (3)의 확장된 T 세포의 사용;
(10) 상기 (1) 또는 (3)에 정의된 바와 같은 부유/확장된 자가 또는 비자가 조절성 CD4+CD25+ T 세포를 환자에게 다시 주사/주입하여 너무 강하고/또는 병원체인 임의의 면역 반응을 예방 또는 치료, 또는 이식편대숙주병, 이식 거부반응과 같은 이식 반응을 예방/치료하는 단계를 포함하는 입양면역 전달 치료 방법;
(11) (i) 상기 (1)에 따른 CD4+CD25+ T 세포를 인 비트로 또는 인 비보에서 항원을 제공하는 항원제공세포, 바람직하게는 미성숙 또는 성숙 수지상 세포로 활성화/자극/확장하는 단계; 또는
(ii) CD4+CD25+ 조절성 T 세포(의 서브세트) 상에 발현된 특정 T 세포 수용체에 대한 리간드/항체, 또는 CD4+CD25+ T 세포(의 서브세트) 상의 특정 T 세포 수용체에 결합하는 MHC-펩티드 복합체를 이용하는 단계를 포함하는, 특정 항원-특이적 T 세포 수용체로 CD4+CD25+ T 세포를 제조하는 방법;
(12) 상기 (11)에서 정의된 바와 같은 방법, 또는 엑스 비보에서 분리된 또는 확장된 T 세포 내로 항원 특이성을 갖는 T 세포 수용체의 트랜스펙션에 의하여 얻어지는 CD4+CD25+ T 세포;
(13) 상기 (12)의 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 바람직하기로는 상기 약제학적 조성물은 자가면역 질환, 이식편대숙주 질환 및 이식거부 반응을 포함하나 여기에 한정되는 것은 아닌 증진된 면역성과 관련된 질병을 치료하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물;
(14) 예를 들면, 종양 면역성을 증진시키기 위하여, 인 비보에서 CD4+CD25+ T 세포에 의한 조절을 약화시키는 것을 포함한, 면역 반응을 증진시키기 위하여 인 비보에서 CD4+CD25+ T 세포를 제거 또는 기능적으로 손상시키기 위한 약물을 제조하는데에, 항-CD25 및/또는 항-CTL-A4 단일클론항체와 같은 리간드/항체를 포함하나, 여기에 한정되지는 않는 T 세포 상의 CD4 및/또는 CD25 및/또는 CTL-A4 (CD152)에 특이적으로 결합하는 제제, 또는 CD4+CD25+ T 세포(의 서브세트) 상의 T 세포 수용체에 결합하는 항체 또는 MHC-펩티드 복합체 또는 다른 리간드를 사용하는 것을 제공한다.
본 발명의 구체예 (1) 내지 (14)를 이하 보다 상세하게 설명한다.
(A) 인간 CD4+CD25+ T 세포의 표현형적 특성 확인에 의하여 엑스 비보(이하 종종 인 비트로(in vitro)라고도 한다) 또는 인 비보에서 인간 혈액 및 다른 조직으로부터 이들 세포를 확인, 모니터링 (예, FACS에 의하여), 분리 및 제거할 수 있게 되었다. 이 분리 또는 제거는 상기 인간 혈액 및 다른 조직을 엑스 비보에서 적당한 제제(agent)와 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 적당한 제제는 구체적으로 항-CD4, 항-CD25, 항-CTL-A4 (CD152) 항체 등이다.
(B) 상기 CD4+CD25+ T 세포는 적당한 T 세포 자극제 또는 항원제공세포(이하 간단히 "APC"라고 한다)로 처리하여 상기 세포를 자극함으로써 엑스 비보에서 확장될 수 있다. 상기 (2) 및 (6)의 방법에 적당한 적당한 T 세포 자극제에는
(a) 수퍼아고니스트 항체를 포함한 항-CD3 및/또는 항-CD28 리간드/단일클론 항체 (mAb);
(b) CD4+CD25+ T 세포의 표면 상의 T 세포 수용체 또는 T 세포 수용체 성분에 대한 리간드/항체; 또는
(c) 조절성 T 세포의 표면상에 발현된 상기 T 세포 수용체에 결합하는 MHC-펩티드 복합체; 또는
(d) PMA (뿐만 아니라 다른 포볼에스테르) + 이오노마이신(ionomycin) (또는 다른 칼슘 이오노포어)를 포함하는 조성물이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 "리간드(ligand 또는 ligands)"는 특정한 분자(예, 폴리뉴클레오티드 및 세포 수용체, CD25, CTL-A4 등과 같은 폴리펩티드)와 결합할 수 있는 모든 종류의 분자를 말한다. 바람직한 리간드는 단일클론 항체 또는 그 단편이다. "리간드" 및 "항체(antibody)"란 용어는 본 명세서에 걸처서 교환가능하게 사용된다.
적당한 APC에는 자가 또는 비자가 또는 인공 항원제공세포(예, 수지상 세포(수지상 세포의 제조에 대하여는 예를 들면, WO 93/20185, WO 97/29182 및 EP-A-0 922 758 참조) 등)가 포함된다. 상기 T 세포 자극제 및 항원제공세포는 IL-2 또는 IL-15와 함께 사용되거나 그 조합으로 사용될 수 있다. IL-2/IL-15 대신에, 여러 사이토카인 수용체에 공통적인 감마 체인을 사용하는 다른 사이토카인이 또한 사용될 수 있다(. IL-7 및 IL-9가 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다). 더욱이, 다른 조절성 세포의 생성을 촉진하는 것으로 알려진 IFN 알파 및 IL-10 (Groux, H. 등, Nature 389:737-742 (1997); Roncarolo, M.G., J. Exp. Med. 193:F5-F9 (2001))도 또한 이들 세포의 생성/확장을 촉진할 수 있다. 마지막으로, 다클론성 또는 올리고클론성 (예, 초항원(superantigen)에 의하여) T 세포 자극을 위한 다른 방법이 또한 적용가능하다 (수퍼아고니스트 항체를 포함한 항-CD3 및/또는 항-CD28 리간드/항원; PMA + 이오노마이신; 등). 이들 자극제 또는 항원제공세포는 당업자에게 잘 알려진 양으로 확장에 사용될 수 있다.
(C) 상기 CD4+CD25+ T 세포를 확인하는 것(identification)은 또한 인 비보에서 CD4+CD25+ T 세포를 모니터링하고 확장시켜(예를 들면, 수지상 세포/항원제공세포와 함께 또는 상기 세포 없이, 환자에게 IL-2 + IL-15 또는 IL-10 + IFNα와 같은 상기에서 정의된 T 세포 자극제를 투여함으로써) 예를 들면, 자가면역 질환에 대항하기 위하여 조절성 T 세포를 유도할 수 있도록 한다.
(D) 상기 (1) 또는 (3)의 상기 CD4+CD25+ T 세포 또는 확장된 CD4+CD25+ T 세포(예, 상기 CD4+CD25+ T 세포를 자극 또는 제거 또는 기능적으로 섭동(disturb)시키기 위하여)는 인 비트로 또는 인 비보에서 사용될 수 있는 다른 성장인자 및/또는 기능적으로 변경시키는 (저해/증진시키는)/(아포토시스 또는 항-아포토시스) 인자를 확인할 수 있도록 한다. 이들 T 세포는 또한 mAb 생성, 프로테오믹스, DNA 칩 분석, 감산 혼성화(subtractive hybridization)와 같은 방법, 그러나, 이들 방법에 한정되지는 않는 방법에 의하여 CD4+CD25+ T 세포에 의하여 발현되는 분자를 확인하는데 (특히 (a) "신규한", 즉 이하 미지, 분자 또는 (b) 이들 분자가 신규한 자극, 억제 또는 아포토시스-유도 약물을 개발하는데, 인 비트로 및 인 비보에서 CD4+CD25+ T 세포를 "스위치 온" 또는 "스위치 오프" 하기 위한 약제학적 표적 구조에 적합한지를 확인하는데) 및 상기 조절성 CD4+CD25+ T 세포의 전구 세포 또는 자손을 확인하는데 적합하다.
