WO2012096376A1 - 制御性ｔ細胞の製造方法 - Google Patents

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cell
antibody
cultured
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敬章 片山
広文 吉岡
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell population containing regulatory T cells useful in the medical field.
  • Regulatory T cells are generally defined as T cells that have a function of suppressing abnormal or excessive immune responses and are responsible for immune tolerance. Decrease or dysfunction of regulatory T cells in humans causes autoimmune diseases and allergies. Therefore, quantitative or qualitative control of regulatory T cells is useful for the treatment of autoimmune diseases and allergies, and further, treatment of refractory graft-versus-host disease (GVHD: Graft Versus Host Disease), etc. It is expected to become a new cell therapy in the field of transplant immunity.
  • GVHD Graft Versus Host Disease
  • This regulatory T cell is roughly classified into an endogenous regulatory T cell (nTreg: Naturally Occurring Regulatory T cell) and an inducible regulatory T cell (iTreg: Inducible Regulatory T cell).
  • Endogenous regulatory T cells are defined as those that differentiate in the thymus and are naturally produced independent of external antigen sensitization.
  • inducible regulatory T cells are defined as those induced to differentiate from peripheral naive T cells in response to foreign antigen stimulation in an artificial tolerance induction model. These regulatory T cells are further subdivided according to the type of marker expressed in the cells.
  • CD4 positive hereinafter also referred to as “CD4 + ”
  • CD25 + CD25 positive
  • regulatory T cells one of the endogenous regulatory T cell groups, is removed from the living body. Then, various organ-specific autoimmune diseases spontaneously develop, and when CD4 + CD25 + regulatory T cells are transplanted, the onset of autoimmune diseases is prevented, so that endogenous CD4 + CD25 + regulatory properties are obtained. T cells are thought to play an important role in maintaining immune tolerance in the periphery. Later, the function of CD4 + CD25 + regulatory T cells was analyzed in detail, suppressing not only autoimmunity but also most immune responses such as inflammation due to foreign antigens, allergies, transplant rejection, infection immunity, tumor immunity, etc. It has become clear to get. At present, the transcription factor Foxp3 has been clarified as a master regulator of CD4 + CD25 + regulatory T cells (for example, Non-Patent Document 1).
  • the following two methods are mainly conceivable as a method for producing regulatory T cells from the peripheral blood of a patient by expansion culture.
  • One is a method in which a T cell-containing fraction derived from peripheral blood is subjected to expansion culture, and regulatory T cells are selected during the culture process or after completion of the culture.
  • the other is a method of expanding culture using regulatory T cells previously separated from peripheral blood as a starting material.
  • regulatory T cells have poor proliferation ability compared with other T cells in vitro, and there is an operation of selecting regulatory T cells having a reduced abundance ratio from a wide variety of expanded cell groups. There is a problem that it is difficult.
  • Foxp3 expressed in regulatory T cells is an intracellular molecule, in order to confirm its expression, it is necessary to perform permeabilization of the cell membrane for staining. Therefore, the expression of Foxp3 cannot be used as an index when separating live cells.
  • Non-Patent Document 2 Japanese Patent Document 2
  • Non-patent Document 3 Regulatory T cell expansion culture method using anti-CD3 antibody that is a CD3 activator
  • Non-patent Document 3 regulatory T cell expansion culture method using anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody in combination
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a cell population containing regulatory T cells, a cell population produced by the method, and a medicament containing the cell population.
  • the present inventors have significantly increased the cell proliferation of the CD25 positive T cell population by causing a CD3 activator to act in the presence of fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof, and Foxp3 positive regulatory T cells. It has been found that a cell population containing can be produced. Furthermore, in the method for expanding regulatory T cells using a CD3 activator and CD28 ligand together, the cell proliferation of the CD25 positive T cell population is significantly increased by coexisting fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof. The present inventors have found that a cell population containing Foxp3-positive regulatory T cells can be efficiently produced, and have completed the present invention.
  • the first invention of the present invention relates to a method for producing a cell population containing regulatory T cells, which comprises the following steps: (1) separating a CD25 positive T cell population from a cell population containing T cells; and (2) obtained in step (1) in the presence of a CD3 activator and fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof. Culturing a cell population in vitro.
  • the method of culturing the cell population obtained in step (1) in vitro includes the step of culturing in the presence of CD28 ligand. It is included in a method for producing a cell population containing T cells.
  • the CD28 ligand may be an anti-CD28 antibody.
  • the CD25 positive T cell population may be a CD4 positive CD25 positive T cell population
  • the CD3 activator may be an anti-CD3 antibody.
  • the second invention of the present invention relates to the cell population produced in the first aspect of the present invention.
  • the third aspect of the present invention relates to an immunosuppressive agent comprising the cell population produced in the first aspect of the present invention.
  • the present invention relates to a cell population containing Foxp3-positive regulatory T cells produced in the first aspect of the present invention.
  • an immunosuppressive agent comprising a cell population containing Foxp3-positive regulatory T cells produced in the first invention aspect of the present invention.
  • a cell population containing regulatory T cells can be efficiently expanded in vitro.
  • Regulatory T cells produced by this method are useful as an immunosuppressant for the prevention and treatment of organ transplant rejection, allergic diseases, autoimmune diseases, graft-versus-host disease (GVHD) and the like.
  • T cells are also called T lymphocytes, mean cells derived from the thymus among lymphocytes involved in the immune response, and include differentiated T cells and undifferentiated T cells.
  • T cells include helper T cells (Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, Tfh), regulatory T cells, cytotoxic T cells, naive T cells, memory T cells, ⁇ chain Known are ⁇ T cells that express TCR of ⁇ chain, ⁇ T cells that express TCR of ⁇ chain and ⁇ chain, NKT cells, and the like.
  • Regulatory T cells mean T cells that have the ability (immunosuppressive activity) to inhibit the activation (proliferation, cytokine production, etc.) of effector T cells when stimulated via a T cell receptor. . Regulatory T cells are usually present in the CD4 + CD25 + T cell fraction. Regulatory T cells themselves do not show a substantial proliferative response to stimulation through T cell receptors and may be unresponsive.
  • the transcription factor Foxp3 is known as a master regulator of CD4 + CD25 + regulatory T cells (where “+” indicates that the molecule is expressed on the cell surface (positive)) The same shall apply hereinafter.
  • CD4 + CD25 + T cell population cells positive for both L-selectin (CD62L) and CCR7 have a particularly strong immunosuppressive activity among regulatory T cells, and CD45RA + CD4 + It has been reported that the proportion of cells positive for both CD62L and CCR7 is increased by expanding the CD25 + T cell (naive regulatory T cell) population [Blood, 108, 4260-4267. (2006)]. Moreover, it has been reported that CD27 expression correlates with Foxp3 expression and immunosuppressive activity in the expanded cultured CD4 + CD25 + T cell population [Immology, Vol. 121, pp. 129-139 (2007)]. ].
  • production of a cell population containing regulatory T cells means a concept including proliferation (expansion culture) of regulatory T cells. According to the present invention, a cell population containing a high ratio of regulatory T cells having particularly strong immunosuppressive activity can be efficiently obtained.
  • fibronectin and fragments thereof may be isolated from nature, artificially prepared, or recombinantly prepared by genetic engineering, that is, non-natural. Fibronectin and its fragments are described in, for example, Ruoslati E. [Ruoslahti E. et al. , Et al. , Journal of Biological Chemistry, Vol. 256, No. 14, pp. 7277-7281 (1981)], manufactured in a substantially pure form from a naturally occurring substance. can do.
  • Ruoslati E. Ruoslahti E. et al. , Et al. , Journal of Biological Chemistry, Vol. 256, No. 14, pp. 7277-7281 (1981)
  • substantially pure fibronectin or fibronectin fragment means that they are essentially free of other proteins that are naturally present with fibronectin.
  • the above fibronectin and fragments thereof can be used in the present invention alone or in combination with a plurality of types.
  • the domain structure of fibronectin is divided into seven, and the amino acid sequence includes three kinds of similar sequences, and the whole is constituted by repetition of these sequences. Three similar sequences are called type I, type II and type III, respectively.
  • the 12th, 13th and 14th (hereinafter referred to as III-12, III-13 and III-14, respectively) are contained in the heparin binding domain.
  • a region called IIICS exists on the C-terminal side of the heparin-binding domain.
  • IIICS has a region called CS-1, which consists of 25 amino acids and has binding activity to VLA-4.
  • the fibronectin fragment that can be used in the present invention may be a fragment containing any domain of III-7, 8, 9, 11, 12, 13 or CS-1, and is a fragment in which a plurality of domains are repeatedly linked. There may be.
  • a fragment containing a cell adhesion domain containing a ligand for VLA-5, a heparin binding domain, a CS-1 domain that is a ligand for VLA-4, and the like is used in the present invention.
  • Examples of the recombinant fragment include CH-271 (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) described in Journal of Biochemistry, Vol.
  • CH- Examples include 296 (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing), H-271 (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing), H-296 (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), or derivatives or modifications thereof.
  • the aforementioned CH-296 is a recombinant fibronectin fragment having a cell adhesion domain, a heparin binding domain and a CS-1 domain, and is commercially available under the name of RetroNectin (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the “CD25 positive T cell population” means a T cell population that is positive for CD25.
  • a CD4 positive CD25 positive T cell population that is positive for both CD4 and CD25 is a CD25 positive T cell population.
  • Method for producing cell population containing regulatory T cells comprises a first step of separating a CD25 + T cell population from a cell population containing T cells, The CD25 + T cell population obtained by the step is performed by a second step of culturing in the presence of a CD3 activator and fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof.
  • CD4 + cells are preferentially expanded over CD8 + cells by co-stimulation with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody, and further CD4 by co-stimulation with CH-296, an anti-CD3 antibody and fibronectin fragment. It has been reported that CD8 + cells are preferentially expanded rather than + cells [Cancer Gene Therapy, Vol. 15, pp. 508-516 (2008)].
  • the present inventors have found that by culturing in the presence of the CD25 + T cell population CD3 activator and fibronectin or a fragment or a mixture thereof that, cell proliferation rate of the CD25 + T cell population is significantly increased efficiency It was found that a cell population containing well Foxp3-positive regulatory T cells can be produced.
  • the present invention is not particularly limited as a “cell population containing T cells”, but peripheral blood mononuclear cells (PBMC), peripheral lymphocytes, cord blood mononuclear cells and the like are exemplified. .
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • various cell populations derived from blood cells containing T cells can be used in the present invention. These cells may be activated in vivo (in vivo) or ex vivo (ex vivo) by cytokines such as IL-2.
  • cytokines such as IL-2.
  • those collected from a living body or those obtained through in vitro culture may be used as they are, or may be used after being cryopreserved.
  • a cell population obtained from a cell population obtained from a living body through various induction operations or separation operations for example, a CD25 + cell population separated from PBMC or the like can be used.
  • a material containing the cells for example, blood such as peripheral blood or umbilical cord blood, blood from which components such as red blood cells or plasma are removed, bone marrow fluid, or the like is used. You can also
  • the step of separating the CD25 + T cell population from the T cell-containing cell population can be performed using a known method such as a method using a flow cytometer or an immunomagnetic bead method.
  • a CD25 + T cell population can be separated by selectively recovering CD25 + cells that are sorted by staining with a fluorescently labeled anti-CD25 antibody.
  • a CD25 + T cell population can be isolated by selectively recovering CD25 + cells that are targeted to another marker [eg, glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR)].
  • GITR glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor
  • the CD25 + CD4 + T cell population is separated by selectively recovering CD25 + and CD4 + cells that are sorted by co-staining with fluorescently labeled anti-CD25 antibody and anti-CD4 antibody. Can do.
  • the immunomagnetic bead method is a method of separating cells by using magnetic beads combined with various antibodies and a magnet together.
  • kits for isolating CD25 + CD4 + T cells include Dynabeads Regulatory CD4 + CD25 + T Cell Kit (manufactured by Invitrogen), CD4 + CD25 + Regulatory T Cell Isolation Kit (Milten) CD25 + CD4 + T cells can be isolated according to the instruction manual attached to.
  • the operation of obtaining a cell population having a high content of CD25 + CD4 + T cell also the first step in the present invention It is one mode.
  • the CD25 + CD4 + T cell population obtained by the method exemplified above can also be used as a starting material for the method for producing a cell population containing regulatory T cells of the present invention.
  • the CD25 + T cell population obtained in the first step is cultured in the presence of a CD3 activator and fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof.
  • the present invention comprising these two steps, it is possible to produce a cell population containing regulatory T cells in vitro. Furthermore, the regulatory T cells obtained by this method are useful as an immunosuppressive agent for organ transplant rejection, allergic diseases, autoimmune diseases, graft-versus-host diseases (GVHD, etc., cell therapy, etc. It is suitable for use in.
  • GVHD graft-versus-host diseases
  • the second step is usually used for the culture of lymphocytes in the presence of the active ingredients characterizing the production method of the present invention, that is, a CD3 activator and fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof. It is carried out in a medium containing general components.
  • the medium used in the method for producing a cell population containing regulatory T cells of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-mentioned active ingredients. Components suitable for maintaining and growing the CD25 + T cell population are mixed.
  • the produced well-known culture medium can be used, for example, a commercially available culture medium and its modification may be sufficient. These media may contain appropriate proteins, cytokines, and other components in addition to the original components.
  • a medium containing IL-2 is used in the present invention.
  • the concentration of IL-2 in the medium is not particularly limited.
  • IL-7 IL-7, IL-15, IL-21, etc.
  • lymphocyte stimulating factor such as lectin, or rapamycin which is an immunosuppressive agent
  • the CD3 activator used in the present invention as an active ingredient is not particularly limited as long as it has a T cell receptor or CD3 binding activity.
  • anti-CD3 antibody concanavalin A (ConA), phytohemagglutinin Examples include (PHA), allo MHC molecules, antigens presented by artificial antigen-presenting cells and dendritic cells, and the like.
  • an anti-CD3 monoclonal antibody is used in the present invention, and for example, OKT3 [Science, 206, 347-349 (1979)] is particularly suitable.
  • the concentration of CD3 ligand in the medium is not particularly limited. For example, when an anti-CD3 monoclonal antibody is used, 0.001 to 100 ⁇ g / mL, particularly 0.01 to 50 ⁇ g / mL is preferable.
  • the concentration of fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof used in the present invention as an active ingredient is not particularly limited.
  • 0.001 to 500 ⁇ g / mL, particularly 0.01 to 100 ⁇ g / mL is preferable. .
  • a CD28 ligand may be added to the medium as necessary.
  • the CD28 ligand used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance having a binding activity to CD28, and examples thereof include an anti-CD28 antibody.
  • the concentration of CD28 ligand in the medium is not particularly limited. For example, when an anti-CD28 monoclonal antibody is used, 0.001 to 100 ⁇ g / mL, particularly 0.01 to 20 ⁇ g / mL is preferable.
