JP7083190B2 - 制御性ｔ細胞の作製法 - Google Patents
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Description
本特許出願は、日本国特許出願第２０１８－１５５５０７号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、末梢T細胞から制御性T細胞を誘導する方法を提供する。
本願は、末梢T細胞から制御性T細胞を誘導する方法を提供する。
免疫系に内在するCD25陽性CD4陽性制御性T細胞の重要な特徴として、転写因子Foxp3を特異的に発現しており、Foxp3の欠損あるいは突然変異により制御性T細胞の発生および分化、また、抑制機能が障害されることがある。正常なT細胞でもFoxp3を異所性に発現させることにより免疫抑制機能が発揮されるという実験結果から、Foxp3遺伝子は制御性T細胞の発生および機能におけるマスター遺伝子であると考えられている。Foxp3遺伝子に突然変異が生じるとその大半において制御性T細胞の発生が阻害され、その結果、自己抗原および非自己抗原に対する免疫応答の制御が異常をきたすことが報告されている。
マウスのCD4陽性T細胞をIL2とTGFβを含む培地中、抗CD3抗体と抗CD28抗体の存在下で培養し、その後IL2及びTGFβを含む培地にて培養することによってFoxp3を発現し、機能および表現型において内在性の制御性T細胞に類似した誘導性制御性T細胞を実験的に作製することが報告されている（特許文献１）。この他にも末梢T細胞から制御性T細胞を誘導する方法が幾つか提案されている（特許文献２～５）。しかし、誘導性制御性T細胞におけるFoxp3の発現は不安定であり、このことが臨床への応用をはばんでいる。
近年の研究により、誘導性制御性T細胞におけるFoxp3発現の不安定性は、主にFoxp3遺伝子のエピジェネティックな制御の違いに由来すると理解されている。エピジェネティクスとは、DNA塩基配列の変化をともなわず細胞分裂ののちも継承される遺伝子発現あるいは表現型の変化と定義され、遺伝子発現のエピジェネティックな制御とは、DNAの配列は変化することなくDNAやクロマチンの修飾により遺伝子発現が制御されることである。
細胞系譜に特異的な遺伝子発現制御は、転写因子による制御とエピジェネティックな制御に依存することが明らかになってきている。制御性T細胞におけるエピジェネティックな制御として、Foxp3をはじめとする制御性T細胞に特異的なさまざまな機能タンパク質をコードする遺伝子の発現制御領域において、制御性T細胞に特異的な脱メチル化領域が存在する。従来知られている誘導性制御性T細胞ではFoxp3遺伝子をはじめとする制御性T細胞に特異的な遺伝子において、制御性T細胞に特異的な脱メチル化領域がメチル化されたままであり、このため、Foxp3遺伝子を含む制御性T細胞に特異的な遺伝子の発現が不安定であると考えられている（非特許文献１および２）。また、アスコルビン酸などを用いた既存の脱メチル化誘導法では、ヒトT細胞での制御性T細胞特異的脱メチル化の誘導は不可能であった（非特許文献３）。
Floess et al. PLos Biol. (2007) 5(2):169-178
Ohkura et al. Immunity (2012) 785-799
Kasahara et al. Int. Immunol. (2017) 29(10):457-469
本願は、末梢T細胞から制御性T細胞をインビトロで誘導する方法を提供することを目的とする。本願の方法によって誘導される制御性T細胞は、制御性T細胞としての機能を有し、また安定である。制御性T細胞として、様々な免疫疾患、移植臓器の拒絶、自己免疫病などの炎症性疾患の治療や予防、移植免疫寛容の誘導などに用い得る。
本発明者らは、末梢T細胞から制御性T細胞を誘導する際に、末梢T細胞をCD3刺激下、CD28刺激を加えないで培養する工程を経ることによって、機能的に安定な制御性T細胞を誘導できることを初めて見出した。
第１の態様において本願は、哺乳動物由来の末梢T細胞を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養する工程を含む、哺乳動物由来の末梢T細胞から制御性Ｔ細胞を製造する方法を提供する。本態様において、培地にはさらにレチノイン酸および／またはアスコルビン酸を含んでいてもよい。好ましくは培地にはアスコルビン酸を含む。
本態様においては、得られた細胞培養物をさらに、IL-2を含む培地で培養する工程を含んでいてもよい。
本態様においては、得られた細胞培養物をさらに、IL-2を含む培地で培養する工程を含んでいてもよい。
