JP2011519271A - エクスビボで制御性ｔ細胞の作成を加速するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、非制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物を制御組成物で処理して、制御性Ｔ細胞を作成することに関する。本発明は、ＦＯＸＰ３転写因子のメチル化を防止する物質、Ｔ細胞のサプレッサー細胞への分化を加速する物質およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤である物質を含む制御組成物を利用する方法を包含する。本発明はまた、非制御性Ｔ細胞を制御組成物と培養して作成した制御性Ｔ細胞の組成物、ならびに自己免疫疾患および異常な免疫応答の処置における前記制御性Ｔ細胞の使用を包含する。

Description

関連出願の相互参照
本願は２００８年４月１１日に出願した米国特許出願第61/044,306号の優先権の利益を主張し、その全体において、ここで参照により本明細書に組み込む。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
適用なし。

発明の背景
制御性Ｔ細胞（「サプレッサーＴ細胞」または「Ｔｒｅｇ」とも知られる）は、免疫系の活性化を抑制し、それによって免疫系ホメオスタシスおよび自己抗原に対する寛容性を維持するために作用するＴ細胞の特殊な集団である。制御性Ｔ細胞は天然に生じ得る（ここで「ｎＴｒｅｇ」とも称する）か、あるいはそれらは、末梢リンパ組織において誘導され得る（ここで「ｉＴｒｅｇ」とも称する）。誘導されたＴｒｅｇは、一般に、制御組成物の存在下でＣＤ２５前駆体の刺激を介して、インビボまたはエクスビボで作成できる。かかる制御組成物中にサイトカインＴＧＦ−βを含めることは、ｉＴｒｅｇの作成に有効であると示されている。

ＴｒｅｇはいくつかのＴ細胞集団を含み得るが、フォークヘッド（Forkhead）転写因子（「ＦＯＸＰ３」）を発現するものが免疫ホメオスタシスの維持のための病的自己反応性の防止に重要である。ｎＴｒｅｇおよびｉＴｒｅｇの表現型特性は極めて類似（多くの場合、同一である）するが、これらの２つの集団におけるＦＯＸＰ３遺伝子のメチル化状態が異なり得ることが示されている。マウスおよびヒト由来の細胞において実施された研究において、ＦＯＸＰ３遺伝子座の特定の領域が、ｎＲｅｇとｉＲｅｇ間で異なる遺伝子メチル化パターンを有することが示されている。一般に、ｎＴｒｅｇは脱メチル化されたＦＯＸＰ３遺伝子座の領域を有するが、ｉＴｒｅｇにおいて、これらの領域はしばしばメチル化されている。絶対ではないが一般に、遺伝子メチル化の程度と転写活性の間に相関がある。いくつかの研究において、ｉＴｒｅｇとｎＴｒｅｇ間に存在するサプレッサー活性における差は、少なくとも一部において、２つのタイプのＴｒｅｇにおけるＦＯＸＰ３遺伝子座のメチル化パターンの差のためであり得る。ＦＯＸＰ３のアセチル化状態は、その転写活性の重要な決定因子でもある。

エクスビボで作成されたＴｒｅｇは、抗原特異的細胞とポリクローナル細胞（ポリクローナルＴｒｅｇは広い特異性を有する）に分けることができる。抗原特異的およびポリクローナルｉＴｒｅｇはいずれも、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βをマウス細胞に適用してエクスビボで誘導できる。ＩＬ−２およびＴＧＦ−βを用いて作成したポリクローナルｉＴｒｅｇは、全身性エリテマトーデス、自己免疫性糖尿病、重症筋無力症およびアレルギー性脳脊髄炎のマウスモデルにおいて長期間にわたる有利な効果を有することが示されている（Horwitz et al., (2008), Trends Immunol., 29(9):429-35参照）。ヒト細胞において、同種抗原ｉＴｒｅｇはＩＬ−２でうまく作成されているが、ポリクローナルｉＴｒｅｇはエクスビボで作成することがより難しい。ある研究によると、ヒトＣＤ４＋細胞は、未処理のＣＤ４細胞にＩＬ−２およびＴＧＦ−βを適用してＦＯＸＰ３を安定に発現するように誘導できるが、これらの細胞は抑制活性を発生しないことをが示されている（Tran et al., (2007), Blood, 110(8):2983-90）。しかし、他の研究によれば、反復刺激の後、かかる細胞は天然ＦＯＸＰ３サプレッサー細胞と類似の特性を有するサプレッサー細胞となり得ることが示されている（Horwitz et al., (2008), Eur J Immunol, 38(4):912-5）。これらの細胞はまた、反復刺激後に膜結合ＴＧＦ−β（ｎＴｒｅｇサプレッサー細胞の別の表現型特性）を示す。したがって、ｎＴｒｅｇと類似の表現型特性を有するｉＴｒｅｇを作成することはできるが、ｉＴｒｅｇを作成する従来の方法は、ｎＴｒｅｇ表現型特性および機能を作成し、維持するために細胞の反復刺激を通常必要とする。特にヒト細胞における、反復刺激なしで安定なサプレッサー細胞集団を作成するためにＴＧＦ−βおよびＩＬ−２を用いる従来の方法のこの欠点は、少なくとも一部において、ＦＯＸＰ３をコードする遺伝子のメチル化およびアセチル化状態のためであり得る。

治療適用のためには、Ｔ細胞を繰り返し刺激して機能的サプレッサー細胞への終末分化を誘導せずに、短時間で治療的数のＴｒｅｇを作成するための方法および組成物を持つことが有利であろう。

発明の概要
したがって、本発明はｎＴｒｅｇと表現型および／または機能的に類似または区別できないｉＴｒｅｇを作成するための方法および組成物を提供する。

一つの局面において、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を作成する方法であって、非制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物を制御組成物で処理する工程を含む方法を提供する。この局面において、制御組成物は転写因子をコードする遺伝子のメチル化を防止する物質を含む。

一つの局面において、本発明は、患者における異常な免疫応答または自己免疫疾患を処置する方法であって、該患者に制御性Ｔ細胞を投与する段階を含む方法を提供する。この局面において、制御性Ｔ細胞は非制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物を制御組成物で処理することによって作成する。この制御組成物は、次のものを含んでいてよい：アザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡまたはアザシチジン、レチノイン酸およびトリコスタチンＡの２種以上の組合せ。

一つの局面において、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を作成する方法であって、Ｔ細胞のＴｒｅｇへの分化を加速する物質を含む制御組成物で非制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物を処理する工程を含む方法を提供する。

一つの局面において、本発明は、次のものを含むＴ細胞集団を含む組成物を提供する：細胞培養培地、アザシチジン、レチノイン酸および少なくとも１個の未処理ＣＤ４＋細胞。

一つの局面において、本発明は、次のものを含むキットを提供する：制御組成物、細胞処理容器および該キットの使用のための指示書。さらなる局面において、上記キットに含まれる制御組成物は、アザシチジン、レチノイン酸またはアザシチジンとレチノイン酸の組合せを含む。

ＴＧＦ−βの存在下または非存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激したＣＤ４＋細胞におけるＦＯＸＰ３（横軸）およびＣＤ２５（縦軸）発現を示す。 ＦＯＸＰ３発現に対するアザシチジン、ＴＧＦ−βおよびＡＬＫ５ｉの効果を示す。図２Ａは培地中（左パネル）、ＴＧＦ−βの存在下（中央パネル）およびアザシチジンの存在下（右パネル）で刺激した細胞におけるＦＯＸＰ３発現を示す。図２Ｂは培地、ＡＬＫ５ｉを含む培地および溶媒ＤＭＳＯ中で刺激した培養物についてのＦＯＸＰ３を発現する細胞の割合を示す。 ＦＯＸＰ３発現に対するアザシチジンとＴＧＦ−βの相加効果を示す。図３Ａは、培地のみ、ＴＧＦ−βを含む培地、アザシチジンを含む培地およびアザシチジンとＴＧＦ−βの両方を含む培地中で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズによって刺激した細胞における、ＦＯＸＰ３の発現を分析したフローサイトメトリー実験のデータを示す。図３Ｂはアザシチジン、ＴＧＦ−βおよびアザシチジンとＴＧＦ−βの存在下または非存在下で刺激した後のＦＯＸＰ３を発現する細胞の割合を示す少なくとも３回の別個の類似の実験の棒グラフである。 培地のみの中で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズで刺激した細胞およびアザシチジンを含む培地中で刺激した細胞の抑制活性を示す棒グラフである。 ＦＯＸＰ３発現に対するレチノイン酸の効果を示す。図５ＡはＩＬ−２またはＩＬ−２とＴＧＦ−β中で、異なる濃度の全トランスレチノイン酸中で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズで刺激した細胞の棒グラフである。図５Ｂは培地のみ、ＴＧＦ−βの存在下およびＴＧＦ−βとレチノイン酸の存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を用いて未処理ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を刺激した実験の細胞カウントを示す。 培地のみ、ＴＧＦ−βを含む培地、アザシチジンを含む培地、レチノイン酸の活性代謝産物を含む培地、全トランスレチノイン酸（0.05μm/ml）（ＡＴＲＡ）およびＴＧＦ−βとレチノイン酸、アザシチジンおよびＡＴＲＡの組合せを含む培地中で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズで刺激した細胞のフローサイトメトリーデータを示す。 培地のみ、ＴＧＦ−βを含む培地、レチノイン酸（ＲＡ）を含む培地、アザシチジンを含む培地、レチノイン酸とアザシチジンを含む培地ならびにレチノイン酸、アザシチジンおよびＴＧＦ−βを含む培地中で刺激した６日後の、ＣＤ４＋細胞の棒グラフを示す。ＣＤ１２７、ＦＯＸＰ３、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ１０３の発現に対するこれらの物質の効果を示す。 培地のみ（図８Ａ）、ＴＧＦ−βを含む培地（図８Ｂ）ならびにレチノイン酸、アザシチジンおよびＴＧＦ−βを含む培地（図８Ｃ）中で刺激した細胞における膜結合ＴＧＦ−βの発現を示す。図８Ｄはレチノイン酸、アザシチジンおよびＴＧＦ−βを含む培地中で刺激した細胞におけるコントロールＩｇＧ発現を示す。 ＩＬ−２とＴＧＦ−βを含む制御組成物で処理した細胞において見られる抑制活性の増加と、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βと全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を含む制御組成物で処理した細胞において見られる抑制活性のさらなる増加を示す棒グラフである。

発明の詳細な説明
本発明の実施は、異なることが示されていない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の常套の技術および説明を用いることができ、これらは当該分野の技術の範囲内である。かかる常套の技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーションおよびラベルを用いたハイブリダイゼーションの検出を含む。好適な技術の具体的な説明は、本明細書の下記実施例を参照して入手可能である。しかし当然、他の均等な常套の手法も使用してよい。かかる常套の技術および説明は、標準的な実験マニュアル、例えばGenome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, New York, Gait, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3^rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.および Berg et al. (2002) Biochemistry, 5^th Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.において見ることができ、これらは全て、あらゆる目的のために、それらの全体においてここに参照により本明細書に組み込む。

単数表現"a"、"an"および"the"は、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用するとき、文脈が明らかに異なることを示していない限り、複数の意味を含むことに注意されたい。したがって例えば、「ポリメラーゼ」との記載は、１つの物質またはかかる物質の混合物を意味し、「方法」との記載は、均等な段階および当業者に既知の複数の方法等への言及を含む。