  • the culture in the presence of CD28 ligand may be performed only in a part of the culture process, or the entire culture may be performed in the presence of the above components.
  • CD3 activator “fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof” and “CD28 ligand” are not only dissolved and coexisting in a medium, but also an appropriate solid phase, for example, Cell culture equipment such as petri dishes, flasks, bags, etc. (including both open and closed systems), or immobilized on cell culture carriers such as beads, membranes, glass slides, etc. May be.
  • the material of the solid phase is not particularly limited as long as it can be used for cell culture.
  • the component is solid-phased on the device, when the medium is put in the device, the device has a ratio similar to a desired concentration when the component is dissolved in the medium and used.
  • the amount of the solid phase of the component is not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • the carrier is used by immersing it in a culture solution in a cell culture equipment during cell culture. When solidifying the component on the carrier, the medium to be placed in the equipment so that when the carrier is placed in the medium, the ratio is the same as the desired concentration when the component is dissolved in the medium. It is preferable to solid-phase a certain amount of each component with respect to the amount, but the amount of the solid-phased component is not particularly limited as long as a desired effect is obtained.
  • immobilization of the component is performed according to a known method, for example, a fibronectin fragment immobilization method described in WO 97/18318 pamphlet and WO 00/09168 pamphlet. Can be done.
  • an active ingredient other than “CD3 activator”, “fibronectin or a fragment thereof or a mixture thereof” and “CD28 ligand” may be immobilized on a cell culture device or a cell culture carrier.
  • anti-4-1BB antibody, anti-OX40 antibody, anti-GITR antibody, CD80, CD86, 4-1BBL, OX40L and the like are exemplified.
  • the cell population and the solid phase are obtained in the process of obtaining a cell population containing regulatory T cells by the method of the present invention.
  • the active ingredient and the cell population can be easily separated only by separation, and contamination of the active ingredient and the like into the cell population can be prevented.
  • the second step in the method of the present invention may include culturing in a medium containing no active ingredient, which is carried out following the cultivation of the CD25 + T cell population in the presence of the active ingredient.
  • a medium having the same composition may be used except that it does not contain “CD3 activator”, “fibronectin or a fragment thereof, or a mixture thereof”, or both. May be used.
  • the culture period in the presence of the active ingredient may be 1 day or longer, preferably 2 days or longer, and the period may be within 8 days, preferably 6 Within days.
  • the medium containing the active ingredient again, or the cell culture equipment or cell culture in which the active ingredient is solidified after or during the culture in the medium not containing the active ingredient Culture may be performed using a carrier for use.
  • a medium containing no serum or plasma can be used, but serum or plasma may be added to the medium.
  • the amount added to these media is not particularly limited, but a content of more than 0 to 20% by volume, preferably more than 0 to 6% by volume is exemplified, and serum or plasma used depending on the culture stage The amount of can be changed.
  • the serum or plasma concentration can be decreased in stages and used.
  • the origin of serum or plasma may be either self (meaning that the origin is the same as the cell to be cultured) or non-self (meaning that the origin is different from the cell to be cultured). From this point of view, self-derived ones are preferably used.
  • the number of cells at the start of the culture used in the present invention is not particularly limited. For example, it is preferably 10 2 to 1 ⁇ 10 8 cells / mL, more preferably 10 3 to 5 ⁇ 10 7 cells / mL. mL, more preferably 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the conditions normally used for cell culture can be used. For example, it can be cultured in conditions such as 37 °C, 5% CO 2.
  • operations such as dilution by adding a fresh medium to the cell culture medium at an appropriate time interval, exchanging the medium, and exchanging the cell culture equipment can be performed.
  • a cell culture equipment used in the manufacturing method of this invention For example, a petri dish, a flask, a bag, a large culture tank, a bioreactor etc. can be used.
  • a bag a CO 2 gas permeable bag for cell culture can be used.
  • a large culture tank can be used.
  • cultivation can be implemented in any of an open system or a closed system, it is preferable to culture by a closed system from a viewpoint of the safety
  • the total number of culture days in the culture in the presence and absence of active ingredients is preferably 5 to 40 days, more preferably 6 to 35 days, and even more preferably 7 to 30 days. It is. Within this range, the number of cells that can be used for general immunotherapy can be obtained, and the period during which cell growth is maintained well may be selected as appropriate.
  • the cell population obtained by the production method of the present invention is positive for both CD4 and CD25 and has a high content of Foxp3-positive cells. Furthermore, the content rate of cells in which both CD4 and CD25 are positive and both CD62L and CCR7 are positive is high. As described above, cells positive for CD4, CD25, CD62L and CCR7 are known to be regulatory T cells with strong immunosuppressive activity.
  • cells contained in a high ratio in the cell population obtained by the production method of the present invention are regulatory T cells with strong immunosuppressive activity.
  • the production method of the present invention is an expanded culture that is superior to the conventional method using only anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody in that the proliferation of regulatory T cells is better.
  • the production method of the present invention may further include a step of separating regulatory T cells from the obtained cell population. That is, in the present invention, a cell population enriched with regulatory T cells is prepared by separating cells other than regulatory T cells from regulatory T cells in a cell population containing regulatory T cells. And can be used. Isolation of regulatory T cells can be performed according to a known method.
  • the regulatory T cells having a high immunosuppressive activity can be isolated by recovering the target. Further, by removing cells other than regulatory T cells from the cell population obtained by the production method of the present invention, a cell population containing a high amount of regulatory T cells can be obtained. In addition, the cell population containing a high amount of regulatory T cells in the present invention may include a cell population containing only regulatory T cells.
  • a method for producing a cell population containing regulatory T cells into which a desired gene has been introduced utilizing the above-described “method for producing a cell population containing regulatory T cells”.
  • the method includes a gene introduction step in addition to the first step and the second step described above.
  • the gene introduction step for introducing a desired gene into a cell population containing regulatory T cells can be carried out after the completion of the first step, simultaneously with the second step, or after the completion of the second step.
  • the efficiency of gene introduction into a cell population containing regulatory T cells is improved. That is, the cell population produced by the method of the present invention is a cell population containing a high percentage of regulatory T cells into which a desired gene has been introduced.
  • the present invention is particularly useful for the production of cells for gene therapy.
  • the desired gene to be introduced into the cell population containing regulatory T cells is not particularly limited, and any gene desired to be introduced into the cell can be selected from a self-derived gene or a foreign gene.
  • a gene for example, a gene encoding an antisense nucleic acid, siRNA (small interfering RNA) or ribozyme can be used in addition to a gene encoding a protein (for example, an enzyme, cytokines, receptors, etc.).
  • an appropriate marker gene that enables selection of the gene-introduced cell and a suicide gene for selectively removing the gene-introduced cell may be introduced together with the gene. That is, the number of desired genes to be introduced is not limited, and a plurality of genes can be introduced.
  • the desired gene to be introduced may have been obtained from nature, or may have been genetically engineered, or may be a DNA molecule of different origin bound by a known means such as ligation. Also good. Furthermore, it may have a sequence in which a mutation is introduced into a natural sequence depending on the purpose.
  • one embodiment of the present invention includes introduction of a gene encoding a receptor that recognizes a desired antigen.
  • the gene includes a gene encoding a T cell receptor (TCR) that recognizes the surface antigen of the target cell, or an antigen recognition site of an antibody against the surface antigen of the target cell, a transmembrane domain and an intracellular domain derived from the receptor molecule. Examples include genes encoding chimeric receptors.
  • the cell population containing regulatory T cells into which this gene has been introduced is a cell population containing regulatory T cells that recognize a desired antigen.
  • the cell population is a cell population having a high specificity for a desired antigen as compared to a cell population into which a gene encoding a receptor has not been introduced. It is useful for use in immunotherapy because it can react specifically with cells presenting the.
  • the desired gene can be used by being inserted into a vector or a plasmid so that it can be expressed under the control of an appropriate promoter, for example.
  • promoters or other regulatory elements that cooperate with the transcription initiation site such as enhancer sequences or terminator sequences, may be present in the vector.
  • enhancer sequences or terminator sequences may be present in the vector.
  • the gene may be placed between flanking sequences.
  • the means for introducing a desired gene in the gene introduction step is not particularly limited, and an appropriate one can be selected and used by a known gene introduction method.
  • the gene introduction method any of a method using a viral vector and a method not using the vector can be used in the present invention. Much literature has already been published about the details of these methods.
  • the viral vector is not particularly limited, and is a known viral vector commonly used in gene transfer methods, such as retroviral vectors (including lentiviral vectors and pseudotype vectors), adenoviral vectors, adeno-associated viral vectors, and simian.
  • retroviral vectors including lentiviral vectors and pseudotype vectors
  • adenoviral vectors adeno-associated viral vectors
  • simian adeno-associated viral vectors
  • Viral vectors, vaccinia virus vectors, Sendai virus vectors and the like can be used.
  • retroviral vectors, adenoviral vectors or lentiviral vectors are used.
  • those lacking replication ability are preferable so that they cannot self-replicate in infected cells.
  • the present invention is not limited as a gene introduction method without using a viral vector, for example, a method using a carrier such as a liposome or a ligand-polylysine, a calcium phosphate method, an electroporation method, a particle gun method or the like is used. be able to. In this case, a foreign gene incorporated into plasmid DNA, linear DNA or RNA is introduced.
  • Retrovirus vectors and lentiviral vectors can stably incorporate a foreign gene inserted into the chromosomal DNA of a cell into which the vector is introduced, and are used for gene therapy and other purposes. Since the vector can infect cells that are dividing and proliferating, it is particularly suitable for gene transfer by the production method of the present invention. Many retrovirus vectors and lentivirus vectors have been published in the literature and are already commercially available. These known vectors can be used in the present invention.
  • these vectors can be prepared as virus particles in which the vector is packaged by using a known packaging cell line.
  • retrovirus-producing cells can be prepared using 293 cells or 293T cells with high transfection efficiency.
  • retroviruses and lentiviruses produced by pseudotype packaging having an envelope derived from a virus different from that derived from the virus genome can also be used in the present invention.
  • a pseudo-type retrovirus having an envelope derived from Moloney murine leukemia virus (MoMLV), gibbon leukemia virus (GaLV), vesicular stomatitis virus (VSV) or feline endogenous virus (feline endogenous virus) can be used.
  • retroviruses and lentiviruses having a sugar chain modified envelope or other membrane protein on their surface can also be used in the present invention.
  • gene transfer efficiency can be improved by using a functional substance having a retrovirus binding activity.
  • a target cell-specific gene transfer can be carried out in combination with a functional substance having target cell binding activity (for example, International Publication No. 95/26200, International Publication No. 97/18318, International Publication No. (See Publication No. 00/01836 pamphlet).
  • gene transfer into a cell population containing regulatory T cells can be achieved by the method of the present invention in which gene transfer is performed after the end of the first step, simultaneously with the second step, or after the end of the second step. It becomes possible to carry out efficiently.
  • the method of the present invention does not require any special equipment or apparatus, and is effective for various retroviral vectors and target cells. Furthermore, since the method is suitable for use in a closed system, it is very useful in clinical applications such as gene therapy.
  • the step of culturing the gene-transferred cells obtained in the gene transfer step when the gene transfer step is performed after the end of the second step may be included.
  • the culture step can be performed in the same manner as the second step.
  • the total number of days of culture in the method for producing a cell population containing regulatory T cells into which the gene of the present invention has been introduced may be the same as that in which no gene introduction is performed.
  • Medicament comprising a cell population containing regulatory T cells produced by the method of the present invention
  • the cell population produced by the method of the present invention has a strong immunosuppressive activity, so an immune reaction in vivo due to some cause In the patient's body, such as by administering the cell population to the patient when an undesired immune response is occurring abnormally or an undesirable immune response is occurring or when an undesirable immune response is predicted in the future. Abnormally enhanced undesirable immune reactions can be suppressed or avoided.
  • the present invention provides an immunosuppressant comprising a cell population that can be produced by the above method.
  • the immunosuppressive agent of the present invention includes rejection in organ transplantation, autoimmune disease, allergic disease (hay fever, food allergy, drug allergy, asthma, atopic dermatitis, eczema, food sensitivity, hives, allergic rhinitis, Allergic conjunctivitis) and graft-versus-host disease (GVHD) are useful for prevention and treatment.
  • the immunosuppressive agent of the present invention can be produced as an oral / parenteral preparation by mixing a cell population containing an effective amount of the regulatory T cells with a pharmaceutically acceptable carrier according to conventional means. .
  • the immunosuppressive agent of the present invention is usually produced as a parenteral preparation such as an injection, a suspension, an infusion.
  • Carriers that can be included in the parenteral preparations include, for example, aqueous solutions for injection such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride).
  • aqueous solutions for injection such as physiological saline
  • isotonic solutions containing glucose and other adjuvants eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride.
  • a liquid can be mentioned.
  • the immunosuppressant of the present invention includes, for example, a buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, procaine, etc.), a stabilizer (for example, human serum). Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants, immunosuppressants (such as rapamycin), antibody preparations, cell preparations (regulatory dendritic cells) and the like.
  • a buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, benzalkonium chloride, procaine, etc.
  • a stabilizer for example, human serum.
  • Albumin polyethylene glycol, etc.
  • preservatives such as rapamycin
  • immunosuppressants such as rapamycin
  • antibody preparations such as rapamycin
  • cell preparations regulatory dendritic cells
  • the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to mammals such as humans, for example.
  • the dose of the cell population containing the regulatory T cells of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, and the like, but usually in an adult patient (with a body weight of 60 kg), for example, parenterally In the case of administration, it is convenient to administer an effective amount up to about 2.6 ⁇ 10 9 cells per day. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
  • an anti-CD28 antibody (CD28.2, manufactured by Biolegend) is added to the cell suspension so as to have a final concentration of 1 ⁇ g / mL and a group in which the anti-CD28 antibody is not added are prepared.
  • the plate was added to an immobilized plate or an anti-CD3 antibody-immobilized plate at 0.2 mL / well, and culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). On the second day of culture, 0.1 mL of the above culture medium was added. Cells were collected on the 4th day of culture, 0.6 mL of culture medium was added, and the whole amount was re-wound into a 48-well plate for cell culture.
  • the cell growth rate is shown in FIG. In FIG. 1, the vertical axis represents the cell growth rate (hereinafter, “fold expansion” in each figure).
  • “CD3” indicates a cell cultured on an anti-CD3 antibody-immobilized plate
  • “RNCD3” indicates a cell cultured on a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate
  • “CD28” indicates a group to which an anti-CD28 antibody is added
  • ⁇ indicates a group to which no anti-CD28 antibody is added.
  • the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed higher cell growth rate than the cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • Even in the presence of the anti-CD28 antibody the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed higher cell growth rate than the cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • FIG. 2 shows the ratio of cultured cells expressing Foxp3, which is a master regulator of regulatory T cells.