第２の態様において本願はまた、哺乳動物由来の末梢T細胞を第1の態様における方法に供する前に、CD3刺激およびCD28刺激の存在下、IL-2を含有する培地で培養する工程、および得られた培養物をIL-2を含む培地で培養する工程を含む方法を提供する。即ち、本願の第２の態様は（１－１）哺乳動物由来の末梢T細胞をCD3刺激およびCD28刺激の存在下、IL-2を含む培地で培養する工程、（１－２）得られた培養物を、IL-2を含有する培地で培養する工程、および（２）得られた培養物を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養する工程を含む、制御性T細胞の製造方法である。
第２の態様において、（２）の工程は第１の態様と同じ工程であり、培地には更にアスコルビン酸を含んでいてもよいし、得られた培養物をIL-2を含む培地で培養する工程をさらに含んでいてもよい。第２の態様は特にヒト末梢T細胞から制御性T細胞を誘導する際に好適に用いられる。
本願の方法により末梢T細胞から制御性T細胞をインビトロで誘導することができる。本願の方法により得られる制御性Ｔ細胞は、機能的に安定である。即ち本願の方法によって、ヒトを含む哺乳動物の末梢T細胞から制御性T細胞のマスター遺伝子であるFoxp３を安定に発現し、機能的に安定な制御性T細胞を誘導することができる。
本明細書および特許請求の範囲においては、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
本願は、末梢T細胞から制御性T細胞を製造する。本願明細書および請求の範囲において、「末梢T細胞」とは、胸腺外に存在するT細胞をいい、末梢血液、リンパ節、脾臓等から取得することができる。本願において「末梢T細胞」というとき、細胞群に末梢T細胞が含まれていればよく、T細胞が単離されている必要はない。末梢血単核球（PBMC）などT細胞の他にも種々のリンパ球を含む細胞画分を用いてもよい。
末梢T細胞には、ナイーブ制御性T細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞などが含まれている。複数種類のT細胞を含む培養物から制御性T細胞を誘導しても、これらの細胞からCD4陽性T細胞やCD8陽性T細胞など特定の細胞を単離した上で制御性T細胞を誘導してもよい。また、特定の抗原に特異的なT細胞を単離した上で制御性T細胞を誘導してもよい。
なお、本願明細書及び請求の範囲において「CD4陽性」あるいは「CD4+」という場合、特に断りがなければCD4陽性CD8陰性のシングルポジティブ細胞をいうものとする。また「CD8陽性」あるいは「CD8+」という場合は、CD4陰性CD8陽性のシングルポジティブ細胞をいうものとする。
本願明細書および特許請求の範囲において、「制御性T細胞」とは、少なくともCD4、CD25およびFoxp３が陽性である細胞をいう。
本明細書および特許請求の範囲において、「哺乳動物」とは、ヒト及び非ヒト動物、例えばマウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなどであり、特に限定はされない。例えばマウスまたはヒトが例示される。
本願明細書および特許請求の範囲において、「CD28刺激」、「CD3刺激」の語は、細胞上のそれぞれCD28受容体、CD3受容体に特異的な刺激を加える物質を意味する。CD28刺激、CD3刺激としては例えば抗CD28アゴニスト抗体、抗CD3アゴニスト抗体が例示される。本願明細書および請求の範囲において「抗CD28抗体」あるいは「抗CD3抗体」という場合には、それぞれ抗CD28アゴニスト抗体、抗CD3アゴニスト抗体を意味するものとする。抗CD28アゴニスト抗体や抗CD3アゴニスト抗体は研究用試薬として市販されている製品を用いても、常套方法にて作成してもよい。
抗CD3抗体および抗CD28抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシなどの動物由来、及びヒト由来のものが使用できる。
本願の方法において抗体は、培地へ添加しても、培養容器の内壁や、不溶性担体表面に固定化したものを用いてもよい。不溶性担体は、抗CD3抗体や抗CD28抗体を物理的又は化学的に結合できる部材であって、水溶液に対して不溶なものを用いることができる。抗CD3抗体や抗CD28抗体を物理的に吸着可能な素材として、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂やガラスなどがあげられる。不溶性担体の形状は特に限定されず、例えば、プレート形状やビーズ形状、容器形状などが採用できる。