(E) 상기 (1) 또는 (3)의 상기 CD4+CD25+ T 세포 또는 확장된 CD4+CD25+ T 세포는 입양면역 절단 치료(adoptive transfer therapy)에 사용될 수 있다. 즉, 부유/확장된 자가 또는 비자가(non-autologous) 조절성 T 세포를 환자에게 다시 주사/주입하여, (홍반성 루푸스(lupus erythematosus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris) 또는 티레오이티디스(thyreoiditis)와 같은 고전적 자가면역 질환 뿐만 아니라 백반증(vitiligo), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 건선(psoriasis vulgaris) 등과 같은 발병과정에 적어도 일부분 자가면역 측면이 있는 질병 그러나, 여기에 한정되지는 않는 질병을 포함한)너무 강하고/또는 병원성인 임의의 면역 반응을 예방 또는 치료, 즉 가장 넓은 의미의 자가면역성을 치료할 수 있고, 또한 GVHD (인식편대숙주병 : graft versus host disease) 및 이식거부반응과 같은 이식 반응을 예방/치료할 수 있다.
(F) 상기 (1) 또는 (3)의 상기 CD4+CD25+ T 세포 또는 확장된 CD4+CD25+ T 세포 (뿐만 아니라 상기 (2)에서 정의된 확장 방법, 상기 (4)의 약제학적 조성물 및 상기 (5) 및 (7) 내지 (9)의 사용)는 인 비트로 또는 인 비보에서 상기 CD4+CD25+ T 세포를 활성화/자극/확장시키기 위하여, 특정한 소망의 항원-특이적 TCR (T 세포 수용체)을 갖는 CD4+CD25+ T 세포를 생성/확장시키기 위하여 조직 또는 임의의 다른 항원(정의되거나 정의되지 않은(defined or undefined))으로 펄스/로딩/도입되어 있거나 있지 않은 미성숙 또는 성숙 수지상 세포(dendritic cell)(DC)(또는 인공 세포를 포함한 다른 항원제공세포)와 함께 사용될 수 있다.
정의된 항원의 예는 자가항원(autoantigen) (예, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris)의 경우 데스모글라인(desmoglein) 3, 백반증(vitiligo)의 경우 멜란 A(melan A) 또는 타이로시나제(tyrosinase); 티레오이티디스(thyreoiditis)의 경우 트레오글로불린(thyreoglobulin)) 또는 외래 항원 (예, Hepatitis C 등과 같은 병원체-유래 항원) 또는 알로항원(alloantigen)/이식 항원이다. 정의되지 않은 항원의 예는 조직 또는 세포-유래 항원(예, 괴사 또는 아포토시스 세포의 형태 또는 조직 유래 RNA 또는 원하는 세포와 수지상 세포/항원제공세포와의 혼성체(hybrid) 또는 정의되지 않은 항원의 수지상 세포 또는 다른 항원제공세포 내로의 다른 전달형태) 또는 병원체-유래 항원이다. 자가 또는 비자가 CD4+CD25+ T 세포 및/또는 수지상 세포가 사용될 수 있다.
(G) 상기 (14)에서 정의된 바와 같은 상기 T 세포 상의 CD4 및/또는 CD25 및/또는 CTL-A4 (CD152)에 특이적으로 결합하는 제제(agent)는 예를 들면, (변경되지 않은 또는 변경된 예, 독소에 접합된) 항-CD25 및/또는 항-CTL-A4 mAb에 의하여 또는 면역흡착법(immunoadsorption) (혈액을 칼럼을 통하여 흘려주고, CD4+CD25+ T 세포의 표면에서 발현된 분자에 대한 고체상-결합 항체, 예, 항-CD25에 의하여 CD4+CD25+ T 세포를 제거한다)에 의하여 인 비보에서 CD4+CD25+ T 세포를 제거하고 제거를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 그렇게 함으로써, 예를 들면, 종양 면역성을 증진시키기 위하여, 면역반응을 증진시킬 수 있다(예, 인 비보에서 CD4+CD25+ T 세포에 의한 조절을 약화).
(H) 본 발명의 또다른 구체예에서 상기 (3)의 상기 확장된(즉, 활성화된) CD4+CD25+ T 세포 (및 또는 상기 (1) 및 (12)의 상기 T 세포)는 고정될 수 있다. 그러한 고정된 T 세포는 파라포름알데히드 등을 포함하나, 여기에 한정되지 않는 고정제로 상기 (확장된) T 세포를 엑스 비보에서 처리함으로써 얻어질 수 있다. 바람직하게는 상기 고정은 상기 세포를 0.5 내지 5% (w/w) 수성 파라포름알데히드 용액, 가장 바람직하게는 약 2% (w/w) 파라포름알데히드 용액에서, 약 15분 내지 3시간, 가장 바람직하게는 1시간 동안 현탁시키고, 적당한 세척 단계를 거쳐 수행된다.
(I) 상기 (5)의 약물, 상기 (9) 및 (14)의 제제, 또는 상기 (10)의 방법에 사용되는 상기 CD4+CD25+ T 세포는 자가 또는 비자가 조절성 T 세포일 수 있다. 비자가 조절성 T 세포인 경우, 상기 T 세포는 상기 (H)에서 설명한 바와 같이 고정되는 것이 바람직하다.
(J) 상기 (4) 및 (13)의 상기 약제학적 조성물, 상기 (5)의 약물, 상기 (7), (9) 및 (14)의 제제, 및 상기 (6), (8) 및 (10)의 방법에 사용되는 상기 T 세포는 당업자에게 알려진 약제학적으로/진단학적으로 적당한 담체(carrier), 용매, 희석제 및 첨가제와 같은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 이들 성분의 농도는 당업자에 의하여 각 목적에 따라 조정된다.
억제자(suppressor) 면역조절성 T 세포 개념은 설치류에서 여러 조절성 세포 형태를 더 잘 설명하고, 아직 최종적으로 정의되지 않은 조절성 세포의 상호 관계에 의하여 지난 수년 동안 활기를 띄게 되었다. 소위 Tr1 및 Th3 세포는 각각 IL-10 및 TGF-β의 고수준 분비에 의하여-직접적 세포 접촉 없이-바이스탠더 (bystander) 억제를 매개한다 (Groux, H. 등, Nature 389:737-742 (1997); Fukaura, H. 등, J. Clin. Invest. 98:70-77 (1996)). 지금까지 가장 잘 특성이 확인되고 외견상 가장 중요한 조절성 T 세포 집단은 CD4+CD25+ T 세포이다. CD4+CD25+ T 세포는 설치류에 천연적으로 존재하고 (림프 기관(lymphoid organs) 내의 CD4+ 세포의 약 10%를 나타낸다), CD25 (IL-2R-알파)를 구성적으로 발현하는 것이 특징이고, 인 비보에서 관용(tolerance)을 유지하고 자가면역 질환을 예방하는데 아주 중요하다는 것은 명백하다. 놀랍게도, 오늘날까지 인간에서 동등한 특성을 보이는 세포 집단은 개시되지 않았다. 본 명세서에서 본 발명자들은 종래 통상의 기억 T 세포를 나타내는 것으로 알려진 인간 혈액 중의 상기 CD4+CD25+ T 세포 (Kanegane, H. 등, Int. Immunol, 3:1349-1356 (1991); Taka, K. 등, Immunol., 72:15-19 (1990); Jackson,, A. L. 등, Clin. Immunol. Immunopathol. 54:126-133 (1990))가 사실은 수년 동안 설치류에서 알려지고 연구되어 온 상기 독특한 CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 바로 인간 대응세포(counterpart)인 것처럼 보인다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 세부적인 연구 및 CD4+CD25- T 세포와의 비교가 이루어질 수 있을 정도의 충분한 양의 성인 혈액으로부터 상기 CD4+CD25+ T 세포를 분리할 수 있었다(CD4+ T 세포의 평균 6%). 상기 인간 세포는 생쥐 CD4+CD25+ 면역조절성 T 세포와 핵심적 표현형적 및 기능적 특징을 공유한다는 것이 밝혀졌다. 