  • FIG. 2 shows that PE-Cy7-labeled anti-human CD4 antibody (Becton Dickinson) and FITC-labeled anti-human CD25 antibody (Becton Dickinson) were added to the cultured cells, reacted at 4 ° C. for 20 minutes, stained, and then treated with PE anti.
  • -The result of having measured FoxP3 positive cell rate by MACSQuant (made by Miltenyi Biotech) using human FoxP3 Staining Set (made by eBioscience) is shown.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive and Foxp3 positive cells.
  • the absolute number of cultured cells expressing Foxp3 is shown in FIG.
  • the vertical axis represents the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 1 and the positive rate in FIG. From FIG. 3, the number of CD4-positive, CD25-positive, and Foxp3-positive cells increased in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate compared to the condition cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • Example 2 Regulatory T Cell Culture Method Using Surface Untreated Plate (1) Preparation of Fibronectin Fragment / Anti-CD3 Antibody Immobilized Plate and Anti-CD3 Antibody Immobilized Plate As in Example 1- (1) Then, an anti-CD3 antibody solution and a mixed solution of anti-CD3 antibody and retronectin were prepared, added to a surface-untreated 96-well flat plate at 0.1 mL / well, and left at 37 ° C. for 4 hours. After standing, each lysate is removed, and each plate is washed twice with PBS at a volume of 0.2 mL / well to prepare fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate and anti-CD3 antibody immobilized plate. did.
  • Example 2 Culture of regulatory T cells
  • a cell population containing many CD4-positive and CD25-positive cells was obtained. These cells were mixed with GT-T503 medium containing 5% autologous plasma, 600 IU / mL IL-2, 0.2% HSA, 2.5 ⁇ g / mL fungizone (hereinafter referred to as 3.2 ⁇ 10 5 cells / mL). This was suspended in a culture medium). Further, anti-CD28 antibody (CD28.2) was added to the cell suspension so as to have a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and 0. 5 was added to the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate or anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • GT-T503 medium containing 5% autologous plasma, 600 IU / mL IL-2, 0.2% HSA, 2.5 ⁇ g / mL fungizone (hereinafter referred to as 3.2 ⁇ 10 5 cells / mL).
  • the culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) at 2 mL / well.
  • 0.1 mL of the above culture medium was added.
  • the cells were collected, 0.2 mL of culture medium was added, and the whole amount was re-wound into a 48-well plate for cell culture.
  • the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 4.0 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 1 mL / well in a 24-well plate for cell culture.
  • On the ninth day of culture 1 mL of culture medium was added and re-wound.
  • the cells were collected, and the cell growth rate and Foxp3-positive cell rate were measured.
  • FIG. 4 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis represents the number of days from the start of culture, and the vertical axis represents the cell growth rate.
  • CD3 + CD28 is a cell cultured on an anti-CD3 antibody-immobilized surface-untreated plate in the presence of anti-CD28 antibody
  • RNCD3 + CD28 is a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody solid phase in the presence of anti-CD28 antibody.
  • the cells cultured on the non-treated surface untreated plate are shown. From FIG. 4, even when immobilized on a surface untreated plate, the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate are higher than those cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate.
  • the cell growth rate was shown.
  • the ratio of cultured cells expressing Foxp3 was measured in the same manner as in Example 1- (2). The result is shown in FIG. In FIG. 5, the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive and Foxp3 positive cells. From FIG. 5, even when cultured on the surface untreated plate, the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate is more in comparison with the cell population cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. The proportion of CD4 positive, CD25 positive and Foxp3 positive cells was high.
  • FIG. 6 shows the absolute number of cultured cells expressing Foxp3.
  • the vertical axis represents the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 4 and the positive rate in FIG.
  • FIG. 6 shows that even when cultured on a surface-untreated plate, cells cultured on a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate are more CD4-positive and CD25 than those cultured on an anti-CD3 antibody-immobilized plate. The number of positive and Foxp3-positive cells was significantly increased.
  • Example 3 Measurement of growth inhibitory activity of cultured cells on CD4-positive cells (1) Preparation of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate According to the procedure described in Example 2- (1), Fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate were prepared using a surface-untreated 96-well flat plate.
  • Example 2 Culture of regulatory T cells
  • a cell population containing many CD4-positive and CD25-positive cells were obtained. These cells were suspended in a culture medium having the same composition as that described in Example 2- (2) so as to be 6 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • anti-CD28 antibody CD28.2 was added to the cell suspension so as to have a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and 0. 5 was added to the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate or anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • the culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) at 2 mL / well.
  • the cells On the third day of culture, 0.1 mL of the above culture medium was added. On the fourth day of culture, the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 4 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 0.5 mL / well in a 48-well plate for cell culture. On the fifth day of culture, the cells were collected, 2.5 mL of culture medium was added, and the whole amount was re-wound in a 12-well plate for cell culture. On the 7th day of culture, the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 4.32 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 5.0 mL / well in a 12-well plate for cell culture. On the 10th day from the start of the culture, the cells were collected, and the cell growth rate, Foxp3-positive cell rate, and proliferation inhibitory activity against CD4-positive cells were measured.
  • FIG. 7 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of culture, and the vertical axis indicates the cell growth rate.
  • the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed higher cell growth rate than the cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • the ratio of cultured cells expressing Foxp3 was measured in the same manner as in Example 1- (2). The result is shown in FIG. In FIG. 8, the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive and Foxp3 positive cells.
  • FIG. 8 shows that the proportion of CD4-positive, CD25-positive, and Foxp3-positive cells in the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate is higher than that on the cell population cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. Was high.
  • FIG. 9 The absolute number of cultured cells expressing Foxp3 is shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 7 and the positive rate in FIG.
  • FIG. 9 shows that the number of CD4-positive, CD25-positive, and Foxp3-positive cells is significantly higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. Increased.
  • CD4 positive cells and CD4 negative cells were obtained from PBMC of the same donor as the cells used in this Example (2) using CD4 microbeads (Miltenyi Biotech). It was. CD4 negative cells were irradiated with 30 Gy X-rays, and GT-T503 medium containing 5% autologous plasma, 0.2% HSA, 2.5 ⁇ g / mL fungizone (hereinafter referred to as “this”) to 1 ⁇ 10 6 cells / mL. was used as a medium for measuring inhibitory activity).
  • CD4 positive cells are suspended in a suppressive activity measurement medium containing CFSE (manufactured by Sigma Aldrich) having a final concentration of 2 ⁇ M, treated with a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 8 minutes, and the cells are cultured in the suppressive activity measurement medium. After washing 4 times, the suspension was suspended in a medium for measuring inhibitory activity so as to be 1 ⁇ 10 6 cells / mL. This is the responder cell.
  • X4-irradiated CD4 negative cells and CFSE-treated responder cells were mixed 1: 1 (hereinafter referred to as Tres), and anti-CD3 antibody (OKT3) was added to a final concentration of 200 ng / mL.
  • the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate are a cell population that suppresses the cell proliferation of the responder cells, similar to the cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. It was.
  • Example 4 Measurement of growth inhibitory activity of cultured cells against CD4-positive cells (1) Preparation of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate According to the procedure described in Example 2- (1), Fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate were prepared using a surface-untreated 96-well flat plate.
  • Example 2 Culture of regulatory T cells
  • a cell population containing many CD4-positive and CD25-positive cells were obtained. These cells were suspended in a culture medium having the same composition as that described in Example 2- (2) so as to give 4.05 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • anti-CD28 antibody CD28.2 was added to the cell suspension so as to have a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and 0. 5 was added to the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate or anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • the culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) at 2 mL / well.
  • the cells On the first day of culture, 0.05 mL of the above culture medium was added.
  • the cells On the 4th day of culture, the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 2 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 1.0 mL / well in a 48-well plate for cell culture.
  • the cells On the 6th day of culture, the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 4 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 2.0 mL / well in a 12-well plate for cell culture.
  • On the 8th day of culture cells were collected, 1 mL of culture medium was added, and the whole amount was rewound in a 12-well plate for cell culture.
  • the cells On the 11th day from the start of the culture, the cells were collected, and the cell growth rate, Foxp3-positive cell rate, CD62L-positive and CCR7-positive cell rate, and growth inhibitory
  • FIG. 11 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of culture, and the vertical axis indicates the cell growth rate. From FIG. 11, the cell growth rate was higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate.
  • FIG. 12 shows that an APC-Cy7-labeled anti-human CD4 antibody (Becton Dickinson) was added to cultured cells, reacted at 4 ° C. for 20 minutes, stained, and then subjected to a PE-anti-human FoxP3 Staining Set to determine the FoxP3 positive cell rate. The result measured by FACSCanto (made by Becton Dickinson) is shown.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive and Foxp3 positive cells. From FIG.
  • the proportion of CD4-positive and Foxp3-positive cells was higher in the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate than on the cell population cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • Fig. 13 shows the absolute number of cultured cells expressing Foxp3.
  • the vertical axis represents the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 11 and the positive rate in FIG. From FIG. 13, the number of CD4-positive and Foxp3-positive cells was significantly increased in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate compared with the condition cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • FIG. 14 shows APC-Cy7-labeled anti-human CD4 antibody, PE-Cy7-labeled anti-human CD62L antibody (Becton Dickinson), PE-labeled anti-human CD25 antibody (Becton Dickinson) and FITC-labeled anti-human CCR7 antibody. (R & D Systems Co., Ltd.) is added and reacted at 4 ° C. for 20 minutes. After staining, the results measured with FACSCanto are shown. In FIG.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive, CD62L positive, and CCR7 positive cells.
  • FIG. 14 shows that the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate compared with the cell population cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate was CD4 positive, CD25 positive, CD62L positive, and CCR7 positive cells. The rate was high.
  • Fig. 15 shows the absolute number of cultured cells expressing CD62L and CCR7.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 11 and the positive rate in FIG. 14.
  • FIG. 15 shows that the number of CD4-positive, CD25-positive, CD62L-positive, and CCR7-positive cells is higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. Increased significantly.
  • Example 3- (3) the proliferation inhibitory activity of the cells obtained in this Example (2) on responder cells was measured with FACSCanto.
  • the growth inhibitory activity against CD4 positive cells is shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the ratio of CFSE weakly positive cells among all CFSE positive cells, that is, the proportion of divided cells in responder cells, and the horizontal axis indicates the mixing ratio of responder cells and cultured cells. From FIG. 16, in the sample added with the cultured cells (“CD3 + CD28” or “RNCD3 + CD28”), the cell proliferation of the responder cells increases as the mixed ratio of the cultured cells increases compared to the sample “Tres” that does not include the cultured cells.
  • the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate are a cell population that suppresses the cell proliferation of the responder cells, similar to the cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. It was.
  • Example 5 Measurement of growth inhibitory activity of cultured cells against CD8 positive cells (1) Preparation of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate According to the procedure described in Example 2- (1), Fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate were prepared using a surface-untreated 96-well flat plate.
  • CD4 + CD25 + CD45RA + Regulatory T Cell Isolation Kit from PBMC prepared from healthy individuals with informed consent, CD4 + CD25 positive and CD45RA positive cells are included A cell population was obtained. These cells were suspended in a culture medium having the same composition as that described in Example 2- (2) so as to be 1.8 ⁇ 10 5 cells / mL. Further, anti-CD28 antibody (CD28.2) was added to the cell suspension so as to have a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and 0. 5 was added to the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate or anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • CD28.2 anti-CD28 antibody
  • the culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) at 2 mL / well. On the first day of culture, 0.1 mL of the above culture medium was added. On the fourth day of culture, 0.05 mL of culture medium was added. On the fifth day of culture, the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 3 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 0.5 mL / well in a 48-well plate for cell culture.
  • the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 8 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 1.0 mL / well in a 24-well plate for cell culture. The cells were collected on the 11th day from the start of the culture, and the cell growth rate, Foxp3-positive cell rate, CD62L-positive and CCR7-positive cell rate, and growth inhibitory activity against CD8-positive cells were measured.
  • FIG. 17 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of culture, and the vertical axis indicates the cell growth rate. From FIG. 17, the cell growth rate was higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate.
  • FIG. 18 shows APC-Cy7-labeled anti-human CD4 antibody, APC-labeled anti-human CCR7 antibody (manufactured by R & D Systems), PE-Cy7-labeled anti-human CD62L antibody and FITC-labeled anti-human CD25 antibody (Becton Dickinson). And the reaction was carried out at 4 ° C. for 20 minutes, followed by staining, and the rate of Foxp3-positive cells was measured with FACSCanto using PE anti-human FoxP3 Staining Set.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive, and Foxp3 positive cells.
  • the vertical axis indicates the ratio of CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive, CD62L positive and CCR7 positive cells.
  • FIG. 19 shows that the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate is more CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive and CD62L positive than the cell population cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. And the ratio of CCR7 positive cells was high.
  • FIG. 20 shows the absolute number of cultured cells expressing Foxp3.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 17 and the positive rate in FIG.
  • FIG. 20 shows that the number of CD4-positive, CD25-positive, and Foxp3-positive cells is significantly higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. Increased.
  • FIG. 21 The absolute number of cultured cells expressing CD62L and CCR7 is shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 17 and the positive rate in FIG.
  • FIG. 21 shows that the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate were more CD4-positive, CD25-positive, Foxp3-positive, CD62L-positive, and CCR7 than the conditions cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. There was a marked increase in the number of positive cells.
  • CD8 positive cells and CD8 negative cells were obtained from PBMC of the same donor as the cells used in this Example (2) using CD8 microbeads (Miltenyi Biotech). It was. The CD8 negative cells and CD8 positive cells were subjected to the same operations as the CD4 negative cells and CD4 positive cells of Example 3- (3), respectively, to obtain a mixed cell solution containing CD8 positive responder cells. The growth inhibitory activity of the cultured cells obtained in this Example (2) against responder cells was measured with FACSCanto. The growth inhibitory activity against CD8 positive cells is shown in FIG. In FIG.
  • the vertical axis indicates the ratio of CFSE weakly positive cells among all CFSE positive cells, that is, the ratio of divided cells in the responder cells
  • the horizontal axis indicates the mixing ratio of the responder cells and the cultured cells.
  • Example 6 Measurement of DNA methylation degree in TSDR of cultured cells (1) Preparation of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate As in Example 1- (1), anti-CD3 An antibody solution and a mixed solution of anti-CD3 antibody and retronectin were prepared, added to a surface-untreated 96-well flat plate in an amount of 0.1 mL / well, and left overnight at 4 ° C. Then, after each plate was left at 37 ° C.
  • Example 5- (2) Culture of regulatory T cells
  • a cell population containing many CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive cells was obtained. These cells were suspended in a culture medium having the same composition as that described in Example 2- (2) so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • anti-CD28 antibody CD28.2 was added to the cell suspension so as to have a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and 0. 5 was added to the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate or anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • the culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) at 2 mL / well.