本願の方法において、細胞の培養には、動物細胞培養用基礎培地へ必要な因子を添加した培地を用いる。本願において用い得る動物細胞培養用基礎培地としては、例えば、Iscove's modified Eagle's Medium 培地、Ham's F12培地、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。
基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。無血清培地には必要に応じて、例えば、アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、トランスフェリン、アポトランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロール、モノチオグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。、基礎培地にはまた、脂質（例えば、chemically defined lipid concentrate）、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン類（例えば、ニコチンアミド、アスコルビン酸）、増殖因子、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。
１つの実施態様において、基礎培地としては血清および2-メルカプトエタノールを含むRPMI 1640培地が例示される。
本願の方法において、細胞の培養は一般的な動物細胞培養条件下で行えば良い。培養温度は、以下に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃である。培養は、好適にはCO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
第１の態様において、哺乳動物由来の末梢T細胞を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養する工程を含む、哺乳動物由来の末梢T細胞から制御性Ｔ細胞を製造する方法を提供する。
本願の方法において、CD3刺激として抗CD3抗体を用いる場合、抗CD3抗体は培地中にそのまま添加されても、あるいは培養容器の内壁や、不溶性担体表面に固定化したものを用いてもよい。抗CD3抗体量は使用する抗体の力価や由来により変動するが、制御性T細胞の誘導のための十分な刺激を与えられるよう適宜設定すればよい。
第１の態様において使用されるTGFβとしては、TGFβ1、TGFβ2およびTGFβ3が例示され、例えばTGFβ1である。TGFβの濃度は当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。TGFβとしてTGFβ1を用いる場合、培地中の濃度は特に限定されないが0.25～25ng/mL、例えば約2.5ng/mLとすればよい。
第１の態様において使用される培地中のIL-2の濃度は限定されないが、約5U/mL～約500U/mL、例えば約50U/mLである。
本態様において使用される培地には、さらにレチノイン酸および／またはアスコルビン酸を添加してもよい。好ましくは培地にはアスコルビン酸を含む。アスコルビン酸の濃度は限定されないが、約１～約100μg/mL、例えば約10μg/mLである。
培養日数は、当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。例えば約３日とすればよい。
哺乳動物由来の末梢T細胞を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養することによって、制御性T細胞特異的脱メチル化状態を有する制御性T細胞を誘導することができる。得られた制御性T細胞が、制御性T細胞特異的脱メチル化状態にあることは、例えばFoxp3のCNS2部位が脱メチル化されていることにより確認することができる。
第1の態様において、哺乳動物由来末梢T細胞を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養した後、好ましくはIL-2を含む培地でさらに培養する工程を含む。ここで「IL-2を含む培地でさらに培養する工程」においては、CD3刺激、CD28刺激のようなT細胞受容体への刺激は加えないが、mTOR阻害剤、例えばラパマイシンのような制御性T細胞を安定化させるような因子を添加しても良い。
使用されるIL-2の濃度は限定されないが、例えば約100～500U/mlである。IL-2を含む培地でさらに培養する工程の培養日数は、当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。例えば約４～１０日とすればよい。
