CN112135901A - 获得源自胸腺组织的调节性t细胞的方法及所述细胞作为细胞免疫疗法在免疫系统失调中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从胸腺组织获得和纯化调节性T细胞(或thyTreg细胞)的体外方法，这使得从单个胸腺获得超过100亿个细胞成为可能。除了从临床角度来看是安全的以外，本发明中获得的这些thyTreg具有超过95％的纯度和非常高的抑制能力、存活率和活力。前述内容将不需要使用大量离体细胞扩增方案。将这些thyTreg细胞转移至患者能够诱导免疫耐受。因此，所述细胞可以用作细胞疗法以在治疗和/或预防移植排斥和自身免疫疾病中诱导免疫耐受。

Description

获得源自胸腺组织的调节性T细胞的方法及所述细胞作为细 胞免疫疗法在免疫系统失调中的用途
技术领域
本发明属于临床免疫学和细胞免疫疗法的领域，特别是属于用于获得和纯化调节性T细胞(Treg)的方案，该调节性T细胞可随后在细胞疗法中被转移到患者中用于例如在移植个体或经受自身免疫过程者中诱导免疫耐受的目的。
背景技术
长期归因于免疫系统的主要功能是保护生物体免受病原体侵害的功能。然而，现在我们知道免疫系统还负责消除肿瘤细胞和预防癌症的发展，并且其还可以引起由于出现自身免疫过程、过敏或移植排斥而导致的反应不足。免疫系统的正常功能只有在存在对正常功能来说充足的平衡或体内平衡时才有可能，如此，过度反应将引起诸如过敏或排斥反应的病理状态，而反应缺乏则将导致感染和癌症的进展。
近年来，我们已经目睹了革命性的使用免疫细胞的细胞疗法出现在癌症治疗中，该疗法试图诱导或恢复对肿瘤的特异性免疫反应，并修补造成这些病理的患者免疫缺陷。对患者的免疫细胞进行遗传修饰以便以特定方式攻击肿瘤的“CAR T细胞”技术就是这种情况。像Novartis或Gilead这样的公司已经开发出这种细胞疗法来治疗B型白血病，实现了约80％的缓解，并且该疗法最近已获得FDA和EMA的批准，这代表着癌症治疗的真正的革命(Maude S.L.,et al.,2014,N Engl J Med.,371(16):1507-17；Lee D.W.,et al.,2015,Lancet,385(9967):517-528)。
然而，在相反意义上，尚未开发出具有相似效果，即诱导免疫耐受以预防或治愈自身免疫疾病或同种异体移植物排斥的细胞疗法。尚未开发出明显成功地减少过度免疫反应并恢复免疫耐受的免疫疗法。当前，使用免疫抑制药来治疗自身免疫疾病和免疫排斥。自从20世纪60年代出现这些药以来，移植实践变得可行，但是，尽管这些药有所改进，它们仍不能为排斥反应提供明确的解决方案，并且持续引起副作用，该副作用是患者的临床演变中的决定因素。具体来说，长期的免疫抑制引起慢性毒性，所述慢性毒性除了显著影响患者的生活质量外，还影响治疗的完成、患者和移植物的总体成功率以及存活。由于大多数免疫抑制剂以非选择性方式起作用，因此整个系统被阻抑和/或失去控制，从而丧失了其保卫宿主抵抗感染或肿瘤细胞繁殖的能力或产生了引起移植器官衰竭的血管损伤。此外，在儿童时期，持续施用免疫抑制剂可能会干扰正常发育，并干扰该时期中发生的免疫系统的适当成熟，这可能在改变患者的免疫能力方面导致终生后果。这些免疫抑制药将来可能会继续改善，从而进一步降低排斥率；然而，这种策略的弊端常常是引起免疫系统的退化和慢性损伤。即使能够更好地预防移植物排斥，与免疫系统的退化有关的病症(如感染、癌症和自身免疫疾病)也将继续限制接受免疫抑制药的移植患者的长期存活。
为此，实现将无限期地避免影响上百万人的排斥或自身免疫疾病的免疫耐受已成为现代医学的主要挑战。
科学界当前的观点是，只有一种涉及再训练(re-educating)移植受者的免疫反应的免疫耐受诱导会允许移植物无限期存活或预防和治愈自身免疫过程。这种耐受诱导会使耐受移植器官成为可能而无需药理学免疫抑制，从而消除了这些疗法的毒性作用及其对免疫系统的损伤作用。
增加移植患者预期寿命的最有希望的替代方案之一是借助细胞免疫疗法诱导免疫耐受，这将使移植物无限期存活，而没有与免疫抑制治疗相关的病状(Sicard A.,etal.,2015,Front Immunol；6:149)。该方法集中于有意地减少对移植物的特异性免疫反应，同时消除或显著降低长期的药理学抑制，从而维持有效的免疫系统。免疫耐受是免疫系统的基本特征，能够诱导这种耐受的具有抑制能力的淋巴细胞亚群的发现在临床领域正引起广泛的热情。被称为调节性T细胞(Treg)的这些细胞构成免疫系统的基本部分，并且在预防移植物排斥或自身免疫疾病以及维持对患者有益的免疫稳态方面能够起到至关重要的作用。Treg能够抑制多种细胞的效应功能，所述多种细胞包括T CD4+和CD8+、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞(Sakaguchi S.,et al.,2008,Cell；133:775-87)。因此，Treg细胞已成为研究自身免疫、过敏和移植的令人关注的领域。
因此，使用Tregs的细胞疗法被假定成为治疗由免疫系统反应过度或不足介导的疾病(如自身免疫过程(Bluestone J.A.,et al.,2015,Expert Opin.Ther.Targets；19:1091-103)、骨髓移植患者的移植物抗宿主病(Brunstein C.G.,et al.,2016,Blood；127:1044-51)或移植排斥(Safinia N.,et al.,2015,Front Immunol；6:438))的巨大希望。
Tregs在移植物中的基本作用已在皮肤和心脏移植动物模型的各种研究中得到证实，证明在移植时存在于容器(receptacle)中的Treg对于诱导和维持对移植物的耐受性至关重要(Wood K.J.,Sakaguchi S.,2003,Nat.Rev.Immunol.；3:199-210)。这些Treg细胞将阻碍效应T细胞的活化和扩增，而效应T细胞是造成细胞性排斥的原因。另外，Tregs还可以诱导B细胞死亡，从而预防体液性排斥，如在心脏异种移植模型中已经证明的那样(Ma Y.,et al.,2008,Xenotransplantation；15:56-63)。
该领域的现有知识指出了一种假说，即移植患者或具有自身免疫过程者的免疫耐受由Treg细胞与效应T细胞的平衡决定。因此，预期更大量的循环性Treg将能够预防触发这些疾病的效应细胞活化和增殖。
因此，在预防排斥或治疗自身免疫过程中可提供优异结果的治疗策略是通过Treg细胞转移来进行细胞疗法，以大幅增加Treg细胞在循环中的数量，并且从而加强受者对移植器官或对自身组织的在接受体中的内在耐受机制。患者中的自体Treg的转移通过以下实现：从患者中抽取血液，纯化存在于所述血液中的Treg，离体扩增这些Treg以获得合适的数量以及将扩增的自体Treg转移回患者。如下所述，其他小组已经证明了它们在动物模型中对预防排斥的有效性，甚至已经在其他疾病中进行了临床试验，证实了它们在人体中的治疗用途。
已经进行的第一批I/II期试验中反映了Treg疗法在人体中的安全性和潜在有效性。大多数使用Treg的临床试验都是在对血液肿瘤患者进行骨髓移植的背景下进行的，显示在这些患者中输注Treg减少或预防了移植物抗宿主病(GvHD)(Brunstein CG.et al.,2016,Blood.127(8):1044-51；Di Ianni M.et al.,2011,Blood.117(14):3921-8)。GvHD的最大风险发生在前三个月，并且已经证明了在该短时期中通过Treg疗法的免疫抑制足以提供长期的耐受性。然而，在实体器官移植或自身免疫疾病的情况下，该风险在患者或移植物的整个生命周期中持续存在，这需要Treg的保护作用适时地持续存在以确保预防免疫反应不足。
名为The One Study的国际联合会正在进行一项多中心I/II期研究，其中研究了对成人进行肝肾移植的背景下输注离体扩增的Treg的安全性和潜在有效性。然而，尽管该联合会的初步结果前景很好，但他们证明了从成人患者的外周血中获得优质Treg的困难以及成人患者中存在的Treg由于其更加分化的表型而导致存活率和有效性有限(SafiniaN.,et al.,2015,Front Immunol.,6:438)。还有在其他疾病(如I型糖尿病)中的Treg转移试验，包括在儿童中的试验(Marek-Trzonowska N.,et al.,2012,Diabetes Care；35:1817-20)。但是，尽管近年来这种治疗替代方案引发了极大的兴趣和期望，但是使用Treg细胞进行治疗仍无法在预防人实体器官排斥方面提供明确的结果。
迄今为止进行的大多数策略和试验都使用从外周血中获得的Treg细胞，该Treg细胞随后进行离体扩增并作为细胞疗法转移回患者。最大的限制是获得足够数量的Treg，因为它们在外周血中的频率非常低(占总T CD4+淋巴细胞的4％至10％)，因此，在能够将细胞转移回患者之前应用大量离体Treg扩增方案是必不可少的。Wiesinger et al.,2017,Frontiers in Immunology,8:1371描述了从外周血中分离的离体扩增Treg细胞的符合GMP的生产。该方法包括在CD3/CD28刺激之前使CD8+细胞耗竭。
另一个重要的限制是存在于成人外周血中的Treg细胞是分化的细胞，并且可能高度老化。这些更加分化的细胞的存活期限于几个月，抑制能力降低，表型不稳定从而可能使它们丧失决定其功能性和抑制能力的Foxp3分子的表达，甚至可以分化为促炎性效应T细胞(Miyara M.,et al.,2009,Immunity；1-13)。如果还在培养物中扩增这些细胞，则它们的调节性细胞容量会进一步降低(Hoffmann P.,et al.,2009,Eur.J.Immunol.；39:1088-97)。
因此，离体Treg细胞扩增方案具有各种问题，这些问题限制了它们在获得可以成功并安全地用于人临床试验的功能性细胞方面的实用性：
a.大多数扩增方案不满足对获得以用于人的免疫疗法的细胞的强制性GMP(良好生产规范)要求。
b.已经证明，取决于最初的Treg表型，离体扩增可导致其抑制能力的丧失。具有体外刺激记忆表型的Treg细胞丧失Foxp3表达(负责其抑制能力)及其Treg表型，而具有幼稚表型的Tregs能够维持Foxp3表达，并因此在反复刺激和扩增后维持其抑制能力。该事实已被不同的作者证实，表明在成人中比例占少数的幼稚Treg细胞群将最适于扩增，从而保留其抑制特性。
c.体外扩增分化的Treg细胞或具有记忆表型的Treg细胞可导致其抑制表型的丧失并取得促炎分泌型细胞因子表型如IL-17或IL-4，其甚至可能恶化或促进器官排斥过程。
也就是说，使用当前策略获得充足数量和质量的Treg所遭遇的困难限制了该疗法的临床实用性。因此，针对通过Treg转移诱导耐受的正在进行的人体试验在产生足够的细胞以及具有必要的抑制能力以获得明确的短期和长期治疗作用方面遇到了很大的困难。
迄今为止，使用Treg疗法预防人的实体器官排斥尚未产生明确的临床结果。可纯化的外周血中Treg的数量有限，加之从成人获得Treg的存活率低且抑制能力有限，可能已经使这种治疗策略达不到成功。