異なることが定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は本発明が属する分野における通常の技術知識を有する者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の全ての文献は、文献に記載されており、ここに記載の発明と関連して使用することができる装置、組成物、製剤および方法論を説明し、開示する目的でここに引用により組み込まれる。

数値の範囲が示されている場合、特に指定されなければ下限の単位の小数第１位までの、その範囲の上限と下限の間の、かつその指定範囲における任意の他の指定されたまたは介在する数値である各介在値（intervening value）が、本発明の範囲に含まれるものと理解される。これらのより狭い範囲の上限および下限は、指定範囲における任意の特定除外限度を条件として、独立して、より狭い範囲に含まれてよく、これらも本発明の範囲に含まれる。指定範囲が一方または両方の限度を含む場合、それら包含される限度の一方または両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

以下の記載において、本発明の完全な理解を促すために多くの具体的な詳細が述べられている。本発明がこれら具体的な詳細の一部以上がなくとも実施され得ると当業者には理解される。加えて、本発明の趣旨をぼかさないために、当業者によく知られた特徴および手法は詳細には記載されていない。

本発明は具体的な態様についての記載によって一次的に説明されるが、本開示を読んだ当業者には他の態様が明らかとなると予測され、そしてかかる態様が本発明の方法に含まれると意図される。

Ｉ．概略
本発明は、制御組成物を用いて誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）を作成するための方法および組成物に関する。本発明の制御組成物は、本明細書において更に詳細に記載するとおり、多数の異なる成分を含んでいてよい。一般に、制御組成物は、転写因子のメチル化またはアセチル化に作用する物質、Ｔ細胞のサプレッサー細胞への分化に作用する物質、またはかかる物質と他の成分、例えばサイトカインＴＧＦ−βおよびＩＬ−２のようなサイトカイン類の組合せを含む。

サイトカインＴＧＦ−βおよびＩＬ−２はマウス細胞においてｉＴｒｅｇを作成するために十分であると知られているが、ヒト細胞において、これらのサイトカイン類のみを用いると、安定なポリクローナルｉＴｒｅｇ集団の作成には不十分であり得る（ＩＬ−２およびＴＧＦ−βをヒト細胞において用いると抗原特異的ｉＴｒｅｇが作成され得る）。理論に縛られないが、一つの可能性は、これらのサイトカイン類がヒトＣＤ４＋細胞のＦＯＸＰ３発現およびアセチル化を誘導するが、機能的サプレッサー細胞への完全な変異にはメチル化およびアセチル化状態のさらなる修飾が必要とされ得る。したがって、本発明は、ＦＯＸＰ３、特にＦＯＸＰ３遺伝子プロモーターのアセチル化およびメチル化状態に作用し得る制御組成物を含む。一つの態様において、本発明は、ＦＯＸＰ３遺伝子プロモーターのアセチル化を促進する物質（例えばレチノイン酸）および／またはＦＯＸＰ３脱アセチル化に作用する物質（例えばトリコスタチンＡ）を含む。本明細書に記載のとおり、レチノイン酸もサプレッサー細胞へのＴ細胞変異を加速する。

ある状況において、ｉＴｒｅｇの作成に使用される制御組成物は、転写因子ＦＯＸＰ３のメチル化に作用する物質を含む。かかる物質は、アザシチジンのようなメチルトランスフェラーゼ阻害剤であってよい。ある状況において、本発明の制御組成物は、Ｔ細胞分化を加速する物質を含んでいてもよい。かかる物質は、レチノイン酸であり得る。レチノイン酸はＦＯＸＰ３遺伝子プロモーターのアセチル化を誘導し得る（Kang et al., (2007) J. Immunol. 179:3724-33）。本発明の制御組成物はまた、転写因子のメチル化に作用する物質およびＴ細胞分化を加速する物質を含んでいてもよく、すなわち本発明の制御組成物はアザシチジンとレチノイン酸を含んでいてよい。ヒストンアセチル化を促進する他の物質（例えばトリコスタチンＡ、Tao et al., (2007) Nat Med 13:1299-1307参照）も本発明の制御組成物に含まれていてもよい。本発明の制御組成物は、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２のようなサイトカイン類を含んでいてもよい。理論に縛られないが、かかる制御組成物に含まれるいずれかのアセチル化剤および脱メチル化剤がＴ細胞の分化および変異を加速し、誘導してＴｒｅｇとなり得る。

一般に、ｉＴｒｅｇは本発明に従って、制御組成物で非制御性Ｔ細胞を処理して作成される。非制御性Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含んでいてもよい。「処理」は、通常は、制御組成物を非制御性Ｔ細胞を含む培養物に適用して、非制御性Ｔ細胞と制御組成物を接触させることを意味する。理解されるとおり、細胞培養物は非制御性Ｔ細胞の培養物に関して本明細書において説明されるが、かかる細胞培養物は他のタイプの細胞を含んでいてもよい。ある状況において、制御組成物は細胞培養の開始時に細胞と接触させ、ある状況において、制御組成物は細胞培養の開始後少なくとも１回、細胞と接触させる。ある状況において、制御組成物は細胞培養の開始時に細胞と接触させ、次いで細胞培養の開始後少なくとも１回、再び接触させる。

本発明に従って作成した制御性Ｔ細胞は、異常または望ましくない免疫応答および自己免疫疾患を処置するために使用できる。一般に、かかる制御性Ｔ細胞は当該技術分野で既知の方法を用いて患者に導入する。

本発明はまた、本明細書に記載の方法に従って作成したｉＴｒｅｇの集団を含む。本発明はまた、アザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２およびそれらのいずれかの組合せを含んでいてよい。これらの制御組成物は、ある状況において、細胞培養培地と組み合わせることができる。ある状況において、本発明はまた、Ｔ細胞と組み合わせた制御組成物を含む。

本発明はキットも含む。かかるキットは、ｉＴｒｅｇを作成するための本明細書に記載の制御組成物を含む、少なくとも１個の物質を含み得る。本発明のキットはまた、本発明のｉＴｒｅｇを作成するための容器を含んでいてもよい。かかる容器は、該容器内で細胞に物質を送達できる複数のポートを含んでいてもよい。本発明はまた、ｉＴｒｅｇをパッケージし、患者に送達するためのキットを含む。本発明のキットはさらに、患者から細胞を単離するための容器を含んでいてもよい。ある状況において、本発明のキットは、本発明の複数の局面に使用できる容器を含んでいてもよい。例えばかかる容器は、患者からの細胞の単離、制御組成物による単離した細胞の処理によるｉＴｒｅｇの作成、そして／または新たに作成されたｉＴｒｅｇの患者への投与に適合し得る。

ＩＩ．天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）および誘導Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）の表現型特性
一つの局面において、本発明は、ｎＴｒｅｇの表現型特性を有するｉＴｒｅｇを作成するための方法および組成物を提供する。「表現型」または「表現型特性」は、本明細書において使用するとき、観察可能な特徴を意味する。制御性Ｔ細胞についてのかかる表現型特性は、特定のタンパク質（例えばサイトカイン類および転写因子）、増殖およびサプレッサー活性を含み得るが、これらに限定されない。例えば、ｎＴｒｅｇは転写因子ＦＯＸＰ３を発現することが知られており、またトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）のようなサイトカイン類を発現し得る。ｎＴｒｅｇは低レベルのインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン（ＩＬ−１０）のような他のサイトカイン類のみを発現する傾向がある。サプレッサー活性を示す細胞は、それらの膜上でサイトカインＴＧＦ−βを発現することも示されている。「サプレッサー活性」を有するＴｒｅｇは、他のＴ細胞の増殖および免疫応答を抑制する能力を有する細胞である。

ｎＴｒｅｇの一次的表現型特性はサプレッサー活性であり、同様のサプレッサー活性を有するｉＴｒｅｇの作成は本発明の一つの局面である。サプレッサー活性は、Ｔ細胞増殖の阻害のようなＴ細胞細胞傷害活性についての標準的なアッセイならびに例えば米国特許6,759,035（その全体において、ここにあらゆる目的のために、特にサプレッサー細胞活性のアッセイに関する全ての教示について、参照により本明細書に組み込む。）に記載のアッセイを含む、多くの方法において測定できる。他の表現型特性を検出および測定して、ｉＴｒｅｇがサプレッサー細胞であり、そしてｎＴｒｅｇの表現型特性を有するかを決定することもできる。

ｎＴｒｅｇの一つの表現型特性は、転写因子ＦＯＸＰ３の発現である。ＦＯＸＰ３はｎＴｒｅｇの最上調節因子であり、それらの発生および機能に必要であることが示されている。ＦＯＸＰ３遺伝子の遺伝的欠損を有するマウスおよびヒトは自己免疫疾患性症状を発症する。研究により、サイトカイン類ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの存在下で、マウス非制御性Ｔ細胞の刺激し、ＦＯＸＰ３の発現およびサプレッサー活性の発生をもたらすことが知られている。ＦＯＸＰ３発現はサプレッサー活性の絶対的な指標ではないが、ｉＴｒｅｇをｎＴｒｅｇのものと類似のサプレッサー細胞と同定するために使用できる一つの表現型特性である。

ｎＴｒｅｇの別の表現型特性は、膜結合性ＴＧＦ−βの発現である。したがって、ｉＴｒｅｇにおける膜結合性ＴＧＦ−βの検出は、かかるｉＴｒｅｇがサプレッサー細胞であることの指標である。膜結合性ＴＧＦ−βの検出方法は、例えば２００８年８月１９日に出願された米国特許出願12/194,101（その全体において、ここにあらゆる目的のために、特に膜結合性ＴＧＦ−βのアッセイに関する全ての教示について、参照により本明細書に組み込む。）に記載されている。

ｎＴｒｅｇのさらなる表現型特性は低い増殖応答性であり、これはしばしば、ＩＬ−２のようなある種のプロ増殖サイトカイン類の低い産生を伴う。ＩＬ−４、ＩＦＮγおよびＴＦＮ−αのような他のサイトカイン類も増殖と関連しているが、それらは一般に、増殖細胞においてさえ低いレベルで産生される。増殖応答は、当該技術分野において既知の方法、例えばチミジン取り込みアッセイおよびカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）希釈のアッセイを用いて測定できる。

ＩＩＩ．誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）の作成
制御性Ｔ細胞の形成を誘導するための多数の方法が存在しており、例えば米国特許6,228,359; 6,358,506; 6,797,267; 6,803,036; 7,381,563および6,447,765、ならびに米国特許出願10/772,768; 11/929,254; 11/400,950;および11/394,761に記載されている（それらの全てを、それらの全体について、ここにあらゆる目的のために、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の作成に関する全ての教示について、参照により本明細書に組み込む。）。かかる常套の方法はマウスにおいてｉＴｒｅｇをかなり速やかに作成できるが、ヒト細胞におけるこれらの多くの方法の欠点は、持続するサプレッサー活性を有するヒトｉＴｒｅｇを作成するためにＴｒｅｇ前駆体の培養物を繰り返し刺激しなければならない時間がそれらにおいて延長されることである。本発明は、ｉＴｒｅｇを作成する過程における再刺激が最小乃至必要でない、速やかに前駆細胞を作成できる方法および組成物を提供する。一般に本明細書において使用するとき、異なることが示されていない限り、非制御性Ｔ細胞を「刺激する」とは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を含むがこれらに限定されない１種以上のＴ細胞アクチベーターと細胞を接触させることを意味する。かかる刺激は制御組成物の存在下であってよく、あるいはかかる刺激は制御組成物による非制御性Ｔ細胞の接触の前またはその後に生じてもよい。