가장 흥미있고 종래에는 확인되지 않았던 표현형적인 특징은 CTLA-4 분자 (CD152)가 인간 CD4+CD25+ T 세포에 의하여 (세포 내부에서는 고수준으로, 세포 표면에서는 저수준으로) 이미 구성적으로 발현되고 있고, TCR을 통한 자극 후에 더욱더 상향조절되고(upregulated) 적어도 1주일 이후까지 높은 표면 수준을 유지한다는 것이다 (이는 Thompson, C. B., Allison, J. P., Immunity, 7:4145-450 (1998); Chambers, C. A. 등, Immunol. Rev. 153:27-46 (1996)에 개시된 바와 같이, 자극되었을 때 새로이(de novo) CTLA-4를 발현하고, 단지 아주 임시적으로만 발현되는 CD4+CD25- T 세포와 확연히 대조적이다). CD4+CD25-에 의한 CTLA-4의 발현 양상은, 인 비보 억제성 활성에 필수적인 분자로서 CTLA-4를 구성적으로 발현하는 생쥐 CD4+CD25+ 조절성 T 세포와의 관계를 이미 지지하였다 (Read, S. 등, J. Exp. Med. 192:295-302 (2000), Salomon, B. 등, Immunity, 12:431-440 (2000)). 생쥐 대응세포와 같이, 상기 인간 CD4+CD25+ T 세포는 플레이트-결합 항 CD3 + 항 CD28에 의한 다클론 활성화나 가장 강력한 천연 면역자극 세포, 즉, 성숙한 (타생(allogeneic)) DC로 자극(심지어는 연속적 자극) 중 어느 것에 대하여도 자극에 대응한 증식을 거의 보이지 않았다. 이들 자극이 고용량의 IL-2 (500 U/ml)와 조합되었을 때, 무력화(anergy)는 생쥐에서 개시된 바와 같이 부분적으로 반전되었다 (Thornton, A. M., Shevach, E. M., J. Immunol., 164:183-190 (2000)). 고용량 (50-100ng/ml)의 IL-15에 의하여 상당한 증식이 유도되고, IL-2 및 IL-15를 심지어는 더 낮은 용량 (각각 10 U/ml 및 10 ng/ml)에서 조합 작용시켰을 때 강한 상승적인 작용이 얻어지고 격렬한 증식이 유도된다는 것이 새로인 밝혀졌다. 잠재적 치료학적인 응용 및 (기작 및 분자적 연구를 포함한) 추가의 상세한 연구를 위한 이들 세포의 클로닝에 CD4+CD25+ T 세포의 확장이 핵심적이기 때문에 상기 발견은 중요한 것으로 입증될 것이다. 흥미있는 것은 중화 항 IL-10 mAb 이 증식을 촉진하지 못한다는 것인데, 이는 이들 세포에 의한 IL-10의 방출은 오토크린(autocrine) 방식으로 무력화(anergy)를 유발하지 않는다는 것을 나타낸다. 공동배양 실험에서 CD4+CD25+ T 세포의 또다른 핵심적 특성이 밝혀졌다. 이는 CD4+CD25+ T 세포가 접촉- 및 용량 의존적으로, 그러나 사이토카인-비의존적 방식으로 CD25-CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식을 CD4+CD25+ T 세포 자신의 TCR을 통하여 활성화되었을 때에만 억제한다는 점이다. 본 발명자들의 엑스 비보 시스템으로는 TCR 형질전환 생쥐를 이용하여 생쥐에서 최근에 밝혀진 바와 같이, 상기 억제가 완전히 항원-비특이적인 것인지 여부를 조사할 수 없었다 (Thornton, A. M., Shevach, E. M., J. Immunol., 164:183-190 (2000)). 그러나, 이들 세포의 확장을 위하여 본 발명자들의 IL-2 + IL-15 접근법을 채용함으로써 각각의 기작을 연구하는 것이 가능하다.
본 발명자들이 엑스 비보에서 인간 혈액으로부터 분리한 상기 CD4+CD25+ T 세포와 실제적으로 동일한 조절성 특성 및 표현형을 갖는 T 세포가 인간 나이브 T 세포를 미성숙 DC로 반복적으로 자극함으로써 인 비트로에서 생성시킬 수 있다는 것이 최근의 보고에 의하여 밝혀졌다는 것이 가장 주목할 만하다 (Jonuleit, H. 등, J. Exp. Med., 192:1213-1222 (2000)). 생쥐에서 CD4+CD25+ 조절성 T 세포 집단은 흉선에서 연속적으로 생성되나 (Itoh, M. 등, J. Immunol., 162:5317-5326 (1999)), 말초에서 조절성 T 세포를 유지하기 위하여는 조직-특이적 항원 및 IL-2 (25, 26)의 존재를 필요로 한다. 상기 2가지 보충적 발견에 근거하면 (Jonuleit, H. 등, J. Exp. Med., 192:1213-1222 (2000)), 아포토시스 항체의 섭취(uptake)를 통하여 말초 조직으로부터 채취되고 (Steinman, R. M. 등, J. Exp. Med., 191:411-416 (2000); Roncarolo, M. G. 등, J. Exp. Med. 193:F5-F9 (2001)), 보편적(universal) 또는 조직-특이적 자가항원(autoantigen)을 제시하는 미성숙 DC가 흉선 T 세포 이주세포(emigrant)의 생존 및 아마도 적은(slight) 증식과 관련이 있을 것이라는 것은 당연히 생각해 볼 수 있다. 엑스 비보에서 분리된 CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 생존은 미성숙 DC와의 상호작용에 의하여 촉진될 수 있고, 최근 보고된 인 비트로에서 미성숙 DC에 의하여 나이브 T 세포로부터 CD4+CD25+ T 세포를 생성시킨 것(Jonuleit, H. 등, J. Exp. Med., 192:1213-1222 (2000))은 아마도 초기 접종(inoculum) 중의 기존 CD4+CD25+의 생존 유지를 오히려 나타내는 것으로 믿어지고 있다. 엑스 비보에서 분리된 인간 CD4+CD25+ T 세포와 자생(syngeneic) 성숙 DC의 상호작용은 그들의 억제 특성을 활성화시키는데 불충분한 반면, 타생(allogeneic) 성숙 DC는 조절의 강력한 유도자(inducer)라는 것이 밝혀진 점이 주목받고 있다. 이 관찰 결과는 다시 시험가능한 가설을 암시한다. 예를 들면, 성숙 자생(syngeneic) DC와는 대조적으로 미성숙 자생(syngeneic) DC가 CD4+CD25+ T 세포를 활성화시킬 것인가(CD4+CD25+ T 세포가 상호작용을 위한 어떤 특이적 리간드를 가지고 있음을 암시한다) 또는 CD4+CD25+ T 세포가 아포토시스체(apoptotic body)를 섭취(ingestion)한 후에만 활성화될 것인가(자가항원의 제시가 필요하다는 것을 암시한다)? 더욱이, 아주적은 회상 항원 (recall antigen)(예, 인플루엔자 단백질/펩티드)를 제시하는 성숙 DC가 CD4+CD25- T 세포 집단 및 CD4+CD25+ T 세포 모두에서 T 세포를 자극할 수 있을까 (이는 자가항원외에 외래 항원의 인지가 또한 염증 부위에서 조절을 유발할 수 있다는 것을 암시한다)?
요약하면, 종래의 믿음과는 대조적으로 통상의 기억 T 세포라기 보다는 설치류에서 수년 동안 연구되어 오던 CD4+CD25- "전문적" 억제자/조절성 T 세포의 독특한 집단과 동등한 조절성 T 세포를 나타내는 CD4+CD25- T 세포의 상당한 크기의 집단(∼ 6%)이 정상적인 인간 성인의 말초 혈액에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 상기 인간 CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 확인 및 특성확인에 의하여 다양한 질병 상태에서 CD4+CD25+ T 세포를 모니터링할 있도록 할 것이고, 자가면역성, 이식거부반응 및 암을 이해하고 치료하는데 중요한 의미를 가진다.
도면
도 1 (도 1-3): CD4+CD25+ T 세포는 CD4+CD25- T 세포와는 분명한 표현형적 차이를 보인다. CD4+ T 세포를 음성 MACS 소팅하여, 고도로 정제된 접촉되지 않은(untouched) CD4+ T 세포를 얻음으로써 PBMC로부터 분리하였다. 이들 세포를 항 CD25 자기 비드로 표지하고 소팅하였다.
(도 1a): 소팅 결과가 실제적으로 순수한 CD25+ T 세포가 얻어졌다. 20개의 독립적 표준화된 실험 중 대표적인 결과만을 나타내었다.