IL-2の存在下で、無刺激状態で培養することによって、誘導された制御性T細胞特異的脱メチル化状態を有する制御性T細胞を増殖させることができる。
本願の第２の態様においては、哺乳動物由来の末梢T細胞をCD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養する工程に供する前に、哺乳動物の末梢T細胞を、CD3刺激およびCD28刺激の存在下、IL-2を含む培地で培養し、さらに刺激後の培養物をIL-2を含む培地で培養する工程を含む。即ち本願の第２の態様は、（１－１）哺乳動物由来の末梢T細胞をCD3刺激およびCD28刺激の存在下、IL-2を含む培地で培養する工程、（１－２）得られた培養物をIL-2を含む培地で培養する工程および（２）得られた培養物を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養する工程を含む、制御性T細胞の製造方法である。
本態様において、工程（１－１）は哺乳動物由来の末梢T細胞をCD3刺激およびCD28刺激の存在下、IL-2を含む培地で培養する工程である。
工程（１－１）の培地中のIL-2の濃度は限定されないが、例えば約100～500U/mlとすればよい。本態様において、CD3刺激として抗CD3抗体を用いる場合、CD28刺激として抗CD28抗体を用いる場合、抗CD3抗体および抗CD28抗体はそれぞれ培地中にそのまま添加されても、あるいは培養容器の内壁や、ビーズ表面に固定化したものを用いてもよい。抗CD3抗体量、抗CD28抗体量は使用する抗体の力価や由来により変動するが、適宜定めればよい。工程（１－１）における培養日数は、当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。例えば約３～５日とすればよい。
工程（１－２）は、CD3刺激およびCD28刺激の存在下、IL-2を含む培地で培養した末梢T細胞を、さらにIL-2を含む培地で培養する工程である。
工程（１－２）において「IL-2を含む培地」は、CD3刺激、CD28刺激などのT細胞受容体刺激を含まない。培地中のIL-2の濃度は限定されないが、例えば約100～500U/mlである。本工程における培養日数は、当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。例えば約５～１０日とすればよい。
工程（２）では、工程（１－２）で得た細胞培養物を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養する。本願の第１の態様と同様の工程である。培地がアスコルビン酸をさらに含んでいてもよいこと、またさらにIL-2を含む培地で培養することによって誘導された制御性T細胞の安定した制御性Ｔ細胞培養物を得ることができる。
第２の態様は、特にヒトの末梢T細胞から制御性T細胞を誘導する際に好適に用いることができる。ヒト末梢T細胞は、例えばヒト末梢血単核球である。ヒト末梢T細胞から誘導する場合、工程（２）の培地には、抗サイトカイン中和抗体、例えば抗IFNγ抗体、抗IL-4抗体および抗IL-6抗体、および抗FasL中和抗体、並びにCTLA4-Igのうち１または２以上を添加してもよい。各成分の添加量は適宜定めれば良いが、それぞれ約１μｇ／ｍＬとすることが例示される。
得られた制御性T細胞を含む細胞培養物から制御性T細胞を単離するには、制御性T細胞に特有な細胞表面マーカーに基づいて常套方法により細胞を単離すればよく、例えばセルソーターによりFoxp3陽性分画を取り出せばよい。また、所望により特定の抗原特性を有する制御性T細胞を単離してもよい。
本願の第１の態様および第２の態様に示す方法によって、内在性の制御性T細胞に類似した制御性T細胞特異的脱メチル化状態を有する制御性T細胞を、哺乳動物の末梢T細胞から誘導することができる。
本発明の方法によって得られる制御性T細胞は、ヒトの炎症性疾患、例えば自己免疫疾患やアレルギーの治療に用いることが期待される。また、移植において免疫寛容を誘導するために用いることが期待される。
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
以下の実施例において、RPMI1640（10% FCS (v/v), 60 μg/mL penicillin G, 100 μg/mL streptomycin, 0.1 mM 2-mercaptoethanolを含有）を基礎培地として用いた。
以下の実施例において、RPMI1640（10% FCS (v/v), 60 μg/mL penicillin G, 100 μg/mL streptomycin, 0.1 mM 2-mercaptoethanolを含有）を基礎培地として用いた。