  • FIG. 23 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of culture, and the vertical axis indicates the cell growth rate.
  • the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed higher cell growth rate than the cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • FIG. 24 shows that APC-Cy7-labeled anti-human CD4 antibody, PE-Cy7-labeled anti-human CD27 antibody (Becton Dickinson) and FITC-labeled anti-human CCR7 antibody were added to the cultured cells, reacted at 4 ° C. for 20 minutes, and stained.
  • the rate of FoxP3-positive cells was measured with FACSCanto using PE anti-human FoxP3 Staining Set.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive and Foxp3 positive cells. From FIG.
  • CD4-positive and Foxp3-positive cells were higher in the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate than on the cell population cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • FIG. 25 the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, Foxp3 positive and CCR7 positive cells.
  • FIG. 25 shows that the proportion of CD4-positive and Foxp3-positive or CCR7-positive cells in the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate compared to the cell population cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. was high.
  • FIG. 26 the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, Foxp3 positive and CD27 positive cells.
  • FIG. 26 shows that the proportion of CD4-positive and Foxp3-positive or CD27-positive cells in the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate compared to the cell population cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. was high.
  • Fig. 27 shows the absolute number of cultured cells expressing Foxp3.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 23 and the positive rate in FIG. From FIG. 27, the number of CD4-positive and Foxp3-positive cells was significantly increased in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate compared to the condition cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • the absolute number of cultured cells expressing CCR7 is shown in FIG. In FIG. 28, the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 23 and the positive rate in FIG. FIG. 28 shows that the number of CD4-positive, Foxp3-positive, and CCR7-positive cells is significantly higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. Increased.
  • the absolute number of cultured cells expressing CD27 is shown in FIG. In FIG. 29, the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of the culture by the cell growth rate in FIG. 23 and the positive rate in FIG. FIG. 29 shows that the number of CD4-positive, Foxp3-positive, and CD27-positive cells is significantly higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. Increased.
  • PCR reaction solution was 50 ⁇ L [10X EpiTaq PCR Buffer (Mg2 + free) 5 ⁇ L, dNTP Mixture (2.5 mM each) 6 ⁇ L, 25 mM MgCl 2 5 ⁇ L, TaKaRa EpiTaq HS (5 U / mL) 1 ⁇ L each 10 ⁇ L, each primer 10 ⁇ L
  • the PCR reaction conditions were (98 ° C. 10 seconds) ⁇ (55 ° C. 30 seconds) ⁇ (72 ° C. 30 seconds) (40 cycles), and finally (72 ° C. 7 minutes), and TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (Takara) PCR reaction was carried out using Biotech).
  • FIG. 30 shows the results of agarose electrophoresis using 2 ⁇ L of the reaction solution after the reaction.
  • “Tconv” indicates a cell obtained by culturing PBMC on an anti-CD3 antibody-immobilized plate. From FIG. 30, the single amplification and size (336 bp) of the PCR product of each sample were confirmed. Next, 2 ⁇ L of the PCR product was used, and TA cloning was performed using T-vector pMD20 (Takara Bio) and DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (Takara Bio). Thereafter, 5 ⁇ L of the above ligation solution was used. E.
  • coli HST08 Premium Competent Cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were reacted at 42 ° C. for 45 seconds for transformation. After culturing at 37 ° C. for 1 hour in an SOC medium, it was inoculated on an LB medium plate containing ampicillin coated with X-gal (manufactured by Takara Bio Inc.) and cultured at 37 ° C. overnight. Thereafter, 24 clones of white colonies were picked up and cultured overnight in LB medium at 37 ° C., and glycerol was added to a final concentration of 17% to prepare a glycerol stock. For the sequence reaction, base sequence information was obtained by entrusting base sequence analysis (TAKARA BIO INC.) With a plate unit using M13-47 primer.
  • the obtained base sequence was analyzed using QUAMA (RIKEN) software. As exclusion conditions, the lower limit of bisulfite conversion efficiency was 95%, and the upper limit of the number of alignment mismatches was 15.
  • the frequency of DNA methylation of TSDR is shown in FIG. In FIG. 31, the horizontal axis represents the DNA methylation site of TSDR, and the vertical axis represents the sample name. From FIG. 31, the frequency of methylation at any DNA methylation site was lower in cells in which regulatory T cells were isolated and cultured than in cells in which normal T cells were cultured.
  • FIG. 32 The results of DNA methylation of each clone are shown in FIG. In FIG. 32, the horizontal axis indicates the DNA methylation site, the vertical axis indicates each clone, the black circle indicates that the site is “methylated”, and the white circle indicates that the site is “demethylated”. It shows that. As shown in FIG. 32, almost all clones in which normal T cells were cultured were “methylated”, whereas in cells in which regulatory T cells were isolated and cultured, all DNA methylation sites were “de-methylated”. The majority of the clones were “methylated”.
  • the cells obtained by culturing the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate can stably express Foxp3 similarly to the cells obtained by culturing the anti-CD3 antibody-immobilized plate. It became clear that the cell population was rich in cells.
  • Example 7 Method of culturing regulatory T cells using immobilized plate of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody (1) Fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate and fibronectin fragment / anti-CD3 antibody / anti-antibody Preparation of CD28 antibody-immobilized plate In the same manner as in Example 1- (1), an anti-CD3 antibody solution and a mixed solution of anti-CD3 antibody and retronectin were prepared, and 0.1 mL / well was added to a surface-untreated 96-well flat plate. And left at 4 ° C. overnight.
  • fibronectin fragment for the preparation of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody-immobilized plate, fibronectin fragment (retronectin) was 25 ⁇ g / mL or 5 ⁇ g / mL, and anti-CD3 antibody 5 ⁇ g / mL and anti-CD28 antibody (CD28 2) was dissolved in PBS to 5 ⁇ g / mL, added to a surface-untreated 96-well flat plate in an amount of 0.1 mL / well, and allowed to stand at 4 ° C. overnight. Then, after each plate was left at 37 ° C.
  • Example 5- (2) Culture of regulatory T cells
  • a cell population containing many CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive cells was obtained. These cells were suspended in a culture medium having the same composition as that described in Example 2- (2) so as to obtain 0.85 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • anti-CD28 antibody CD28.2 was added to the cell suspension to a final concentration of 2 ⁇ g / mL. The cell suspension was added to each plate at 0.1 mL / well, and culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • FIG. 33 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis represents the number of days from the start of culture, and the vertical axis represents the cell growth rate.
  • “RNhiCD3 + CD28” is a cell cultured on a plate on which 25 ⁇ g / mL fibronectin fragment and anti-CD3 antibody are immobilized in the presence of an anti-CD28 antibody, and “RNloCD3 + CD28” is an anti-CD28 antibody.
  • RNhiCD3CD28 was cultured on a plate on which 25 ⁇ g / mL fibronectin fragment, anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody were immobilized.
  • RNloCD3CD28 indicates a cell cultured on a plate on which 5 ⁇ g / mL fibronectin fragment, anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody are immobilized. From FIG.
  • the conditions under which the fibronectin fragment was cultured at a low concentration (5 ⁇ g / mL) showed a high cell growth rate, similar to the conditions cultured at a high concentration (25 ⁇ g / mL). Similarly, a high cell growth rate was exhibited even under conditions in which the anti-CD28 antibody was cultured on a solid-phased plate.
  • FIG. 34 shows the ratio of cultured cells expressing Foxp3.
  • APC-Cy7-labeled anti-human CD4 antibody was added to the cultured cells, reacted at 4 ° C. for 20 minutes and stained, and then the rate of Foxp3-positive cells was measured with FACSCanto using PE anti-human FoxP3 Staining Set.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive and Foxp3 positive cells. From FIG. 34, the ratio of CD4 positive and Foxp3 positive cells was high in the cell population cultured under any condition.
  • Fig. 35 shows the absolute number of cultured cells expressing Foxp3.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 33 and the positive rate in FIG. From FIG. 35, the number of CD4-positive and Foxp3-positive cells was remarkably increased under any condition.
  • Example 8 Method of culturing regulatory T cells by restimulation (1) Preparation of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate According to the procedure described in Example 6- (1) A fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and an anti-CD3 antibody-immobilized plate were prepared using a treated 96-well flat plate.
  • Example 5- (2) Culture of regulatory T cells
  • a cell population containing many CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive cells was obtained. These cells were suspended in a culture medium having the same composition as that described in Example 2- (2) so as to be 1.5 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • anti-CD28 antibody CD28.2 was added to the cell suspension so as to have a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and 0. 5 was added to the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate or anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • the culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) at 2 mL / well.
  • FIG. 36 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of culture, and the vertical axis indicates the cell growth rate. From FIG. 36, the cell culture magnification was higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate.
  • the ratio of cultured cells expressing Foxp3 was measured in the same manner as in Example 5- (2). The result is shown in FIG. In FIG. 37, the vertical axis represents the ratio of CD4 positive and Foxp3 positive cells. From FIG. 37, compared to cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate, the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate have the same proportion of CD4 positive, CD25 positive and Foxp3 positive cells. It was a little expensive.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive, CD62L positive and CCR7 positive cells.
  • FIG. 38 shows that the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate is more CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive, CD62L positive, and CCR7 than the cell population cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. The percentage of positive cells was similar or slightly higher.
  • FIG. 39 shows the absolute number of cultured cells expressing Foxp3.
  • the vertical axis represents the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 36 and the positive rate in FIG. From FIG. 39, the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate has a remarkable number of CD4-positive, CD25-positive and Foxp3-positive cells compared to the cell population cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. Increased.
  • FIG. 40 shows the absolute number of cultured cells expressing CD62L and CCR7.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 36 and the positive rate in FIG. From FIG. 40, the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate were CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive, CD62L positive, and CCR7 positive cells as compared with the cells cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. The number increased significantly.
  • Example 3 Culture of regulatory T cells by restimulation culture The same composition as that described in Example 2- (2) so that the cells prepared in this Example (2) have 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL. In the culture medium. Further, anti-CD28 antibody (CD28.2) was added to the cell suspension so as to have a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate prepared in this Example (1) It added to a 0.2 mL / well CD3 antibody immobilized plate, CO 2 incubator (37 °C, 5% CO 2 ) was initiated restimulated cultured.
  • CD28.2 anti-CD28 antibody
  • the cells were collected and suspended in a culture medium equivalent to the culture solution, and the whole amount was reapplied to a surface untreated 48-well plate.
  • a culture medium equivalent to the culture solution On the 4th day of the re-stimulation culture, 0.2 mL of the culture medium was added, and on the 5th day of the re-stimulation culture, 0.5 mL of the culture medium was added.
  • the cells On day 7 after the start of restimulation culture, the cells were collected, and the cell growth rate, Foxp3-positive cell rate, and CCR7-positive cell rate were measured.
  • FIG. 41 shows changes with time in the cell growth rate after restimulation.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of restimulation culture, and the vertical axis indicates the cell growth rate. From FIG. 41, compared with the conditions cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate, the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed a higher cell growth rate.
  • FIG. 42 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of culture, and the vertical axis indicates the cell growth rate. From FIG. 42, the cells cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed higher cell growth rate than the cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • FIG. 43 shows the ratio of cultured cells expressing Foxp3.
  • FIG. 43 shows that after adding APC-Cy7-labeled anti-human CD4 antibody, APC-labeled anti-human CCR7 antibody and FITC-labeled anti-human CD25 antibody to cultured cells and reacting at 4 ° C. for 20 minutes, staining was performed, and then PE anti-human FoxP3 Staining Set was used to measure the Foxp3-positive cell rate with FACSCanto.
  • the vertical axis indicates the ratio of CD4 positive, CD25 positive, and Foxp3 positive cells. From FIG.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive and CCR7 positive cells. From FIG. 44, the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate is more CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive and CCR7 positive than the cell population cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. The percentage of cells was high.
  • the absolute number of cultured cells expressing Foxp3 is shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 42 and the positive rate in FIG.
  • FIG. 45 shows that the number of CD4-positive, CD25-positive, and Foxp3-positive cells is significantly higher in the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody immobilized plate than on the condition cultured on the anti-CD3 antibody immobilized plate. Increased.
  • FIG. 46 shows the absolute number of cultured cells expressing CCR7.
  • the vertical axis represents the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 42 and the positive rate in FIG.
  • FIG. 46 shows that the number of CD4-positive, CD25-positive, Foxp3-positive, and CCR7-positive cells is more marked in the cells cultured in the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate than in the cells cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. Increased to.
  • Example 9 Method of culturing regulatory T cells in the presence of rapamycin (1) Preparation of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate In the same manner as in Example 1- (1), A CD3 antibody solution and a mixed solution of anti-CD3 antibody and retronectin were prepared, each added to a surface-untreated 96-well flat plate in an amount of 0.1 mL / well, and left at 4 ° C. overnight. Thereafter, each plate was allowed to stand at 37 ° C.
  • Example 5- (2) Culture of regulatory T cells
  • a cell population containing many CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive cells was obtained. These cells were suspended in a culture medium having the same composition as that described in Example 2- (2) so as to be 0.6 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • anti-CD28 antibody CD28.2 was added to the cell suspension so as to have a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and 0. 5 was added to the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate or anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • the culture was started in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) at 2 mL / well.
  • Example (2) Culture of regulatory T cells by addition of rapamycin
  • the cells prepared in this Example (2) have the same composition as that described in Example 2- (2) so as to be 2.0 ⁇ 10 5 cells / mL. It was suspended in the culture medium. Furthermore, anti-CD28 antibody (CD28.2) was added to the cell suspension to a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and rapamycin (manufactured by Sigma Aldrich) was added to a final concentration of 2 nM. In addition, about the cell liquid culture
  • rapamycin-added culture On day 5 of rapamycin-added culture, 0.5 mL of culture medium was added to the group not added with rapamycin. In the group to which rapamycin was added, the cells were collected, suspended in a culture medium containing 2 nM rapamycin so as to be 4 ⁇ 10 5 cells / mL, and 0.5 mL / well in a surface-untreated 48-well plate. Re-wound. On day 7 after the start of the culture with rapamycin, the cells were collected, and the cell growth rate, Foxp3-positive cell rate, CD62L-positive and CCR7-positive cell rate were measured.
  • FIG. 47 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis indicates the number of days from the start of culture
  • the vertical axis indicates the cell growth rate
  • the arrow indicates the timing at which rapamycin is added.
  • “RNCD3 + CD28” is a cell cultured on a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate in the presence of an anti-CD28 antibody
  • “CD3 + CD28 + Rapa” is a rapamycin added in the presence of an anti-CD28 antibody.
  • “RNCD3 + CD28 + Rapa” indicates a cell cultured on a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate with rapamycin added in the presence of the anti-CD28 antibody.