近期发表的“概念性验证”证明，作为外周血的替代物，人胸腺组织是能够获得具有最佳表型的细胞的Treg细胞的潜在来源，(Dijke I.E.,et al.,2016,American Journalof Transplantation,16:58-71；and MacDonald K.et al.2017,Wolters Kluwer,Canadian national transplant research program,page S9；https://journals.lww.com/transplantjournal/Fulltext/2017/05003)。该研究建议使用胸腺组织作为Tregs的来源，证实了相对于使用外周血作为细胞来源的从该组织中获得的细胞的质量、其抑制能力以及大量可获得的细胞。然而，由于这是使用动物模型的体外研究，它应用了研究中常用的Treg纯化方案，该方案包括使用牛血清、酶处理、使用补体介导的裂解作用耗竭CD8、雷帕霉素、作为Treg活化剂的包被有非人抗CD3和抗CD28抗体的颗粒等，其中一些与获得的细胞作为人的免疫疗法的后续使用不相容。另外，使用该方法获得的Treg细胞的数量仍然不足以在人体中实施充足的治疗。
基于前述内容，需要开发用于获得和纯化Treg细胞的优化的方法，该方法除了使获得数量充足且足够用于其在人的免疫疗法中的后续使用的细胞成为可能，还将使获得在表型、纯度、保留的抑制能力、存活率和活力方面质量改善的细胞成为可能。而且，所述方法必须提供从临床角度来看安全用于人的细胞免疫疗法的细胞。借助所述增强方法获得的Treg细胞的治疗用途将使预防慢性免疫排斥成为可能，从而实现移植存活延长。
发明内容
如上所述，基于Treg的细胞疗法的最大限制之一是实现足够数量的Treg。迄今为止，用于从外周血中纯化Treg的方案获得了少于2000万个细胞的产量，因此需要涉及使用不同的试剂并且显著降低细胞的质量的大量扩增方案。
本发明人首次提供了获得Treg细胞的方案，其中在CD3/CD28刺激之前不耗竭CD8+细胞。本发明人证明这导致在最终产品中存在Foxp3+Treg的CD4+CD8+群(约41％，图4B、4C)。考虑到胸腺组织中存在的约80％的胸腺细胞是表达CD4和CD8标志物的细胞(图4A)，先前在其他方案中采用的CD8耗竭将放弃这些CD4+CD8+Treg细胞中的大多数。
在优选的实施方式中，将与人源化的CD3和CD28激动剂缀合的胶体聚合物纳米基质(nanomatrix)用于CD3/CD28活化，这是创新的方法，该方法提供的Treg细胞活化和扩增的水平与使用CD3/CD28珠子所获得的水平相当(图6)，同时使T细胞活化剂易于从培养基中除去，从而使该步骤中Treg细胞的损失最小。
如实施例中所示，本发明的用于从分离的胸腺组织获得Treg细胞的方案使得能够获得多于130亿、纯度大于95％(参见图1C和4B)、活力大于80％(图1B)、且抑制能力非常高(图2和3)的thyTreg。如此数量的细胞将使针对小于1岁的患者制备多于1000剂的细胞疗法以及如果用于较大的儿童或成人而制备上百剂成为可能。在获得thyTreg细胞中，这些产量是闻所未闻的。
因此，在第一方面，本发明涉及一种从分离的胸腺组织中获得调节性T(Treg)细胞群的体外方法，包括以下步骤：
a.机械分解胸腺组织；
b.过滤阶段(a)之后获得的产物，并将包含胸腺细胞的沉淀物重悬于培养基中；
c.从阶段(b)之后获得的产物中分离CD25+细胞；
d.在存在T细胞活化剂和IL-2或TGFβ(优选IL-2)的情况下在培养基中培养阶段(c)之后获得的细胞群，优选其中所述T细胞活化剂至少包含CD3和CD28激动剂；和
e.从阶段(d)的培养基中除去T细胞活化剂；
f.任选地，在存在IL-2或TGFβ(优选IL-2)的情况下在培养基中进一步培养调节性T细胞；
条件是在步骤(d)之前，细胞群中的CD8+细胞中未被耗竭。
本发明的另一方面涉及通过本发明的方法获得的或可获得的调节性T细胞或调节性T细胞群。
本发明的另一方面涉及用于作为药物的用途的如本文所述的本发明的thyTreg细胞和thyTreg细胞群。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的本发明的thyTreg细胞和thyTreg细胞群，其中所述药物组合物还包含赋形剂和/或药学上可接受的载体。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒(下文称为“本发明的第一试剂盒”)，其包含用于执行如本文所述的本发明的方法的所有必需的试剂、介质和装置。
本发明的又一方面涉及一种试剂盒(下文称为“本发明的第二试剂盒”)，其包含如本文所述的本发明的thyTreg细胞或thyTreg细胞群或如本文所述的本发明的药物组合物以及用于向个体施用细胞，优选注射细胞的适当的医疗装置。
附图说明
图1.显示纯化和富集胸腺来源的thyTreg细胞的结果。胸腺组织取自5月龄的儿童。显示了纯化方案之前总胸腺细胞中Treg细胞的频率(A)，以及用本发明的方法获得的最终产品中CD25+Foxp3+Treg细胞的活力(B)和纯度(C)。
图2.显示胸腺来源的thyTreg细胞的抑制能力。将PBMC细胞用CFSE染色、活化、并单独或与胸腺来源的thyTreg一起共培养。以CFSE染色的荧光强度的降低来测量反应性T细胞的增殖。培养3天后，单独的活化的TCD4+和TCD8+增殖超过87％。thyTregs的存在使活化的CD4+和CD8+T细胞的增殖减少75％以上。
图3显示thyTreg抑制同种异体CD4+和CD8+T细胞增殖的功效。培养3天后，未活化的(NA)T细胞不增殖(白色)；超过80％的活化CD4+和CD8+T细胞增殖，观察到数个分裂周期(峰)(灰色区域)；然而thyTreg的存在阻止这些同种异体T细胞增殖超过80％(条纹区域)(A)；产生的thyTreg群显示各种Treg比反应性细胞的比率下针对同种异体CD8+和CD4+T细胞的抑制能力(B)。
图4.从胸腺组织中获得的总胸腺细胞的表型(A)；thyTreg最终产品中CD25+Foxp3+细胞的纯度(B)；thyTreg细胞关于thyTreg最终产品中CD4和CD8表达的分布(C)。
图5.在采用雷帕霉素(+雷帕霉素)或不使用雷帕霉素(-雷帕霉素)的相同方案之间，CD25+Foxp3+细胞纯度(A)和倍数扩增(B)的差异。
图6.在采用Dynabeads或TransAct作为细胞活化剂的相同方案之间，CD25+Foxp3+细胞的纯度(A-B)、功能性Treg标志物表达(C)和倍数扩增(D)的差异。
图7.使用我们的方案生产的thyTreg(深灰色)的免疫原性标志物表达比从成人外周血中获得的常规CD4+T细胞(灰色)更低。同型对照以浅灰色区域表示。
图8.与标准培养条件相比，使用我们的方案生产的thyTreg在存在促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα；炎性条件)的情况下维持稳定的Foxp3表达(A)和IL-10生产能力(B)。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了一种获得和纯化从胸腺组织中获得的新亚型Treg细胞的体外方法。在另一方面，本发明涉及根据本文所述的方法获得的Treg细胞或Treg细胞群，所述Treg细胞或Treg细胞群在本发明中被称为“thyTreg”。
与存在于血液中或通过其他方法获得的Treg相反，通过本发明的方法获得的thyTreg已显示展现出差异特征，该差异特征使thyTreg对于其在细胞疗法中的临床应用而言是最佳的。因此，它们具有更大的抑制免疫系统的效应细胞的能力、未分化的表型(由于胸腺中所含的细胞尚未暴露于外来抗原)、高活力和稳定的Foxp3表达(图8A)、稳定的IL-10产生(图8B)、以及功能性标志物(如CTLA-4和CD39)的充足表达(图6C)。另外，本文开发的用于获得、纯化和加工thyTreg的方案使得从单个胸腺中产生纯度大于95％的多于100亿(1×1010)个thyTreg(参见例如实施例1，其中获得了130亿个thyTreg)成为可能。这些数字比使用其他方法从单个个体无论是以外周血(Safinia N.,et al.,2015,Front Immunol.,6:438)还是以胸腺组织(Dijke I.E.,et al.,2016,American Journal ofTransplantation,16:58-71)作为细胞来源可获得的那些优越很多。
成人的治疗试验中常用的Treg剂量约为每kg患者体重1×106个至10×106个Treg。因此，本文所述的方案的产量将使得从例如6月龄小儿患者(6-8kg)产生多于1,800剂的来自单个胸腺的thyTreg细胞成为可能。这不仅使得执行治疗而无需大量细胞扩增成为可能，而且仍将有足够数量的细胞来储存若干冷冻剂量，所述冷冻剂量可用于将来在出现任何排斥迹象的情况下再次输注于患者或用于其他患者(同种异体用途)。
如前所解释的，使用本发明的方案已经获得了大量的thyTreg细胞，并且所述方法在人中也与获得的细胞作为疗法的后续用途所需的GMP条件相容。另外，本发明中获得的thyTreg可具有大于95％的纯度和非常高的抑制能力、存活率和活力。已经在不使用使它们在人中与其后续临床使用不相容的产品或方法情况下获得所述Treg细胞群和产量。因此，这种治疗方法使得不仅在病理过程的早期，而且长期地调节免疫稳态成为可能。因此，将使用本发明的方法获得的thyTreg细胞向患者转移可以实现无限期，即贯穿移植物寿命的免疫耐受诱导。
使用胸腺组织，优选从小儿心脏移植患者中除去的胸腺组织作为细胞来源，已经开发了特定的方案，通过该方案获得大量的具有最佳表型、高抑制能力和更长平均寿命的thyTreg细胞而无需会改变其质量的大量离体扩增。由此获得的细胞可用于自体或同种异体转移至患者，例如移植患者，优选实体移植患者，更优选小儿心脏移植患者。以这种方式，活化了免疫耐受的内在机制。获得的结果表明，这种细胞免疫疗法可以明确地阻止移植物的免疫排斥，并确保减少或完全消除免疫抑制药的施用及其相关的毒性。而且，所述治疗策略在治疗与免疫系统有关的其他类型的失调如自身免疫过程中开辟了新前沿。
因此，本发明使得克服迄今为止存在的限制了Treg细胞疗法在人中(优选在实体器官移植的背景下)的成功的障碍，并且提供了对提供用于获得和纯化Treg细胞的优化方法的需求的解决方案，所述Treg细胞从临床角度来看是安全的，并且数量充足且足够用于其在人细胞免疫疗法中的后续使用，优选具有适时地持续的增强的抑制表型、提高的纯度、保留的抑制能力、高存活率和活力。
因此，本发明的方法和通过该方法获得的thyTreg细胞的一些最突出优势的如下：
-在优选的实施方式中，所述的方法不进行任何类型的酶消化，或使用与获得的细胞的后续治疗用途不相容的试剂、动物血清或产品，这与现有技术中描述的其他类似方案相反，在所述类似方案中，培养基补加有致使细胞的后续临床用途不可能的牛或人血清。在Treg培养基中使用包被有抗CD3和抗CD28抗体的颗粒来活化细胞在现有技术中也是常见的(参见，例如Dijke I.E.,et al.,2016,American Journal of Transplantation,16:58-71)。然而，该类型的试剂的存在需要复杂的附加方法来在将细胞转移至患者之前完全地消除上述颗粒。相反，本发明方法的优选实施方式仅使用在用于治疗用途的细胞的生产中所允许的试剂，由于该试剂是100％相容的和安全的，从而允许所述细胞的临床和治疗性用途。