バイサルファイトシーケンス
誘導された細胞よりゲノムDNAを取得し、MethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit (Human Genetic Signatures)を用いて処理後、制御性T細胞に特徴的な遺伝子の脱メチル化について、調べた。各遺伝子の脱メチル化の解析は、既知の方法およびプライマーを用いた(Floess et al.(2007) PloS Biology Volume 5, Issue 2, e38、およびOhkura et al.(2012) Immunity 37(5) 785-799)。
また、マウスFoxp3 CNS2領域の解析においてはプライマーとしてフォワード側に5'-ATTTGAATTGGATATGGTTTGT-3'（配列番号１）、リバース側に5'-AACCTTAAACCCCTCTAACATC-3'（配列番号２）を用い、ヒトFoxp3 CNS2領域の解析においてはフォワード側に5'-TTGGGTTAAGTTTGTTGTAGGATAG-3'（配列番号３）、リバース側に5'-ATCTAAACCCTATTATCACAACCCC-3'（配列番号４）を用いた。
誘導された細胞よりゲノムDNAを取得し、MethylEasy Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification Kit (Human Genetic Signatures)を用いて処理後、制御性T細胞に特徴的な遺伝子の脱メチル化について、調べた。各遺伝子の脱メチル化の解析は、既知の方法およびプライマーを用いた(Floess et al.(2007) PloS Biology Volume 5, Issue 2, e38、およびOhkura et al.(2012) Immunity 37(5) 785-799)。
また、マウスFoxp3 CNS2領域の解析においてはプライマーとしてフォワード側に5'-ATTTGAATTGGATATGGTTTGT-3'（配列番号１）、リバース側に5'-AACCTTAAACCCCTCTAACATC-3'（配列番号２）を用い、ヒトFoxp3 CNS2領域の解析においてはフォワード側に5'-TTGGGTTAAGTTTGTTGTAGGATAG-3'（配列番号３）、リバース側に5'-ATCTAAACCCTATTATCACAACCCC-3'（配列番号４）を用いた。
各Ｔ細胞の画分の取得
Foxp3-eGFP (eFox)レポーターマウス(Ito et al.(2014) Science 346, 363-368)を用いた。Foxp3-eGFP(eFox)レポーターマウスのリンパ節細胞を得、FACSAriaII (BD)によりCD4+GFP+ 細胞をソートすることによって内在性制御性T細胞(nTreg)画分を得た。CD4+GFP-CD44lowCD62Lhigh 細胞をソートしてナイーブT細胞画分を得た。さらにCD4+GFP-CD44highCD62Llow細胞画分を得、エフェクター/メモリーT細胞として用いた。
Foxp3-eGFP (eFox)レポーターマウス(Ito et al.(2014) Science 346, 363-368)を用いた。Foxp3-eGFP(eFox)レポーターマウスのリンパ節細胞を得、FACSAriaII (BD)によりCD4+GFP+ 細胞をソートすることによって内在性制御性T細胞(nTreg)画分を得た。CD4+GFP-CD44lowCD62Lhigh 細胞をソートしてナイーブT細胞画分を得た。さらにCD4+GFP-CD44highCD62Llow細胞画分を得、エフェクター/メモリーT細胞として用いた。
ヒトCD4+T細胞を健常人のPBMCより単離した。濃縮したPBMCを、フロサイトメトリー用抗CD4、抗CD25、および抗CD45RAモノクローナル抗体にて30分間、氷上にて標識した。標識した細胞からFACSAriaIIを用いてCD4+CD25-CD45RA+ 細胞画分を得た。
実施例で用いた抗体は以下である。
マウスT細胞からの制御性T細胞の製造