  • the conditions of culturing on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed a higher cell proliferation rate than the condition of adding rapamycin.
  • the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed a higher cell growth rate than the conditions cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate.
  • the ratio of cultured cells expressing Foxp3 was measured in the same manner as in Example 5- (2). The results are shown in FIG. In FIG. 48, the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive and Foxp3 positive cells. From FIG. 48, the ratio of CD4 positive, CD25 positive, and Foxp3 positive cells was higher in the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate than on the condition where the culture was performed on the anti-CD3 antibody-immobilized plate and rapamycin was added. It was.
  • the ratio of CD4-positive, CD25-positive, and Foxp3-positive cells was even higher when cultured on a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and added with rapamycin.
  • This result shows that high-purity regulatory T cells can be obtained by stimulation with anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody and retronectin without addition of rapamycin, and by adding rapamycin to this condition, even higher purity can be obtained. It shows that regulatory T cells can be obtained.
  • the vertical axis represents the ratio of CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive, CD62L positive and CCR7 positive cells.
  • FIG. 49 shows that the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate has a higher proportion of CD4-positive, CD25-positive, Foxp3-positive, CD62L-positive, and CCR7-positive cells than the cell population to which rapamycin was added. It was.
  • the cell population cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate between the conditions added with rapamycin was CD4 positive, CD25 positive, Foxp3 positive and The proportion of CD62L positive and CCR7 positive cells was high.
  • FIG. 50 shows the absolute number of cultured cells expressing Foxp3.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 47 and the positive rate in FIG. From FIG. 50, the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed a marked increase in the number of CD4-positive, CD25-positive, and Foxp3-positive cells compared to the condition where rapamycin was added.
  • the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate were more CD4-positive, CD25-positive and Foxp3-positive cells than the conditions cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate. The number increased significantly.
  • FIG. 51 shows the absolute number of cultured cells expressing CD62L and CCR7.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate in FIG. 47 and the positive rate in FIG.
  • the number of CD4-positive, CD25-positive, Foxp3-positive, CD62L-positive, and CCR7-positive cells was significantly increased in the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate compared to the conditions in which rapamycin was added.
  • the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate were more CD4-positive, CD25-positive and Foxp3-positive between the conditions where rapamycin was added.
  • the number of CD62L positive and CCR7 positive cells was remarkably increased.
  • Example 10 Comparison with CD3 / 28 beads (1) Preparation of fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and anti-CD3 antibody-immobilized plate According to the procedure described in Example 6- (1), surface-untreated 96 wells A fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate and an anti-CD3 antibody-immobilized plate were prepared using a flat plate.
  • Example 5- (2) Culture of regulatory T cells
  • a cell population containing many CD4-positive, CD25-positive, and CD45RA-positive cells was obtained. These cells were suspended in a culture medium having the same composition as that described in Example 2- (2) so as to be 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • an anti-CD28 antibody (CD28.2) was added to the cell suspension to a final concentration of 2 ⁇ g / mL, and a fibronectin fragment / anti-CD3 antibody solid phased plate or anti-CD3 was added.
  • the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 3.5 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 1.0 mL / well in a 24-well plate for cell culture.
  • a culture medium so as to be 3.5 ⁇ 10 5 cells / mL, and re-spread so as to be 1.0 mL / well in a 24-well plate for cell culture.
  • day 7 of culture 0.4 mL of the medium was removed, and 0.4 mL of culture medium was added.
  • the cells were collected and the cell growth rate was measured.
  • the CD3 / 28 beads were removed with a magnet, and the cells were collected, suspended in a culture medium so as to be 8.7 ⁇ 10 5 cells / mL, and 12 wells for cell culture. The plate was rewound to 2.0 mL / well. On the 8th day from the start of the culture, the cells were collected and the cell growth rate was measured. On the 11th day from the start of the culture, the cells were collected, and the Foxp3-positive cell rate, the CCR7-positive cell rate, and the CD27-positive cell rate were measured.
  • FIG. 52 shows changes with time in the cell growth rate.
  • the horizontal axis represents the number of days from the start of culture, and the vertical axis represents the cell growth rate.
  • the conditions of culturing with the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate showed higher cell proliferation rate than the conditions of culturing with the anti-CD3 antibody-immobilized plate and the condition of culturing with CD3 / 28 beads.
  • the ratio of cultured cells expressing Foxp3 was measured in the same manner as in Example 6- (2).
  • the absolute number of cultured cells expressing Foxp3 is shown in FIG. In FIG. 53, the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate and the positive rate of Foxp3 in FIG.
  • the number of CD4-positive and Foxp3-positive cells is more prominent when cultured on fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate than when cultured on anti-CD3 antibody-immobilized plate and CD3 / 28 beads. Increased to.
  • the absolute number of cultured cells expressing CCR7 is shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate and the ratio of CD4 positive, Foxp3 positive and CCR7 positive cells in FIG. From FIG. 54, compared with the conditions cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate, the conditions cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate and the conditions cultured on CD3 / 28 beads were CD4. The number of positive, Foxp3-positive and CCR7-positive cells was significantly increased.
  • FIG. 55 shows the absolute number of cultured cells expressing CD27.
  • the vertical axis indicates the value obtained by multiplying the number of cells at the start of culture by the cell growth rate and the ratio of CD4 positive, Foxp3 positive and CD27 positive cells in FIG.
  • the condition cultured on the fibronectin fragment / anti-CD3 antibody-immobilized plate is more CD4 positive than the condition cultured on the anti-CD3 antibody-immobilized plate and the condition cultured on CD3 / 28 beads.
  • the number of Foxp3-positive and CD27-positive cells was remarkably increased.
  • the method of the present invention provides a method capable of efficiently expanding and culturing a cell population containing a large amount of regulatory T cells having strong immunosuppressive ability.
  • a cell population containing regulatory T cells can be efficiently expanded in vitro.
  • Regulatory T cells produced by this method are useful as an immunosuppressant for the prevention and treatment of organ transplant rejection, allergic diseases, autoimmune diseases, graft-versus-host disease (GVHD) and the like.
  • SEQ ID NO: 1 Fibronectin fragment named CH-271.
  • SEQ ID NO: 2 Fibronectin fragment named CH-296.
  • SEQ ID NO: 3 Fibronectin fragment named H-271.
  • SEQ ID NO: 4 Fibronectin fragment named H-296.
  • SEQ ID NO: 5 TSDR forward primer.
  • SEQ ID NO: 6 TSDR reverse primer.

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Abstract

　（１）Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団を分離する工程、及び（２）ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程、を包含することを特徴とする、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法が提供される。該製造方法により、効率良く制御性Ｔ細胞を（高比率で）含む細胞集団が提供される。

Description

制御性Ｔ細胞の製造方法
　本発明は、医療分野において有用な、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造する方法に関する。
　制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ）は、異常あるいは過剰な免疫応答を抑制する機能を持ち、免疫寛容を担うＴ細胞と一般に定義づけられる。ヒトにおける制御性Ｔ細胞の減少ないし機能異常は、自己免疫疾患やアレルギーの発症原因となる。したがって、制御性Ｔ細胞の量的又は質的なコントロールは、自己免疫疾患やアレルギーの治療に有用であり、さらには、難治性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：Ｇｒａｆｔ　Ｖｅｒｓｕｓ　Ｈｏｓｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ）の治療など、移植免疫分野における新たな細胞療法となることが期待されている。
　この制御性Ｔ細胞は、内在性制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ：Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ）と誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ：Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ）に便宜的に大別される。内在性制御性Ｔ細胞は、胸腺において分化し、外部からの抗原感作とは関係なく自然産生されるものと定義される。一方、誘導性制御性Ｔ細胞は、人為的な寛容誘導モデルにおいて、外来抗原刺激に応じて末梢ナイーブＴ細胞から分化誘導されるものと定義される。これらの制御性Ｔ細胞はさらに、その細胞に発現するマーカーの種類に従い細分化されている。
　内在性制御性Ｔ細胞群の一つであるＣＤ４陽性（以下、「ＣＤ４＋」とも記される。）ＣＤ２５陽性（以下、「ＣＤ２５＋」とも記される。）制御性Ｔ細胞を生体より除去すると、各種の臓器特異的な自己免疫疾患が自然発症し、その際、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を移植すると、自己免疫疾患の発症が阻止されるため、内在性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、末梢での免疫自己寛容の維持に重要な働きをしていると考えられている。その後、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の機能が詳細に解析され、自己免疫のみならず、外来抗原による炎症、アレルギー、移植による拒絶反応、感染免疫、腫瘍免疫等、ほとんどの免疫反応を抑制し得ることが明らかになってきた。また、現在、このＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞のマスター制御因子として、転写因子Ｆｏｘｐ３が明らかにされている（例えば、非特許文献１）。
　患者の末梢血から制御性Ｔ細胞を拡大培養により製造する方法として、主として次の二つの方法が考えられる。一つは、末梢血由来のＴ細胞含有画分を拡大培養に供し、その培養過程において、あるいは培養完了後に制御性Ｔ細胞を選択する方法である。もう一つは、末梢血から予め分離された制御性Ｔ細胞を出発材料として拡大培養する方法である。
　しかし、前者において、生体外で制御性Ｔ細胞は他のＴ細胞に比べて増殖能が乏しく、拡大培養された多種多様の細胞群からさらに存在比が減少した制御性Ｔ細胞を選別する作業が難しいという問題がある。また、制御性Ｔ細胞に発現しているＦｏｘｐ３は細胞内分子であるので、その発現を確認するためには、細胞膜の透過処理を施して染色をする必要がある。よって、Ｆｏｘｐ３の発現は生細胞を分離する際の指標とはできない。
　後者においても、生体外で制御性Ｔ細胞は増殖能が乏しく、制御性Ｔ細胞を多く得る点が問題である（例えば、非特許文献２）。
　したがって、制御性Ｔ細胞を前述された様々な細胞療法に用いるために、少ない量の末梢血から制御性Ｔ細胞を効率よく拡大培養できる方法が望まれている。
　ＣＤ３活性化物質である抗ＣＤ３抗体を用いた制御性Ｔ細胞の拡大培養方法（非特許文献３）、ならびに抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を併用した制御性Ｔ細胞の拡大培養方法（非特許文献４）が報告されている。しかしながらこれらの方法は、Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞の製造方法としては満足いくものではない。
ネイチャー　イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第４巻、第３３０～３３６頁（２００３） アニュアル　レビュー　オブ　イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第２２巻、第５３１～５６２頁（２００４） ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第１９３巻、第１２８５～１２９４頁（２００１） ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０４巻、第４５３～４６１頁（２００４） ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０８巻、第４２６０～４２６７頁（２００６） イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１２１巻、第１２９～１３９頁（２００７） ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第３７巻、第２３７８～２３８９頁（２００７） ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１７８巻、第３２０～３２９頁（２００７）
　本発明の目的は、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法、およびその方法により製造された細胞集団、さらにその細胞集団を含む医薬を提供することにある。
　本発明者らは、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、ＣＤ３活性化物質を作用させることにより、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団の細胞増殖が有意に上昇し、Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造できることを見出した。さらに、ＣＤ３活性化物質及びＣＤ２８リガンドを併用した制御性Ｔ細胞の拡大培養方法においても、フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物を共存させることで、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団の細胞増殖が有意に上昇し、効率よくＦｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造できることを見出し、本発明を完成するにいたった。
　すなわち本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、下記工程を包含することを特徴とする、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法に関する：
（１）Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団を分離する工程、及び
（２）ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程。
　本発明の第１の発明の態様において、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程が、ＣＤ２８リガンドの共存下で培養する工程を包含する方法も、本発明の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法に包含される。また、ＣＤ２８リガンドが抗ＣＤ２８抗体であってもよい。更に、本発明の第１の態様において、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団がＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団であってもよく、ＣＤ３活性化物質が抗ＣＤ３抗体であってもよい。
　本発明の第２の発明は、本発明の第１の態様で製造された細胞集団に関する。
　本発明の第３の発明は、本発明の第１の態様で製造された細胞集団を含有してなる、免疫抑制剤に関する。
　本発明の第１の発明の態様として、Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法が挙げられる。
　本発明の第２の発明の態様として、本発明の第１の発明の態様で製造されたＦｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団に関する。
　本発明の第３の発明の態様として、本発明の第１の発明の態様で製造されたＦｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団を含有してなる、免疫抑制剤が挙げられる。
　本発明の方法を用いれば、生体外で制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を効率よく拡大培養できる。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫抑制剤として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の予防・治療に有用である。
培養細胞の細胞増殖倍率（以下図中においてＦｏｌｄ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：拡大倍数で表示）を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞数を示す図である。 培養細胞由来ＤＮＡのバイサルファイトＰＣＲ産物の電気泳動写真を示す図である。 培養細胞の制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化領域のＤＮＡメチル化の頻度を示す図である。 培養細胞の各クローンにおける制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化領域のＤＮＡメチル化度を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数を示す図である。 再刺激後の培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数を示す図である。 培養細胞の細胞増殖倍率の経時変化を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数を示す図である。 培養細胞のＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞数を示す図である。
　Ｔ細胞とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味し、分化したＴ細胞及び未分化なＴ細胞を含む。Ｔ細胞としては、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１型、Ｔｈ２型、Ｔｈ９型、Ｔｈ１７型、Ｔｈ２２型、Ｔｆｈ型）、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞、ＮＫＴ細胞などが知られている。
　制御性Ｔ細胞とは、Ｔ細胞受容体を介する刺激を受けたときに、エフェクターＴ細胞の活性化（増殖、サイトカイン産生等）を阻害し得る能力（免疫抑制活性）を有するＴ細胞を意味する。制御性Ｔ細胞は、通常ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞画分内に存在する。制御性Ｔ細胞自体は、Ｔ細胞受容体を介する刺激に対しては実質的な増殖反応を示さず、不応答性であり得る。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞のマスター制御因子として、転写因子Ｆｏｘｐ３が知られている（なお、ここで「＋」とは細胞表面に当該分子を発現している（陽性である）ことを指す。以下同様）。