-与现有技术的方法(尤其是其中使用外周血作为细胞来源的那些方法或DijkeI.E.,et al.,2016,American Journal of Transplantation,16:58-71中所述的方法，其中仅获得约3亿个细胞(从临床角度来看是不足的))相比，该方法使得获得更大量的Treg细胞成为可能(从单个胸腺获得超过100亿个thyTreg细胞)。这提供了制备各种剂量的可能性，这些剂量可以以不同的时间间隔施用至患者，或者可以被保存用于将来自体或同种异体施用。
-该方法不需要大量离体细胞扩增，从而维持细胞的质量和负责抑制能力(持续的Foxp3表达)的表型。
-该方法使得未成熟Treg细胞(Foxp3表达低)能够分化为稳定的和理想的Foxp3+Treg。
-可以产生纯度为95％的ThyTreg细胞，并且不存在效应T细胞，效应T细胞不仅不具有抑制能力，而且甚至可以诱导排斥或炎性反应。通常使用CD25抗体(存在于Tregs中的分子)分离Treg细胞，但它们也表达T CD4+效应细胞。因此，在当前的方法中，纯化群包含不具有抑制能力并且具有炎性作用的污染性效应细胞。本发明方法的优点在于，由于胸腺中含有的细胞没有暴露于外源抗原，因此没有效应细胞，因此，所有纯化的细胞都将是thyTreg细胞，因为它们表达CD25。
-获得的thyTreg细胞具有高存活率(高于平均寿命)以及大于80％甚至90％的活力(图1B)。
-获得的thyTreg细胞具有优异的抑制能力，高于70％，因为它们具有持续的Foxp3表达。这与这些细胞转移后在患者中诱导的免疫耐受适时地持续存在并提供针对免疫排斥的无限期保护(移植物的长期免疫耐受)相关。
-相对于从外周血中获得的Treg细胞(Dijke I.E.,et al.,2016,AmericanJournal of Transplantation,16:58-71)，获得的thyTreg细胞具有最佳抑制表型。
另外，本发明的该方案使用其中产生Treg细胞的胸腺组织代替外周血作为细胞来源。从该组织中获得的thyTreg细胞的主要优势在于，它们从未迁移到外周，它们都具有幼稚和未分化的表型，从而具有更大的存活率，并且能够在反复刺激和扩增后维持Foxp3表达及其抑制能力。因此，在成人中比例为少数的幼稚Treg细胞最适合用于细胞疗法，从而维持其抑制能力。在这方面，由本发明的发明人进行的分析证明，使用本文所述的方案获得的thyTreg：
a.具有的存活率高达从外周血中获得的成人Treg细胞的存活率的10倍，
b.具有优异的抑制能力，从而抑制TCD4和TCD8效应细胞的增殖大于70％，甚至75％(参见下文显示的本发明的实施例)，
c.在体外活化后维持Foxp3表达以及维持稳定的抑制表型，
d.即使存在通常能够使Treg表型向Th17细胞转换的细胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα)，也维持Foxp3表达和IL-10产生能力(图8)。
本发明的方法表现的另一个优势是可以容易地获得在心脏外科手术(如心脏移植术或缓和先天性心脏病的不同手术)期间通常被除去并丢弃的胸腺组织以用于作为Treg的来源，优选作为自体Treg的来源的用途，也可以用于其同种异体用途。
另外，使用本发明的方法获得的thyTreg细胞的施用使得减少或完全消除免疫抑制药的使用成为可能，所述免疫抑制药由于其阻抑整个免疫系统的非特异性活性而具有相关的慢性毒性和副作用，例如感染、肿瘤过程或自身免疫疾病的发展。
此外，使用患者自身细胞(自体施用thyTreg)的可能性显著降低了因同种异体细胞的治疗使用而引起的潜在副作用。此外，该策略是可以在相对较短的时间内供患者任意使用的低成本的疗法。
总而言之，本文所述的治疗策略使得预防移植排斥，使移植物无限期存活以及使移植患者(尤其是儿童)具有更长的预期寿命成为可能。另外，它开辟了实现thyTreg细胞生物库的可能性，所述thyTreg细胞生物库使用本发明的方法从优选在心脏外科手术中丢弃的胸腺组织中获得，这将使得开发用于通过诱导免疫耐受来治疗各种免疫相关疾病(如自身免疫失调或移植物抗宿主病)的使用同种异体thyTregs的细胞疗法成为可能。
在第一方面，本发明涉及一种从分离的胸腺组织中获得调节性T(Treg)细胞群的体外方法，包括以下步骤：
a.机械分解胸腺组织；
b.过滤阶段(a)之后获得的产物，并将包含胸腺细胞的沉淀物重悬于培养基中；
c.从阶段(b)之后获得的产物中分离CD25+细胞；
d.在存在T细胞活化剂和IL-2或TGFβ(优选IL-2)的情况下，在培养基中培养阶段(c)之后获得的细胞群，优选其中所述T细胞活化剂至少包含CD3和CD28激动剂；和
e.从阶段(d)的培养基中除去T细胞活化剂；
f.任选地，在存在IL-2或TGFβ(优选IL-2)的情况下在培养基中进一步培养调节性T细胞；
条件是在步骤(d)之前，细胞群中的CD8+细胞未被耗竭。
CD8+细胞的耗竭可以例如使用补体介导的裂解来进行。在优选的实施方式中，在CD25+细胞分离步骤之前，胸腺细胞群中的CD8+细胞未被耗竭。
本文使用的术语调节性T(Treg)细胞是指以表达CD4、CD25和Foxp3细胞表面标志物为特征的细胞，也称为CD4+CD25+Foxp3+细胞。优选地，通过本发明的方法获得的Treg细胞群的特征在于包含至少80％，优选至少85％，更优选至少90％、95％、97％或99％的CD4+CD25+Foxp3+细胞。
优选地，步骤a)包括在存在培养基并且不使用酶的情况下机械分解(例如通过使用如下文所述的组织解离器)胸腺组织。
该方法在本说明书中也将被称为“本发明的方法”。
在进行本发明的方法之前，分离的胸腺组织可以存在、储存在包含盐溶液、抗生素和抗真菌剂的无菌容器中，所述盐溶液例如但不限于氯化钠。
在优选的实施方式中，其任选地与本文所述的特征或实施方式中的一个或多个组合，本发明的方法包括在阶段(a)之前的步骤，该步骤包括将分离的胸腺组织分成较小的部分或切片，更优选分为2克至3克的部分。
本发明的方法优选在GMP批准的细胞生产单元中进行，所述细胞生产单元确保最终获得的细胞的生物安全性。
优选地，本发明的方法不包括使用诸如牛血清或来源于牛血清的蛋白、人血清、酶、抗CD28或抗CD3包被的珠子或雷帕霉素的试剂。
本发明涉及的“胸腺组织”是来自胸腺的任何组织样品，所述胸腺是位于心脏前方和胸骨后方的淋巴系统的腺体，T细胞和淋巴细胞在该腺体处成熟。胸腺组织可以通过本领域已知的用于除去目的的任何方法除去，例如借助胸腺切除术，其可以经胸骨、经子宫颈或视频辅助(videoscopic)。优选地，在进行本发明的方法之前，在外科手术干预期间，更优选在旨在治疗心脏病(例如先天性心脏病)的外科手术干预期间，或在心脏移植期间，除去胸腺组织。甚至更优选地，在小儿心脏移植期间，除去本发明的胸腺组织。
胸腺组织可以来自人或非人哺乳动物，例如但不限于啮齿动物、猪、灵长类、反刍动物、猫科动物或犬科动物。在本发明的方法的优选实施方式中，胸腺组织来自人，更优选地年龄为0(新生儿)至16岁的人，甚至更优选地为0至10岁的人，特别是0至24月龄的人。
在另一个优选的实施方式中，胸腺组织所来自的个体与随后要施用在本发明的方法结束时所获得的thyTreg细胞以用于细胞免疫疗法的个体相同。即，组织优选是自体的。
在本发明中，“小儿患者”或“儿童”应理解为年龄为0至16岁的人，优选地为0至10岁的人，甚至更优选地为0至24月龄的人。
可以用于本发明的方法中的“组织解离器”是允许组织在不使用酶的情况下机械分解的组织解离器。现有技术中可商购获得的任何组织解离器均可用于本发明的方法的阶段(a)。这些解离器的实例是但不限于，来自Miltenyi Biotec的gentleMACS Dissociator或gentleMACS Octo Dissociator、来自Quiagen的TissueLyser LT或来自WorthingtonBiochemical、Sigma-Aldrich或Roche Diagnostics的组织解离器。优选地，用于本发明的组织解离器是来自Miltenyi Biotec的gentleMACS Octo Dissociator。
在本发明的方法的步骤(a)中，可以使用组织解离器将先前除去的胸腺组织机械分解，从而产生细胞悬液，该组织解离器是优选允许半自动化和标准化的组织解离的单元。可以将要解离的组织样品添加到容器(优选一次性容器)中，该容器使得在封闭的无菌系统中制备和处理样品成为可能，从而提供高水平的安全性并使污染的风险最低。所述容器还可以包含GMP培养基，并且优选地包含抗生素，例如浓度为2％至20％、优选2％至10％、更优选地5％的抗生素。本发明中可能存在和使用的抗生素的实例包括但不限于青霉素、链霉素、两性霉素或其任何组合。GMP培养基不含来自动物的血清和组分，允许培养和扩增人和小鼠T细胞并扩增本发明的thyTreg细胞。
“GMP(良好生产规范)培养基”是已被批准用于在后续将用于人临床研究，优选用于细胞疗法的培养基中维持细胞的任何细胞培养基，所述细胞优选为T细胞，更优选为人T细胞。GMP培养基不包含动物来源的组分，该培养基不含血清并且满足GMP要求。这种培养基的实例是但不限于X-VivoTM 15(Lonza,Ref.BE02-060)、ImmunoCultTM-XF T细胞扩增培养基(StemCell Technologies,Ref.10981)或TexMACS GMP培养基(Miltenyi Biotic,Ref.170-076-307)。优选地，用于本发明的方法的GMP培养基还包含抗生素。通常存在于培养基中的抗生素是，例如前面段落中引用的那些。更优选地，用于该方法的GMP培养基是Miltenyi Biotic公司的TexMACS培养基，所述TexMACS培养基甚至更优选地包含抗生素。合适的抗生素和抗生素浓度的实例如上文所提供。
“TexMACS培养基”包含盐、氨基酸、脂肪酸、维生素、药物级人白蛋白(即GMP或适用于人)和缓冲液。该培养基的pH值优选维持在6.9至7.3，并且可以包含或可以不包含酚红。
一旦完成步骤(a)，便过滤从组织分解中获得的产物，优选使用孔径为30至40μm的过滤器进行，更优选地其中所述过滤器由尼龙网制成，以除去组织残余物和聚集体从而获得均匀的单细胞悬液。随后，可以(任选地)将得到的产物离心。最后，将包含胸腺细胞的细胞沉淀物重悬于优选含有抗生素的GMP培养基中，例如浓度为2％至20％、优选2％至10％、更优选地5％的抗生素。对于获得的胸腺细胞悬液，可以使用本领域已知的方法任选地进行细胞质量和活力控制，通常如果活力大于80％并且没有污染迹象，则继续进行到本发明的方法的下一阶段，该阶段由纯化Treg细胞组成。否则，将丢弃样品。