eFoxレポーターマウスのリンパ節からFACSによってマウスナイーブT細胞を得た。96ウェルプレート(Nunc)中に2x105細胞/ウェルのマウスナイーブT細胞を播種し、抗CD28抗体存在下(最終濃度1μg/mlとなるように培地に添加)または非存在下において、抗CD3抗体（10μg/ml濃度の抗体をウェル当たり100μL添加し、室温で60分間静置することで容器へ固相化）、hIL-2(50U/ml)、hTGFβ1(2.5 ng/ml)を含む基礎培地で3日間刺激した。その後Foxp3陽性細胞をFACSで分離し、バイサルファイトシーケンスを行った（図１）。Foxp3、CTLA4、Eos、Heliosの制御性T細胞特異的な脱メチル化部位、および共通してメチル化されている部位について解析を行った。抗CD28抗体を含む条件では、制御性T細胞特異的な脱メチル化部位の脱メチル化はほとんど起こらなかった。一方、抗CD28抗体を含まない条件では脱メチル化が起こっており、より内在性制御性T細胞に近い性質を持つ制御性T細胞が得られたことが確認された。
eFoxレポーターマウスのリンパ節からFACSによってマウスナイーブT細胞を得た。96ウェルプレート(Nunc)中に2x105細胞/ウェルのマウスナイーブT細胞を播種し、抗CD28抗体存在下(最終濃度1μg/mlとなるように培地に添加)または非存在下において、抗CD3抗体（10μg/ml濃度の抗体をウェル当たり100μL添加し、室温で60分間静置することで容器へ固相化）、hIL-2(50U/ml)、hTGFβ1(2.5 ng/ml)を含む基礎培地で3日間刺激した。その後Foxp3陽性細胞をFACSで分離し、バイサルファイトシーケンスを行った（図１）。Foxp3、CTLA4、Eos、Heliosの制御性T細胞特異的な脱メチル化部位、および共通してメチル化されている部位について解析を行った。抗CD28抗体を含む条件では、制御性T細胞特異的な脱メチル化部位の脱メチル化はほとんど起こらなかった。一方、抗CD28抗体を含まない条件では脱メチル化が起こっており、より内在性制御性T細胞に近い性質を持つ制御性T細胞が得られたことが確認された。
また、同じ実験系で培養した細胞のFoxp3発現をFACSで比較した。抗CD28抗体を含まない条件で得られた細胞ではFoxp3発現率および発現細胞数が増加していることが確認された（図２）。
脱メチル化に対するアスコルビン酸の優位性
実施例１と同じ実験系において、アスコルビン酸を基礎培地に10μｇ/mlまたは30μg/ml加えてアスコルビン酸の効果を調べた。結果を図３に示す。アスコルビン酸を添加すると、脱メチル化の程度がさらに上昇することが確認された。
実施例１と同じ実験系において、アスコルビン酸を基礎培地に10μｇ/mlまたは30μg/ml加えてアスコルビン酸の効果を調べた。結果を図３に示す。アスコルビン酸を添加すると、脱メチル化の程度がさらに上昇することが確認された。
制御性T細胞の安定性、表面分子マーカー発現およびIn vitro抑制活性
実施例２と同じ実験系により制御性T細胞を得た。得られた制御性T細胞にCD3/CD28 Dynabeadsを細胞数：ビーズ＝１：１となるように添加し、抗CD3/抗CD28抗体で再刺激した。再刺激時、再刺激の1日後、2日後および3日後におけるFoxp3の安定性を調べた（図４）。CD28刺激なしで誘導した制御性T細胞は、再刺激によるFoxp3の発現量の変化が少なく、Foxp3を安定に発現していることが確認された。また、再刺激時および再刺激の3日後における表面分子マーカーの発現を調べた（図６）。再刺激の3日後においても、制御性T細胞の表面分子マーカーであるCTLA4、GITR、CD25およびc-Relはいずれも安定に発現していた。
実施例２と同じ実験系により制御性T細胞を得た。得られた制御性T細胞にCD3/CD28 Dynabeadsを細胞数：ビーズ＝１：１となるように添加し、抗CD3/抗CD28抗体で再刺激した。再刺激時、再刺激の1日後、2日後および3日後におけるFoxp3の安定性を調べた（図４）。CD28刺激なしで誘導した制御性T細胞は、再刺激によるFoxp3の発現量の変化が少なく、Foxp3を安定に発現していることが確認された。また、再刺激時および再刺激の3日後における表面分子マーカーの発現を調べた（図６）。再刺激の3日後においても、制御性T細胞の表面分子マーカーであるCTLA4、GITR、CD25およびc-Relはいずれも安定に発現していた。
次に、実施例２と同じ実験系で作製した制御性T細胞のIn vitro抑制活性を調べた（図５）。CFSE標識したレスポンダーT細胞（5x104）、作製した制御性T細胞(5x104)および抗原提示細胞(2x104)を、抗CD3抗体（1ug/ml）存在下で3日間混合培養し、CFSE強度をFACSで解析した。ここで抗原提示細胞は、マウスリンパ節からMHC Class II(+)細胞をFACSでソートすることにより得た。レスポンダーT細胞が免疫反応を起こすと細胞増殖のためにCFSE強度は複数の弱いピークを示すが、この免疫反応が抑制されるとCFSE強度は単独の強いピークのまま保持される。CD28刺激なしで誘導した制御性T細胞は、レスポンダーT細胞の免疫反応を強く抑制することが確認された。したがって、CD28刺激なしで誘導した制御性T細胞は、従来の方法で得られた制御性T細胞と比較して機能的にも安定していることが確認された。