(도 1b): CD4+CD25+, CD4+CD25- 및 활성화된 CD4+CD25- T 세포의 표현형을 재료 및 방법(Materials & Methods)에 기재한 바와 같이 분석하였다. 또한, CD4+CD25- T 세포를 고정화된 항 CD3 + 용해성 항 CD28로 활성화시켰다. 활성화된 후 세포를 항 CD25 자기 비드로 표지하고 소팅하였다. 결과는 5개의 독립적 실험에서 비슷하였다.
(도 1c): CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포를 37℃에서 2시간 동안 항 CTLA-4 항체로 염색하였다. 염색은 엑스 비보에서 고정화된 항 CD3 + 용해성 항 CD28로 활성화한 후 여러 시점에서 행하였다. 4개의 독립적 실험 중 하나의 대표적 결과만을 나타내었다.
도 2 (도 4-7): CD4+CD25+ T 세포는 타생(allogeneic) 및 다클론 자극 모두에 대하여 비증식성/무력(anergic)하고, 이는 IL-2 및/또는 IL-15의 첨가에 의하여 부분적으로 반전되나, 중화 항 IL-10 항체에 의하여는 반전되지 않는다.
(도 2a) : 도 1과 같이 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포를 MACS 소팅에 의하여 성인 혈액으로부터 분리하였다. 1x 105 T 세포/96 웰을 여러 수치의 성숙한 타생(allogeneic) DC로 자극하였다. T 세포의 증식 (3배수 배양)을 [3H]Tdr 삽입에 의하여 결정하였다. 결과는 6개의 독립적 실험에서 비슷하였다.
(도 2b) : 전체(whole) CD4+, CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포를 도 2a에서 기재한 바와 같이 처리하였다. 3배수 배양의 증식을 [3H]Tdr 삽입에 의하여 결정하였다 (5개의 독립적 실험의 대표적 결과).
(도 2c) : MACS 소팅된 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포를 프라이밍(primed)하고 동일한 공여자(donor)로부터 유래한 성숙한 타생(allogeneic) DC로 매주 재자극하였다 (1:20의 DC:T 세포 비율). 증식(1 x105 T 세포/96 웰)은 [3H]Tdr 삽입에 의하여 결정하였다. 비슷한 결과가 3개의 독립적 실험에서 얻어졌다.
(도 2d) : 도 2a에 기재한 바와 같이 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포를 고정화된 항 CD3 (10㎍ml) 및 용해성 항 CD28 (10㎍ml) [위 패널] 또는 성숙한 타생(allogeneic) DC [아래 패널]로 자극하였다. 500 U/ml IL-2, 100 ng/ml IL-15, 10 U/ml IL-2 + 1 ng/ml IL-15의 혼합물 또는 10 ㎍/ml 항 IL-10이 배양 개시점에 첨가되었다. [3H]Tdr 삽입을 배양 5일 후에 측정하였다. 3개의 독립적 실험 중 하나만을 나타내었다. 다클론 또는 타생(allogeneic) T 세포 자극 없이 IL-2 및/또는 IL-15를 첨가하는 것은 CD25+ 또는 CD25- T 세포 서브세트의 증식을 유의하게 유도하지 않았다 (데이터 나타내지 않음).
도 3 (도 8-11): CD4+CD25+ T 세포가 TCR을 통하여 자극되면 세포 접촉- 및 용량-의존적 방식으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화를 억제한다.
(도 3a 및 3b) : MACS 소팅된 총 CD4+ (3a) 및 CD8+ (3b) T 세포 (105 T 세포/ 96 웰)을 지정된 비율로 CD4+CD25+ T 세포에 첨가하고, DC/CD4+ 또는 CD8+ T 세포 비율 1:20로 타생(allogeneic) DC로 자극하였다. 증식은 5일 후 [3H]Tdr 삽입에 의하여 결정하였다. 5개의 독립적 실험 중 하나만을 나타내었다.
(도 3c) : DC 및 CD4+CD25+ T 세포를 동일한 공여자(공여자 I)로부터 생성/분리하였다. 또한, 전체(whole) CD4+ T 세포 및 CD4+CD25+ T 세포를 다른 공여자(공여자 II)로부터 분리하였다. 105 전체(whole) CD4+ T 세포/96 웰을 5 x 103 DC/웰과 함께 배양하였다 (즉, DC:T 비율 = 1:20; 결과는 DC:T 비율 1:100에서의 결과와 비교할 만하다. 데이터는 나타내지 않음). 다음으로, 각각 공여자 I 및 공여자 II로부터 얻은 CD4+CD25+ T 세포를 첨가하였다. 증식은 배양 5일 후 [3H]Tdr 삽입에 의하여 결정하였다. 3개의 독립적 실험 중 대표적 결과를 3배수 배양의 평균 cpm으로 나타내었다.
(도 3d) : 전체(whole) CD4+ T 세포 또는 CD4+CD25+ T 세포(105 T 세포/ 96 웰)를 5 x103 타생(allogeneic) 성숙 DC (DC:T 비율 = 1: 20) (위 2 패널)로 자극하였다. 또한, 전체(whole) CD4+ T 세포를 비율 1: 1 (각각 105 T 세포/96 웰)로 CD4+CD25+ T 세포와 공동배양하고, 10 ㎍/ml 항 IL-10, 2㎍/ml TGF-베타, 500 U/ml IL-2, 50 ng/ml IL-15 또는 10 U/ml IL-2 및 1 ng/ml IL-15의 혼합물의 존재 또는 부존재하에서 DC:T 비율 1:20에서 타생(allogeneic) DC로 다시 자극하였다. 병렬적 트랜스웰(Transwell) 접근법에서 CD4+CD25+ T 세포를 트랜스웰(Transwell) 챔버에서 타생(allogeneic) DC (DC/ T 세포 비율 1:20)로 자극하고, 전체(whole) CD4+ T 세포 반응세포(responder)를 다시 DC:T 비율 1:20에서 타생(allogeneic) DC와 함께 상기 웰에 넣었다. 배양 5일 후 증식을 [3H]Tdr 삽입에 의하여 결정하였다. 4개의 대표적 실험 중 하나만을 나타내었다.
도 4 (도 12-14) : CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포의 여러 사이토카인 프로필.
(도 4a) : MACS 소팅된 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포를 PMA (20 ng/ml) 및 A23187 Ca2 + 이오노포어 (500 ㎍/ml)로 6시간 동안 자극하였다. 모넨신(monensin) (2μM)은 마지막 5시간 동안 첨가하였다. CD3 표면 발현의 염색을 행하였다. 세포를 FITC- 또는 PE-접합된 특이적 항체를 이용하여 세포내 사이토카인을 검출하기 위하여 세척하고, 고정하고, 투과성을 높이고(permeabilised) 염색하였다. 비슷한 결과의 5개의 독립적 실험 중 하나를 나타내었다. T 세포가 플레이트-결합 항-CD3 + 용해성 항-CD28 AB로 자극되었을 때 결과는 동일하였다 (데이터는 나타내지 않음).
(도 4b) : CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포를 프레이트-결합 항 CD3 + 용해성 항 CD28로 활성시켰다. 배양 48시간 후, RNA 발현 분석을 RNase 보호 분석(Protection assay)에 의하여 수행하였다.
(도 4c) : 상등액 중의 사이토카인을 ELISA로 측정하였다 (5개의 독립적 실험 중 하나만을 나타내었다).
도 1은 CD4+CD25- T 세포와 비교되었을 때 CD4+CD25+ T 세포가 분명한 표현형적 차이를 보인다는 것을 나타낸다.
도 2는 CD4+CD25+ T 세포가 타생(allogeneic) 및 다클론 자극 모두에 비증식성/무력(anergic)하고, 이는 IL-2 및/또는 IL-15의 첨가에 의하여 부분적으로 반전되나, 중화 및 항 IL-10 항체의 첨가에 의하여는 반전되지 않는다는 것을 나타낸다.
도 3은 CD4+CD25+ T 세포가, TCR을 통하여 자극되었을 때, 세포 접촉 및 용량-의존적 방식으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 4는 CD4+CD25+ T 세포와 CD4+CD25- T 세포의 사이토카인 프로필이 다르다는 것을 나타낸다.
도 5는 활성화되고 고정된(fixated) CD4+CD25+ 세포가 여전히 조절 능력을 을 보인다는 것을 나타낸다.