在本发明的方法的阶段(c)中，从在先前阶段中获得的产物中分离或纯化CD25+细胞(其包含Treg细胞)。该阶段(c)的纯化可以使用例如但不限于能够进行阳性选择或分离表面上表达特定标志物的细胞的本领域已知的任何免疫细胞化学技术进行。例如，可以通过流式细胞术或使用磁性细胞分离器来分离CD25+细胞群。尽管尚未得到监管机构的批准，但仍在开发单次使用的闭路式细胞分选仪(single-use and close circuit cellsorter)，该分选仪可能适合于生产用于人的疗法目的的细胞(https://www.miltenyibiotec.com/ES-en/products/macs-flow-cytometry/cell-sorter.html)。在优选的实施方式中，其任选地与本文所述的特征或实施方式中的一个或多个组合，步骤(c)包括使用与抗CD25抗体缀合的磁珠。
该纯化步骤优选在洁净室环境中并借助授权用于人的细胞疗法的细胞纯化系统进行，优选使用
Figure BDA0002756734320000081
仪器进行，更优选在存在缓冲溶液(例如补充有抗生素或TexMACS培养基或其他的0.9％氯化钠)以及与超顺磁性颗粒缀合的特异性鼠IgG1同种型抗人CD25单克隆抗体(优选CliniMACs CD25试剂)的情况下进行。也就是说，将之前阶段中获得的产物引入纯化系统，优选引入
Figure BDA0002756734320000082
系统。
Figure BDA0002756734320000083
或“CliniMACs plus”仪器可从Miltenyi Biotic公司商购获得，它是自动细胞分离平台和功能上封闭无菌的系统。“
Figure BDA0002756734320000084
CD25试剂”由与超顺磁性右旋糖酐铁颗粒缀合的特异性小鼠IgG1同种型抗人CD25单克隆抗体组成，优选包含在无热原无菌溶液中。所述试剂可从Miltenyi Biotic公司商购获得，并且当与
Figure BDA0002756734320000085
仪器或系统组合使用时，使得从异质人细胞群中富集CD25+细胞成为可能。一旦在本发明的方法中纯化了CD25+细胞(包括Treg细胞)，就可以任选地使用例如但不限于流式细胞术来进行质量控制，以验证获得的Treg细胞的活力、数量和纯度。
“授权用于人的细胞疗法的细胞纯化系统”是能够从含有不同细胞类型的异质细胞悬液中分离和纯化特定细胞群的任何仪器。这些仪器必须基于根据细胞表面上表达的分子或特定细胞标志物对所关注的细胞的分离和纯化，并且对于这些仪器来说必不可少的是一旦纯化就保留细胞的活力和功能能力。此外，这些仪器必须经过GMP授权，以用于人的治疗用途。这些授权用于人的细胞疗法的细胞纯化系统的示例是但不限于CliniMACs plus(Miltenyi Biotec)、CliniMACs Prodigy(Miltenyi Biotec)、RoboSep(STEMCELLTechnologies)、MACSQuant Tyto(Miltenyi Biotec)或MoFlo Astrios Sorter(BeckmanCoulter)，优选CliniMACs plus(Miltenyi Biotec)。
在步骤(c)结束时，通常分析获得的细胞群中CD25+细胞的细胞活力和纯度。优选地，细胞活力为至少80％，优选为至少85％、90％、95％、97％或至少99％。而且，CD25+细胞的纯度优选为至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％或至少99％。在优选的实施方式中，细胞活力为至少80％，并且CD25+细胞的纯度为至少70％。
在本发明方法的阶段(d)中，在T细胞活化剂的存在下培养之前阶段中纯化的Treg细胞。步骤(d)可以进行1至5天，优选至少2或3天，更优选至少3天。
“T细胞活化剂”是通过其与T细胞活化受体的相互作用，例如通过接合CD3/CD28，而允许T细胞(优选人)的体外刺激和增殖的任何产品。T细胞的活化可以例如通过确定CD25和/或CD69的表达来确定，如通过使用流式细胞术来确定。优选地，可以通过确定CD25和/或Foxp3的表达来评估Treg细胞的活化。优选地，所述T细胞活化剂至少包含CD3和CD28激动剂。本文使用的术语“激动剂”是指与受体结合并活化该受体的配体。T细胞活化剂的实例是但不限于包含本文所定义的胶体聚合物型纳米基质MACS GMP T Cell TransAct人(Miltenyi Biotec，Ref.170-076-156)、被称为Dynabeads CD3/CD28 CTSTM(ThermoFisher，Ref.40203D)的包被有抗CD3的颗粒以及由MacDonald et al.2017使用的抗体复合物(如抗CD3/CD28和抗CD3/CD28/CD2抗体四聚体)(Wolters Kluwer,Canadian nationaltransplant research program,page S9；https://journals.lww.com/transplantjournal/Fulltext/2017/05003)。
如本文所用，术语“抗体”可以指免疫球蛋白或其抗原结合片段。除非另有说明，否则该术语包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。在某些实施方式中，术语“抗体”也可以指抗体衍生物，例如基于抗体的融合蛋白或被进一步修饰以包含另外的非蛋白质部分(如水溶性聚合物，例如聚乙二醇(PEG))的抗体。
优选地，用于本发明的T细胞活化剂是T细胞TransAct人试剂，该试剂包含胶体聚合物纳米基质。所述T细胞活化剂是与人源化CD3和CD28激动剂缀合的胶体聚合物型纳米基质，更优选是T细胞TransAct人试剂。对于培养，可以将Treg细胞添加到用于培养人细胞的任何培养容器中。“T细胞TransAct人”试剂可从Miltenyi Biotec公司商购获得，可用于活化和扩增人T细胞。所述试剂包括纳米基质，所述纳米基质是补充有磷酸盐缓冲盐水(PBS)并含有泊洛沙姆188(poloxamer 188)和重组人血清白蛋白的与针对CD3和CD28人源化的激动剂缀合的胶体聚合物型纳米基质。维持所述试剂的pH值，优选维持在7.3至7.9之间。该纳米基质促进T细胞的有效活化，同时维持T细胞的活力。将聚合物纳米基质用于CD3/CD28活化允许通过简单地替换上清液或通过洗涤步骤(例如通过离心分离)进行无菌过滤和除去多余的试剂。该T细胞TransAct人试剂已经被设计用于活化T细胞，然而，在本发明中，已经使剂量适合于产生Treg细胞的活化。因此，优选地，在本发明的方法的该阶段中使用的T细胞活化剂(例如，T细胞TransAct人)的剂量为1.10至1:100之间。还在该培养步骤中存在的是培养基(优选GMP培养基，更优选TexMACS培养基)，其中所述培养基优选包含抗生素(例如5％抗生素)，并且还包含白介素2(IL-2)或TGFβ，优选IL-2。
可以在存在或不存在雷帕霉素的情况下在步骤(d)中培养细胞。例如可以使用的雷帕霉素的浓度为50ng/mL至200ng/mL，优选约100ng/mL。在优选的实施方式中，在步骤(d)中在不存在雷帕霉素的情况下培养细胞。
在本发明方法的步骤(e)中，优选通过离心之前阶段的培养物除去T细胞活化剂。根据本发明方法的步骤(e)，可借助例如但不限于离心、柱分离等，优选借助离心，除去T细胞活化剂。所述离心更优选在室温下以1,500rpm进行10分钟。
除去之后，可以任选地使细胞在培养下再维持至少1至7天，优选再维持至少4天，定期地更换含有抗生素和IL-2的培养基。在另外的一天中扩增细胞可以提供最高的纯度，但是Treg细胞的数量将比将它们扩增2天、3天或优选4天后低。
可以在存在或不存在雷帕霉素的情况下在步骤(f)中培养细胞。例如可以使用的雷帕霉素的浓度为50ng/mL至200ng/mL，优选约100ng/mL。优选地，在步骤(f)中在不存在雷帕霉素的情况下培养细胞。
在步骤(d)和(f)中，IL-2可以以50IU/ml至2000IU/ml，优选100IU/ml至1000IU/ml，更优选500IU/ml至700IU/ml，例如约500IU/ml或600IU/ml的浓度使用。
优选地，在本发明方法的培养步骤中，所述培养基是GMP培养基。
在本发明方法的阶段(d)和/或(f)的培养之后，可以进行细胞质量、无菌性和安全性控制。而且，可以以不同的剂量分配培养的细胞以进行储存和/或运输。
如前所解释的，可以用本发明的方案获得的大量thyTreg细胞使得储存用于将来同种异体或自体施用的剂量成为可能。因此，在其他优选的实施方式中，本发明的方法还包括另外的步骤(g)，该步骤包括储存，更优选地超低温保存在步骤(f)的培养后或在步骤(e)后获得的thyTreg细胞中的全部或部分。甚至更优选地，这种储存在无菌容器，优选小瓶中发生，所述无菌容器之间具有相同或不同的剂量。“超低温保存”可以优选在-80℃至-196℃之间进行。
在特别的实施方式中，本发明涉及用于从分离的胸腺组织(或thyTreg细胞)中获得调节性T细胞的体外程序、方案或方法，包括以下阶段：
a.在存在GMP培养基(优选TexMACS培养基)的情况下，使用组织解离器(优选gentleMACS Octo Dissociator)机械分解胸腺组织，
b.过滤(并且优选随后离心)阶段(a)之后获得的产物，并将包含胸腺细胞的沉淀物重悬于GMP培养基(优选TexMACS培养基)中，
c.从阶段(b)之后获得的产物中纯化Treg细胞，所述纯化借助授权用于人的细胞疗法的细胞纯化系统进行，优选使用CliniMACS plus仪器进行，更优选在存在与超顺磁性颗粒缀合的特异性鼠IgG1同种型抗人CD25单克隆抗体的情况下，甚至更优选在存在CliniMACs CD25试剂的情况下进行，
d.在存在T细胞活化剂，存在GMP培养基(优选TexMACS培养基)，以及IL-2的情况下，培养阶段(c)之后获得的细胞群至少3天，其中T细胞活化剂更优选是与人源化CD3和CD28激动剂缀合的胶体聚合物型纳米基质，甚至更优选是T细胞TransAct人试剂，
e.从阶段(d)的培养基中除去T细胞活化剂，优选除去阶段(d)中使用的纳米基质，所述除去更优选通过离心所述培养基进行，和
f.任选地，将获得的thyTreg细胞在培养基中再保持至少四天。
本发明的另一方面涉及通过本发明的方法获得或可获得的调节性T细胞或调节性T细胞群(下文中，“本发明的调节性T细胞”、“本发明的thyTreg细胞”或“本发明的thyTreg细胞群”)。在特别的实施方式中，本发明的所述thyTreg细胞至少表达标志物CD4、CD25和Foxp3。也就是说，本发明的thyTreg细胞是CD4+、CD25+且Foxp3+的。在另一个实施方式中，通过本发明的方法获得的thyTreg细胞群的特征在于包含至少80％，优选至少85％，更优选至少90％、95％、97％或99％的CD4+CD25+Foxp3+细胞。
本发明的Treg细胞或Treg细胞群也可以表达标志物CTLA-4和CD39。在一些实施方式中，本发明的细胞群中至少30％、40％、50％、60％、70％或至少80％的细胞表达CD39和/或CTLA-4。
本发明中的“表达”应理解为蛋白质或mRNA表达，优选蛋白质。