制御組成物
本発明は、ｎＴｒｅｇと類似の表現型特徴を示すｉＴｒｅｇの作成において使用するための制御組成物を提供する。本明細書において「制御組成物」は、非制御性Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への変換を生じ得る組成物を意味する。以下に更に詳細に記載するとおり、制御組成物は、ｎＴｒｅｇの表現型特性と類似または同一のものを有するＴｒｅｇを誘導するために使用できる。一般に、本発明の制御組成物は非制御性Ｔ細胞の培養物に加える。かかる制御組成物は、非制御性Ｔ細胞を刺激してサプレッサー細胞へと分化させる物質ならびにｎＴｒｅｇ表現型特性の分化および形成を促進する物質を含んでいてよい。本明細書に記載の制御組成物のいずれかの成分は、「添加物」とも称する。

一般に、本発明の制御組成物は、ＦＯＸＰ３についての遺伝子および／またはＴＧＦ−βについての遺伝子のメチル化に作用する物質を含む。遺伝子メチル化に対する効果は、該遺伝子に対する該物質の直接的作用によるか、あるいは１つ以上の仲介物質に対する該物質の間接的な作用により得る。さらなる態様において、該物質は、ＦＯＸＰ３遺伝子および／またはＴＧＦ−βについての遺伝子のメチル化を防止する。一つの局面において、ＦＯＸＰ３遺伝子のメチル化を防止するために使用される物質は、メチルトランスフェラーゼ阻害剤である。かかるメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、例えばアザシチジン（「ａｚａＣ」、２’−デオキシ−５−アザシチジン；５−アザ−２’−デオキシシチジンとも知られる）および１−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノンを含み得るが、これらに限定されない。

ある局面において、本発明の制御組成物は、Ｔ細胞のサプレッサー細胞への分化を加速する物質を含む。かかる物質は、レチノイン酸（特にレチノイン酸の活性代謝産物）およびトリコスタチンＡのようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含み得るが、これらに限定されない。かかる物質は、本発明の制御組成物中で、サイトカイン類および／または所望によりＴ細胞アクチベーターのような他の添加物と共に使用してもよい。レチノイン酸およびトリコスタチンＡのような物質は、アザシチジンのような転写因子のメチル化に作用する物質と組み合わせて使用してもよい。

アザシチジンのような物質に加えて、本発明の制御組成物はさらに、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＴＮＦαのようなサイトカイン類をそれぞれまたはいずれかの組合せで、含んでいてもよい。

「トランスフォーミング増殖因子−β」または「ＴＧＦ−β」は、本明細書において、３つのアイソフォームＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３を含むＴＧＦ−β類のファミリーのいずれか１つを意味する（Massague, J. (1980), J. Ann. Rev. Cell Biol 6:597参照）。リンパ球および単球は、このサイトカインのβ１アイソフォームを産生する（Kehrl, J.H. et al. (1991), Int J Cell Cloning 9: 438-450）。ＴＦＧ−βは処置する哺乳類細胞に対して活性であるＴＧＦ−βのいずれかの形態であってよい。ヒトにおいて、組換えＴＦＧ−βが現在では好まれる。一般に、本発明の制御組成物中で使用されるＴＧＦ−βの濃度は、細胞懸濁液の約2 pg/ml〜約50 ng/mlの範囲であり得る。さらなる態様において、本発明の制御組成物において使用されるＴＧＦ−βの濃度は、約5 pg/ml〜約40 ng/ml、約10 pg/ml〜約30 ng/ml、約20 pg/ml〜約20 ng/ml、約30 pg/ml〜約10 ng/ml、約50 pg/ml〜約1 ng/ml、約60 pg/ml〜約500 pg/ml、約70 pg/ml〜約300 pg/ml、約80 pg/ml〜約200 pg/mlおよび約90 pg/ml〜約100 pg/mlの範囲である。さらなる態様において、使用されるＴＧＦ−βの濃度は、細胞集団中で作成されるＦＯＸＰ３＋細胞の割合およびＦＯＸＰ３発現の安定性のような評価項目に基づいて決定される。

ＩＬ−２は、処置する哺乳類細胞に対して活性であるＩＬ−２のいずれかの形態であってよい。ヒト細胞について、組換えＩＬ−２が一般に使用される。組換えヒトＩＬ−２はR & D Systems（Minneapolis、MN）から購入可能である。一般に、使用されるＩＬ−２の濃度は、細胞懸濁液の約1 Unit/ml〜約200 U/mlの範囲である。さらなる態様において、ＩＬ−２の濃度は約1 U/ml〜約175 U/ml、約2 U/ml〜約150 U/ml、約3 U/ml〜約125 U/ml、約4 U/ml〜約100 U/ml、約5 U/ml〜約80 U/ml、約10 U/ml〜約70 U/ml、約15 U/ml〜約60 U/ml、約20 U/ml〜約40 U/mlおよび約25 U/ml〜約30 U/mlの範囲である。

本発明の制御組成物はまた、抗ＣＤ２抗体およびＣＤ２リガンドを含む抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＬＦＡ−３、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）およびブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）のようなＴ細胞アクチベーターを含んでいてもよい。ある態様において、Ｔ細胞アクチベーターは約0.1〜約5.0 μg/mlの濃度で使用される。さらなる態様において、Ｔ細胞アクチベーターの濃度は、約0.2〜約4.0、約0.3〜約3.0、約0.4〜約2.0および約0.5〜約1.0 μg/mlの範囲である。多くの態様において、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８は単独で、あるいはＴＧＦ−βと組み合わせて使用される。さらなる態様において、アザシチジンおよびレチノイン酸ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８のようなＴ細胞アクチベーターのような物質との組合せにおいて、１種以上の他のサイトカイン類が使用される。

ある態様において、本発明の制御組成物は、上記物質のうち１個の要素のみを含む。例えば、制御組成物はＴＧＦ−βのみ、レチノイン酸のみ、アザシチジンのみ、トリコスタチンＡのみ、あるいはＴ細胞アクチベーターのみを含んでいてよい。

さらなる態様において、本発明の制御組成物は、上記物質の１種以上を含む。理解されるように、上記物質のいずれかの組合せが本発明の制御組成物に含まれていてよい。

例示的な態様において、本発明の制御組成物はアザシチジン、レチノイン酸またはアザシチジンとレチノイン酸の組合せを含む。さらなる態様において、かかる制御組成物は、１種以上のサイトカイン類を含んでいてもよい。例えば、かかる制御組成物はさらに、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２またはＴＧＦ−βとＩＬ−２の両方を含んでいてよい。さらなる態様において、かかる制御組成物はまた、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８のような１種以上のＴ細胞アクチベーターを含んでいてもよい。

例示的な態様において、本発明の制御組成物はアザシチジン、トリコスタチンＡまたはアザシチジンとトリコスタチンＡの組合せを含む。さらなる態様において、かかる制御組成物は、１種以上のサイトカイン類を含んでいてもよい。例えば、かかる制御組成物はさらに、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２またはＴＧＦ−βとＩＬ−２の両方を含んでいてよい。さらなる態様において、かかる制御組成物はまた、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８のような１種以上のＴ細胞アクチベーターを含んでいてもよい。

例示的な態様において、制御組成物はアザシチジンとＴＧＦ−βを含む。さらなる態様において、制御組成物はまた、アザシチジン、レチノイン酸およびＴＧＦ−βを含む。さらなる態様において、かかる制御組成物はＩＬ−２も含む。さらなる態様において、かかる制御組成物は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８のような少なくとも１種のＴ細胞アクチベーターも含む。一つの態様において、本発明の制御組成物は、アザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡおよびＩＬ−２を含む。

例示的な態様において、本発明の制御組成物はアザシチジンとレチノイン酸を含む。さらなる態様において、制御組成物は抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８のようなＴ細胞アクチベーターも含む。ある態様において、Ｔ細胞アクチベーターはビーズ上の制御組成物中で提供されるが、アザシチジンおよびレチノイン酸は溶液中に存在する。さらなる態様において、制御組成物はＴＧＦ−βも含む。

例示的な態様において、本発明の制御組成物はアザシチジン、レチノイン酸、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βを含む。さらなる態様において、制御組成物のこれらの要素は細胞培養培地中に含まれる。

例示的な態様において、本発明の制御組成物はアザシチジン、トリコスタチンＡ、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βを含む。さらなる態様において、制御組成物のこれらの要素は細胞培養培地中に含まれる。

例示的な態様において、制御組成物はＩＬ−２とＴＧＦ−βを含む。さらなる態様において、かかる制御組成物はまた、Ｔ細胞のサプレッサーＴ細胞への分化を加速する物質を含み、かかる物質は例えばレチノイン酸を含み得る。さらなる態様において、かかる制御組成物はまた、脱メチル化を促進する物質、例えばアザシチジンを含む。さらなる態様において、かかる制御組成物はまた、ヒストンアセチル化を促進する物質、例えばトリコスタチンＡおよび／またはレチノイン酸を含む。

例示的な態様において、本発明の制御組成物に含まれる物質は、相加乃至相乗効果を有する。例えば、制御組成物におけるトリコスタチンＡとレチノイン酸の使用は、いずれかの物質を単独で使用することによって見られるものよりも多数の作成されたｉＴｒｅｇがもたらされるという、相加乃至相乗効果を有し得る。かかる相乗／相加効果は、一部において、一体となってｉＴｒｅｇの数を増加させるヒストンアセチル化に対する作用のメカニズムがこれらの物質で異なるためであり得る。さらなる例示的な態様において、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、アザシチジン、レチノイン酸およびトリコスタチンＡを含む本明細書に記載の物質のいずれかの組合せは、ｉＴｒｅｇの作成において相乗乃至相加効果を有し得る。

非制御性Ｔ細胞培養物の処理
一つの局面において、本発明は、約７〜約１０日以内に治療数のｉＴｒｅｇを作成する方法を提供する。このｉＴｒｅｇを作成するための比較的短い時間は、天然に生じるＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）を拡大するために使用される当該技術分野における方法よりも利点を提供する。ｎＴｒｅｇの拡大は、一般に、単離したｎＴｒｅｇ集団を治療数に拡大するために少なくとも３週間を必要とする。この時間は一部では、一般に小集団のｎＴｒｅｇのみが単離可能であるために必要であり、そして該集団のそれぞれの細胞は治療数の細胞を作成するために多数の細胞分裂を行わなければならない。そのような多数の細胞分裂は、得られた細胞集団全体のサプレッサー活性および他の表現型特性に影響し得る。またそのような多数の分裂は、患者に移植（例えば望ましくないもしくは異常な免疫応答または自己免疫疾患の処置のために）後のこれらの細胞の増殖能を変化させ、そしてそれらのインビボでの生存を減少させ得る。本発明に従うｉＴｒｅｇの作成に使用する細胞集団はｎＴｒｅｇの単離から得ることができるものよりも一般に大きいため、より小さな細胞集団を拡大するときに必要とされるものと同じ程度の回数の各細胞の分裂を必要とせずに、治療数の細胞を作成できる。

一つの局面において、本発明は、制御組成物で非制御性Ｔ細胞を処理して、制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を誘導する方法を提供する。本明細書において使用するとき、非制御性Ｔ細胞は、制御活性を有するように誘導可能なＴ細胞を含む。かかる細胞は、一次的に未処理なＣＤ−４＋、ＣＤ−８＋細胞を含み得る末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含んでいてもよい。