본 발명을 도면 및 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법(Material and Methods)
배양 배지 : 1% 열 불활성화된 자가(autologous) 혈장, 20㎍/ml 젠타미신 (Merck) 및 2 mM 글루타민 (Bio Whittaker)으로 보충된 RPMI 1640 (Bio Whittaker) 를 수지상 세포 (DC)를 생성시키기 위하여 사용하였고, 1% 열-불활성화된 단일 공여자 인간 혈청, 20㎍/ml 젠타미신 (Merck) 및 2 mM 글루타민 (Bio Whittaker)이 보충된 X-VIVO-20 (Bio Whittaker)를 T 세포 배양을 위하여 사용하였다.
사이토카인 : 본 연구에서 사용된 모든 사이토카인은 재조합 인간 단백질이었다. 최종 농도는: GM-CSF 1,000 U/ml (LeukomaxTM; Novartis), IL-4 800 U/ml (Sandoz), IL-2 (Proleukin; Chiron Corp.) 및 IL-15 (PeproTech)는 지정된 농도로 사용하였다; DC 성숙화를 위하여 IL-1β 2ng/ml (Sigma); IL-6 1,000 U/ml (Sandoz); TNF-α 10 ng/ml (Bender, Vienna), 및 PGE2 1㎍/ml (Sigma)로 이루어지는 칵테일을 사용하였다.
항체 : 면역염색을 위하여 PE- 및 FITC- 접합된 CD3, CD4, CD5, CD8, CD14, CD19, CD25, CD28, CD45 RA, CD45 RO, CD56, CD62L, CD80, CD83, CD86, CD95, CD95L, CD122, CD152, CD154, HLA-DR, 및 각각 생쥐 및 랫트 이소타입 대조군(control)에 대한 항체(Ab)(모두 BD Pharmingen으로부터 구입)를 이용하였다. 세포내 사이토카인 염색을 위하여 사용한 Ab는 FITC- 및 PE-접합된 항 IL-2 (MQ1-17H12), 항 IL-4 (8D4-8), 항 IL-10 (JES3-19Fl) 및 항 IFN-γ(4S.B3)이었고, 모두 BD Pharmingen으로부터 구입하였다. 접합되지 않은 항 IL-10 (JES3-19Fl) (Pharmingen) 및 항 TGF-β (R&D Systems)을 중화 실험을 위하여 사용하였고, 항 CD3 (UCHT1) 및 항 CD28 (CD28.2)을 T 세포의 다클론 활성화를 위하여 사용하였다.
사이토카인 분석 : T 세포를 타생(allogeneic) DC 또는 X-VIVO20 + 1% 혈청 중의 플레이트-결합 항 CD3 (10㎍/ml) + 용해성 항 CD28 (10㎍/ml)로 자극하였다. 사이토카인 분석은 인간 IL-2, IL-37℃, IL-10, IFN-γ 및 TGF-β(BD Pharmingen)에 대한 상업적으로 구입가능한 ELISA 키트로 여러 시점에서 상등액을 분석함으로써 수행하였다. 세포내 사이토카인 생산을 분석하기 위하여, T 세포를 PMA 20 ng/ml 및 Ca2 + 이오노포어 A23187 500 ㎍/ml (둘다 SIGMA로부터 구입)로 6시간 동안 또는 플레이트 결합 항-CD3 및 용해성 항-CD28 Ab로 6시간 동안 자극하였다. 모넨신, 2μM (SIGMA)을 배양 마지막 4시간 동안 첨가하였다. 세포를 수집하고, 세척하고, 고정하고 사포닌 투과성 있게 하고(Fix/perm 용액, BD Pharmingen), 사이토카인 특이적 Ab 또는 이소타입으로 염색하였다. 사이토카인 mRNA 분석을 위하여 T 세포를 플레이트 결합 항 CD3 및 용해성 항 CD28 Ab로 자극하였다. 세포를 RNase 보호 분석(protection assay) 주형 세트(BD Pharmingen)에 의하여 분석하였다.
세포 분리 및 DC 생성 : DC는 개시된 바와 같이(18, 19) 버피 코트(buffy coat) 또는 루카페레시스(leukapheresis) 산물(둘다 동의를 받을 후에 건강한 공여자로부터 수혈 의약품부(the Department of Transfusion medicine)으로부터 얻었다)로부터 생성되었다. 간략하게 설명하면, PBMC를 피콜 농도구배 원심분리에 의하여 분리하였다. 모노사이트를 플라스틱 부착에 의하여 분리하고, IL-4 및 GM-CSF로 보충된, RPMI 배지 중에서 배양하였다. 6일 후, 성숙화 칵테일(IL-1β, IL-6, PGE2 및 TNFα)을 첨가하였다. 7일째에 비부착 세포를 회수하고, 공동자극 분자(costimulatory molecule)(CD80, CD86) 및 CD83에 대하여 90 > 이중 양성인 성숙한 DC를 구성하였다.
CD4+ T 세포를 음성 CD4+ T 세포 분리 키트(Miltenyl Biotech)로 PBMC로부터 분리하였다. CD4+CD25+ T 세포를 CD25 마이크로비드(Microbead)(Miltenyl Biotech)를 사용하여 순수하고, 접촉되지 않은(untouched) CD4+ T 세포로부터 분리하였다. CD8+ T 세포의 분리는 음성 CD8+ T 세포 분리 키트(Miltenyl Biotech)를 사용하여 수행되었다. 순도는 FACS를 사용하여 검사하였다.
흐름 사이토메트릭 분석( Flow Cytometric Analysis ) : 면역형광 염색을 위하여 세포를 세척하고, 각 Ab의 최적 희석 배수로 4℃에서 20분 동안 염색하였다. 세포를 다시 세척하고 흐름 사이토메트리(FACS Scan TM 및 CELLQuestTM 소프트웨어; Becton Dickinson)에 의하여 분석하였다. 세포 표면 CD152 발현을 분석하기 위하여, 세포를 37℃에서 2시간 동안 적당한 항체로 염색하였다.
증식분석: 여러 CD4+ 서브타입의 증식을 검사하기 위하여 105 소팅된 T 세포를 96웰 플레이트 중에서 여러 갯수의 DC 또는 여러 농도의 플레이트 결합 항 CD3 + 용해성 항 CD28와 함께 X-VIVO-20 중에 배양하였다. 조절성 특성을 검사하기 위하여 105 벌크 CD4+ T 세포를 96-웰 플레이트에서 5 x103 (일부 실험에서는 또한 1 x103) DC와 함께 배양하였다. 정제된 CD4+CD25+ 또는 CD4+CD25- T 세포를 여러 농도로 첨가하였다. 배양 4 - 5 일 후 [3H]Tdr (37 KBq/웰)을 추가의 16시간 동안 첨가하였다. 액체 신틸레이션 계수기를 이용하여 증식을 측정하였다.
트랜스웰 ( Transwell ) 실험 : 트랜스웰(Transwell) 실험은 24-웰 플레이트에서 수행하였다. 106 벌크 CD4+ T 세포를 5 x103 DC로 자극하였다. 또한, 106 CD4+CD25+ 또는 CD4+CD25- T 세포를 상기 배양물에 직접적으로 첨가하거나 트랜스웰(Transwell) 챔버에 두었다(Millicell, 0.4㎛; Millipore). 공동배양(coculture) 5일 후, T 세포를 3배수(triplicate)의 96-웰 플레이트로 옮겼다 (105 세포/웰). 증식은 [3H]Tdr로 16시간 동안 펄스한 후 액체 신틸레이션 계수기를 이용하여 측정하였다.
실시예 1: CD4+CD25+ T 세포는 타생(allogeneic) 및 다클론 자극에 대하여 감소된 증식 반응을 보인다.
낮은 증식능은 생쥐 시스템에 있어서 잘 특성이 확인된 조절성 CD25+CD4+ T 세포의 큰 특징이다 (Sakaguchi S. 등, J. Immunol., 155:1151-1164 (1995)). 인간 CD4+ 서브집단의 증식능을 분석하기 위하여 CD4+ T 세포를 상기 세포가 CD25를 발현하는지에 대하여 자기적으로(magnetically) 소팅하였다. MACS CD4 음성 선별 키트(negative selection kit) 및 다음으로 CD25 양성 선발 키트를 사용하여 CD4+CD25+ T 세포의 95% 넘는 순수 집단을 얻었다 (도 1a). 이들 세포는 본 발명자들이 연구한 건강한 성인의 혈액 중의 말초 CD4+ T 세포의 약 6% (21.8 - 17.2%, n = 20)를 포함하였다.