本发明的thyTreg细胞表达上述Treg细胞典型的上述细胞标志物(CD4+、CD25+和Foxp3+)；然而，它还具有这样的功能和结构特征：所述特征使所述thyTreg细胞与使用本发明的方法以外的其他方法分离、扩增、纯化和/或活化的其他Treg细胞区分开。本领域中熟知的是，细胞基因表达谱以及作为其细胞功能的结果取决于用于体外培养细胞并刺激或活化细胞的方案而不同。因此，本发明的方法使用影响基因表达谱和最终获得的thyTreg细胞的特性的特定的培养条件和试剂。
如本说明书先前所解释的，本发明的这些细胞可以具有：i)更大的抑制能力(它们抑制活化的T CD4+和T CD8+细胞的增殖超过70％或甚至75％)；ii)随时间而稳定的Foxp3表达；iii)更高的存活率；iv)更大的IL-10生产细胞的频率；v)未分化的最佳表型；vi)在存在能够转换使用其他方法获得的其他Treg细胞的表型的促炎细胞因子(如IL-1β、IL-6或TNFα)的情况下稳定的Foxp3表达和保留IL-10产生。因此，本发明的所述细胞明显不同于通过现有技术的其他方法获得的其他Treg细胞。
在优选的实施方式中，通过本发明的方法获得的细胞群具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％、95％、97％或99％的活力。细胞活力可以通过本领域已知的任何方法来确定，例如通过基于散射信号排除死细胞和/或使用用于流式细胞术的可固定或不可固定的活力染料。
而且，在优选的实施方式中，本发明的细胞群对活化的T CD4+和T CD8+细胞增殖具有至少60％，优选至少65％、70％、75％或优选80％或更多的抑制能力。抑制能力可以通过本领域已知的任何方法来确定，例如通过比较在存在或不存在Treg细胞群的情况下的T细胞活化，如实施例2所示。
还可以通过本领域已知的任何方法对本发明的thyTreg细胞进行遗传修饰。例如，可以使用基因编辑技术(例如CRISP/CAS9)修饰ThyTreg细胞，以消除免疫原性分子和获得“通用性”ThyTreg细胞。这样的通用性ThyTreg细胞将对于同种异体用途特别有用。本发明还提供了开发CAR thyTreg细胞的生成(即经遗传修饰以表达嵌合抗原受体的thyTreg细胞)的可能性，使得它们将具有抗原特异性。因此，可以用本发明的thyTreg细胞创建个性化疗法，所述thyTreg细胞特异性地和排他性地抑制与移植器官的抗原或介导每个患者自身免疫过程的自身抗原反应的效应细胞。
因此，在优选的实施方式中，本发明的thyTreg细胞或thyTreg细胞群包含编码和表达嵌合抗原受体的重组核酸序列。下文中，将这种细胞称为“本发明的CAR thyTreg”。可以借助已知的分子生物学技术以重组方式将所述核酸序列引入细胞中。
“嵌合抗原受体”或“CAR”是借助遗传工程在本发明的thyTreg细胞中人工引入并表达的T细胞膜受体。所述嵌合受体与存在于另一靶细胞，优选存在于待抑制的效应T细胞中的期望抗原接合。这些受体由于由不同分子的部分组成而被称为是嵌合的。嵌合抗原受体的表达通过使用例如但不限于病毒载体将编码所关注受体的核酸序列转移至本发明的thyTreg细胞而实现。
由嵌合受体识别的“抗原或表位”可以是但不限于蛋白或蛋白片段、碳水化合物或糖脂。更优选地，该抗原或表位是存在于免疫系统的效应细胞中(即由免疫系统的效应细胞表达)的分子，甚至更优选地是由免疫系统的效应细胞在表面上表达的分子，其中甚至更优选地，所述免疫系统的效应细胞是具有特异性的，即所述免疫系统的效应细胞攻击移植到宿主生物体的器官中存在的表位或宿主生物体的器官或组织中自身存在的自身抗原。因此，优选地，由此产生的本发明的CAR thyTreg细胞获得识别和抑制免疫系统中攻击存在于移植的器官或自身抗原中的表位的效应细胞的能力。
“免疫系统的效应细胞”应理解为例如但不限于T CD4或CD8淋巴细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、吞噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞或树突细胞。优选地，本发明涉及的免疫系统的效应细胞是T CD4或T CD8淋巴细胞。
本发明的thyTreg细胞(包括由其衍生的遗传修饰的细胞)、本发明的细胞群或本发明的CAR thyTreg细胞可以被直接施用至个体以用于作为药物的用途，例如用于免疫耐受诱导，或者可以被添加到用于作为细胞疗法药物的用途的药物组合物中。
因此，本发明的另一方面涉及药物组合物(下文中，“本发明的组合物”或“本发明的药物组合物”)，所述药物组合物包含本发明的(优选治疗有效数量的)thyTreg细胞、CARthyTreg细胞或thyTreg细胞群。
表述“治疗有效数量”指的是产生期望效果的本发明的细胞的数量。用于获得治疗有效数量的剂量取决于多种因素，例如将要施用本发明的组合物的个体的年龄、体重、性别、病理状况或耐受性。优选地，本发明的组合物中包含的本发明的细胞的治疗有效量为个体的每kg体重100万至2000万个细胞(1-20×106)。
在另一种优选的实施方式中，本发明的这种药物组合物还包含赋形剂和/或药学上可接受的载体。所述药物组合物还可以包含另一种活性成分和/或佐剂。
术语“赋形剂”是指在例如赋予其稠度的意义上有助于本发明的组合物的元素的吸收、稳定所述元素、活化或有助于组合物的制备的物质。因此，赋形剂可具有维持组合物中包含的细胞的活力和/或所述细胞的抑制特性等的功能，或具有对组合物的保护功能，例如将组合物与空气和/或湿气隔绝的功能，但不排除本段未提及的其他类型的赋形剂。
像赋形剂一样，“药学上可接受的载体”是组合物中用于将其中包含的本发明的组分稀释达到一定体积或重量的物质。药理学上可接受的载体是惰性物质或具有与本发明的任何元素相似的作用。载体的功能是促进其他元素的掺入，实现更好的用药量和施用，或赋予组合物稠度和形式。当表现形式是液体时，药理学上可接受的载体是稀释剂。可用于本发明的药理学上可接受的载体可以是液体，例如水、溶剂、油或表面活性剂，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。
术语“佐剂”是指本身没有抗原作用但可以刺激本发明的组合物的作用的药剂。现有技术中有许多已知的佐剂，例如但不限于磷酸铝、氢氧化铝、toll样受体激动剂、细胞因子、角鲨烯、弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂。
如本文所用，术语“活性本质”、“活性物质”、“药学上活性物质”、“活性成分”或“药物上活性成分”的意思是在疾病或病理状况的治愈、消减、治疗或预防中提供药理活性或影响人或其他动物的身体的结构、代谢或功能的任何成分。本发明所涉及的活性成分可以是例如但不限于一种或多种免疫抑制药或一种或多种抗炎剂。活性成分可以是通常用于治疗自身免疫疾病、移植排斥或移植物抗宿主病的治疗剂，即“免疫抑制药”，例如但不限于：钙调神经磷酸酶抑制剂(环孢霉素、他克莫司)、mTOR抑制剂(西罗莫司、依维莫司)、抗增殖剂(硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸)、单克隆抗体(达克珠单抗、巴利昔单抗)、皮质类固醇、抗胸腺细胞和抗淋巴细胞的球蛋白或其任何组合，只要这些活性成分不与药物组合物中包含的本发明的细胞的存活和功能性不相容。
本发明的药物组合物也可以与载体一起以缓释制剂的形式存在。术语“缓释”是指在一个时间段内逐步释放组合物中包含的细胞的溶媒生成系统(vehiculisation)，优选但非必要地，在整个所述时间段内具有相对恒定的释放水平。缓释系统的说明性实例包括但不限于脂质体、混合脂质体、油质体、类脂质体(niosome)、醇质体(ethosome)、毫米胶囊(millicapsule)、微囊、纳米囊、海绵、环糊精、囊泡、微胶粒(micelle)、混合表面活性剂微胶粒、混合磷脂-表面活性剂微胶粒、毫米球(millisphere)、微球、纳米球、脂质球、微乳剂、纳米乳剂、微小粒、毫米粒、微粒、纳米粒、脂质固体颗粒和纳米结构脂质介质。
本发明的药物组合物可以多种形式施用至动物，包括哺乳动物，并且优选施用至人，所述多种形式包括但不限于肠胃外、腹膜内、静脉内、真皮内、硬膜外、脊柱内、基质内、关节内、滑膜内、鞘内、病灶内、动脉内、心内、肌内、鼻内、颅内、皮下、眶内、囊内、借助透皮贴剂、经皮、鼻喷雾剂、外科植入、内部外科涂料、输注泵、经导管或通过直接注入患者的淋巴结。优选地，本发明的药物组合物被配制用于其静脉内施用。
本发明的药物组合物可以适合于借助医疗装置施用，所述医疗装置能够以足以诱导免疫耐受的浓度释放所述药物组合物中包含的细胞。这些装置可能对于组合物的局部施用是充足的，使得其在受影响的区域中起作用，从而预防使治疗被分散开。这些装置可以例如但不限于在所述装置内部携带本发明的药物组合物或包被有本发明的药物组合物。这些装置包括例如循环辅助、血管内手术和心血管外科手术装置，其中包括但不限于例如支架、瓣膜、环、缝合线、贴片或血管移植物。
本发明的另一方面涉及试剂盒(下文中“本发明的第一试剂盒”)，该试剂盒包括用于进行如前所述的本发明的方法的所有必需的试剂、介质和工具。优选地，所述试剂盒包含：(i)GMP培养基，优选TexMACS培养基，更优选还包含如前所述的抗生素；(ii)一种或多种特异性抗体对由本发明的thyTreg细胞表达表面标志物的响应，例如对CD4、CD25、Foxp3、CTLA-4和/或CD39分子的响应，试剂盒优选包含抗-CD25抗体，更优选与超顺磁性颗粒缀合的特异性鼠IgG1同种型抗人CD25单克隆抗体，试剂盒甚至更优选包含CliniMACS CD25试剂；(iii)T细胞活化剂，优选具有人源化CD3和CD28激动剂的胶体聚合物型纳米基质，更优选T细胞TransAct人试剂；以及任选地(iv)IL-2。在另一种优选的实施方式中，所述试剂盒还包含过滤器，优选所述过滤器的孔径为30μm至40μm，更优选地其中所述过滤器由尼龙网制成。在另一种优选的实施方式中，所述试剂盒进一步包含盐水或缓冲溶液，优选包含氯化钠、抗生素、抗真菌剂或预防污染培养的细胞或组织的任何其他试剂、一个或多个用于容纳胸腺组织和/或细胞悬液的无菌容器，一个或多个用于储存和/或超低温保存所获得的thyTreg细胞的小瓶，和/或一个或多个用于体外培养Treg细胞的容器。所述试剂盒还可包含用于实施本发明的方法的说明书。
本发明的另一方面涉及该本发明的第一试剂盒用于实施本发明的方法的用途。
本发明的另一方面涉及试剂盒(下文中“本发明的第二试剂盒”)，该试剂盒包含本发明的thyTreg细胞、CAR thyTreg细胞或thyTreg细胞群或本发明的药物组合物和足以用于在个体中施用(优选注射)细胞的医疗装置。
“足以用于在个体中注射细胞的医疗装置”是可用于将细胞注射到血流或组织中的任何装置或仪器。这种类型的装置或仪器的实例是但不限于注射器、小瓶、导管、针、套管或通常可用于细胞疗法的任何仪器，包括现有技术中已知的那些。
在本发明的第二试剂盒中，可以将本发明的细胞或本发明的药物组合物例如以相同或不同剂量封装在小瓶中。而且，可以在所述试剂盒中的任何类型的介质中标记和/或固定所述元素。