制御性T細胞の安定化培養
実施例１の方法で作製した制御性T細胞をさらにIL-2のみを含む基礎培地で2日間または4日間培養（安定化培養）した。CD28刺激なしで誘導した制御性T細胞は安定化培養後においてもFoxp3を安定に発現していることが確認された（図７）。
実施例１の方法で作製した制御性T細胞をさらにIL-2のみを含む基礎培地で2日間または4日間培養（安定化培養）した。CD28刺激なしで誘導した制御性T細胞は安定化培養後においてもFoxp3を安定に発現していることが確認された（図７）。
次に、実施例１の方法で作製した制御性T細胞と、その後さらに4日間安定化培養した制御性T細胞のRNA-seqデータを比較した（図８）。RNA-seqは既知の方法を用いて行った(Kitagawa et al.(2017) Nat. Immunol. 18, 173-183)。UCSC Ref genome data (mm9)にマッピングしたRow Tag Count dataを負の2項分布モデリング(DESeq2 ;Love, 2014)により検定し、False Discovery Rate(FDR)を算出した。Foxp3、CD25、およびTregの主要な抑制性分子であるGranzymeB(Gzmb)などの遺伝子は、安定化培養後の制御性T細胞において有意に発現が上昇していた(FDR<0.05；図８の点線より上の遺伝子)。また、Bcl2の発現上昇はin vivo生存性の上昇を示唆しているものと考えられる。安定化培養後の制御性T細胞において有意に発現が減少した遺伝子には、LckおよびZap70などのTCRシグナル関連分子ならびにその下流のエフェクターT細胞分化因子（例えばTh17関連因子であるRorgT(Rorc)およびBhlhe40）が多く認められた（図８の点線より下の遺伝子）。また、Bcl6などの濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh)に関連する遺伝子の発現減少なども認められた(データ示さず)。
Thy1.2／eFoxレポーターマウスから実施例１の方法で制御性T細胞を作製し、上記と同様に4日間安定化培養した。安定化培養した細胞からFoxp3陽性細胞（2x105個）をFACSにより分離し、Thy1.1／野生型マウスに尾静脈投与した。2週間後に移入したThy1.2細胞をリンパ節から回収し、Foxp3発現を解析した（図９）。CD28刺激なしで誘導し、安定化培養を行った制御性T細胞は、in vivoにおいて2週間経過後もFoxp3を安定に発現していることが確認された。
DO11.10マウスから採取したCD4+細胞を実施例１の方法で制御性T細胞に転換し、4日間安定化培養した。DO11.10マウスはOVA特異的なT細胞を高発現するトランスジェニックマウスであり、該方法によりOVA特異的な制御性T細胞を含む制御性T細胞画分を作製することができる。この制御性T細胞(2x105)をDO11.10/RagKOマウスに尾静脈投与し、OVA/Alumを用いて免疫した際のT細胞活性化状態を解析した（図１０）。ここでDO11.10/RagKOマウスではOVA刺激によってT細胞が活性化されるが、CD28刺激なしで誘導し、安定化培養を行った制御性T細胞は、CD28刺激ありで誘導された制御性T細胞と比較してT細胞の免疫反応を強く抑制していることが確認された。
野生型マウスの腹部に2,4-ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)を塗布し、5日後にエフェクター細胞(CD4+GFP-CD44highCD62Llow細胞)を回収した。回収したエフェクター細胞を実施例１の方法で制御性T細胞に転換し、4日間安定化培養した。この制御性T細胞(2x105)を野生型マウスに尾静脈投与すると共に、野生型マウスの腹部にDNFBを塗布し、感作を行った。6日後に耳介にDNFBを塗布し、皮膚炎症を誘導した。その2日後に組織の表現型を調べ、また所属リンパ節から採取したT細胞のFACS解析を行った（図１１）。CD28刺激なしで誘導し、安定化培養を行った制御性T細胞は、CD28刺激ありで誘導された制御性T細胞よりも皮膚炎症を抑制できることが確認された。
ヒトT細胞からの制御性T細胞の製造