本発明の方法および組成物を用いて作成したｉＴｒｅｇは、一般に、天然に生じるＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）と類似または同一のサプレッサー活性および表現型特性を有する。本明細書において「処理」とは、細胞を制御組成物と接触させることを意味する。例示的な態様において、細胞の処理は、ｎＴｒｅｇの表現型特性および機能を発生するのに十分な期間、制御組成物と共に（例えば、制御組成物を細胞培養培地に添加することによる）細胞をインキュベートすることを含む。インキュベーションは一般に、生理的温度下で行う。

一般に、本発明の方法および組成物を用いて作成されるｉＴｒｅｇは、１種以上のＴ細胞アクチベーターによるＴ細胞受容体刺激を含む。かかるＴ細胞アクチベーターは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２およびそれらの組み合わせを含んでいてよい。かかるＴ細胞アクチベーターは制御組成物中に含まれていてもよく、あるいはそれらは、本発明の制御組成物と別個に、その前に、またはそれと同時に、非制御性Ｔ細胞に適用してもよい。ある態様において、非制御性Ｔ細胞は「初回刺激を受け」ていてよく、すなわちＴ細胞アクチベーターによる刺激の前に制御組成物の１種以上の成分と接触されてよい。

一つの局面において、本明細書に記載のいずれかの制御組成物による非制御性Ｔ細胞の培養物の処理は、当該技術分野において既知の他の方法を用いて可能であるよりもかなり短い時間でｉＴｒｅｇを作成する。一つの局面において、本発明の方法および組成物は、１週間以内に非制御性Ｔ細胞からｉＴｒｅｇを作成する。さらなる局面において、本発明の方法および組成物は、約５日〜約１５日、約６日〜約１２日、および約７日〜約１０日の期間にわたって、非制御性Ｔ細胞からｉＴｒｅｇを作成する。さらなる局面において、ｉＴｒｅｇの作成は抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８のようなＴ細胞アクチベーターによる反復刺激を必要としない。理解されるとおり、反復刺激を用いてもよく、本発明に含まれるが、本明細書に記載の制御組成物について常に必要なわけではない。

本発明のある局面は当該技術分野において既知である常套の方法を用いて可能であるよりも短い時間でｉＴｒｅｇを作成することであるが、本発明は、より長い時間にわたってｉＴｒｅｇを作成する方法も含む。例示的な局面において、本発明の方法および組成物は、約３日〜約４週間にわたって非制御性Ｔ細胞からｉＴｒｅｇを作成する。さらなる局面において、本発明の方法および組成物は、約５日〜約３週間、約７日〜約１５日、および約１０日〜約１２日の期間にわたって、非制御性Ｔ細胞からｉＴｒｅｇを作成する。理解されるとおり、広範な培養時間および条件が本発明に含まれる。細胞培養物は、本明細書に記載の制御組成物の添加の前または後に、約２日〜約３ヶ月、約３日〜約２ヶ月、約４日〜約１ヶ月、約５日〜約２０日、約６日〜約１５日、約７日〜約１０日、および約８日〜約９日間、本発明の目的のために維持できる。

本発明の一つの態様において、本発明の制御組成物は、細胞培養の開始時に非制御性Ｔ細胞と接触させる。他の態様において、制御組成物は、培養の開始後のより遅い時点で細胞と接触させる。さらなる態様において、制御組成物は培養の開始時およびより遅い時点で細胞と接触させる。制御組成物の最初のまたは続く接触に関するより遅い時点は、培養開始後0.5時間〜５日の範囲であり得る。他の態様において、制御組成物の最初のまたは続く接触に関するより遅い時点は、培養開始後約１時間〜約３日、約２時間〜約２日、約３時間〜約３６時間、約４時間〜約２４時間、約５時間〜約２０時間、約６時間〜約１５時間、および約７時間〜約１０時間の範囲であり得る。本明細書に記載のとおり、かかる制御組成物は、アザシチジンを単独で、または１種以上のサイトカイン類（ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２を含むがこれらに限定されない）ならびにレチノイン酸および／またはトリコスタチンＡのような物質と共に含んでいてよい。

一つの局面において、アザシチジンの適用によってアップレギュレートされる内因性ＴＧＦ−βが、Ｔｒｅｇを作成するために使用される。別の局面において、アザシチジンと共に外因性ＴＧＦ−βを培養物に加えてＦＯＸＰ３発現を誘導する。一つの態様において、ＴＧＦ−βとアザシチジンを培養物に同時に加える。他の態様において、ＴＧＦ−βとアザシチジンは培養物に逐次的に加える。ここでＴＧＦ−βとアザシチジンのいずれが最初に加えられてもよい。さらに別の態様において、ＴＧＦ−βとアザシチジンは異なる時点で培地に加えられる。さらに別の態様において、ＴＧＦ−βとアザシチジンは、それらが同時、逐次的または別の時点で加えられるにせよ、細胞培養物の寿命の間の２回以上の時点で該培養物に適用される。さらなる態様において、レチノイン酸のようなＴ細胞の分化に作用する物質は、アザシチジンおよびＴＧＦ−βを含むがこれらに限定されない本明細書に記載の他の物質と同時にまたは逐次的に加えてもよい。

さらなる態様において、異なる制御組成物および／または制御組成物の成分を、培養の異なる時点で細胞と接触させる。一つの例示的態様において、制御組成物は培養の開始時および該培養物の寿命の間の少なくとも１回以上で、細胞と接触させる。さらなる態様において、制御組成物は培養の開始時に細胞と接触させ、そして該制御組成物の１種以上の成分が該培養物の寿命の間の少なくとも１回以上で、細胞と接触させる。例えば、アザシチジン、ＴＧＦ−βおよびレチノイン酸を含む制御組成物を培養の開始時に非制御性Ｔ細胞と接触させ、次いでアザシチジン、ＴＧＦ−βまたはレチノイン酸を培養物の寿命の間の少なくとも１回以上で再び加える。さらなる例示的態様において、アザシチジン、ＴＧＦ−βおよび／またはレチノイン酸のいくつかの組合せを培養物の寿命の間の少なくとも１回以上で加える。同様に、例えばＴＧＦ−β、ＩＬ−２および１種以上の脱メチル化剤とヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む制御組成物について、完全な制御組成物をある時点で加え、１種以上の前記成分をさらに、単独でまたは前記制御組成物の他の成分もしくはサイトカイン、Ｔ細胞アクチベーターを含む他の添加物、ならびに新鮮な細胞培養培地および／または細胞培養物の健康および安定性に作用することが知られている他の物質と共に、続く時点で培養物と接触させてもよい。理解されるとおり、制御組成物の成分の任意の組合せを、細胞培養物の寿命の間の１回以上の時点で加えてよい。

ある態様において、制御組成物の１種以上の成分を培養開始後少なくとも１回、細胞培養物に加える。さらなる態様において、制御組成物の１種以上の成分を培養物の寿命の間の約２〜約１５回、細胞培養物に加える。さらなる態様において、制御組成物の１種以上の成分を培養物の寿命の間の約３〜約１４回、約４〜約１４回、約５〜約１２回、約６〜約１１回、約７〜約１０回および約８〜約９回、細胞培養物に加える。これらの態様において、細胞培養物は非制御性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞ならびに非制御性および制御性Ｔ細胞の両方を含んでいてよい。制御性Ｔ細胞は、ｎＴｒｅｇおよび／またはｉＴｒｅｇであってよい。これらの培養物はまた、Ｔ細胞以外の細胞を含んでいてもよい。

さらなる例示的態様において、１種以上の物質を非制御性Ｔ細胞の培養物と逐次的または同時に接触させる。例えば、アザシチジンとレチノイン酸を用いてｉＴｒｅｇを作成する態様において、アザシチジンとレチノイン酸はレチノイン酸と同時にまたはいずれかの順序で逐次的に、細胞と接触させることができる。同様に、アザシチジン、レチノイン酸およびＴＧＦ−βを用いてｉＴｒｅｇを作成する態様において、該３種の物質を同時にまたはいずれかの順序で逐次的に、非制御細胞と接触させることができる。理解されるとおり、制御組成物に含まれ得る本明細書に記載の物質のいずれかの組合せは、同時またはいずれかの順序で逐次的に、細胞と接触させることができる。

一つの局面において、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を作成する方法であって、制御組成物で非制御性Ｔ細胞の培養物を処理する工程を含む方法を提供する。この局面において、制御組成物は転写因子をコードする遺伝子のメチル化を防止する物質を含む。例示的態様において、転写因子をコードする遺伝子のメチル化を防止する物質は、ＦＯＸＰ３に関する遺伝子のメチル化を防止するメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。さらなる例示的態様において、該メチルトランスフェラーゼ阻害剤は、アザシチジンである。さらなる態様において、制御組成物はまた、ＴＧＦ−βのようなサイトカインも含む。さらなる態様において、制御組成物はまた、レチノイン酸のようなＴ細胞分化を加速する物質も含む。さらなる態様において、制御組成物はトリコスタチンＡのようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む。理解されるとおり、この例示的制御組成物のこれらの成分のサブセットのいずれかの組合せを用いて、ｉＴｒｅｇを作成できる。

一つの態様において、非制御性Ｔ細胞の培養物を処理することは、培養開始時に制御組成物を加えることを含む。一つの態様において、非制御性Ｔ細胞の培養物を処理することは、培養開始後に制御組成物を加えることを含む。ある態様において、非制御性Ｔ細胞の培養物は、培養開始時または培養開始に次いで処理を行うかのいずれであれ、制御組成物で処理した後約１週間維持される。

さらなる態様において、培養開始時に制御組成物を加えた後の第二の時点で、非制御性Ｔ細胞の培養物に物質を加える。さらなる態様において、該物質は、培養物の寿命の間の複数の時点で加えられる。かかる態様において、培養の開始後１回以上加えられる物質は、アザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８またはこれらのいくつかの組合せもしくは本明細書に記載の制御組成物の任意の他の成分であってよい。

ある態様において、制御組成物による処理の前およびＴ細胞アクチベーターによる刺激の前に、非制御性Ｔ細胞は１種以上の物質で「予備刺激」される。「予備刺激」は、制御組成物と接触させる前に１種以上の物質と非制御性Ｔ細胞を接触させることを意味する。例えば、細胞はアザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２またはそのいくつかの組合せと、細胞培養開示前および／または細胞を予備刺激するために使用される１種以上の物質を含んでいてもよい制御組成物と接触させる前に、接触させてよい。例示的態様において、非制御性Ｔ細胞の培養物は、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２で予備刺激され、ＦＯＸＰ３のメチル化に作用する物質、サプレッサー細胞への細胞の分化に作用する物質、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である物質または該３種の物質のいくつかの組合せを含む制御組成物の存在下でＴ細胞アクチベーターで刺激される。さらなる例示的態様において、制御組成物はアザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡまたはこれら３種のいくつかの組合せを含む。さらなる態様において、制御組成物はＴＧＦ−βおよび／またはＩＬ−２も含む。

ある態様において、制御組成物による処理の前に、非制御性Ｔ細胞を１つ以上の前処理プロトコルに供してもよい。例えば、回収した後、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離の使用を含むが、これに限定されない当該技術分野において標準的な技術を用いてさらに細胞を濃縮できる。

さらなる態様において、１回以上の濃縮工程の後、当該技術分野において周知の技術を用いて細胞を洗浄して、血清タンパク質および可溶性血液成分、例えば自己抗体、阻害剤等を除去できる。一般に、かかる技術は生理的培地またはバッファーの添加、次いで遠心分離を含む。かかる工程は必要に応じて反復できる。