성숙한 DC는 가장 강력한 항원제공세포로서 알려졌다 (Bancherau, J., Steinman, R. M., Nature, 392:245-252 (1998)). 그럼에도 불구하고, 상기 CD4+CD25+ T 세포는 인 비트로에서 완전히 성숙한 타생(allogeneic) DC로 자극되었을 때 실질적으로 증식성 반응을 보이지 않았다. 이는 CD4+CD25- T 세포 (도 2a, 2b) 또는 전체(whole) CD4+ 집단 (도 2b)과 확연히 대조적인 것이다. 흥미롭게도, CD25+ T 세포가 고갈된 상기 CD4+ 집단은 타생(allogeneic) DC로 자극되었을 때 상기 전체 CD4+ 집단에 비하여 높은 증식성을 보였다(도 2b).
다음으로, 상기 CD4+CD25+ T 세포가 성숙한 DC로 반복적으로 자극하였을 때만 아마도 증식하는 것은 아닌지를 결정하였다. 재자극 후, CD25- T 세포의 증식 반응은 다소 증가하였으나, CD25+ T 세포의 증식 반응은 아주 낮게 남아 있었다 (도 2c). 타생(allogeneic) 성숙한 DC로 프라이밍(priming)과 재자극을 하였을 때 2회의 재자극 후 CD25- 집단이 30 내지 50-배 확장하였다. 반면에 CD25+ 집단의 경우 유의한 증가는 없었다(데이터는 나타내지 않음). 유의한 아포토시스 또는 괴사의 외견상의 부재하에서 반복 자극된 후 초기 접종(inoculum)과 비교하였을 때 약간 (∼10%) 감소된 절대 수치의 CD4+CD25+ T 세포가 회수되었다(데이터는 나타내지 않음).
CD4+CD25+ T 세포의 극히 낮은 증식 반응은 또한 이들 세포 집단이 플레이트 결합 항 CD3 + 용해성 항 CD28로 다클론적으로 자극되었을 때에도 분명하다 (도 2d). T 세포 성장 인자 IL-2 및 IL-15가 증식능에 영향을 미치는지를 검사하기 위하여, 고정화된 항 CD3 + 용해성 항 CD28로(도 2d, 위 패널) 또는 성숙한 타생(allogeneic) DC로(도 2d, 아래 패널) 자극된 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포에 다양한 용량을 첨가하였다. 일련의 파일롯 실험 결과, IL-2는 고용량 (100-1000 U/ml)에서만 CD25+ T 세포의 증식을 증진시켰다. IL-15도 역시 고용량 50-100 ng/ml에서만 증식을 증진시키는 비슷한 효과가 있었다. 두 사이토카인을 혼합하였을 때, 강한 상승적 효과가 있었으며, 10 U/ml IL-2 플러스 lOng/ml IL-15의 용량으로도 CD4+CD25+ T 세포의 증식을 촉진하기에 충분하였다. 다클론 또는 타생(allogeneic) T 세포 자극의 부재하에서 IL-2 및/또는 IL-15의 첨가는 상기 CD25+ 또는 CD25- T 세포 서브세트의 유의한 증식을 유발하지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 2 : CD4+CD25+ T 세포는 CD4+CD25- T 세포와는 분명한 표현형적 차이를 보인다.
상기 CD25+CD4+ T 세포 집단의 특성을 더 확인하기 위하여, CD4+CD25+, CD4+CD25- 상의 다양한 표면 분자의 발현을 자극된 CD4+CD25- T 세포 상의 다양한 표면 분자의 발현과 비교하였다(도 1b). 세 집단 모두 균질한 CD3 및 CD4 발현을 보였다. 모노사이트, B 세포, CD8+ T 세포 또는 NK 세포와 같은 오염 세포는 FACS 분석에 의하여 관찰할 수 없었다 (데이터는 나타내지 않음). 사전 자극 없이, 즉 엑스 비보에서 상기 CD25+ 집단은 이미 고수준의 세포 내, 및 저수준의 세포 표면 CTLA-4 (CD152)를 발현하였다. 엑스 비보에서 분리된 CD4+CD25+ T 세포는 더욱이 CD122 (IL-2R 베타 체인), HLA-DR (∼ 50%)을 구성적으로 발현하였으며, 기억 T 세포 표현형을 닮은 CD45RO 세포로 주로(∼ 80%) 구성되어 있다. 확연한 대조로서, 상기 엑스 비보에서 분리된 CD4+CD25- T 세포는 CTLA-4 (세포내 및 세포 표면 모두 발현하지 않음), CD122, 또는 HLA-DR를 발현하지 않았으며, 더 많은 세포가 CD45RO 보다는 CD45RA를 발현하였다. 그러나, 플레이트 결합 항-CD3 + 용해성 항-CD28로 활성화되었을 때, 대부분의 CD4+CD25-는 강한 CD25+가 되었고 (CD25 발현 수준은 상기 CD4+CD25+ T 세포와 비교하였을 때 약 1 로그 높았다. 데이터는 나타내지 않음), 예측되는 바와 같이 고수준의 HLA-DR 및 CD122를 디스플레이하였다 (CD4+CD25+ T 세포와 비교하였을 때 역시 약 1로그 높았다). 또한, 세포 내 및 표면 CTLA-4는 24-48 시간 내에 상향 조절되었으나, 예상되는 바와 같이 그 후 재빨리 하향 조절되었다(도 1c). CD4+CD25+ T 세포가 자극되었을 때 CTLA-4/CD152 발현의 속도론(kinetics)는 현저히 다름이 밝혀졌다. 이들 세포도 또한 (비록 낮은 농도로 구성적으로 이미 존재하는) CD152 표면 발현을 상향 조절하나, 상기 CD152의 강한 발현은 1주 넘는 기간 동안 일정하게 유지되었다(도 1c). 항 CD28, CD62L, CD69, CD95, CD95L, CD154 (CD40L)과 같은 여러 다른 mAb으로 염색한 결과는 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포 사이에서 재현성 있고 유의한 차이를 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 3 : CD4+CD25+ T 세포는 TCR을 통하여 자극되었을 때 세포 접촉- 및 용량-의존적 방식으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 활성화를 억제한다.
CD25+ T 세포의 잠정적 조절성 특성을 분석하기 위하여 공동배양 실험을 수행하였다. 첫번째 일련의 시험을 위하여, 특정 공여자로부터 총 CD4+ 집단 및 CD25+ 및 CD25- 분획을 분리하였다. 다음으로, 전체(whole) CD4+ T 세포를 지정된 비율로 CD4+CD25+ 또는 CD4+CD25- T 세포 서브집단과 혼합하고, 타생(allogeneic) 성숙한 DC로 자극하였다(도 3a). CD4+CD25+ T 세포는 전체 CD4+ T 세포의 증식을 상당히 저해하였으며, 1:1 비율에서는 실제적으로 증식을 막았다(block)(이때 cpm은 CD25+ T 세포 증식의 배경 수준을 나타내었다, 도 2a-2d를 참조). CD25+ T 세포 대신에 CD25- T 세포를 첨가하였을 때는 증식을 약간 증진시켰다(데이터는 나타내지 않음). CD4+CD25- T 세포가 다클론 (도 1b 참조) 뿐만 아니라 타생(allogeneic) DC(데이터는 나타내지 않음)에 의하여 자극되었을 경우 CD25 및 CD122, 즉 IL-2R의 두 체인을 빠르게 발현하였다. 이 발견은 CD4+CD25+ T 세포 서브세트의 억제성 활성은 단순히 그들의 IL-2R을 통한 IL-2의 소비 또는 수동적 흡착 때문만은 아니었다라는 것을 나타낸다. CD4+CD25+ T 세포는 또한 비록 하향 조절은 덜 강하지만 전체 CD8+ T 세포에 대하여도 억제 활성을 보였다(도 3b).