　拡大培養されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の中で、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）及びＣＣＲ７が共に陽性である細胞が、制御性Ｔ細胞の中でも特に免疫抑制活性が強いこと、またＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（ナイーブ制御性Ｔ細胞）集団を拡大培養することによりＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７が共に陽性である細胞の割合が増加することが報告されている［ブラッド、第１０８巻、第４２６０～４２６７頁（２００６）］。また、拡大培養されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団において、ＣＤ２７の発現はＦｏｘｐ３の発現及び免疫抑制活性と相関することが報告されている［イムノロジー、第１２１巻、第１２９～１３９頁（２００７）］。さらに、制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の安定的な発現には、Ｆｏｘｐ３座にある“制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化領域”（ＴＳＤＲ）が脱メチル化されていることが重要であることが報告されている［ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　イムノロジー、第３７巻、第２３７８～２３８９頁（２００７）］。さらに、制御性Ｔ細胞をラパマイシン存在下に拡大培養を行うことにより、Ｆｏｘｐ３とＣＤ２５を発現する細胞の割合が増加することが報告されている［ジャーナル　オブ　イムノロジー、第１７８巻、第３２０～３２９頁（２００７）］。
　本発明において、「制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造」とは、制御性Ｔ細胞の増殖（拡大培養）を含む概念を意味する。本発明により、特に免疫抑制活性の強い制御性Ｔ細胞を高い比率で含有する細胞集団を効率よく得ることができる。
　本発明において、「フィブロネクチン」及びそのフラグメントは、天然から単離されたもの、人為的に作製されたもの、又は遺伝子工学的に調製された組換え体、すなわち非天然のもののいずれでもよい。フィブロネクチン及びそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ　Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ　Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７～７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。また、フィブロネクチンフラグメントを調製するための情報であるフィブロネクチンをコードする核酸配列及びフィブロネクチンのアミノ酸配列については、ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７にそれぞれ開示されている。本明細書において、実質的に純粋なフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチン及びそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。
　フィブロネクチンのドメイン構造は７つに分けられ、そのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列は、それぞれＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型と呼ばれている。フィブロネクチン中には１４個のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９及びＩＩＩ－１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目及び１４番目（以下、それぞれＩＩＩ－１２、ＩＩＩ－１３及びＩＩＩ－１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５残基のアミノ酸からなる、ＶＬＡ－４に対して結合活性を有するＣＳ－１と呼ばれる領域が存在する。本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメントは、ＩＩＩ－７、８、９、１１、１２、１３又はＣＳ－１のいずれかのドメインを含むフラグメントであればよく、更に複数のドメインが繰り返し連結されたフラグメントであってもよい。例えば、ＶＬＡ－５へのリガンドを含む細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ－４へのリガンドであるＣＳ－１ドメインなどを含有するフラグメントが本発明に使用される。前記組換えフラグメントとしては、例えば、ジャーナル　オブ　バイオケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４～２９１頁（１９９１）に記載されたＣＨ－２７１（配列表の配列番号１）、ＣＨ－２９６（配列表の配列番号２）、Ｈ－２７１（配列表の配列番号３）、Ｈ－２９６（配列表の配列番号４）、又はこれらの誘導体もしくは改変物が例示される。前記のＣＨ－２９６は細胞接着ドメイン、ヘパリン結合ドメイン及びＣＳ－１ドメインを有する組換えフィブロネクチンフラグメントであり、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）の名称で市販されている。
　本発明において、「ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団」とは、ＣＤ２５が陽性であるＴ細胞集団を意味するが、例えば、ＣＤ４及びＣＤ２５が共に陽性であるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団もＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団に含まれる。
　以下、本発明を具体的に説明する。
１．制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法
　本発明の方法による制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造は、Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離する第１工程、第１工程により得られたＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を、ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で培養する第２工程、により実施される。
　既に、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による共刺激によって、ＣＤ８＋細胞よりもＣＤ４＋細胞が優先的に拡大培養されること、さらに抗ＣＤ３抗体及びフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ－２９６による共刺激によって、ＣＤ４＋細胞よりもＣＤ８＋細胞が優先的に拡大培養されることが報告されている［キャンサー　ジーン　セラピー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１５巻、第５０８～５１６頁（２００８）］。
　本発明者らは、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団をＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で培養することにより、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の細胞増殖率が有意に上昇し、効率よくＦｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造できることを見出した。
　第１工程において、「Ｔ細胞を含有する細胞集団」としては特に本発明を限定するものではないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢リンパ球、臍帯血単核細胞などが例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞はＩＬ－２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）又は生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのまま使用してもよく、凍結保存した後に使用してもよい。また、例えば生体から得られた細胞集団から種々の誘導操作又は分離操作を経て得られた細胞集団、例えば、ＰＢＭＣ等から分離されたＣＤ２５＋の細胞集団も使用することができる。更に、本発明の細胞集団の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血、臍帯血などの血液、又は血液から赤血球もしくは血漿などの成分を除去したもの、骨髄液などを使用することもできる。
　Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離する工程は、例えばフローサイトメーターを用いる方法、もしくは免疫磁気ビーズ法などの公知の方法を用いて実施することができる。フローサイトメーターを用いる方法では、蛍光標識した抗ＣＤ２５抗体で染色することにより区分されるＣＤ２５＋細胞を選択的に回収することによってＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離することができる。また、別のマーカー［例えば、ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＩＴＲ）］を標的に区分されるＣＤ２５＋細胞を選択的に回収することによってＣＤ２５＋Ｔ細胞集団を分離することもできる。さらに、該工程において、蛍光標識した抗ＣＤ２５抗体及び抗ＣＤ４抗体で共染色することにより区分されるＣＤ２５＋かつＣＤ４＋細胞を選択的に回収することによってＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を分離することができる。
　免疫磁気ビーズ法は、種々の抗体を結合した磁気ビーズと磁石を併用することにより、細胞の分離を行う方法である。ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離するためのキットとして、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＣＤ４＋ＣＤ２５＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）などがあり、キットに添付の取扱説明書に従い、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離することができる。
　なお、Ｔ細胞を含有する細胞集団から、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞以外の細胞を除去することにより、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を高含有する細胞集団を得る操作も、本発明における第１工程の一態様である。
　以上に例示した方法により取得されるＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団も、本発明の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法の出発材料として使用することができる。
　第２工程では、前記第１工程により得られたＣＤ２５＋Ｔ細胞集団がＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で培養される。
　これら２つの工程からなる本発明によれば、生体外で制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を製造することが可能である。更に、当該方法により得られる制御性Ｔ細胞は、免疫抑制剤として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ等の予防・治療に有用であり、細胞療法などへの利用に好適である。
　本発明の方法において、第２工程は、通常、本発明の製造方法を特徴づける有効成分、すなわちＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下に、リンパ球の培養に使用される一般的な成分を含む培地中で行なわれる。
　本発明の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法において使用される培地は前記の有効成分を含有すれば特に限定はなく、ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の維持、生育に適した成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、例えば市販の培地やその改変物であってもよい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、本発明にはＩＬ－２を含有する培地が使用される。ＩＬ－２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．１～１×１０５ＩＵ／ｍＬ、より好適には１～１×１０４ＩＵ／ｍＬ、さらに好適には１０～１×１０３ＩＵ／ｍＬである。また、他のサイトカイン類（ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１等）、レクチンなどのリンパ球刺激因子又は免疫抑制剤であるラパマイシンを添加することもできる。
　有効成分として本発明に使用されるＣＤ３活性化物質としては、Ｔ細胞受容体やＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ３抗体、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、アロＭＨＣ分子、人工抗原提示細胞や樹状細胞により提示される抗原などが例示される。好適には抗ＣＤ３モノクローナル抗体が本発明に使用され、例えば、ＯＫＴ３［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２０６巻、第３４７～３４９頁（１９７９）］が特に好適である。ＣＤ３リガンドの培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合、０．００１～１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１～５０μｇ／ｍＬが好適である。
　また、有効成分として本発明に使用されるフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１～５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１～１００μｇ／ｍＬが好適である。
　さらに、本発明において、必要に応じて、培地にＣＤ２８リガンドを添加してもよい。本発明に使用されるＣＤ２８リガンドとしては、ＣＤ２８に結合活性を有する物質であれば特に限定されないが、例えば抗ＣＤ２８抗体が挙げられる。ＣＤ２８リガンドの培地中の濃度は、特に限定されないが、例えば、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体を使用する場合、０．００１～１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１～２０μｇ／ｍＬが好適である。ＣＤ２８リガンド存在下での培養は、本発明において培養工程の一部のみで実施してもよく、培養全体を前記成分の存在下で実施してもよい。
　なお、これらの成分のうち、「ＣＤ３活性化物質」、「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」及び「ＣＤ２８リガンド」は、培地中に溶解して共存させる以外に、適切な固相、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグなどの細胞培養用器材（開放系のもの又は閉鎖系のもののいずれも含む）、又はビーズ、メンブレン、スライドガラスなどの細胞培養用担体に固定化することにより固相化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固相化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固相化するのが好適であるが、当該成分の固相化量は所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固相化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固相化するのが好適であるが、当該成分の固相化量は所望の効果が得られる限り、特に限定されるものではない。いずれの場合においても、前記成分の固相化は、公知の方法、例えば、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット及び国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載されたフィブロネクチンフラグメントの固相化方法に準じて行なうことができる。さらに、「ＣＤ３活性化物質」、「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」及び「ＣＤ２８リガンド」以外の有効成分を、細胞培養用器材又は細胞培養用担体に固相化してもよい。例えば、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌなどが例示される。
　前記の種々の成分や、本発明の有効成分から選択されるものを固相化しておけば、本発明の方法により制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を得る過程で該細胞集団と固相とを分離するのみで、有効成分等と該細胞集団を容易に分離することができ、該細胞集団への有効成分などの混入を防ぐことができる。
　本発明の方法における第２工程は、前記の有効成分の存在下でのＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の培養に続いて実施される、有効成分を含有しない培地での培養を包含してもよい。この際には、「ＣＤ３活性化物質」、「フィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物」のいずれか、もしくはその両方を含有しない他は同じ組成の培地を使用してもよく、異なる組成の培地を使用してもよい。
　本発明の方法において前記の有効成分の存在下での培養の期間は１日以上であればよく、好ましくは２日以上であり、また、前記期間は８日以内であればよく、好ましくは６日以内である。さらに、増殖倍率を上げるために、前記の有効成分を含有しない培地での培養の後もしくはその途中で、再度有効成分を含有する培地、もしくは有効成分を固相化した細胞培養用器材又は細胞培養用担体を用いて培養を行ってもよい。
　本発明には血清又は血漿を含有しない培地を使用することもできるが、培地に血清又は血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はされないが、０超～２０容量％、好適には０超～６容量％の含有量が例示され、また、培養段階に応じて使用する血清又は血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）又は非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでもよいが、安全性の観点から、自己由来のものが好適に使用される。
　本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はされないが、例えば、好適には１０２～１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１０３～５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、更に好適には１０４～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、細胞培養に通常使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２などの条件で培養することができる。また、適当な時間間隔をおいて細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈する、培地を交換する、細胞培養用器材を交換するなどの操作を行うことができる。
　本発明の製造方法において使用される細胞培養用器材として、特に限定されないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクターなどを使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系又は閉鎖系のいずれにおいても実施することができるが、得られる細胞集団の安全性の観点から、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
　本発明において、有効成分存在下、非存在下での培養を合わせた総培養日数は、好適には５～４０日間であり、より好適には６～３５日間、更に好適には７～３０日間である。この範囲で、一般的な免疫療法に使用しうる細胞数を得ることができ、細胞増殖が良好に維持される期間を適宜選択すればよい。
　本発明の製造方法で得られる細胞集団は、ＣＤ４及びＣＤ２５が共に陽性であり、かつＦｏｘｐ３陽性細胞の含有率が高い。さらに、ＣＤ４及びＣＤ２５が共に陽性であり、かつＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７が共に陽性である細胞の含有率が高い。前述したように、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７が陽性の細胞は、免疫抑制活性の強い制御性Ｔ細胞であることが知られている。
　すなわち、下記の各実施例に示すように、本発明の製造方法により得られる細胞集団に高比率に含まれる細胞は、免疫抑制活性の強い制御性Ｔ細胞である。また、本発明の製造方法は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のみを使用する従来法よりもさらに制御性Ｔ細胞の増殖が良好な点で優れた拡大培養である。
　本発明の制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法により得られた細胞集団中には、通常、制御性Ｔ細胞以外の細胞も混在している。本発明の製造方法は、得られた細胞集団から制御性Ｔ細胞を分離する工程をさらに含んでもよい。すなわち、本発明において、制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団中の制御性Ｔ細胞以外の細胞と制御性Ｔ細胞との分離操作を施すことにより、制御性Ｔ細胞が濃縮された細胞集団を調製し、使用することができる。制御性Ｔ細胞の分離は公知の方法に従って実施することができる。例えば、フローサイトメーターを用いて、蛍光標識した抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体及び抗ＣＣＲ７抗体で共染色することにより区分されるＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞を選択的に回収することによって、免疫抑制活性が高い制御性Ｔ細胞を分離することができる。また、本発明の製造方法より得られた細胞集団から、制御性Ｔ細胞以外の細胞を除去することにより、制御性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を得ることができる。また、本発明における制御性Ｔ細胞を高含有する細胞集団には、制御性Ｔ細胞のみの細胞集団も包含され得る。
　本発明によれば、上記の「制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団の製造方法」を利用した、所望の遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団を製造する方法が提供される。当該方法は、前述した第１工程及び第２工程に加えて、遺伝子導入の工程を包含する。
　制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団に所望の遺伝子を導入する遺伝子導入の工程は、第１工程の終了後に、第２工程と同時に、又は第２工程の終了後に実施することができる。前述した第１工程及び第２工程と該遺伝子導入工程を組み合わせることにより、制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団への遺伝子導入効率が向上する。すなわち、本発明の方法により製造される細胞集団は所望の遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を高比率で含む細胞集団である。本発明は遺伝子治療用細胞の製造に特に有用である。
　本発明において制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団に導入される所望の遺伝子は特に限定はなく、自己由来の遺伝子又は外来遺伝子から前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類など）をコードするもの以外に、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）又はリボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子や遺伝子導入された細胞を選択的に除去するための自殺遺伝子を上記遺伝子と一緒に導入してもよい。すなわち、導入する所望の遺伝子の数に限定はなく、複数の遺伝子を導入することもできる。
　導入される所望の遺伝子は天然より得られたものでも、又は遺伝子工学的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーションなどの公知の手段によって結合されたものであってもよい。更に、目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
　特に限定はされないが、本発明の一態様として、所望の抗原を認識するレセプターをコードする遺伝子の導入が例示される。当該遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）をコードする遺伝子、又は標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位と、レセプター分子由来の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。この遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を含む細胞集団は、所望の抗原を認識する制御性Ｔ細胞を含有している細胞集団である。当該細胞集団は、レセプターをコードする遺伝子が導入されていない細胞集団と比較して、所望の抗原に対する特異性の高い細胞集団であり、所望の抗原の刺激を受けた際に当該抗原や当該抗原を提示する細胞に特異的に反応することができることから、免疫療法への利用に有用である。
　所望の遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクター又はプラスミドなどに挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、相同組換えにより導入対象の制御性Ｔ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に前記の遺伝子を配置してもよい。
　本発明において、遺伝子導入工程における所望の遺伝子の導入手段に特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれも本発明にて使用できる。それらの方法の詳細については、すでに多くの文献が公表されている。
　前記ウイルスベクターに特に限定はなく、遺伝子導入方法に通常使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが使用できる。特に好適には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
　ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法として、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド－ポリリジンなどの担体を使用する方法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合、プラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
　レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に感染しうることから、本発明の製造方法にて遺伝子導入を行うのに特に好適である。多数のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターが文献等で発表されており、また、すでに市販されている。本発明にはこれらの公知のベクターを使用することができる。
　また、これらのベクターは公知のパッケージング細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケージングされたウイルス粒子として調製することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞又は２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。
　前記のとおり、本発明にはウイルスのゲノムが由来するものとは異種のウイルス由来のエンベロープを有する、シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）パッケージングによって作製されたレトロウイルス、レンチウイルスも使用することができる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はネコ内在性ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｖｉｒｕｓ）由来のエンベロープを有するシュードタイプレトロウイルスを使用することができる。更に、糖鎖修飾を受けたエンベロープやその他の膜タンパクをその表面に有するレトロウイルス、レンチウイルスも本発明に使用できる。