１回以上の濃縮および／または精製の後、さらなる態様において、該細胞は生理的培地、例えばＡＩＭ Ｖ無血清培地（Life Technologies）中に再懸濁してもよく、あるいはバッファー、例えばHanks平衡塩溶液（ＨＢＢＳ）もしくは生理的緩衝化食塩水（ＰＢＳ）を用いてもよい。生理的培地を用いるとき、血清はｉＴｒｅｇ生成の阻害剤として作用するタンパク質を含む得るため、無血清培地が好ましい。

一つの態様において、細胞は、制御組成物による処理の前に１種以上の細胞タイプについて富化してよい。例えば、細胞は当該技術分野において周知の技術を用いて、例えば市販の免疫吸着カラムおよび他の技術、例えばGray et al. (1998), J. Immunol. 160:2248に記載のもの（ここで、その全体について、あらゆる目的のために、特に１種以上の細胞タイプについて細胞集団を富化することに関する全ての技術について、参照により本明細書に組み込む）によって、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞について富化することができる。

他の態様において、ＰＢＭＣを自動化されたクローズドなシステム、例えばNexell Isolex 300i Magnetic Cell Selection System、Miltenyiの“AutoMACS system”またはフローサイトメーターで分離する。一般に、かかる分離は、滅菌状態を維持し、細胞分離、活性化およびサプレッサー細胞機能の発生に用いる方法論の標準化を保証する、当該技術分野において既知の方法およびデバイスを用いて実施する。多くの態様において、細胞がいずれかの必要な前処理を受けた後、細胞を制御組成物で処理する。

一つの態様において、白血球フェレーシス回収方法を用いて非制御性Ｔ細胞を回収して、滅菌ロイコパック（leukopak）中濃縮細胞サンプルを得る。さらなる態様において、試薬の添加および／またはキットとしての制御組成物の用量のためにロイコパックを修飾して、細胞を回収したものと同じロイコパック中でｉＴｒｅｇを作成するための細胞の処理を行うことができる。かかるキットは以下に詳細に説明される。

ある局面において、本明細書に記載の制御組成物および方法は、天然に生じるＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）を拡張し、そして非制御性Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導するために使用する。ある態様において、ｎＴｒｅｇの拡張は、ＩＬ−２を含む本明細書に記載の制御組成物を用いる。さらなる態様において、本明細書に記載の方法を用いたｎＴｒｅｇの拡張は、単離されたｎＴｒｅｇ集団を制御組成物で処理することを含む。この制御組成物は、さらなる態様において、ＩＬ−２を含む。さらなる態様において、ｎＴｒｅｇはＩＬ−２、ならびにＴＧＦ−β、アザシチジン、レチノイン酸およびトリコスタチンＡを含む１種以上のさらなる物質および／またはサイトカイン類で処理する。非制御性Ｔ細胞を処理してｉＴｒｅｇを作成するための上記いずれかの方法は、ｎＴｒｅｇ集団の拡張にも適用できる。

理解されるとおり、本発明は、一つの局面において、本明細書に記載の方法に従って作成されたｉＴｒｅｇの組成物を含む。

さらに、本発明はまた、細胞培養培地、転写因子のメチル化に作用する物質（例えばアザシチジン）、サプレッサー細胞へのＴ細胞の分化に作用する物質（例えばレチノイン酸）および少なくとも１個の未処理ＣＤ４＋細胞を含むＴ細胞集団を含んでなる組成物を含む。かかる組成物はまた、少なくとも１個の誘導された制御性Ｔ細胞も含んでいてよい。さらなる態様において、少なくとも１個の誘導された制御性Ｔ細胞は、サプレッサーＴ細胞である。さらなる態様において、組成物はさらにトリコスタチンＡのようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む。ある態様において、さらにｉＴｒｅｇを誘導するために、Ｔ細胞アクチベーターがこの本発明の組成物にさらに添加されていてよい。

一つの局面において、本発明は、細胞培養培地、転写因子のメチル化に作用する物質（例えばアザシチジン）、サプレッサー細胞へのＴ細胞の分化に作用する物質（例えばレチノイン酸）および少なくとも１個の天然Ｔｒｅｇを含むＴ細胞集団を含んでなる組成物を含む。かかる組成物は、ｎＴｒｅｇを拡張するために、１種以上のＴ細胞アクチベーターならびに他の添加物、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤またはＩＬ−２のようなサイトカインでさらに処理してもよい。理解されるとおり、この拡張されたｎＴｒｅｇ集団も本発明に含まれる。

ｎＴｒｅｇ表現型特性についてのｉＴｒｅｇの評価
一つの局面において、本発明の方法および組成物は、アザシチジンを含む制御組成物で非制御性Ｔ細胞の培養物を処理してｉＴｒｅｇを刺激し、培養物中のＦＯＸＰ３陽性細胞の割合を増大させることを含む。図２は異種ＴＧＦ−βの非存在下での、非制御性Ｔ細胞培養物のアザシチジンによる刺激が顕著にＦＯＸＰ３陽性細胞の割合を増大することを示している（図２Ａの矢印はＴＧＦ−β（中央のパネル）またはアザシチジン（右側のパネル）による増強を示す）。図２Ａに示すとおり、このＦＯＸＰ３＋細胞の割合の増大は、アザシチジンのみによって増大が誘導されるときでもＴＧＦ−βによって誘導されるＦＯＸＰ３発現と同程度にアザシチジンによって誘導されるＦＯＸＰ３発現をＡＬＫ５ｉが阻害したため、少なくとも部分的には、内因性ＴＧＦ−βを含むメカニズムに依存している可能性がある（「ＡＬＫ５ｉ」と表示がある矢印で示されるトレースを参照）。図２Ａのグラフにおける影付きの領域は、バックグラウンド染色を示す。

本発明の「アザシチジン産生ｉＴｒｅｇ」は、アザシチジンのみを用いて産生されたものならびにアザシチジンと、サイトカイン類（例えばＴＧＦ−βおよびＩＬ−２）およびサプレッサー細胞へのＴ細胞の分化を促進する物質（例えばレチノイン酸）を含むがこれらに限定されない他の物質を用いて産生されたものを含む。

上記のとおり、ｎＴｒｅｇの一つの表現型特性は、貧増殖応答性である。ＩＬ−２およびＴＧＦ−βで刺激したヒト未処理ＣＤ４＋細胞はＦＯＸＰ３＋になるが、一部のみがサプレッサー細胞に分化する。図５ＡはかかるｉＴｒｅｇが再刺激されたときに増殖することを示している。逆に、アザシチジンと共に培養されたＣＤ４＋細胞は培養の６日後に不応性となり、再刺激によって増殖しない。前増殖性サイトカイン源がｉＴｒｅｇそれ自体のみであるため、アザシチジン処理細胞による増殖の欠如は貧サイトカイン産生と一致し、これはｎＴｒｅｇの区別される特徴である。ＴＧＦ−βと組み合わせたアザシチジンの添加もこれらの細胞の増殖性活性を低減する。

一つの局面において、本発明に従って作成されるｉＴｒｅｇをサプレッサー活性について評価する。サプレッサー活性について評価するとき、アザシチジンの存在下で培養したヒト細胞は、アザシチジンの非存在下で培養した細胞よりもより顕著に抑制性である（図４）。したがって、本発明に従うアザシチジンの存在下での培養は、ｎＴｒｅｇと同一または類似の表現型および機能的特徴を有するｉＴｒｅｇ細胞の作成を促進する能力と一致する。

一つの局面において、ＴＧＦ−βはＦＯＸＰ３発現を誘導するために、非制御性Ｔ細胞の培養物にアザシチジンとともに添加する。図３Ａは、アザシチジンとＴＧＦ−βの組合せが相加効果を有し、いずれかの物質を単独で加えるよりも高い割合のＦＯＸＰ３＋細胞を誘導することを示している。

上記のとおり、一つの態様において、ＴＧＦ−βとアザシチジンは、同時に培養物に加える。他の態様において、ＴＧＦ−βとアザシチジンは逐次的に培養物に添加し、ここでＴＧＦ−βとアザシチジンのいずれが最初に加えられてもよい。さらに別の態様において、ＴＧＦ−βとアザシチジンは異なる時点で培養物に加える。さらに別の態様において、ＴＧＦ−βとアザシチジンは、それらが同時、逐次的または異なる時点のいずれで添加されるにせよ、細胞培養物の寿命の間の２回以上で培養物に適用される。

ビタミンＡの代謝産物であるレチノイン酸は、ＴＧＦ−β依存的メカニズムによって、胃腸管においてＣＤ４＋細胞を誘導して抗原提示細胞をＦＯＸＰ３＋ ｉＴｒｅｇとさせることが可能であることが見出されている（例えば、Kang et al., (2007) J. Immunol., 179:3724-3733参照）。レチノイン酸の主要な効果の一つは細胞成熟を加速させることであるから、本発明者らは、レチノイン酸それ自体またはアザシチジンとの組合せがヒトｉＴｒｅｇの分化も促進できると判断した。したがって、本発明は、レチノイン酸を単独でまたはＩＬ−２およびＴＧＦ−βのようなサイトカイン類、Ｔ細胞アクチベーターおよび転写因子のメチル化に作用する物質、例えばアザシチジンを含む本明細書に記載のいずれかの物質および組成物との組合せで含む、制御組成物を利用した方法および組成物を包含する。

図６はＩＬ−２、ＴＧＦ−β、ＡＴＲＡ（全トランス・レチノイン酸、これはレチノイン酸の活性な代謝産物である）およびアザシチジンの組合せが、いずれかの物質それ自体の適用によって見られるよりも高い割合で未処理ＣＤ４＋細胞をＦＯＸＰ３＋細胞に誘導することを示している。矢印で示される図６のトレースは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズによる刺激後の細胞数である。

上記のとおり、一つの例示的態様において、ｉＴｒｅｇは、レチノイン酸、アザシチジン、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの組合せによる非制御性Ｔ細胞の刺激によって作成する。かかるｉＴｒｅｇは、成熟ＦＯＸＰ３＋ ｎＴｒｅｇの特徴である特異的表面マーカーのようなｎＴｒｅｇの表現型特性について評価できる。未処理のＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋ マーカーを示し、ＣＤ４５ＲＯを欠く。活性化後、それらがメモリー表現型を示したとき、これらの細胞はＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋となった（図７）。ＴＧＦ−β刺激の６日後、50％のみがＣＤ４５ＲＯマーカーを獲得した（図７）。しかし培地中にアザシチジンとレチノイン酸が含まれていたとき、ほぼ全ての細胞がＣＤ４５ＲＯ＋になった。ｎＴｒｅｇのように、未処理のＣＤ４＋細胞は顕著に減少したＩＬ−７受容体（ＣＤ１２７）発現を示し、ＣＤ１２７ｄｉｍになった。最後に、ｎＴｒｅｇはＴＧＦ−βによって誘導されるαＥβ７インテグリン（ＣＤ１０３）を特徴的に発現する。アザシチジンおよびレチノイン酸をＴＧＦ−βに加えると、ＣＤ１０３を発現するＣＤ４＋細胞の割合が顕著に増加した。ＴＧＦ−β、アザシチジンおよびレチノイン酸の組合せはまた、未処理のヒトＣＤ４＋細胞を誘導して膜結合ＴＧＦ−βを発現する。ＴＧＦ−βで予備刺激したいくつかのＴ細胞は再刺激後それらの細胞表面上でこのサイトカインを発現したが、この数はアザシチジンとレチノイン酸で予備刺激したとき、２倍であった。