추가의 실험 세트에서 자생(syngeneic) DC에 의한 CD4+CD25+ T 세포의 활성화가 상기 세포의 조절성 특성을 유도하기에 충분한지를 결정하였다. 이 목적을 위하여 성숙한 DC 및 CD4+CD25+ T 세포를 동일한 공여자(공여자 I)로부터 생성/분리하였다. 또한, 전체 CD4+ T 세포 뿐만 아니라 CD4+CD25+ T 세포 서브세트를 다른 공여자(공여자 II)로부터 분리하였다. 다음으로 공여자 I 또는 공여자 II로부터 분리된 다양한 수치의 CD4+CD25+ T 세포의 부존재(도 3c, CD4+ 만) 또는 존재하에서 상기 전체 CD4+ T 세포(공여자 II)를 타생(allogeneic) 성숙한 DC(공여자 I)로 자극하였다(도 3c). 타생(allogeneic), 공여자 I-유래 DC로 자극되었을 때, 공여자 II로부터 분리된 전체 CD4+ T 세포는 예상된 바와 같이, 격렬하게 증식하였다(도 3c, CD4+ 만). 공여자 I-유래 CD4+CD25+ T 세포(즉, 사용된 DC에 대하여 자생(syngeneic))의 존재하에서 전체 공여자 II-유래 CD4+ T 세포의 증식(즉, 알로반응성(alloreactivity))은 전혀 억제되지 않았다(도 3c). 그러나, 공여자 II-유래 CD4+CD25+ T 세포(즉, 사용된 DC에 대하여 타생(allogeneic))가 첨가되었을 때 강력한 억제가 일어났다(도 3c). DC, 전체 CD4+ T 세포 및 CD4+CD25+ T 세포가 다른 공여자로부터 유래한 실험에서 억제가 또한 관찰되었다. 이들 데이터는 CD4+CD25+ T 세포의 TCR-매개된 활성화가 상기 세포가 상기 세포의 조절성 기능을 발휘할 수 있도록 하기 위하여 필요하고, 자생(syngeneic) DC는 상기 세포의 억제 활성을 유도하는 데 불충분하다는 것을 나타낸다.
다음으로, CD4+CD25+ T 세포의 조절 기능이 용해성 인자에 의하여 주로 매개되는지 또는 세포-세포 접촉을 필요로 하는지를 조사하기 위하여 트랜스웰(Transwell) 챔버 실험을 수행하였다 (도 3d). 도 3d에 나타낸 바와 같이, CD4+CD25+ T 세포는 타생(allogeneic) DC의 존재하에서 전체 CD4+ T 세포의 증식을 거의 완전하게 억제하였다. 트랜스웰 챔버에서 두 집단을 분리하였을 경우 상기 세포의 억제 효과는 실제적으로 제거되었다. 트랜스웰 챔버의 반투막이 용해성 인자의 자유 통과는 허용하나, 직접적 세포 접촉은 배제시키기 때문에, 이들 관찰 결과는 직접적 세포 접촉이 CD4+CD25+ T 세포의 저해능에 필수적이라는 것을 암시한다. 상기 트랜스웰 실험 결과, CD4+CD25+ T 세포에 의한 IL-2의 소비는 억제와 관련된 기작이 아니라는 것도 확인되었다.
조절 세포와 반응 세포 사이의 밀접한 상호작용을 분명한 요건으로 함에도 불구하고, 항원제공 DC의 표적화(targeting) 또는 용해성 인자의 역할 중 어느 것도 트랜스웰 실험에 의하여 배제되지 않았다. 그러므로, 항원제공 세포 독립적 및 다클론 T 세포 자극으로서 플레이트-결합 항-CD3 Ab(용해성 항 CD28 Ab와 조합하여)를 또한 이용하였다. 전체 CD4+ T 세포만 이 자극에 대하여 강한 증식을 보였다. 상기한 바와 같이(도 2d), CD4+CD25+ T 세포는 증식하지 않았다. 두 집단의 공동배양에서, 대조군에 비하여 1:1 비율에서 적어도 75% 감소하였다(데이터 나타내지 않음). 이들 데이터는 조절이 APC 기능의 변조(modulation)을 통하여 주로 일어나는 것은 아니라는 것을 암시한다. 사이토카인 IL-10 및 TGF-β(각각 소위 Trl 및 Th3의 억제 활성에 핵심적임, (Groux, H. 등, Nature, 389:737-742 (1997); Fukaura, H. 등, J. Clin. Invest., 98:70-77 (1996))에 대한 중화 항체는 상기 CD4+CD25+ T 세포의 조절 활성을 제거하지 않았다. 이는 적어도 본 발명자들이 관찰한 분석에서는 이들 사이토카인이 중요한 억제 역할을 하지 않는다는 것을 설명하는 것이다. CD4+CD25+ T 세포의 증식을 촉진하는 IL-2 및/또는 IL-15를 공동배양액에 고용량으로 첨가함으로써(도 2d), 상기 세포의 저해 효과는 감소되었다. 그러나, 상기 데이터를 해석하는 경우, CD4+CD25+ T 세포의 유의한 증식이 고려되어야 하기 때문에 상기 억제 활성이 제거될 것 같지는 않다(도 3d).
실시예 4 : CD4+CD25+ T 세포는 주로 IL-10을 분비한다.
사이토카인 프로필을 분석하고 비교하기 위하여, 신선하게 소팅된 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포를 플레이트-결합 항 CD3 + 항 CD28로 활성화시켰다. 다음으로, 상등액을 ELISA에 의하여 분석하고, RNA 발현은 RNase 보호 분석에 의하여 연구하였다. 또한, 특정의 사이토카인을 방출하는 세포의 백분율을 결정하기 위하여 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, CD4+CD25- T 세포는 IL-10 및 IL-4는 거의 분비하지 않으면서, IFN-γ 및 IL-2를 주로 분비하여, Thl 유사 프로필을 닮았다. 반면, CD4+CD25+ T 세포는 IL-10을 주로 생산하고, IL-2, IL-4 및 IFN-γ를 저수준으로만 생산하여, Trl 세포를 닮았다. RNA 수준에서 두 집단을 비교한 결과, CD25+ T 세포는 CD25- T 세포에 비하여 IL-10 mRNA를 더 많이, IFN-γmRNA를 더 적게, IL-2 mRNA를 비슷한 수준으로 발현하는 것이 밝혀졌다. IL-1 수용체 길항제(antagonist) (IL-lRa) mRNA는 주로 CD4+CD25+ T 세포에서 발견되는 반면, 유의한 수준의 IL-1β mRNA는 CD4+CD25- T 세포에만 존재하였다. TGF-β는 두 세포 형태에 비슷하게 낮은 수준으로 발현되었다.
실시예 5 : 활성화된 다음 고정된 CD4+CD25+ T 세포는 여전히 조절능을 갖는다.
CD4+CD25- 및 CD4+CD25+ T 세포를 상기한 MACSR 소팅에 의하여 성인 혈액으로부터 유래한 전체 CD4+ T 세포로부터 분리하였다. CD4+CD25+ T 세포를 세부분으로 나누었다. 한 분획은 10㎍/ml 플레이트 결합 항-CD3 및 10㎍/ml 용해성 항-CD28 항체로 밤새 활성화시켰다. 다음 날 이 분획과 활성화되지 않은 CD4+CD25+ T 세포의 일 부분을 2% 포름알데히드로 1시간 동안 고정하였다. 세번째 부분은 처리하지 않고 두었다. 세포를 세번 세척하였다.