　レトロウイルスベクターを使用して遺伝子導入を行う場合、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質を使用して遺伝子導入効率を向上させることができる。さらに、標的細胞結合活性を有する機能性物質を併用して標的細胞特異的な遺伝子導入を実施することもできる（例えば、国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、国際公開第００／０１８３６号パンフレット参照）。
　以上説明したように、第１工程の終了後に、第２工程と同時に、又は第２工程の終了後に、遺伝子導入を行う本発明の方法により、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団への遺伝子導入を効率よく行うことが可能となる。また、本発明の方法は、特別な設備、装置を必要とせず、また、多種のレトロウイルスベクター及び標的細胞について有効である。更に、当該方法は閉鎖系での利用に適していることから、遺伝子治療などの臨床用途で非常に有用である。
　本発明の遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法は、遺伝子導入工程を第２工程の終了後に実施する場合、遺伝子導入工程で得られた遺伝子導入細胞を培養する工程をさらに包含してもよい。前記の培養工程は、第２工程と同様に実施することができる。
　本発明の遺伝子が導入された制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法における総培養日数は、遺伝子導入を実施しないものと同程度とすればよい。
２．本発明の方法により製造される制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を含有してなる医薬
　本発明の方法により製造される細胞集団は、強い免疫抑制活性を有するので、何らかの原因により生体内で免疫反応が異常に亢進し望ましくない免疫反応が起こっている場合、あるいは望ましくない免疫反応が起こることが将来的に予測される場合等に、患者に該細胞集団を投与すること等によって、患者の体内において異常に亢進した望ましくない免疫反応を抑制、あるいは回避することが出来る。
　本発明は、上記方法により製造され得る細胞集団を含有してなる、免疫抑制剤を提供する。本発明の免疫抑制剤は、臓器移植における拒絶反応、自己免疫疾患、アレルギー疾患（花粉症、食品アレルギー、薬剤アレルギー、喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、食物過敏症、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の予防・治療に有用である。
　本発明の免疫抑制剤は、常套手段に従って、有効量の上記制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団を医薬として許容される担体と混合するなどして、経口／非経口製剤として製造することが出来る。本発明の免疫抑制剤は、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることが出来る。本発明の免疫抑制剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤、免疫抑制剤（ラパマイシンなど）、抗体製剤、細胞製剤（制御性樹状細胞）などと配合してもよい。
　このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト等の哺乳動物に対して投与することができる。
　本発明の制御性Ｔ細胞を含有する細胞集団の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重６０ｋｇとして）においては、例えば非経口投与の場合、一日につき２．６×１０９細胞程度を上限とする有効量を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例１　細胞培養用プレートを用いた制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
　フィブロネクチンフラグメント［レトロネクチン（登録商標）、タカラバイオ社製］を２５μｇ／ｍＬ、及び抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ヤンセンファーマ社製）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、細胞培養用９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、３７℃で３．５時間放置した。また、対照として抗ＣＤ３抗体のみを５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、細胞培養用９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で３．５時間放置した。放置後、それぞれの溶解液を取り除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）よりＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ＣＤ４＋ＣＤ２５＋　Т　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性の制御性Ｔ細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１．５％　自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％　ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、２．５μｇ／ｍＬ　ファンギゾン（ブリストルマイヤーズ社製）を含むＧＴ－Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製）（これを培養用培地とする）に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、バイオレジェンド社製）を終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加する群と添加しない群を作製し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養２日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、０．６ｍＬの培養用培地を追加して、細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養５日目に培養用培地を２．５ｍＬ加え、細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率及びＦｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
　細胞増殖倍率を図１に示す。図１において、縦軸は細胞増殖倍率（以下各図においてＦｏｌｄ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ：拡大倍数で示す）を示す。実施例の各図において、「ＣＤ３」は抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞、「ＲＮＣＤ３」はフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞を示す。また、「ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体を添加した群を示し、「－」は抗ＣＤ２８抗体の添加していない群を示す。図１より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞の方が、高い細胞増殖倍率を示した。抗ＣＤ２８抗体存在下においても、同様に抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、高い細胞増殖倍率を示した。
　制御性Ｔ細胞のマスター制御因子であるＦｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図２に示す。図２は、培養細胞にＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトンディッキンソン社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ　ＦｏｘＰ３　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔ（イーバイオサイエンス社製）を用いてＦｏｘＰ３陽性細胞率をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（ミルテニーバイオテク社製）で測定した結果を示す。図２において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図２より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図３に示す。図３において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１の細胞増殖倍率と図２の陽性率を乗じた値を示す。図３より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方がＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が増加した。抗ＣＤ２８抗体存在下においても、同様に抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例２　表面未処理プレートを用いた制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
　実施例１－（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルで加え、３７℃で４時間放置した。放置後、それぞれの溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　実施例１－（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を３．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％　自己血漿、６００ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２、０．２％　ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬ　ファンギゾンを含むＧＴ－Ｔ５０３培地（以下、これを培養用培地とする）に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養２日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、培養用培地を０．２ｍＬ加えて細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養９日目に培養用培地を１ｍＬ加えまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率及びＦｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図４に示す。図４において、横軸は培養開始からの日数、縦軸は細胞増殖倍率を示す。実施例の各図において、「ＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下に抗ＣＤ３抗体固相化表面未処理プレートで培養した細胞、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下にフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化表面未処理プレートで培養した細胞を示す。図４より、表面未処理プレートに固相化した場合においても、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例１－（２）と同様の操作で測定した。その結果を図５に示す。図５において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図５より、表面未処理プレートで培養した場合においても、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図６に示す。図６において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４の細胞増殖倍率と図５の陽性率を乗じた値を示す。図６より、表面未処理プレートで培養した場合においても、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例３　培養細胞のＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
　実施例２－（１）記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　実施例１－（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養３日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養５日目に細胞を回収し、培養用培地を２．５ｍＬ加えて細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養７日目に細胞を回収し、４．３２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに５．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始１０日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率及びＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図７に示す。図７において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図７より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例１－（２）と同様の操作で測定した。その結果を図８に示す。図８において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図８より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図９に示す。図９において、縦軸は培養開始時の細胞数に図７の細胞増殖倍率と図８の陽性率を乗じた値を示す。図９より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
　本実施例（２）に使用した細胞と同じドナーのＰＢＭＣからＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ４陽性細胞とＣＤ４陰性細胞を得た。ＣＤ４陰性細胞は３０ＧｙのＸ線を照射後、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％　自己血漿、０．２％　ＨＳＡ、２．５μｇ／ｍＬ　ファンギゾンを含むＧＴ－Ｔ５０３培地（以下、これを抑制活性測定用培地とする）に懸濁した。ＣＤ４陽性細胞を終濃度２μＭのＣＦＳＥ（シグマアルドリッチ社製）を含む抑制活性測定培地で懸濁し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で８分間処理し、抑制活性測定用培地で細胞を４回洗浄後、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように抑制活性測定用培地に懸濁した。これをレスポンダー細胞とする。Ｘ線照射したＣＤ４陰性細胞とＣＦＳＥ処理したレスポンダー細胞を１対１で混合（以下、Ｔｒｅｓと記載）し、さらに終濃度２００ｎｇ／ｍＬとなるように抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を添加した。この混合細胞液を細胞培養用９８ウェル丸底プレートに１００μＬ添加し、さらに本実施例（２）で得られた培養細胞を抑制活性測定用培地で５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したものを１００μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で３日間培養した。その後、細胞を回収しレスポンダー細胞のＣＦＳＥの蛍光強度をＭＡＣＳＱｕａｎｔで測定した。ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を図１０に示す。図１０において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を示す。陽性対照として、培養細胞を添加せずに抑制活性測定用培地を１００μＬ添加したＴｒｅｓのみを培養したサンプル（図中「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」）と、陰性対照として、ＣＦＳＥ処理したレスポンダー細胞のみを培養するサンプル（図中「Ｎｅｇａｔｉｖｅ」）を作製した。その結果、Ｔｒｅｓのみのサンプル「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ」に比べて、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、レスポンダー細胞の細胞増殖倍率が５％以下に抑制されていた。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
実施例４　培養細胞のＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
　実施例２－(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　実施例１－（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を４．０５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに２．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養８日目に細胞を回収し、培養用培地を１ｍＬ加えて細胞培養用１２ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率及びＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図１１に示す。図１１において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図１１より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図１２に示す。図１２は、培養細胞にＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトンディッキンソン社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ　ＦｏｘＰ３　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔを用いてＦｏｘＰ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ベクトンディッキンソン社製）で測定した結果を示す。図１２において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図１２より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図１３に示す。図１３において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１１の細胞増殖倍率と図１２の陽性率を乗じた値を示す。図１３より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率の測定
　ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の割合を図１４に示す。図１４は、培養細胞にＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ベクトンディッキンソン社製）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体（アールアンドディーシステムズ社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した結果を示す。図１４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図１４より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
　ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図１５に示す。図１５において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１１の細胞増殖倍率と図１４の陽性率を乗じた値を示す。図１５より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
（４）ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定　
　実施例３－（３）と同様の操作により、本実施例（２）で得られた細胞のレスポンダー細胞に対する増殖抑制活性をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。ＣＤ４陽性細胞に対する増殖抑制活性を図１６に示す。図１６において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を、横軸はレスポンダー細胞と培養細胞の混合比を示す。図１６より、培養細胞を含まないサンプル「Ｔｒｅｓ」と比べて、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、又は「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、培養細胞の混合比が上がるに従って、レスポンダー細胞の細胞増殖が抑制された。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
実施例５　培養細胞のＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
　実施例２－(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　インフォームドコンセントが得られた健常人から調製したＰＢＭＣよりＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、培養７日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、細胞培養用２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養８日目に細胞を回収し、８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始１１日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率及びＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図１７に示す。図１７において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図１７より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図１８に示す。図１８は、培養細胞にＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体（アールアンドディーシステムズ社製）、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ２５抗体（ベクトンディッキンソン社製）を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ　ＦｏｘＰ３　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔを用いてＦｏｘｐ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。図１８において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図１８より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
　図１９において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図１９より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図２０に示す。図２０において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１７の細胞増殖倍率と図１８の陽性率を乗じた値を示す。図２０より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
　ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図２１に示す。図２１において、縦軸は培養開始時の細胞数に図１７の細胞増殖倍率と図１９の陽性率を乗じた値を示す。図２１より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）ＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性の測定
　本実施例（２）に使用した細胞と同じドナーのＰＢＭＣからＣＤ８マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）を用いてＣＤ８陽性細胞とＣＤ８陰性細胞を得た。ＣＤ８陰性細胞、ＣＤ８陽性細胞をそれぞれ実施例３－（３）のＣＤ４陰性細胞、ＣＤ４陽性細胞と同様の操作に供し、ＣＤ８陽性のレスポンダー細胞を含有する混合細胞液を得た。本実施例（２）で得られた培養細胞のレスポンダー細胞に対する増殖抑制活性をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。ＣＤ８陽性細胞に対する増殖抑制活性を図２２に示す。図２２において、縦軸はＣＦＳＥ全陽性細胞中のＣＦＳＥ弱陽性細胞、つまりレスポンダー細胞中の分裂した細胞の割合を、横軸はレスポンダー細胞と培養細胞の混合比を示す。その結果、培養細胞を添加したサンプル（「ＣＤ３＋ＣＤ２８」、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」）では、培養細胞の混合比が上がるに従って、レスポンダー細胞の細胞増殖が抑制された。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞と同様に、レスポンダー細胞の細胞増殖を抑制する細胞集団であることが明らかとなった。
実施例６　培養細胞のＴＳＤＲにおけるＤＮＡメチル化度の測定
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
　実施例１－（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で４時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　実施例５－（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養７日目に培地を０．４ｍＬ除き、上記の培養用培地を０．４ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７とＣＤ２７陽性細胞率及びＴＳＤＲのＤＮＡメチル化頻度を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図２３に示す。図２３において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図２３より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図２４に示す。図２４は、培養細胞にＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＰＥ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ２７抗体（ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ　ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ　ＦｏｘＰ３　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔを用いてＦｏｘＰ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。図２４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図２４より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
　図２５において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図２５より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
　図２６において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞の割合を示す。図２６より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かＣＤ２７陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図２７に示す。図２７において、縦軸は培養開始時の細胞数に図２３の細胞増殖倍率と図２４の陽性率を乗じた値を示す。図２７より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
　ＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図２８に示す。図２８において、縦軸は培養開始時の細胞数に図２３の細胞増殖倍率と図２５の陽性率を乗じた値を示す。図２８より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