ヒトCD4+CD25-CD45RA+T細胞(ヒトT細胞）を抗CD3抗体、抗CD28抗体、およびIL-2を含む基礎培地で3日間刺激した。その後IL-2のみを添加した基礎培地で4日間前処理培養した。前処理培養後の細胞または未処理のヒトT細胞を、抗CD28抗体存在下(最終濃度1μg/mlとなるように培地に添加)または非存在下において、抗CD3抗体(10μg/ml濃度の抗体をウェル当たり100μL添加し、室温で60分間静置することで容器へ固相化)の存在下、IL-2(50U/ml)、TGF-β(2.5ng/ml)、抗IFN-g抗体(最終濃度1μg/mL)、抗IL-4抗体(最終濃度1μg/mL)、抗IL-6抗体(最終濃度1μg/mL)、抗Fasリガンド抗体(最終濃度1μg/mL)およびCTLA4-Ig（最終濃度1μg/mL）を含む基礎培地で3日間刺激した。その後、Foxp3陽性細胞をFACSにて回収し、バイサルファイトシーケンスを行いFoxp3のCNS2領域の脱メチル化を調べた。結果を図１２に示す。
前処理培養を行わない条件では、Foxp3の脱メチル化はほとんど起こらなかった。一方、前処理培養後にCD28刺激なしで培養することで、Foxp3 CNS2領域の脱メチル化が確認された。この結果から、ヒトT細胞においても、あらかじめ前処理培養を行うことで安定な制御性T細胞を製造できることが確認された。また、マウスと同様にアスコルビン酸による脱メチル化効果も認められた（図１３）。
ヒトCD4+CD25-CD45RA+T細胞(ヒトT細胞）を抗CD3抗体、抗CD28抗体、およびIL-2を含む基礎培地で3日間刺激した。その後IL-2のみを添加した基礎培地で4日間前処理培養した。前処理培養後の細胞または未処理のヒトT細胞を、抗CD28抗体存在下(最終濃度1μg/mlとなるように培地に添加)または非存在下において、抗CD3抗体(10μg/ml濃度の抗体をウェル当たり100μL添加し、室温で60分間静置することで容器へ固相化)の存在下、IL-2(50U/ml)、TGF-β(2.5ng/ml)、抗IFN-g抗体(最終濃度1μg/mL)、抗IL-4抗体(最終濃度1μg/mL)、抗IL-6抗体(最終濃度1μg/mL)、抗Fasリガンド抗体(最終濃度1μg/mL)およびCTLA4-Ig（最終濃度1μg/mL）を含む基礎培地で3日間刺激した。その後、Foxp3陽性細胞をFACSにて回収し、バイサルファイトシーケンスを行いFoxp3のCNS2領域の脱メチル化を調べた。結果を図１２に示す。
前処理培養を行わない条件では、Foxp3の脱メチル化はほとんど起こらなかった。一方、前処理培養後にCD28刺激なしで培養することで、Foxp3 CNS2領域の脱メチル化が確認された。この結果から、ヒトT細胞においても、あらかじめ前処理培養を行うことで安定な制御性T細胞を製造できることが確認された。また、マウスと同様にアスコルビン酸による脱メチル化効果も認められた（図１３）。
本願の方法により末梢T細胞から制御性T細胞を安定に誘導することができる。本願の方法により誘導される制御性T細胞は、様々な免疫疾患、移植臓器の拒絶、自己免疫病などの炎症性疾患の治療や予防、移植免疫寛容の誘導のために用いることが期待される。
Claims (7)
- 哺乳動物由来の末梢T細胞を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβ、IL-2およびアスコルビン酸を含む培地で培養する工程を含む、制御性T細胞の製造方法。
- 哺乳動物由来の末梢T細胞を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養する工程、および
得られた細胞培養物を、IL-2を含む培地で培養する工程を含む、制御性T細胞の製造方法。 - （１－１）哺乳動物由来の末梢T細胞をCD3刺激およびCD28刺激の存在下、IL-2を含む培地で培養する工程、
（１－２）得られた培養物を、IL-2を含む培地で培養する工程、および
（２）得られた培養物を、CD3刺激の存在下、CD28刺激の不存在下でTGFβおよびIL-2を含む培地で培養する工程を含む、制御性T細胞の製造方法。 - （２）の工程において、培地がさらにアスコルビン酸を含む、請求項３に記載の方法。
- （２）の工程で得られた培養物を、IL-2を含む培地で培養する工程をさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
- 哺乳動物由来の末梢T細胞が、ヒト由来の末梢T細胞である、請求項３～５のいずれかに記載の方法。
- ヒト由来の末梢T細胞が、ヒト末梢血単核球である、請求項６記載の方法。
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| The Journal of Immunology (2016) Vol.196, pp.2119-2131 |
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