고정되지 않은 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포 단독 및 CD4+CD25+ T 세포 각 분획을, 1:1 비율로 CD4+CD25- T 세포와 혼합하고, 고정화된 항-CD3 및 용해성 항-CD28로 활성화하였다. 5 일 후, 증식을 [3H]Tdr 삽입에 의하여 측정하였다. 5개의 독립적 실험 중 대표적인 것만을 도 5에 나타내었다. 도 5에서 기호는 다음을 나타낸다:
CD4+CD25- 고정되지 않은 CD4+CD25- 세포
CD4+CD25+ 고정되지 않은 CD4+CD25+ 세포
Reg. 1:1 1:1 비율의 고정되지 않은 CD4+CD25+ 및 CD4+CD25- T 세포
Reg. 1:1
CD25+ stim fix 1:1 비율의 활성화되고 고정된 CD4+CD25+ T 세포 및 고정 되지 않은 CD4+CD25- T 세포
Reg. 1:1
CD25+ fix 1: 1 비율의 비활성화된 고정되지 않은 CD4+CD25+ T 세포 및 고정되지 않은 CD4+CD25- T 세포

Claims (32)

  1. 분리된, 천연적으로-존재하는 인간 CD4+CD25+CTLA-4+ 조절 T 세포로서, 상기 세포의 TCR을 통한 자극에 대하여는 비증식성이나 무력화 상태 (anergic state)가 IL-2 및 IL-15에 의하여 부분적으로 반전되고, 상기 세포는 상기 T 세포 상의 상기 CD4, CD25, 또는 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하여 인간 혈액으로부터 직접적으로 분리되며, 상기 T 세포 상의 상기 CD4, CD25 또는 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 특이적으로 결합하는 리간드는 항-CD4 항체, 항-CD25 항체 및 항-CTLA-4 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것인 T 세포.
  2. 제1항에 있어서, 단일클론항체 및 자기적 분리 또는 면역흡착법을 사용함으로써, 인간 말초혈액으로부터 분리될 수 있는 것인 T 세포.
  3. 제1항에 있어서, 조절 특성을 갖는 것인 T 세포.
  4. 엑스 비보(ex vivo)에서 CD4+CD25+CTLA-4+ 세포를 T 세포 자극제 또는 항원제공세포로 자극하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 CD4+CD25+CTLA-4+ 세포를 증식시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 T 세포 자극제는
    (a) 수퍼아고니스트(superagonistic) 항체를 포함한, 항-CD3 및 항-CD28 리간드 또는 단일클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질;
    (b) CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포의 표면 상의 T 세포 수용체 또는 T 세포 수용체 성분에 대한 리간드 또는 항체; 또는
    (c) 조절 T 세포의 표면에 발현된 상기 T 세포 수용체에 결합하는 MHC-펩티드 복합체; 또는
    (d) 포볼에스테르 및 칼슘 이오노포어를 포함하는 조성물인 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항원제공세포는 자가 세포, 비자가 세포, 및 인공 항원제공세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 T 세포 자극제 및 항원제공세포는 IL-2, IL-15, IL-7, IL-9, IFN-α 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질과 함께 사용되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 항원제공세포는 수지상 세포인 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 T 세포 자극제는 IL-2 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 T 세포 자극제는 IL-15이고 상기 IL-15는 50-100 ng/ml 용량으로 사용되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 T 세포 자극제는 IL-2와 IL-15인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 IL-2는 10U/ml 용량으로 사용되고 상기 IL-15는 10 ng/ml 용량으로 사용되는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 T 세포 자극제는 항-CD3 및 항-CD28 리간드 또는 단일클론 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것인 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 항원제공세포는 타생(allogenic) 수지상 세포인 것인 방법.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 얻어진 증식된 인간 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포.
  16. 제15항에 있어서, 파라포름알데히드에 의한 엑스 비보 처리로 얻어진, 고정된 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포인 것을 특징으로 하는 증식된 인간 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포.
  17. 제1항에 따른 인간 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 포함하는, 홍반성 루푸스(lupus erythematosus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 티레오이티디스(thyreoiditis), 백반증(vitiligo), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 건선(psoriasis vulgaris), 이식편대숙주병(graft versus host disease) 또는 이식거부 반응(graft rejection)을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  18. 제1항에 따른 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 사용하여, 조절 약물을 제조하는 방법.
  19. (a) CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포 상의 CD4, CD25, 및 CTLA-4(CD152)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 특이적으로 결합하는 제제를 이용하는 단계; 또는
    (b) 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 자극제 또는 항원제공세포를 이용하는 단계를 포함하는, 엑스 비보에서 인간 혈액 및 다른 조직으로부터 유래한 제1항에 따른 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 확인, 모니터링 또는 제거하는 방법.
  20. 제5항 또는 제6항에서 정의된 T 세포 자극제 또는 항원제공세포를 사용하여, 인 비보에서 조절 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 유도하는 제제 또는 환자의 자가면역 질환을 치료하는 제제를 제조하는 방법.
  21. 제1항에 따른 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 사용하여,
    (a) 다른 성장 인자 또는 기능적으로 변형시키는 아포토시스 또는 항-아포토시스 인자를 확인하는 엑스 비보 분석하거나;
    (b) CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포 상의 신규한 분자를 확인하는 것을 포함하는 상기 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포에 의하여 발현된 분자, 또는 약제학적으로 활성인 분자를 제공하는지를 엑스 비보로 확인하거나; 또는
    (c) 조절 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포의 전구 세포 또는 자손을 엑스 비보로 확인하는 방법.
  22. 제1항에 따른 부유(enriched) CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 사용하여, 입양면역 전달 치료(adoptive transfer therapy)를 위한 제제, 자가면역 질환을 치료하기 위한 제제, 또는 이식 반응을 예방하거나 또는 치료하기 위한 제제를 제조하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 입양면역 전달 치료를 위한 제제는 부유 또는 증식된 자가 또는 비자가 조절 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 환자에게 다시 주입하여 너무 강하고 또는 병원성인 면역 반응을 예방 또는 치료하거나, 또는 이식 반응을 예방 또는 치료하는데 적절한 것인 방법.
  24. (a) 제1항에 따른 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 인 비트로에서 항원을 제공하는 미성숙 또는 성숙 수지상 세포(dendritic cell, DC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원제공세포로 자극하는 단계; 또는
    (b) CD4+CD25+CTLA-4+ 조절 T 세포 상에 발현된 특정 T 세포 수용체에 대한 리간드 또는 항체, 또는 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포 상의 특정 T 세포 수용체에 결합하는 MHC-펩티드 복합체를 이용하는 단계를 포함하는, 엑스 비보에서 특정 항원-특이적 T 세포 수용체로 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포를 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항원제공세포는 조직 또는 임의의 정의된 또는 정의되지 않은 항원이 펄스된 것으로서,
    (a) 상기 정의된 항원은 자가항원(autoantigen) (심상성 천포창(pemphigus vulgaris)의 경우 데스모글라인 3, 백반증(vitiligo)의 경우 멜란 A 또는 타이로시나제; 티레오이디티스(thyreoiditis)의 경우 티레오글로불린(thyreoglobulin)을 포함), (C형 간염과 같은 병원체-유래 항원을 포함한) 외래 항원, 알로항원(alloantigen) 또는 이식 항원이고; 및
    (b) 상기 정의되지 않은 항원은 조직 또는 세포-유래 항원 또는 병원체-유래 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 특정 항원-특이적 T 세포 수용체를 가지고, 제24항 또는 제25항의 방법, 또는 엑스 비보에서 분리된 또는 증식된 T 세포 내로 항원 특이성을 갖는 T 세포 수용체의 트랜스펙션에 의하여 얻어지는 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포.
  27. 제26항의 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 심상성 천포창, 티레오이티디스, 백반증, 아토피성 피부염, 건선, 이식편대숙주병 또는 이식거부 반응을 치료하는데 적절한 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  28. T 세포 상의 CTLA-4(CD152)에 특이적으로 결합하고, 항-CTLA-A4 mAb, 및 CD4+CD25+ 세포 상의 T 세포 수용체에 결합하는 항체, MHC-펩티드 복합체 및 다른 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 사용하여, 인 비보에서 CD4+CD25+CTLA-4+ T 세포에 의한 조절을 약화시키는 것을 포함하는 면역 반응을 증진시키기 위하여 인 비보에서 CD4+CD25+ T 세포를 제거 또는 기능적으로 손상시키기 위한 약물을 제조하는 방법.
  29. 제19항에 있어서, 상기 방법은 상기 T 세포 상의 상기 CD4, CD25 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질에 특이적으로 결합하는 제제를 사용하는 단계를 포함하고, 상기 제제는 항-CD4 항체, 항-CD25 항체 및 항-CTLA-4 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제22항에 있어서, 상기 이식 반응은 이식편대숙주병 또는 이식거부반응인 것인 방법.
  31. 제23항에 있어서, 상기 이식 반응은 이식편대숙주병 또는 이식거부반응인 것인 방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 세포-유래 항원은 괴사 또는 아포토시스 세포 또는 조직 유래의 RNA의 형태인 항원을 포함하는 것인 방법.
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