ＩＶ．本発明のｉＴｒｅｇの使用
本発明は、本明細書に記載の方法および組成物を用いて作成したｉＴｒｅｇ集団を包含する。かかるｉＴｒｅｇ集団は、治療的および研究的適用に使用できる。

一つの局面において、例えば異常な免疫応答および／または自己免疫疾患を有する患者に、本明細書に記載の方法および組成物を用いて誘導したＴｒｅｇを投与する。さらなる局面において、本明細書に記載の方法および組成物を用いて誘導したＴｒｅｇは同種移植片拒絶反応を予防または処置できる。

本発明の方法および組成物を用いて誘導したＴｒｅｇは、当該技術分野において一般に知られている方法を用いて患者に投与できる。かかる方法は、ｉＴｒｅｇを患者に注射または導入することを含むが、これらに限定されない。ある態様において、ｉＴｒｅｇは静脈内投与を介して患者に導入される。さらなる態様において、バッファー、塩または薬学的に許容される添加物のようなさらなる薬物をｉＴｒｅｇと組み合わせて投与してもよい。

細胞を患者に導入した後、当該技術分野において既知の方法を用いて処置の効果を評価してもよい。かかる評価の例は、総Ｉｇまたは特定の免疫グロブリンの力価を測定すること、腎機能試験、組織損傷評価等を含むが、これらに限定されない。

本発明のＴｒｅｇを用いた処置は、必要または所望により反復してもよい。例えば数週間の期間について１週間に１回、またはある期間について１週間に複数回、例えば２週間にわたって３〜５回処置を行うことができる。時間経過と共に、患者は症状の再発を経験することがあり、その時点で処置を反復できる。

一つの例示的局面において、本発明は、患者における異常な免疫応答または自己免疫疾患を処置する方法であって、患者に制御性Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。この局面において、制御性Ｔ細胞は非制御性Ｔ細胞の培養物を制御組成物で処理して作成する。この制御組成物は、アザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡまたはアザシチジン、レチノイン酸およびトリコスタチンＡの２種以上の組合せを含んでいてよい。

一つの態様において、患者に投与される制御性Ｔ細胞は、アザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡの１種以上を含む制御組成物を用いて作成する。さらなる態様において、制御組成物はＴＧＦ−βおよび／またはＩＬ−２を含んでいてよい。さらなる態様において、制御組成物は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の組合せを含むがこれらに限定されないＴ細胞アクチベーターを含んでいてもよい。

さらなる例示的態様において、異常な免疫応答の処置のために患者に投与される制御性Ｔ細胞は、非制御性Ｔ細胞の培養物から、該非制御性Ｔ細胞の培養物を制御組成物による処置の前、それと同時またはその後にＴ細胞アクチベーターで刺激して、作成する。

Ｖ．キット
一つの局面において、本発明は、ｉＴｒｅｇを作成するためのキットを提供する。一般に、かかるキットは、特別の細胞処理設備の使用を必要とせずに本明細書に記載の制御組成物で非制御細胞の処理が可能な滅菌クローズドシステムを含む。

例示的態様において、本発明のキットは細胞処理容器を含む。細胞処理容器は、多くの態様において、コンタミネーションの危険なく制御組成物で非制御性Ｔ細胞を処理可能なクローズド滅菌システムである。細胞処理容器の形状および組成は、当業者に理解されるとおり、変化してよい。一般に、容器は多数の異なる形態、例えばＩＶバッグに似たフレキシブルバッグまたは細胞培養容器に似た硬い容器であり得る。一般に、容器の組成はいずれかの好適な、生物学的に不活性な材料、例えばガラスまたはプラスチック、例えばポリプロピレン、ポリエチレンなどである。

さらなる態様において、細胞処理容器は、培養中の細胞増殖を維持するために必要な反応条件を阻害することなく、Ｔｒｅｇの作成用薬物を細胞処理容器内の細胞に導入可能なように、１個以上のポートを含む。例えば本発明の細胞処理容器は、新鮮な細胞培養培地を導入するための１個のポートを含んでいてよいが、別のポートはアザシチジン、レチノイン酸および１種以上のサイトカイン類（ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２を含むがこれらに限定されない）のような本明細書に記載の制御組成物の成分を導入するために使用される。理解されるとおり、かかる細胞処理容器へのポートについての広範なデザインが当該技術分野において既知であり、本発明に含まれる。

さらなる態様において、本発明の細胞処理容器は、Ｔ細胞のみが制御組成物による処理のために容器内に残るように細胞の分離に使用できる成分を含む。例えば、専用ポートまたは該システムに他の物質および分子を導入するためにも使用されるポートを介して容器に抗体を導入できる。かかる抗体は、非Ｔ細胞を同定し、次いで容器から除去し、キットに含まれる他の成分で処理するためのＴ細胞のみが残るように、非Ｔ細胞に特異的であってよい。一つの例示的態様において、免疫磁性ビーズを細胞処理容器に加えて、抗体で標識された非Ｔ細胞と結合させ、次いで当該技術分野において既知の方法を用いて免疫磁性ビーズを容器から除去できる。

一つの局面において、本発明は、患者にｉＴｒｅｇを投与するためのキットを提供する。さらなる局面において、患者にｉＴｒｅｇを投与するためのキットは、ｉＴｒｅｇを作成するためのキットのいくつかまたは全ての成分と組み合わせられる。かかるキットは、ある例示的態様において、ｉＴｒｅｇを作成するために非制御性Ｔ細胞に制御組成物を加えるための複数のポートを含む、上記のもののような細胞処理容器を含んでいてよい。かかる細胞処理容器はさらに、当該技術分野において既知の方法を用いて、例えば静脈内（Ｉ．Ｖ．）注入によって患者にｉＴｒｅｇを投与できるように、さらなる区画および／またはポートを含んでいてよい。例えば、上記細胞処理容器は、患者にｉＴｒｅｇを投与するＩ．Ｖ．バッグと接続するために適合されているポートをさらに含んでいてもよい。

さらなる局面において、本発明のキットは、患者から細胞を回収するときにも使用できる細胞処理容器を含んでいてもよい。一つの例示的態様において、本発明のキットは、入口ポートを用いる白血球フェレーシス装置に取り付けられるように適用されており、同一の容器を細胞収集およびｉＴｒｅｇを作成するための細胞処理の両方に使用できる細胞処理容器を含む。さらなる例示的態様において、容器は、作成したｉＴｒｅｇを患者に、例えば上記のとおりＩ．Ｖ．セットアップに対するアダプターを介して投与するために使用できるさらなる適応を含んでいてよい。

さらなる態様において、本発明のキットは、患者から細胞を回収するために使用できる別々の細胞回収容器と、それらの細胞を細胞処理容器に導入するものを含んでいてよく、これもキットのパーツである。該細胞処理容器はさらに、ｉＴｒｅｇを作成するための容器中の細胞に制御組成物を導入でき、得られたｉＴｒｅｇを細胞処理容器から患者に投与可能であるか、あるいは細胞処理容器から患者にｉＴｒｅｇを投与できる適応を含んでいてもよく、これもキットに含まれ得る。ｉＴｒｅｇは次いで、細胞投与容器から患者に投与できる。

さらなる態様において、本発明のキットは、制御組成物による処理と同じ容器内で非制御性Ｔ細胞の分離および／または精製を行えるように、細胞分離および精製用要素を含む細胞回収容器を含んでいてよい。さらなる態様において、細胞は分離および／または精製のために細胞回収容器から除去され、かかる分離および／または精製の後、該細胞を細胞処理容器に導入する。細胞回収容器外のかかる分離および／または精製用容器および試薬は、同じキット内に含まれていてもよい。

本発明のキットは、少なくとも１用量の制御組成物をさらに含んでいてもよい。この文脈での「用量」は、ある効果を引き起こすのに十分な制御組成物の量を意味する。さらなる態様において、本発明のキット中に複数用量の制御組成物を含んでいてもよい。さらなる態様において、制御組成物の用量は、ポートを用いて細胞処理容器に加えることができ；あるいはある態様において、用量は細胞処理容器内に既に存在する。さらなる態様において、制御組成物の用量は凍結乾燥形態で存在し、これは当該技術分野において既知の細胞培地または他の物質を用いて再構成可能である。

さらなる態様において、本発明のキットはｉＴｒｅｇを作成するための本明細書に記載の制御組成物と組み合わせて使用できる当該技術分野において既知のバッファー、塩、培地、タンパク質、薬物および他の成分を含んでいてもよい。かかる成分はまた、患者にｉＴｒｅｇを投与するために使用されるキットのパーツとして使用してもよい。

さらなる態様において、本発明のキット中に集合される物質または成分が実施者に提供され、またそれらの操作性および有用性を保存するいずれかの簡便かつ好適な方法で保存されてもよい。例えば、成分は溶解、脱水または凍結乾燥形態で存在していてよく；それらは室温、冷蔵または冷凍温度で提供できる。該成分は典型的には、好適なパッケージング材中に含まれる。本明細書において使用されるとき、用語「パッケージング材」は、キットの内容物、例えば発明の組成物等を保存するために使用される１つ以上の物理的構造を意味する。パッケージング材は周知の方法で構築され、好ましくは滅菌、無汚染環境を提供する。キットに使用するパッケージング材は、ラボラトリーキットにおいて商業的に利用可能なものである。本明細書において使用するとき、用語「パッケージ」は、ガラス、プラスチック、紙、フォイル等のような、個々のキット成分を保持可能な好適な固体マトリックスまたは材料を意味する。したがって例えば、パッケージは好適な量の制御組成物を含むように用いるガラスバイアルであってよい。パッケージング材は一般に、キットの内容物および／または目的ならびに／あるいはその成分を示す外側ラベルを有する。

さらなる態様において、本発明のキットは、キットの使用に関する指示書をさらに含んでいてもよい。

キットが細胞分離用要素を含む本発明のある例示的態様において、該キットは、ＧＭＰ品質のビオチニル化抗体を含む。かかる抗体は、単球を除去するための抗ＣＤ１４、ＮＫ細胞を除去するための抗ＣＤ１１ｂまたはＣＤ５６、そしてＣＤ８細胞を除去するためのＣＤ８を含んでいてよいが、これらに限定されない。かかるキットはさらに、染色された単球、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を除去するためのアビジン結合抗マウスＩｇＧを有する磁性ビーズを含んでいてもよい。さらなる態様において、かかるキットは制御組成物、例えばアザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２を含む制御組成物ならびにこれらの成分の２種以上の組合せを含む制御組成物を含んでいてもよい。

ある態様において、本発明のキットは細胞処理容器と制御組成物を含む。例示的態様において、制御組成物はアザシチジン、レチノイン酸およびＴＧＦ−βを含む。さらなる例示的態様において、制御組成物はＩＬ−２も含む。さらなる例示的態様において、かかるキットは１種以上のＴ細胞アクチベーターとサイトカインを、別々の容器中にあるいは制御組成物の一部として含む。さらなる態様において、かかるキットはバッファー、薬物および細胞培養培地も含む。ある態様において、かかるキットはさらに、キットの使用に関する指示書を含んでいてもよい。