　ＣＤ２７を発現する培養細胞の絶対数を図２９に示す。図２９において、縦軸は培養開始時の細胞数に図２３の細胞増殖倍率と図２６の陽性率を乗じた値を示す。図２９より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）ＴＳＤＲのＤＮＡメチル化度の測定
　本実施例（２）より得られた細胞と、対照としてＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡの抽出を行い、培養細胞１×１０６細胞から５．１－５．６μｇのＤＮＡを得た。次に、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ　Ｘｃｅｅｄ　Ｒａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、前記ＤＮＡの２．０－２．２μｇをバイサルファイト処理し、０．５－１．０μｇのバイサルファイト処理後のＤＮＡを得た。次に、前記ＤＮＡの２０ｎｇを使用し、バイサルファイト－ＰＣＲをＴａＫａＲａ　ＥｐｉＴａｑ　ＨＳ　（ｆｏｒ　ｂｉｓｕｆｉｔｅ－ｔｒｅａｔｅｄ　ＤＮＡ）（タカラバイオ社製）を用いて行った。プライマーはフォワード側が５’－ＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＴＴＴ－３’、リバース側が５’－ＴＡＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＡＡＣＣＡＡ－３’を用いた。ＰＣＲ反応液は、５０μＬ［１０ＸＥｐｉＴａｑ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋　ｆｒｅｅ）　５μＬ、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）　６μＬ、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　５μＬ、ＴａＫａＲａ　ＥｐｉＴａｑ　ＨＳ（５Ｕ／ｍＬ）　０．２５μＬ、各プライマー（１０μＭ）　各１μＬ］で、ＰＣＲ反応条件は、（９８℃　１０秒）－（５５℃　３０秒）－（７２℃　３０秒）（４０サイクル）、最後に（７２℃　７分）とし、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応後の反応液より２μＬを用いてアガロース電気泳動を行った結果を図３０に示す。図３０～３２の各図において、「Ｔｃｏｎｖ」はＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞を示す。図３０より、各サンプルのＰＣＲ産物の単一増幅及びサイズ（３３６ｂｐ）を確認した。次に、前記ＰＣＲ産物を２μＬ使用し、Ｔ－ベクター　ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）とＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて、ＴＡクローニングを行った。その後、上記Ｌｉｇａｔｉｏｎ液を５μＬ使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＳＴ０８　Ｐｒｅｍｉｕｍ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）に４２℃４５秒間反応させ、形質転換を行った。ＳＯＣ培地で３７℃１時間培養後、Ｘ－ｇａｌ（タカラバイオ社製）を塗布したアンピシリン入りＬＢ培地プレートに接種し、３７℃で一晩培養した。その後、白コロニーを各２４クローンピックアップし、ＬＢ培地で３７℃一晩培養後、グリセロールを終濃度１７％になるように添加し、グリセロールストックを作製した。シークエンス反応は、Ｍ１３－４７プライマーを用いプレート単位塩基配列解析（タカラバイオ社）を委託し、塩基配列情報を得た。
　得られた塩基配列をＱＵＭＡ（理化学研究所）ソフトウェアを用いて解析を行った。除外条件として、バイサルファイト変換効率の下限を９５％、アライメントミスマッチの数の上限を１５として行った。ＴＳＤＲのＤＮＡメチル化の頻度を図３１に示す。図３１において、横軸はＴＳＤＲのＤＮＡメチル化部位を、縦軸はサンプル名を示す。図３１より、通常のＴ細胞を培養した細胞に比べて、制御性Ｔ細胞を分離し培養した細胞ではどのＤＮＡメチル化部位においてもメチル化されている頻度が低かった。
　各クローンのＤＮＡメチル化の結果を図３２に示す。図３２において、横軸はＤＮＡのメチル化部位を、縦軸は各クローンを示し、黒丸はその部位が“メチル化”されていることを、白丸はその部位が“脱メチル化”されていることを示す。図３２より、通常のＴ細胞を培養した細胞はほぼすべてのクローンが”メチル化”されていたのに対して、制御性Ｔ細胞を分離し培養した細胞では、ＤＮＡメチル化部位がすべて“脱メチル化”されているクローンが大多数を占めていた。したがって、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養して得られた細胞は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養して得られた細胞と同様に安定的にＦｏｘｐ３を発現する制御性Ｔ細胞を多く含む細胞集団であることが明らかとなった。
実施例７　フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体の固相化プレートを用いた制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートの調製
　実施例１－（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートの調製のために、フィブロネクチンフラグメント（レトロネクチン）を２５μｇ／ｍＬもしくは５μｇ／ｍＬ、及び各々に抗ＣＤ３抗体を５μｇ／ｍＬと抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で４時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　実施例５－（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を０．８５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養するものには、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加した。細胞懸濁液をそれぞれのプレートに、０．１ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、培養用培地を０．２ｍＬ加えて、細胞培養用４８ウェルプレートに全量をまき直した。培養６日目に培養用培地を０．５ｍＬ加え、細胞培養用２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図３３に示す。図３３において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。また、図３３～３５の各図において、「ＲＮｈｉＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下に２５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体を固相化したプレートで培養した細胞、「ＲＮｌｏＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下に５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体を固相化したプレートで培養した細胞、「ＲＮｈｉＣＤ３ＣＤ２８」は２５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を固相化したプレートで培養した細胞、「ＲＮｌｏＣＤ３ＣＤ２８」は５μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントと抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を固相化したプレートで培養した細胞を示す。図３３より、フィブロネクチンフラグメントが低濃度（５μｇ／ｍＬ）で培養した条件は高濃度（２５μｇ／ｍＬ）で培養した条件と同様に、高い細胞増殖倍率を示した。また、抗ＣＤ２８抗体を固相化したプレートで培養した条件においても同様に、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図３４に示す。図３４は、培養細胞にＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ　ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ　ＦｏｘＰ３　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔを用いてＦｏｘｐ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。図３４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図３４より、いずれの条件で培養した細胞集団においても、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図３５に示す。図３５において、縦軸は培養開始時の細胞数に図３３の細胞増殖倍率と図３４の陽性率を乗じた値を示す。図３５より、いずれの条件においても、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例８　再刺激による制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
実施例６－(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　実施例５－（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養６日目に細胞を回収し、培養用培地を０．５ｍＬ加え表面未処理２４ウェルプレートに全量をまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図３６に示す。図３６において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図３６より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例５－（２）と同様の操作で測定した。その結果を図３７に示す。図３７において、縦軸はＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図３７より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が同程度かやや高かった。
　図３８において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図３８より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が同程度かやや高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図３９に示す。図３９において、縦軸は培養開始時の細胞数に図３６の細胞増殖倍率と図３７の陽性率を乗じた値を示す。図３９より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
　ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図４０に示す。図４０において、縦軸は培養開始時の細胞数に図３６の細胞増殖倍率と図３８の陽性率を乗じた値を示す。図４０より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
（３）再刺激培養による制御性Ｔ細胞の培養
　本実施例（２）で調製した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、本実施例（１）で調製したフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で再刺激培養を開始した。再刺激培養３日目に細胞を回収し、培養液と等量の培養用培地で懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに全量をまき直した。再刺激培養４日目に培養用培地を０．２ｍＬ加え、再刺激培養５日目に培養用培地を０．５ｍＬ加えた。再刺激培養開始７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
　再刺激後の細胞増殖倍率の経時的変化を図４１に示す。図４１において、横軸は再刺激培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図４１より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、高い細胞増殖倍率を示した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図４２に示す。図４２において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図４２より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を図４３に示す。図４３は、培養細胞にＡＰＣ－Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＣＲ７抗体及びＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ２５抗体を添加して４℃で２０分間反応させ染色後、ＰＥ　ａｎｔｉ―ｈｕｍａｎ　ＦｏｘＰ３　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｅｔを用いてＦｏｘｐ３陽性細胞率をＦＡＣＳＣａｎｔｏで測定した。図４３において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図４３より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が同程度かやや高かった。
　図４４において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図４４より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図４５に示す。図４５において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４２の細胞増殖倍率と図４３の陽性率を乗じた値を示す。図４５より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
　ＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図４６に示す。図４６において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４２の細胞増殖倍率と図４４の陽性率を乗じた値を示す。図４６より、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例９　ラパマイシン存在下での制御性Ｔ細胞の培養法
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
　実施例１－（１）と同様に、抗ＣＤ３抗体溶液、及び抗ＣＤ３抗体とレトロネクチンの混合溶液を調製し、それぞれ表面未処理９６ウェル平面プレートに０．１ｍＬ／ウェルの量で加え、４℃で一晩放置した。その後、それぞれのプレートを３７℃で２．５時間放置後、溶解液をとり除き、ＰＢＳを用い０．２ｍＬ／ウェルの量で各プレートを２回洗浄し、抗ＣＤ３抗体固相化プレート及びフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　実施例５－（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を０．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養４日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加え、培養５日目に培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養７日目に培地を０．１ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収した。
（３）ラパマイシン添加による制御性Ｔ細胞の培養
　本実施例（２）に調製した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。さらに、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、ラパマイシン（シグマアルドリッチ社製）を終濃度２ｎＭとなるようにそれぞれに添加した。なお、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞液について、ＣＤ２８抗体は添加するがラパマイシンは添加しない条件を設定した。本実施例（１）で調製したフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）でラパマイシン添加培養を開始した。ラパマイシン添加培養３日目に、ラパマイシンを添加しない群は、細胞を回収し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、表面未処理２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。ラパマイシンを添加した群は、培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。ラパマイシン添加培養５日目に、ラパマイシンを添加しない群は、培養用培地を０．５ｍＬ加えた。ラパマイシンを添加した群は、細胞を回収し、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように２ｎＭ　ラパマイシンを含む培養用培地に懸濁し、表面未処理４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。ラパマイシン添加培養開始７日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞率を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図４７に示す。図４７において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を、矢印はラパマイシンを添加したタイミングを示す。また、図４７～５１の各図において、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８」は抗ＣＤ２８抗体存在下にフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞、「ＣＤ３＋ＣＤ２８＋Ｒａｐａ」は抗ＣＤ２８抗体存在下にラパマイシンを添加し抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞、「ＲＮＣＤ３＋ＣＤ２８＋Ｒａｐａ」は抗ＣＤ２８抗体存在下にラパマイシンを添加しフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞を示す。図４７より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、ラパマイシンを添加した条件に比べ高い細胞増殖倍率を示した。また、ラパマイシンを添加した条件間において、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例５－（２）と同様の操作で測定した。その結果を図４８に示す。図４８において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合を示す。図４８より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養し、かつラパマイシンを添加した条件よりＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合が高かった。また、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養し、かつラパマイシンを添加した条件ではＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞の割合がさらに高かった。この結果は、ラパマイシンを添加せずとも抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及びレトロネクチンで刺激すると、高純度の制御性Ｔ細胞を得ることができ、この条件にラパマイシンを添加することでさらに高純度の制御性Ｔ細胞が得ることができることを示している。
　図４９において、縦軸はＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を示す。図４９より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ラパマイシンを添加した条件の細胞集団に比べＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。ラパマイシンを添加した条件間において、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した細胞集団は、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合が高かった。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図５０に示す。図５０において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４７の細胞増殖倍率と図４８の陽性率を乗じた値を示す。図５０より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、ラパマイシンを添加した条件に比べＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。ラパマイシンを添加した条件間では、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
　ＣＤ６２ＬとＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図５１に示す。図５１において、縦軸は培養開始時の細胞数に図４７の細胞増殖倍率と図４９の陽性率を乗じた値を示す。図５１より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、ラパマイシンを添加した条件に比べＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。ラパマイシンを添加した条件間において、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
実施例１０　ＣＤ３／２８ビーズとの比較
（１）フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートの調製
　実施例６－(１)記載の操作に従い、表面未処理９６ウェル平面プレートを用いてフィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート及び抗ＣＤ３抗体固相化プレートを調製した。
（２）制御性Ｔ細胞の培養
　実施例５－（２）と同様にして、ＣＤ４陽性かつＣＤ２５陽性かつＣＤ４５ＲＡ陽性細胞を多く含む細胞集団を得た。これらの細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例２－（２）記載のものと同組成の培養用培地に懸濁した。固相化プレートで培養する群は、上記細胞懸濁液に抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加し、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレート又は抗ＣＤ３抗体固相化プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。一方、増殖刺激ビーズで培養する群は、上記細胞懸濁液に洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｒｅｇ　Ｅｘｐａｎｄｅｒ（インビトロジェン社製）（以下、ＣＤ３／２８ビーズと記載）を細胞対ＣＤ３／２８ビーズ比が１対４になるように添加し、表面未処理９６ウェル平面プレートに０．２ｍＬ／ウェルとなるように加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養を開始した。培養１日目に上記の培養用培地を０．０５ｍＬ加えた。培養４日目に培地を０．０５ｍＬ除き、培養用培地を０．１ｍＬ加えた。培養５日目に細胞を回収し、３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用２４ウェルプレートに１．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養７日目に培地を０．４ｍＬ除き、培養用培地を０．４ｍＬ加えた。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。また、ＣＤ３／２８ビーズで培養した群はマグネットでＣＤ３／２８ビーズを除き、細胞を回収し、８．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、細胞培養用１２ウェルプレートに２．０ｍＬ／ウェルとなるようにまき直した。培養開始８日目に細胞を回収し、細胞増殖倍率を測定した。培養開始１１日目に細胞を回収し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞率、ＣＣＲ７陽性細胞率とＣＤ２７陽性細胞率を測定した。
　細胞増殖倍率の経時的変化を図５２に示す。図５２において、横軸は培養開始からの日数を、縦軸は細胞増殖倍率を示す。図５２より、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件は、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件及びＣＤ３／２８ビーズで培養した条件よりも高い細胞増殖倍率を示した。
　Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の割合を実施例６－（２）と同様の操作で測定した。Ｆｏｘｐ３を発現する培養細胞の絶対数を図５３に示す。図５３において、縦軸は培養開始時の細胞数に図５２の細胞増殖倍率とＦｏｘｐ３の陽性率を乗じた値を示す。フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件及びＣＤ３／２８ビーズで培養した条件よりも、ＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性細胞数が顕著に増加した。
　ＣＣＲ７を発現する培養細胞の絶対数を図５４に示す。図５４において、縦軸は培養開始時の細胞数に図５２の細胞増殖倍率とＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞の割合を乗じた値を示す。図５４より、に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件、及びＣＤ３／２８ビーズで培養した条件よりもＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＣＲ７陽性細胞数が顕著に増加した。
　ＣＤ２７を発現する培養細胞の絶対数を図５５に示す。図５５において、縦軸は培養開始時の細胞数に図５２の細胞増殖倍率とＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞の割合を乗じた値を示す。図５５より、に比べて、フィブロネクチンフラグメント／抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件の方が、抗ＣＤ３抗体固相化プレートで培養した条件及びＣＤ３／２８ビーズで培養した条件よりもＣＤ４陽性かつＦｏｘｐ３陽性かつＣＤ２７陽性細胞数が顕著に増加した。
　以上、本発明の方法により、免疫抑制能の強い制御性Ｔ細胞を多く含む細胞集団を効率よく拡大培養できる方法が提供される。
　本発明の方法を用いれば、生体外で制御性Ｔ細胞を含む細胞集団を効率よく拡大培養できる。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫抑制剤として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等の予防・治療に有用である。
SEQ ID NO:1; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:2; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:3; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:4; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:5; TSDR forward primer.
SEQ ID NO:6; TSDR reverse primer.

Claims (7)

  1. 　下記工程を包含することを特徴とする、制御性Ｔ細胞を含む細胞集団の製造方法：
    （１）Ｔ細胞を含有する細胞集団からＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団を分離する工程、及び
    （２）ＣＤ３活性化物質及びフィブロネクチンもしくはそのフラグメント又はそれらの混合物の存在下で、工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程。
  2. 　工程（１）で得られた細胞集団を生体外で培養する工程が、ＣＤ２８リガンドの共存下で培養する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 　ＣＤ２８リガンドが抗ＣＤ２８抗体である請求項２に記載の方法。
  4. 　ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団がＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞集団である、請求項１～３いずれか記載の方法。
  5. 　ＣＤ３活性化物質が抗ＣＤ３抗体である請求項１～４いずれか記載の方法。
  6. 　請求項１～５いずれか記載の方法により製造された細胞集団。
  7. 　請求項６に記載の細胞集団を含有してなる、免疫抑制剤。
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