另外，本发明的第二试剂盒可包含可用于体外或离体维持本发明的细胞或本发明的组合物的其他元素，例如培养基和/或试剂。所述试剂盒还可包含有助于预防其中所包含的细胞被污染的元素，例如抗生素、抑菌剂、拟杆菌、抗真菌剂等。
通常，本发明的第二试剂盒包含所有根据本发明在个体中进行免疫耐受诱导所必需的试剂。此外，该第二试剂盒可包括所有其启动和优化所必需的介质和容器。优选地，该试剂盒还包括用于将本发明的细胞或药物组合物注射入个体的说明。
本发明的另一方面涉及本发明的thyTreg细胞、CAR thyTreg细胞或thyTreg细胞群或本发明的药物组合物在制作药中的用途。可供选择地，本发明的这一方面涉及本发明的thyTreg细胞、CAR thyTreg细胞或thyTreg细胞群，或涉及用于作为药物的用途的本发明的药物组合物。
术语“药物”是指用于预防、减轻、治疗或治愈人和动物疾病或病理状况的任何物质。本发明所涉及的药物可以用于人或兽医用途。“用于人用途的药物”是指这样的任何物质或物质组合：呈现出具有治疗或预防人疾病或病理状况的特性，或者出于恢复、矫正或改变生理功能(优选免疫系统的生理功能)目的而用于人或施用至人，从而行使药理、免疫或代谢作用。“用于兽医用途的药物”是指这样的的任何物质或物质组合：呈现出对于动物疾病或病理状况具有治愈或预防特性，或者可以出于恢复、矫正或改变生理功能(优选免疫系统的生理功能)目的而施用至动物，从而行使药理、免疫或代谢作用。
术语“治疗”是指在患者(优选为哺乳动物，更优选为人)中对抗由于所关注的疾病或病理状况而引起的效应，包括：
(i)抑制疾病或病理状况，即停止其发展；
(ii)减轻疾病或病理状况，即引起疾病或病理状况或其症状的消退；
(iii)稳定疾病或病理状况。
术语“预防”包括预防疾病或病理状况的出现，即，预防疾病或病理状况在患者(优选哺乳动物，更优选人)中发生，特别是当所述患者对病理状况易感但尚未被如此诊断时。
本发明的药物可以如下施用，但不限于此：借助全身水平的移植或借助在受影响的组织中局部注射。
在本发明的该方面的优选实施方式中，所述药物是细胞疗法药物，更优选细胞免疫疗法药物。
“细胞疗法(Cell therapy/cytotherapy)”应理解为将细胞材料或细胞(在本发明的背景下，即本发明的活thyTreg细胞)施用至个体的疗法。
优选地，本发明所涉及的药物用于将本发明的thyTreg细胞、CAR thyTreg细胞或thyTreg细胞群过继转移至个体，其中所述细胞对于所述个体可以是自体或同种异体来源的，尽管更优选是自体的。
“自体”细胞应理解为从与在用本发明的方法对其进行治疗或改变后后续将要进行施用的个体相同的个体中获得的那些细胞。因此，术语“自体”意味着供体和受体相同的个体。
优选地，在本发明中，用作本发明的方法中的起始材料的胸腺组织已被从随后将受益于细胞免疫疗法即施用本发明的药物或药物组合物的同一个体中移出。
相反，“同种异体”应理解为通常是从受体个体以外的个体中获得的那些细胞、组织、器官或生物学样品。
在另一种优选的实施方式中，本发明的药物旨在诱导或恢复个体的免疫耐受，所述个体更优选地是在经受了移植或移植物，或具有自身免疫状况、炎性过程或过敏或移植物抗宿主病的个体。通常，本发明的药物旨在用于治疗和/或预防个体中必须降低或抑制免疫系统活性的任何情况。
在另一种优选的实施方式中，本发明的药物旨在用于治疗和/或预防与免疫系统的过度反应、不期望或不足的反应有关的病理状况。更优选地，其中病理状况选自由以下组成的清单：移植个体中的自身免疫疾病、炎性过程、过敏，移植物抗宿主病和/或免疫排斥。可供选择地，本发明的该方面涉及本发明的thyTreg细胞、CAR thyTreg细胞、thyTreg细胞群、药物组合物，其用于治疗和/或预防选自由以下组成的清单中的病理状况：移植个体中的自身免疫疾病、炎性过程、过敏、移植物抗宿主病和/或免疫排斥。在特别的实施方式中，病理状况是自身免疫疾病。
可以用本发明的药物治疗和/或预防的“自身免疫疾病”的实例是但不限于I型糖尿病、关节炎(例如类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎或青少年特发性关节炎)、多发性硬化症、自身免疫性来源的肠道炎性病(例如克罗恩病或溃疡性结肠炎)、血管炎(例如韦格纳氏病或动脉粥样硬化)、哮喘、胆管炎性自身免疫病(例如原发性胆汁性肝硬化或原发性硬化性胆管炎)、自身免疫性甲状腺炎(桥本氏病)、甲状腺功能亢进症(格雷夫斯氏病)、自身免疫性肾上腺功能不全(艾迪生氏病)、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性溶血性贫血、阵发性冷血红蛋白尿、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、恶性贫血、纯红细胞再生障碍、自身免疫性凝血病、重症肌无力、自身免疫性多发性神经炎、天疱疮和其他水疱性失调、风湿性心脏病、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture Syndrome)、心力衰竭综合征、红斑狼疮、干燥综合征(
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Syndrome)、多发性肌炎、皮肌炎、硬皮症、慢性阻塞性肺疾病、慢性炎性疾病、乳糜泻、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss Syndrome)、心血管疾病、多发性皮肌炎、败血性休克、鼻炎、牛皮癣、癌症相关的恶病质、湿疹、白癜风、雷特综合征(Reiter Syndrome)、川崎病、特发性血小板减少性紫癜、格林-巴利综合征(Guillain-Barré Syndrome)、抗磷脂抗体综合征(APS)或发作性睡病。
在本发明的背景下，术语“过敏”包括但不限于对例如牛奶和卵蛋白的食物、花粉、螨虫、霉菌和真菌孢子、动物毛皮、昆虫叮咬或药物过敏。
此外，本发明所涉及的“移植的(transplanted/grafted)个体”既包括临床移植患者，也包括在进行器官或组织的同种异体或异种移植或同种异体或异种转移的实验中使用的动物模型。
本发明涉及的“移植”或“转移”优选地是同种异体的或异种的，并且涉及移植的细胞并涉及完整器官、器官或组织的一部分。
“移植物抗宿主病”(GvHD)是骨髓或造血干细胞移植后可能出现的病理性免疫状况。
在本发明的该方面的另一种优选的实施方式中，具有病理状况的个体，更优选经历移植或患有自身免疫疾病或状况的个体是人。甚至更优选地，人是年龄为0至16岁，优选0至10岁，更优选0至24月龄的儿童或小儿患者。在将本发明的自体thyTreg细胞用于治疗的情况下，人优选是小儿患者。在将同种异体thyTreg细胞用于治疗的情况下，人优选是任何年龄的患者，包括成人。
在另一种优选的实施方式中，本发明的药物旨在治疗和/或预防移植个体中的免疫排斥。更优选地，移植是实体器官移植。
“实体器官移植”应理解为器官而不是组织(例如骨髓或分离的细胞)的移植。实体器官的实例是但不限于心脏、肾、肝、前列腺、脾脏、肺、腺体(如胰腺)、皮肤、角膜、骨骼、消化道等。更优选地，本发明的实体器官涉及心脏。
在特别的实施方式中，本发明的药物用于治疗和/或预防小儿心脏(优选心脏)移植患者的免疫排斥，其中所述药物包括本发明的thyTreg细胞或自体来源的本发明的CARthyTreg细胞。
本发明的药物可单独使用或与其他药物或组合物组合使用，以用于诱导免疫耐受，或用于治疗和/或预防选自由以下组成的清单中的病理状况：移植个体中的自身免疫疾病、炎性过程、过敏、移植物抗宿主病和/或免疫排斥。要作为与本发明的药物组合的疗法而施用的这些其他药物或组合物可以形成同一组合物的一部分，或者可以借助不同的组合物施用，并且可以与本发明的药物同时或在不同时间施用。
因此，在另一种优选的实施方式中，本发明的药物与至少一种免疫抑制药和/或与至少一种抗炎药，更优选与至少一种免疫抑制药组合施用。所述施用可以是同时或依次的。优选地，该施用是依次的，更优选地，免疫抑制药首先以随时间分配的一个或多个剂量来施用，然后，优选地，在开始用免疫抑制药治疗后七天，施用本发明的药物，同时逐渐减少或完全消除免疫抑制药的施用。因此，在更优选的实施方式中，一旦完成用免疫抑制药的先前治疗，就施用本发明的药物。在施用本发明的药物时，可以完全消除免疫抑制药的施用，以让位于用本发明的药物进行排他性治疗，或者可以逐渐减少所述免疫抑制药的剂量直至完全消除。免疫抑制药优选是本说明书先前所述的那些。
本发明的另一方面涉及用于在个体中，更优选在移植或转移的个体中，或在具有自身免疫疾病的个体中，或处于炎性过程或过敏或移植物抗宿主病的个体中诱导或恢复免疫耐受的方法，其中所述方法包括将本发明的thyTreg细胞、本发明的CAR thyTreg细胞、本发明的thyTreg细胞群或本发明的药物组合物施用至个体，更优选以治疗有效数量施用。
本发明的另一方面涉及用于治疗和/或预防选自由以下组成的清单中的病理状况的方法：移植个体中的自身免疫疾病、炎性过程、过敏，移植物抗宿主病和/或免疫排斥，其中该方法包括将本发明的thyTreg细胞、本发明的CAR thyTreg细胞、本发明的thyTreg细胞群或本发明的药物组合物施用至患有所述病理状况的个体。
在整个说明书和权利要求书中，单词“包括/包含”及其变型形式并不意图排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。对于本领域技术人员而言，本发明的其他目的、优点和特征将部分地从说明书中推断出，并且部分地从本发明的实践中推断出。以下实施例和附图通过举例的方式提供，并不旨在限制本发明的范围。
实施例
下面通过发明人进行的试验来说明本发明，所述试验证明了本发明的方法在获得和纯化thyTreg细胞中的有效性，所述thyTreg细胞可用于其随后在通过诱导免疫耐受的细胞免疫疗法中的治疗用途。
实施例1.从人胸腺组织中获得和纯化thyTreg细胞的方案
本文所述的方案在IISGM免疫调节实验室开发，用于从心脏外科手术期间从儿科患者中除去的胸腺组织(thyTreg细胞)中纯化Treg细胞。该方案使得获得大量具有非常高纯度和最佳表型的thyTreg细胞成为可能。该方案也是GMP相容的，并且满足对作为人的免疫疗法的细胞后续用途的要求。
该方案的阶段如下：
1.除去和运输胸腺组织。
2.分解组织和获得胸腺细胞。
3.纯化Treg细胞。
4.培养和活化thyTreg细胞。
1.1.除去和运输胸腺组织
在小儿心脏移植和其他先天性心脏病手术期间，通常会除去胸腺组织以接近心脏。由于幼儿的胸腺尺寸大，完全覆盖了心脏，因此外科医生不得不将其切除以释放外科手术的视野，因此通常被丢弃的这种组织可用作小儿心脏移植患者的thyTreg来源，或用于在其他患者和病理中使用thyTreg细胞进行免疫疗法的同种异体用途。
将在手术室中去除的胸腺收集在无菌容器中，该无菌容器中装有50ml的0.9％氯化钠盐水溶液，并补充了抗生素和抗真菌剂(Sigma，Cat.No.A5955)。将该容器密封并保护在生物安全塑料容器内，然后将该容器运输到GMP认证的细胞生产单元对其进行加工。