一つの例示的局面において、本発明は、制御組成物、細胞処理容器およびキットの使用に関する指示書を含むキットを提供する。さらなる局面において、キットに含まれる制御組成物は、アザシチジン、レチノイン酸またはアザシチジンとレチノイン酸の組合せを含む。一つの態様において、制御組成物はさらに、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２またはＴＧＦ−βとＩＬ−２の組合せを含んでいてもよい。さらなる態様において、制御組成物はさらにトリコスタチンＡを含む。さらなる態様において、この例示的キットの細胞処理容器は、白血球フェレーシス装置への取り付けに適用されるポートを含む。

上記本発明の使用方法をより十分に説明し、そして本発明の多様な局面を実施するための最良の態様を記載するため、下記実施例を提供する。これらの実施例は、いかなる方法においても本発明の真正な範囲を限定せず、説明的な目的で提供されていると理解される。本明細書に記載の全ての文献は、全体において参照により本明細書に組み込む。

実施例
実施例１：刺激ＣＤ４＋細胞におけるＦＯＸＰ３発現
図１は非制御性Ｔ細胞の培養６日時点でのＦＯＸＰ３発現の典型的な例である。この図に示す実験において、未処理のＣＤ４＋細胞をＴＧＦ−βと共に（右パネル）またはなしで（左パネル）３／２８ビーズ（１０個のＴ細胞あたり１ビーズ）で６日間刺激した。データは、ＦＯＸＰ３発現がＴＧＦ−βによって促進されたことを示している（ＦＯＸＰ３３発現細胞の割合を各グラフに示す）。ＦＯＸＰ３は両方の培養物由来の細胞によって発現されるが、ＴＧＦ−βを添加した培養物からはＦＯＸＰ３を発現する細胞が２倍であった。

実施例２：ＦＯＸＰ３発現に対するアザシチジンおよびＴＧＦ−β効果の比較
図２ＡはＦＯＸＰ３発現に対するアクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤（ＡＬＫ５ｉ）の効果を示す。この阻害剤はＴＧＦ−βタイプＩ受容体シグナル伝達を阻止する。図２Ａは、刺激されたＣＤ４＋細胞のフローサイトメトリー分析からのデータを提供する。未処理のＣＤ４＋細胞は培地のみ（左パネル）、5 ng/mlのＴＧＦ−βの存在下（中央パネル）または1 μMのアザシチジンの存在下（右パネル）で５または６日間、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。グラフはまた、ＡＬＫ５ｉ（10μM）で刺激したか刺激しなかった細胞からのデータを示す。影付きの領域は、コントロールＩｇＧのみで染色された細胞を示す。図２Ａは、アザシチジンがＦＯＸＰ３発現を、ＴＧＦ−βで見られる促進と同程度まで促進することを示す。図２Ａのデータはまた、ＡＬＫ５ｉがアザシチジンによって誘導されるＦＯＸＰ３発現をＴＧＦ−βによって誘導されるＦＯＸＰ３発現と同程度まで阻害するため、アザシチジンによるＦＯＸＰ３発現の促進が少なくとも部分的にはＴＧＦ−β依存的であることを示唆している。

図２Ｂは、培地中、ＡＬＫ５ｉを含む培地および溶媒（ＤＭＳＯ）のみで刺激後のＦＯＸＰ３発現の割合を測定する５回の実験の平均±ＳＥＭを示す。当該図は、培地中で刺激された細胞にＡＬＫ５ｉを加えるとＦＯＸＰ３発現を低減することができたため、刺激されたＣＤ４＋細胞によるバックグラウンドＦＯＸＰ３発現でさえ部分的にＴＧＦ−β依存的であり得ることを示している。

実施例３：ＦＯＸＰ３発現に対するＴＧＦ−βとアザシチジンの相加効果の評価
ＦＯＸＰ３発現に対するＴＧＦ−βとアザシチジンの相加効果を分析した。図３はＦＯＸＰ３発現に対するＴＧＦ−βとアザシチジンの相加効果を示すデータを示している。図３Ａは（左から右へパネルの順番で）培地のみ、ＴＧＦ−βを含む培地中、そしてアザシチジンとＴＧＦ−βを含む培地中で５〜６日間、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した未処理ＣＤ４細胞からのフローサイトメトリーデータを提供する。矢印は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激後の細胞数を示す。図３Ｂは、５回の実験の平均±ＳＥＭを示し、培地のみ、アザシチジン（1 μM）を含む培地中、ＴＧＦ−β（5 ng/ml）を含む培地中、およびアザシチジンとＴＧＦ−βの両方を含む培地中で刺激後のＦＯＸＰ３発現の割合を示す。これらのデータはアザシチジンとＴＧＦ−βがＦＯＸＰ３発現を促進する相加効果を有することを示唆している。

実施例４：アザシチジンの存在下で刺激した細胞の抑制活性の評価
図４はアザシチジンで刺激したＣＤ４＋細胞が抑制活性を発現することを示している。この図は、培地のみおよびアザシチジンを含む培地中で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで未処理のＣＤ４＋細胞を刺激した４回の実験の、平均±ＳＥＭを示す。比率１：１０のカルボフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識したレスポンダーＴ細胞を培養して、刺激した細胞の集団それぞれを抑制活性についてアッセイした。細胞を可溶性抗ＣＤ３で３日間刺激し、レスポンダー細胞の増殖をＣＦＳＥの希釈物によって測定した。これらのデータは、アザシチジンの存在下で刺激した細胞集団において見られるＦＯＸＰ３発現の促進が（図３参照）、これらの細胞の抑制活性の促進を伴うことを示している。

実施例５：ＦＯＸＰ３＋発現に対するレチノイン酸の効果の評価
ＴＧＦ−βおよびアザシチジンにレチノイン酸を添加すると、刺激されたＣＤ４＋細胞におけるＦＯＸＰ３発現を促進する。未処理のＣＤ４＋細胞を上記のとおり抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。図５はＩＬ−２（20 u/ml）±ＴＧＦ−β（2 ng/ml）±全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）（0.1 - 0.5 μM）またはＤＭＳＯの存在下で４日間刺激した細胞からのデータを示す。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞でのＦＯＸＰ３発現は、フローサイトメトリーで測定した。図５Ａは５回の独立した実験の平均±ＳＥＭを示す棒グラフである。図５Ｂは0.1 μMのＡＴＲＡにおける代表的実験である。

図６は、培地のみ、ＴＧＦ−βを含む培地中、アザシチジンを含む培地中、レチノイン酸の活性代謝産物である全トランスレチノイン酸（0.05 μm/ml）（ＡＴＲＡ）を含む培地中、およびＴＧＦ−β、アザシチジンおよびＡＴＲＡの組合せを含む培地中で刺激Ｓ他細胞のさらなるフローサイトメトリーデータを示す。矢印で同定されているトレースは、刺激後にＦＯＸＰ３を発現する細胞からのデータを示し、ＦＯＸＰ３発現細胞の割合を各図に示す。明らかに、ＴＧＦ−β、アザシチジンおよびＡＴＲＡの組合せはＦＯＸＰ３発現の促進に最も顕著な効果を有していた。

実施例６：Ｔｒｅｇの表現型に対するレチノイン酸の効果の評価
ＴＧＦ−β、アザシチジンおよびレチノイン酸の組合せは、成熟ＦＯＸＰ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の表現型を有するＣＤ４＋細胞を増加する。ベースラインとして、未処理のＣＤ４＋細胞はＦＯＸＰ３、ＣＤ１０３またはＣＤ４５ＲＯを発現しない。かかる細胞はまた、ＣＤ１２７で明るく染色される。準最適数の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した後、70〜85％の未処理ＣＤ４＋細胞がＦＯＸＰ３、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ１０３を発現し、ＣＤ１２７でかすかな染色を示す（図７）。これらは全て、成熟ＦＯＸＰ３ ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞のマーカーである。

ＴＧＦ−β、アザシチジンおよびレチノイン酸の組合せは、未処理のＣＤ４＋細胞を誘導して膜結合ＴＧＦ−βを発現させることができる。記載の物質で未処理のＣＤ４＋細胞を６日間刺激し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで再刺激し、そして膜結合ＴＧＦ−βについて抗ＴＧＦ−β結合蛍光色素で染色した。図８は、刺激前にＴＧＦ−βと接触させたいくつかのＴ細胞がそれらの細胞表面上でこのサイトカインを発現し（図８Ｂ）、細胞をアザシチジンおよびレチノイン酸と接触させたときこの数が２倍になった（図８Ｃ）ことを示している。図８ＤのデータはＩｇＧの発現についてのコントロールのデータを示す。

図９はＩＬ−２（20 U/ml）、ＴＧＦ−β（2 ng/ml）および全トランスレチノイン酸（0.1 μM）の組合せの存在下で４日間刺激した未処理のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞が、ＴＧＦ−βのみまたはＩＬ−２のみ（ＣＤ４−ｃｏｎ）の存在下で刺激した細胞に対して増加した抑制を示したことを示している。誘導されたＴｒｅｇをＴレスポンダー細胞（比率１：４）に加え、抑制活性を計算した。

実施例７：アザシチジンの存在下および非存在下でのメモリーＣＤ４＋細胞の刺激
未処理のＣＤ４＋細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋細胞とも称する）に加え、メモリーＣＤ４＋細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）を刺激し、それらの表現型特性に対するアザシチジンおよびアザシチジン＋レチノイン酸の効果について評価した。これらのメモリーＣＤ４＋細胞は、以前には活性化集団であったが、静止を示す。アザシチジン（1 μM）、アザシチジンと全トランスレチノイン酸の組合せの存在下または非存在下およびＴＧＦ−β（5 ng/ml）の存在下または非存在下で、該細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（１０個中１個）で刺激する。６日後、該細胞は刺激ビーズが枯渇して、ＦＯＸＰ３発現、サプレッサー活性および増殖性活性についてアッセイする。刺激細胞の50％以上がＦＯＸＰ３を発現する。培地のみで培養した細胞における促進されたＦＯＸＰ３発現は、培養物中の非Ｔ細胞によって提供されたＴＧＦ−βのためであり得る。ＴＧＦ−βで処理した細胞は過増殖性であり、顕著に拡張する。しかし１回、２回またはそれ以上刺激を反復した後、それらは反応不顕性となり、Ｔ細胞刺激に対して応答が乏しいが、これらの細胞によるＦＯＸＰ３発現および抑制活性は、アザシチジンの非存在下で刺激した全Ｔ細胞よりも顕著であった。

アザシチジン／アザシチジン＋レチノイン酸に初めて曝露される各ＣＤ４＋サブセットからのグループが存在するように、新鮮なアザシチジンおよび／またはアザシチジンとレチノイン酸の組合せの存在下または非存在下で、残りの細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（１０個中１個）で再刺激する。さらに６日後、ＦＯＸＰ３発現、サプレッサー活性および増殖性活性について細胞をアッセイする。

ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞はいずれもＦＯＸＰ３を発現し、抑制活性を示す。この実施例では、特定のＴ細胞集団の必要性なく、Ｔ細胞療法に好適なＴｒｅｇを作成する。

実施例８：サイトカイン産生の評価
抗原提示細胞なしで、無血清培地中で、１次および２次培養物からの細胞を刺激する。該細胞を固定化抗ＣＤ３または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激する。ＩＬ−２、ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−４を測定するためのサイトカインビーズアレイキットを用いて、培養の１日目および３日目に回収した上清からサイトカインの量を測定する。さらに、ＥＬＩＳＡキットを用いて活性かつ潜在性ＴＧＦ−βを測定する。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の測定のために培養１日目および３日目に回収した上清からサイトカイン量を測定し、サイトカインを測定するためのサイトカインビーズアレイキットおよびＥＬＩＳＡキットを用いて活性かつ潜在性ＴＧＦ−βを測定する。