1.2.分解组织和获得胸腺细胞
按照必需的生物安全方案并满足细胞GMP产生的特定要求，将胸腺组织从其容器中取出，转移到无菌培养板中，在该板上将组织分成2-3克的部分。所有方法均由专业人员在细胞生产单元的“洁净室”中进行，并且满足使用细胞作为人的疗法的所有要求。
为了机械分解组织，将胸腺组织的碎片引入特定的一次性容器中，该容器含有用于分解组织的刀片(gentleMACS C管，Miltenyi Biotic Ref.130-096-334)，并且还含有GMP TexMACS培养基和5％的抗生素。用gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)分解胸腺组织。分解完成后，将试管离心，丢弃上清液，将含有胸腺细胞的细胞沉淀物重悬于50ml含5％抗生素的Tex MACS培养基中，并使用孔径为40μm的过滤器过滤以除去聚集体和组织残余物。对获得的胸腺细胞悬液进行质量和活力控制。如果活力大于80％且没有污染迹象，则纯化thyTreg细胞。否则，将样品丢弃。
所开发的方案的创新元素在于它不涉及酶消化，也不涉及与随后将细胞用作人的疗法不相容的任何类型的试剂、动物血清或方法。
1.3纯化thyTreg细胞
使用已由相应法规批准用于人的细胞疗法的加工设备和磁性细胞分离器(MACS)在洁净室环境中纯化Treg细胞。在这种情况下，决定使用CliniMACS plus仪器(MiltenyiBiotec)，为此目的，使用了闭路(CliniMACS管套件，Miltenyi Biotec)和CliniMACS CD25试剂(Miltenyi Biotec)。按照制造商的说明，将先前步骤中分离的所有胸腺细胞加工并引入MACS系统中以纯化Treg。一旦细胞被纯化，使用流式细胞仪进行质量控制，以验证thyTreg细胞的活力、数量和纯度。如果活力为至少80％，且CD25+细胞的纯度为至少70％，则活化并培养纯化的细胞。否则，将样品丢弃。
1.4培养和活化thyTreg细胞
将纯化的CD25+细胞分配在大型培养容器(烧瓶)中，该容器含有TexMACS培养基和5％的抗生素、600U/ml的GMP白介素2(IL-2)和使得含有和活化thyTreg成为可能的胶体聚合物纳米基质(T细胞TransAct人,Miltenyi Biotec,Cat.No.130-111-160)。在本发明中优化了人使用的T细胞TransAct的剂量，该剂量的范围为1:10至1:100。
培养三天后，借助离心除去纳米基质，并将thyTreg细胞再培养四天，定期地更换含有抗生素和IL-2的培养基。结果显示，在该实施例中，在组织分解后，CD25+Foxp3+Treg细胞在总胸腺细胞中的比例为9.10％(图1A)，在应用本发明的方案后，获得了最终产品，其细胞活力为96％(图1B)，CD25+Foxp3+细胞的thyTreg纯度大于95％(图1C)(图1)。通过流式细胞术(Gallios，Beckman coulter)确定CD25+Foxp3+细胞的频率。我们透化了细胞膜以用于使用抗人Foxp3试剂盒(eBioscience)进行Foxp3胞内染色。然后，我们用与荧光染料偶联的CD25(Beckton Dickinson)和Foxp3(eBiosciences)抗体对细胞进行染色。在染色程序中包括可固定活力染料，从而计算了活力。在该实施例中，在加工的整个胸腺为26.17gr的情况下，我们生产了最终产品，该产品含有13.7×109(>130亿)个具有上述纯度和活力的thyTreg。
实际上，文献中现存的或用于细胞培养/表达的所有方案都在培养基中补充了与细胞在人中的治疗用途不相容的牛血清。在Treg培养中使用诸如包被有抗CD3和抗CD28的颗粒(即DynabeadsTM)的试剂来活化细胞或使用雷帕霉素来增加产品的Treg纯度也是常见的。这些试剂的使用阻碍了所获得的细胞的治疗用途，或者在将细胞转移至患者之前需要另外的方法来完全除去上述颗粒。相反，本文所述的方案不使用任何使其与细胞在人中的治疗用途不相容的血清、药物或试剂。培养基和IL-2均为GMP的，可被允许用于生产用于临床治疗的细胞。另外，通过该方案，该实施例中在thyTreg细胞中用于其活化的胶体聚合物纳米基质通过简单的离心被完全除去，因此，不影响细胞的质量和产量，并允许其后续在细胞疗法中的用途。
1.5.获得最终的thyTreg产品
七天的培养结束后，进行了相关的质量、无菌性和安全性控制(微胞浆(microplasma)的存在和遗传稳定性)，获得了成功的结果，从而确认所获得的产品满足其用于人的治疗用途的所有要求。接下来，考虑到个体的体重和在每种情况下确定的每kg细胞数的剂量，确定了用于患者细胞疗法的thyTreg细胞的所必需的剂量。将其余的细胞冷冻保存，以备将来在患者中重复给药或用于其他患者或疾病。
示意性地，本发明的方案能够获得超过130亿个thyTreg，其纯度大于95％，活力大于90％，并且具有非常高的抑制能力。如此数量的细胞将使针对小于1岁的患者制备多于1000剂的细胞疗法以及如果用于较大的儿童或成人则制备上百剂成为可能。这些获得thyTreg细胞的产量是闻所未闻的。迄今为止，用于从外周血中纯化Treg的方案获得的产量少于2000万个细胞，因此需要大量扩增方案，所述大量扩增方案需要使用不同的试剂并且显著降低细胞的质量。用其他方案获得的纯度显然较差，因为外周血中有活化的细胞，可能在纯化过程中留下成为Treg的污染物。另外，外周血中存在的细胞的更高分化或活化状态使得所获得的Treg细胞比借助本发明的这种基于胸腺的方案而获得的Treg细胞具有更低的存活率和更低的抑制能力，这显著拖累了它们的治疗实用性。
实施例2.用实施例1中所述的方案获得的thyTreg细胞的抑制能力的分析
先前实施例中产生的thyTreg细胞的抑制能力通过测量它们在体外抑制TCD4和TCD8淋巴细胞的细胞增殖的能力来分析，TCD4和TCD8淋巴细胞是对移植物的细胞排斥以及自身免疫疾病的主要媒介。为此目的，将thyTreg细胞与用CFSE(CellTraceTMCFSE增殖试剂盒，Invitrogen)染色的同种异体外周血单核细胞(PBMC)以thyTreg:PBMC 1:2的比率共培养。先用PMA和碘霉素(Sigma)活化了PBMC以便触发T CD4+和T CD8+淋巴细胞的增殖，从而将这些细胞的增殖与不包含thyTreg的培养物进行了比较。通过流式细胞术，按照CFSE染色的荧光强度降低测量反应性T细胞的增殖。使用针对特定表面标志物的CD3、CD4和CD8标记的抗体(贝克曼库尔特公司)区分CD4+和CD8+T细胞。结果确认，thyTregs的存在使活化的TCD4和TCD8细胞的增殖降低了大于70％(图2)。
使用不同的thyTreg:反应性细胞比率，还研究了获得的thyTreg群在抑制同种异体CD4+和CD8+T细胞增殖方面的功效。ThyTregs显示了非常高的抑制能力，在thyTreg:反应性细胞比率为1:1时，抑制同种异体的效应CD4+和CD8+T细胞的增殖大于80％(图3A，3B)。该数据还显示了，共培养物中thyTreg比例降低导致对增殖的抑制作用也降低，从而证实了抑制增殖是thyTreg的特定作用(图3B)。
实施例3.不耗竭CD8+阳性细胞群提供更高的Treg细胞产量
从胸腺中分离的全部的胸腺细胞中的绝大多数(80％)是双阳性(CD4+CD8+)细胞(图4A)。发明人出乎意料地表明，非常高比例的Treg细胞在该DP级分内。实际上，发明人已经表明，当按照实施例1中所述的方案时(在培养的第7天)，获得的作为最终产品的thyTreg细胞群中约41％是DP细胞(图4B、4C)。因此，如Dijke I.E.,et al.,2016或MacDonald etal.2017所述的先前对CD8+细胞的耗尽(选择了CD4+CD8-CD25+然后进行Treg细胞的刺激和扩增)将完全消除DP级分，因此Foxp3+DP群将不存在于最终产品中，从而CD25+Foxp3+细胞的回收率急剧下降。再者，不受理论的束缚，由于DP级分中包含的Treg细胞分化程度较低的表型，所述细胞可能具有较高的存活率、可塑性和其抑制能力的稳定性。
实施例4.不需要采用雷帕霉素来获得高纯度的thyTreg产品
雷帕霉素是一种抑制T细胞活化的免疫抑制剂，通常用于Treg细胞培养。在体外存在高剂量的IL-2时，雷帕霉素可诱导Treg的增殖并削弱效应T细胞的增殖。关于CD25+Foxp3+纯度，我们比较了我们的培养物中存在或不存在100ng/mL雷帕霉素的情况，获得了相似结果(图5A)。有趣的是，在不存在雷帕霉素的情况下，培养7天后的Treg增殖略高(图5B)。避免在生产thyTreg的方法中使用雷帕霉素可能将会促进获得政府药物机构的授权以在人中使用这些细胞作为疗法。因此，避免使用雷帕霉素使得在我们的手术中具有进一步的优势。
实施例5.用于thyTreg刺激的胶体纳米基质(TransAct)与CD3/CD28珠子的比较
在大多数的方案中，采用Invitrogen的“Dynabeads CD3/CD28 CTSTM”来培养或扩增Treg细胞。它包含与抗人CD3和CD28的激动性单克隆抗体缀合的磁珠。这些珠子需要在Treg活化后和向患者施用细胞之前采用磁选法除去，该磁选法使得在通过磁柱除去Dynabeads后细胞损失显著(>25％)。
实施例1中所述的方案通过MACS GMP T Cell TransAct(Miltenyi Biotec)代替了dynabeads的采用，该MACS GMP T Cell TransAct包括活化T细胞的胶体聚合物型纳米基质。发明人已成为采用该产品活化Treg细胞的先驱。
将纳米基质用于活化目的的优势在于，可以通过简单的离心和培养基替换来轻松除去纳米基质，而不会造成细胞的大量损失。
发明人比较了两种活化剂在培养后如何影响纯度、功能性标志物的表达和Treg细胞的扩增。如图所示，CD25+Foxp3+的纯度在使用TransAct(89％)而非Dynabeads(82％)时略高(图6A、6B)。当使用TransAct时，与Dynabeads相比，活化标志物HLA-DR以及倍数扩增(活化和扩增前后CD25+Foxp3+细胞的数量)似乎是相当的，而与Treg功能相关的标志物(例如CTLA-4和CD39)显示了更高的表达(图6C、6D)。
实施例6.用本发明的方案产生的Treg细胞具有稳定的Foxp3表达并维持IL-10产 生能力
大量研究已表明，在存在促炎性细胞因子的情况下，从外周血中获得的Treg细胞可能会丧失其Foxp3表达和抑制表型，甚至Treg在这些条件下也可以转换其表型，获得Th1、Th17或Th2细胞因子分泌细胞的表型。因此，基于Treg的治疗的潜在局限性是治疗性Treg的不稳定性和可塑性，尤其是在炎性条件下。我们分析了在存在炎性环境的情况下最终产品中获得的thyTreg的Foxp3表达稳定性和产生IL-10的能力。为此，我们在存在IL-1β、IL-6、TNFα的情况下培养了thyTreg。结果表明，Foxp3表达(图8A)和产生IL-10的能力(图8A)在标准培养条件下和在存在炎性环境的情况下之间是相当的。
实施例7.用本发明的方案产生的Treg细胞表达低水平的免疫原性标志物
发明人还确定了，本发明的Treg细胞或细胞群将适合于其在治疗与从中获得该细胞的对象不同的患者中的自身免疫疾病、GVHD和其他免疫疾病中的用途(同种异体用途)。为了适合于作为同种异体细胞疗法的用途，Treg细胞必须具有低免疫原性以避免被受者的免疫系统识别和破坏。再者，同种异体Treg必须具有抑制来自受者的免疫细胞的能力以发挥其抑制功能(如实施例2所示)。
通常，如果表达MHC分子(HLA-DR)的细胞具有合适的共刺激分子(CD40、CD40L、CD80、CD86…)，则所述细胞可以刺激T细胞并被T细胞识别。发明人通过流式细胞术确定了如实施例1所述获得的ThyTreg细胞和获得自成人外周血的常规CD4+细胞中CD40L、CD80、CD86和HLA-DR(贝克曼库尔特)的表达。他们证明，与来自外周血的常规CD4+T细胞相比，通过本发明的方案产生的thyTregs表达水平较低的这些免疫原性标志物(图7)。由于获得的ThyTreg细胞群具有较低水平的共刺激分子，因此这些可能不能够通过直接抗原呈递而在同种异体受体中诱导强烈的免疫应答，或者至少免疫活化将以低于常规CD4+T细胞的程度发生。
条款
1.一种从分离的胸腺组织中获得调节性T细胞的体外方法，包括以下阶段：
a.在存在GMP培养基的情况下，使用组织解离器机械分解胸腺组织，
b.过滤阶段(a)之后获得的产物，并将包含胸腺细胞的沉淀物重悬于GMP培养基中，
c.从阶段(b)之后获得的产品中纯化调节性T细胞，
d.在存在T细胞活化剂，存在GMP培养基，以及IL-2的情况下，培养阶段(c)之后获得的调节性T细胞至少3天，
e.从阶段(d)的培养基中除去T细胞活化剂，和
f.任选地，将调节性T细胞在培养基中再保持至少四天。
2.根据条款1所述的方法，其中阶段(c)所述的纯化在存在与超顺磁性颗粒缀合的特异性鼠IgG1同种型抗人CD25单克隆抗体的情况下使用CliniMACS plus仪器进行。
3.根据条款1或2中任一项所述的方法，其中阶段(d)所述的T细胞活化剂是与人源化CD3和CD28激动剂缀合的胶体聚合物纳米基质。
4.根据条款1至3中任一项所述的方法，其中阶段(e)的除去借助离心进行。
5.根据条款1至4中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织来自人。
6.根据条款1至5中任一项所述的方法，其中所述胸腺组织来自0至16岁的人。
7.根据条款6所述的方法，其中所述胸腺组织来自0至24月龄的人。
8.根据条款1至7中任一项所述的方法，还包括另外的步骤(g)，所述步骤(g)包括超低温保存所获得的调节性T细胞。
9.一种通过根据条款1至8中任一项所述的方法获得的调节性T细胞或调节性T细胞群，其中所述调节性T细胞至少表达CD3、CD25和Foxp3标志物。
10.根据条款9所述的调节性T细胞或调节性T细胞群，其中所述细胞包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
11.根据条款10所述的调节性T细胞或调节性T细胞群，其中所述抗原是存在于免疫系统的效应细胞中的抗原。
12.一种药物组合物，包含根据条款9至11中任一项所述的调节性T细胞或调节性T细胞群。
13.根据条款12所述的药物组合物，还包含赋形剂和/或药学上可接受的载体。
14.一种用于进行根据条款1至8中任一项所述的方法的试剂盒，包含GMP培养基、抗CD25抗体、T细胞活化剂和IL-2。
15.所述试剂盒，包含根据条款9至11中任一项所述的调节性T细胞或调节性T细胞群，或根据条款12或13中任一项所述的药物组合物，以及用于将细胞注射至对象中的合适的医疗装置。
16.根据条款9至11中任一项所述的调节性T细胞或调节性T细胞群或根据条款12或13的任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途。
17.根据条款16所述的用途，其中所述药物是细胞疗法药物。
18.根据条款16或17中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防选自由以下组成的清单中的病理状况：移植个体中的自身免疫疾病、炎性过程、过敏，移植物抗宿主病和/或免疫排斥。
19.根据条款18所述的用途，其中患有所述病理状况的个体是人。
20.根据条款18或19中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防移植对象的免疫排斥。
21.根据条款20所述的用途，其中所述移植是实体器官移植。
22.根据条款21所述的用途，其中所述实体器官是心脏。
23.根据条款16至22中任一项所述的用途，其中所述药物与至少一种免疫抑制药组合施用。
24.根据条款16至23中任一项所述的用途，其中所述药物在完成使用免疫抑制药的先前治疗后施用。

Claims (29)

1.一种从分离的胸腺组织中获得调节性T(Treg)细胞群的体外方法，包括以下步骤：
a.机械分解所述胸腺组织；
b.过滤阶段(a)之后获得的产物，并将包含胸腺细胞的沉淀物重悬于培养基中；
c.从阶段(b)之后获得的产物中分离CD25+细胞；
d.在存在T细胞活化剂和IL-2的情况下在培养基中培养阶段(c)之后获得的细胞群，优选其中所述T细胞活化剂至少包含CD3和CD28激动剂；和
e.从阶段(d)的培养基中除去所述T细胞活化剂；
f.任选地，在存在IL-2的情况下在培养基中进一步培养所述调节性T细胞；
条件是在步骤(d)之前，细胞群中的CD8+细胞未被耗竭。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)包括在存在培养基并且不使用酶的情况下机械分解所述胸腺组织。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，步骤c)中的分离CD25+细胞包括使用与抗CD25抗体缀合的磁珠。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，阶段(d)所述的T细胞活化剂包括CD3和CD28激动剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，阶段(d)所述的T细胞活化剂是与人源化CD3和CD28激动剂缀合的胶体聚合物纳米基质。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中培养所述细胞至少2或3天，优选至少3天。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中在不存在雷帕霉素的情况下培养所述细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，阶段(e)的除去借助离心进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤f)中在存在IL-2的情况下再培养所述调节性T细胞1至7天，优选再培养4天。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤f)中在不存在雷帕霉素的情况下培养所述细胞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基是GMP培养基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基还包含抗生素，优选地为5％的抗生素。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所获得的Treg细胞群包含至少80％，优选至少85％，更优选至少90％的CD4+、CD25+且Foxp3+的细胞。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述胸腺组织来自人。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其特征在于，所述胸腺组织来自0至16岁的人，优选地来自0至24月龄的人。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，还包括另外的步骤(g)，所述步骤(g)包括超低温保存所获得的调节性T细胞。
17.一种通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法获得的调节性T(Treg)细胞或Treg细胞群。
18.根据权利要求17所述的Treg细胞或Treg细胞群，其特征在于，所述细胞已经经遗传修饰。
19.根据权利要求18所述的Treg细胞或Treg细胞群，其特征在于，所述细胞包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
20.根据权利要求19所述的Treg细胞或Treg细胞群，其特征在于，所述抗原是存在于免疫系统的效应细胞中的抗原。
21.一种药物组合物，包含根据权利要求17至20中任一项所述的Treg细胞或Treg细胞群，其中，所述药物组合物还包含赋形剂和/或药学上可接受的载体。
22.根据权利要求17至20中任一项所述的Treg细胞或Treg细胞群或根据权利要求21所述的药物组合物用于作为药物的用途。
23.根据权利要求17至20中任一项所述的Treg细胞或Treg细胞群或根据权利要求21所述的药物组合物用于治疗和/或预防选自由以下组成的清单中的病理状况的方法中的自体用途或同种异体用途：移植个体中的自身免疫疾病、炎性过程、过敏、移植物抗宿主病和/或免疫排斥。
24.根据权利要求17至20中任一项所述的Treg细胞或Treg细胞群或根据权利要求21所述的药物组合物用于根据权利要求23所述的方法中的用途，其中，所述具有病理状况的个体是人。
25.根据权利要求23或24中任一项所述的Treg细胞或Treg细胞群的用途，所述Treg细胞或Treg细胞群用于治疗和/或预防移植对象的免疫排斥。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的Treg细胞或Treg细胞群的用途，其特征在于，所述Treg细胞或Treg细胞群与至少一种免疫抑制药组合施用。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的Treg细胞或Treg细胞群的用途，其特征在于，所述Treg细胞或Treg细胞群在完成使用免疫抑制药的先前治疗后施用。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的Treg细胞或Treg细胞群的用途，其特征在于，所述Treg细胞或Treg细胞群的用途是同种异体用途。
29.一种试剂盒，包含根据权利要求17至20中任一项所述的thyTreg细胞或thyTreg细胞群或根据权利要求21所述的药物组合物；以及用于向个体施用细胞的适当的医疗装置。
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