実施例９：メチル化状態の評価
ＣＯＢＲＡ（組合せ亜硫酸水素塩制限分析）と呼ばれる手法を用いて、最初にメチル化状態を測定する。この方法は、亜硫酸水素塩処理と目的の遺伝子の特定の部位のＰＣＲ増幅を組み合わせている。ヒトでの試験について、焦点はアンプリコン５にある。パラレル試験を行って、マウス未処理ＣＤ４＋脾臓細胞を用いてｎＴｒｅｇの特徴を有するｉＴｒｅｇを作成するアザシチジンを含む制御組成物の能力を試験する。

実施例１０：アザシチジン産生ｉＴｒｅｇの安定性およびホメオスタシス特性の評価
この評価はＧＦＰ−ＦＯＸＰ３融合タンパク質を発現するように操作されたマウスを用いる。細胞ソートによって単離されたＣＤ４＋ＧＦＰ−細胞を、アザシチジンを含む制御組成物の存在下または非存在下、およびアザシチジンとレチノイン酸を含む制御組成物の存在下で刺激する。刺激も、ＴＧＦ−βを含むおよび含まない制御組成物で試験する。制御組成物またはＴＧＦ−βの存在下での刺激は、ＦＯＸＰ３発現を誘導する。精製したＦＯＸＰ３＋細胞集団は、細胞ソートによって単離する。ポジティブコントロールとして、ｎＴｒｅｇも新鮮な脾臓およびリンパ節からソートする。ｉＴｒｅｇおよびｎＴｒｅｇ細胞はいずれも（5 × 10⁶個）をコンジェニックＣＤ４５．１−マウスに注射する。アザシチジン産生ｉＴｒｅｇについて、１集団あたり３〜４匹のマウスが十分な細胞を有する。ｎＴｒｅｇについて、１集団あたり少なくとも２匹のマウスが存在する。いくつかの実験において、ｎＴｒｅｇは十分な数の細胞を得られるように培養物中で拡張される。注射の前に、ＣＤ１０３（皮膚および腸）、ＣＤ６２Ｌ（リンパ節）およびＣＸＣＲ４（骨髄）のようなケモカイン／ホーミングレセプターの発現について多様な集団をアッセイする。

相対的に早い（７日目）および遅い（２１日目）時点で評価を行う。マウスを殺し、ＦＯＸＰ３＋およびＦＯＸＰ３−細胞であるＣＤ４５．１＋細胞の数を多様な臓器（血液、リンパ節、脾臓および骨髄）で測定する。アザシチジンおよび／またはレチノイン酸（ＴＧＦ−βありまたはなしで）を含む制御組成物で作成した細胞が、典型的にはそれらのＦＯＸＰ３発現を維持するｎＴｒｅｇと同様にふるまうかを決定する。

実施例１１：自己免疫疾患に有利に影響する、アザシチジンを用いて作成したｉＴｒｅｇの能力の評価
関節炎のＫ／ＢｘＮマウスモデルを使用する。最初のステップは組織適合性の非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６ ｘ ＮＯＤ（ＢｘＮ）マウスからｉＴｒｅｇを作成することである。未処理のＣＤ４＋細胞を濃度範囲1×10⁶ 〜 10×10⁶個で、３〜５週齢Ｋ／ＢｘＮマウスに静脈内注射する。３週齢マウスでの実験は、疾患発生に対するｉＴｒｅｇの効果を示すが、５週齢マウスでの実験は、確立された疾患に対するｉＴｒｅｇの効果を示す。疾患の臨床的重症度は、次のとおりスコアを付ける：０、正常；１、わずかな紅斑と足中部（足根）または足首関節に限定された軽度の腫脹；２、紅斑および足首から足中部に拡大した軽度の腫脹；３、紅斑および足首から中足骨間接に拡大した中度の腫脹、ならびに４、強い紅斑および足首、足および指を含む重度の腫脹。全後肢に等級を付けると、マウスあたり８で最大臨床スコアが得られ、所定の日における平均関節炎指数として表す。１つ以上の肢がスコア＞２を有するとき、マウスを関節炎と評価する。各後肢の足首の周辺をノギスで測定する。

かかるマウスモデルにおいて、常套の方法に従って（すなわち、ＴＧＦ−βと所望によりＩＬ−２のような１種以上の他のサイトカイン類を含む制御組成物を用いて）作成したｉＴｒｅｇの効果を、アザシチジンと所望によりレチノイン酸および／またはＴＧＦ−βおよびＩＬ−２を含む１種以上のサイトカイン類を含む制御組成物を含む、本明細書に記載の制御組成物を用いて作成したｉＴｒｅｇの効果と比較する。

ＢｘＮマウスからのアザシチジン産生ｉＴｒｅｇが治療効率が示されると、次いでＫ／ＢｘＮマウスからの細胞が同様に機能し得るのかを決定する。関節炎発症前および後のマウスから単離した細胞を、疾患の改善についてのそれらの能力について試験する。確立された疾患を有するマウスから未処理のＣＤ４＋細胞を単離して、この手法が臨床的状況において使用されるときに存在するであろう状況を模倣できる。

アザシチジン産生ｉＴｒｅｇで処置したマウスに加え、該試験はまた、新鮮な未処理のＣＤ４＋細胞を注射したマウスおよびアザシチジンとレチノイン酸の非存在下で作成されたｉＴｒｅｇを注射したマウスを含む。この比較の理由は、ホメオスタシス増殖の阻害に寄与するものと、本当の制御効果を区別するためである。

上記プロトコルは、コラーゲン誘導性関節炎の動物モデルにおいて、アザシチジン、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、レチノイン酸、トリコスタチンＡおよびこれらの物質の２種以上の組合せを含む制御組成物の効果を試験するために用いてもよい。

本明細書は、ここに記載の技術の例示的局面における方法論、システムおよび／または構造およびそれらの使用の完全な説明を提供する。この技術の多様な局面が、ある程度の特殊性によって、または１つ以上の個々の局面についての記載をもって説明されているが、当業者はその技術の精神または範囲から離れることなく、開示された局面に多様な変更を加えることができる。多くの局面がここに記載の技術の精神および範囲から離れることなく行い得るが、適切な範囲を添付の特許請求の範囲に示す。したがって、他の局面が意図される。さらに、異なることが明示的に記載されていないか、あるいは請求項の記載から特定の順序が本質的に必要とされていない限り、いずれかの操作を任意の順序で行うことができると理解されるべきである。上記説明に含まれ、添付の図面に示される全ての事柄は、具体的な局面の説明のみと理解されるべきであり、示された態様に限定しないことを意図する。異なることが文脈から明らかであるか、あるいは明示的に述べられていない限り、本明細書に提供されるいずれかの濃度の値は、一般に、混合物の特定の成分の添加によってまたはその後に生じる何らかの換算を考慮せずに、混合物の値またはパーセンテージとして与えられる。既に明示的に本明細書中に組み込まれていない程度に、本明細書において言及した全ての公表文献および特許明細書は、それらの全体において、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込む。詳細または構造の変化は、添付の特許請求の範囲に定義の本技術の基本的な要素から離れることなく、行うことができる。

Claims (35)

1. 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を作成する方法であって、転写因子をコードする遺伝子のメチル化を防止する物質を含む制御組成物で、非制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物を処理することを含む方法。
2. 物質がメチルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項１の方法。
3. メチルトランスフェラーゼ阻害剤がアザシチジンである、請求項２の方法。
4. 制御組成物がさらにサイトカインを含む、請求項２の方法。
5. サイトカインがＴＧＦ−βである、請求項４の方法。
6. 制御組成物がさらにＴ細胞分化を加速する物質を含む、請求項２の方法。
7. Ｔ細胞分化を加速する物質がレチノイン酸である、請求項６の方法。
8. 制御組成物がさらにヒストンデアセチラーゼ阻害剤である物質を含む、請求項２の方法。
9. ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がトリコスタチンＡである、請求項８の方法。
10. 細胞培養物の処理が、培養の開始時に制御組成物を加えることを含む、請求項１の方法。
11. 培養の開始時での制御組成物の添加に次ぐ第二の時点で、細胞培養物に物質を加えることをさらに含む、請求項１０の方法。
12. 物質が下記から選択されるメンバーである、請求項１１の方法：アザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびそれらの組合せ。
13. 細胞培養物の処理が、培養の開始後に制御組成物を加えることを含む、請求項１の方法。
14. 細胞培養物が、制御組成物による処理の後約１週間維持される、請求項１の方法。
15. 患者における異常な免疫応答または自己免疫疾患を処置する方法であって、制御性Ｔ細胞を該患者に投与することを含み、ここで該制御性Ｔ細胞は、アザシチジン、レチノイン酸、トリコスタチンＡおよびそれらの組合せから選択されるメンバーを含む制御組成物で非制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物を処理して作成される、方法。
16. 制御組成物がさらにＴＧＦ−βを含む、請求項１５の方法。
17. 制御組成物がさらにＩＬ−２を含む、請求項１６の方法。
18. 制御組成物がさらにＴ細胞アクチベーターを含む、請求項１７の方法。
19. 細胞培養物が制御組成物による処理の前に、それと同時にまたはその後に、Ｔ細胞アクチベーターで刺激される、請求項１５の方法。
20. Ｔ細胞アクチベーターが抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８の組合せである、請求項１９の方法。
21. 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を作成する方法であって、Ｔ細胞のＴｒｅｇへの分化を加速する物質を含む制御組成物で非制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物を処理することを含む、方法。
22. Ｔ細胞の分化を加速する物質がレチノイン酸である、請求項２１の方法。
23. 制御組成物がさらに、ＩＬ−２、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２とＴＧＦ−βの組合せから選択されるメンバーを含む、請求項２２の方法。
24. 制御組成物がさらにメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、請求項２３の方法。
25. 制御組成物がさらにヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む、請求項２４の方法。
26. メチルトランスフェラーゼ阻害剤がアザシチジンであり、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がトリコスタチンＡおよびレチノイン酸から選択されるメンバーである、請求項２５の方法。
27. 制御組成物がさらに少なくとも１種のＴ細胞アクチベーターを含む、請求項１８の方法。
28. 以下のものを含んでなる組成物：
    a. 細胞培養培地；
    b. アザシチジン；
    c. レチノイン酸；
    d. 少なくとも１個の未処理ＣＤ４＋細胞を含むＴ細胞集団。
29. Ｔ細胞集団がさらに、少なくとも１個の誘導性制御性Ｔ細胞を含む、請求項２０の組成物。
30. 少なくとも１個の誘導性制御性Ｔ細胞がサプレッサーＴ細胞である、請求項２１の組成物。
31. さらにトリコスタチンＡを含む、請求項２８の組成物。
32. 以下のものを含んでなるキット：
    a. アザシチジン、レチノイン酸およびアザシチジンとレチノイン酸の組合せから選択されるメンバーを含む、制御組成物；
    b. 細胞処理容器；
    c. キットの使用のための指示書。
33. 制御組成物がさらに、ＴＧＦ−β、ＩＬ−２またはＴＧＦ−βとＩＬ−２の組合せを含む、請求項３２のキット。
34. 制御組成物がさらにトリコスタチンＡを含む、請求項３３のキット。
35. 細胞処理容器が白血球フェレーシス装置への取り付けに適合するポートを含む、請求項３２のキット。

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