WO2007037544A1 - 制御性ｔ細胞の製造を向上させる薬剤のスクリーニング方法の開発、及び免疫抑制性のマクロライド系抗生剤を用いる制御性ｔ細胞の製造方法 - Google Patents

制御性ｔ細胞の製造を向上させる薬剤のスクリーニング方法の開発、及び免疫抑制性のマクロライド系抗生剤を用いる制御性ｔ細胞の製造方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing / deleting regulatory T cells using a screening compound that can induce regulatory T cells, immunoregulatory agent, immune method, control tt T cell production kinoto, regulatory T cells Background art
  • immunosuppressants are used to suppress rejection i. Infection is often caused by immunosuppressants, and the most common cause of death is infection. In this way, although the current transplanter procedure has been established, it has become an urgent issue to make both the anti-rejection measures and the infectious disease measures and the treatment compatible. This is a major pillar in the field of transplantation medicine or research on whether immunological tolerance is achieved, that is, whether a transplanted organ is sufficiently established to use an immunosuppressant, and whether immune tolerance is induced more or less. And this means that we have entered the second layer of transplant medicine research, organ preservation and improved surgery / exclusion.
  • CD25 + CD4 + regulatory T cells are called Treg (s) (Int Immunol, 16 ⁇ , 1189-1201, 2004).
  • Treg regulatory T cells
  • effective ones that actively induce immune tolerance and proliferation of cells in vitro transfer to S patients, ie cell adoptive immunotherapy, proliferation of regulatory T cells in vitro
  • the ability to control the cell is well established for cell adoptive immunotherapy (Nat Rev Imm 199-210, 2003), and the rate at which human regulatory T cells lose their immune control ability.
  • Human CD25 + CD4 + regulatory sputum cells play an essential role in inoheho, endogenous self-tolerance, and more recently transplant immune tolerance after organ transplantation. Wang has been reported to be useful for prevention (Annu Rev Immunol, 2 Nat Rev Immunol, 2, 389-400, 2002, Nat Rev Immunol, 3, 199-103, 2410-2416, 2004, Lancet, 363, 608-615, 2004, Tren 563-565 2004) Human Tregs are expressed in cell surface C F0XP3, intracellular CTLA-4, cell surface GITR, TNFRI I, and self-unresponsiveness / immunosuppressive ability.
  • the memory phenotype is characterized (JI ⁇ unol, 167, 1245-1253, 2001, J Exp Med, 2001, J Exp Med, 193, 1295-1302, 2001, Blood, 98, 2736- 2 Immunol, 32, 1621-1630, 2002, Int Immunol, 16, 1643-1656, 2 32, 622-629, 2004)
  • CD25 + CD4 + cells from thymocytes were converted to immunodeficient camps.
  • adoptive transfer causes autoimmune disease
  • the present inventors have found that when CD45RA + CD25 + CD4 + cells in the periphery of human are stimulated with IL-2 C, the cells proliferate and can acquire control ability.
  • the immunosuppressive effect of lahaminone is also shown in FASEB, 3, 3411 (1989) as a macrocycle or an immunosuppressant such as cross-holino A or FK-506, which prevents transplant rejection.
  • Luo HY or an experimental allergic encephalomyelitis motel ie, multiple Anhan hunting arthritis motel (ie, effective I rheumatoid arthritis, effectively inhibiting IgE-like antibody formation) Clin Immunol Immunopathol, 61 (3) 410-420, 1991).
  • Rahaminono is a systemic lupus erythematosus [US Pat. No. 5,078] [US Pat. No. 5,080,899], Inoslino-dependent diabetes [US], skin disorders such as psoriasis [US Pat. 286, 730], No. 5, 286, 731], Smooth muscle cell proliferation and intimal fertilization after vascular injury
  • the present invention relates to the following.
  • a method for a compound capable of inducing regulatory T cells comprising the following steps:
  • CD4 + T cells having at least one selected from the group consisting of CD45RA +, ⁇ DASRO 1 or CD45 and (4) CD38 + are cultured and cultured. Of isolating T cells from food
  • the CD4 + T cells are cultured in the presence of an antigen.
  • the CD4 + T cells are cultured in the presence of a T cell growth factor according to [1].
  • Test compound [9] The method of increasing the production of regulatory T cells and including the following steps:
  • Step (1) Number of regulatory T cells obtained and / or immunization step
  • step (2) Number of regulatory T cells assessed in step (2) and / or in the absence of compound, (l) CD45RA +, (2) CD45R0 1 ⁇ 3W + or CD45R0—, (3) (4) Step of comparing with the regulatory T-cell immunosuppressive ability obtained by culturing CD25 + CD4 + T cells selected from the group consisting of CD38 +
  • a regulatory T cell that can be obtained by [15] or [15], and at least any control selected from one group of (C) ⁇ cells
  • the immunomodulator or for immunosuppression [3 3] An agent for maintaining regulatory T cells by culturing at least one of the na ⁇ ve phenotype cells selected from the group consisting of T cells and obtaining regulatory T cells. There is a Lahama agent.
  • CD45RA ⁇ ⁇ 1 ⁇ or CD45R (T, including (3) CD45R0 hlgh + at least one of the naive phenotypes selected from the group including antibodies and lahaminone compounds Control no.
  • a method for inducing a na ⁇ ve phenotype in a living body comprising the following steps:
  • [4 1] A method for screening a compound capable of increasing the number of cells in a living body with a na ⁇ ve phenotype, comprising the following steps:
  • step (1) A step of administering a test compound to the mammal in step (1)
  • step (3) The step of evaluating the number of sputum cells for the na ⁇ ve phenotype in the mammary tissue of the mammal in step (2)
  • CD25 + CD with na ⁇ ve phenotype evaluated in step (3) [4 3] (1) CD45RA ⁇ (2) CD45R0 1 or CD45R0—, (3) CD45R0 Agent for inducing regulatory T cells from at least one naive phenotype selected from the group consisting of hlgh + The use of LA for manufacturing.
  • [44] Culturing at least one na ⁇ ve phenotype cell selected from the group consisting of (l) CD45RA +, (2) CD45R0 lc) W + or CD45R0, and (3) CD45R0 hlgh + to obtain regulatory T cells.
  • a method for producing an immunomodulator comprising the following steps:
  • An agent comprising a rhaminono compound which is a regulatory T cell agent from a CD4 + T cell having a na ⁇ ve phenotype.
  • step (3) A step capable of inducing regulatory vaginal cells from the test compound when it is isolated in step (1) and has the ability as a result of the evaluation in step (2).
  • Controllable including the following steps: Increased production efficiency of sputum cells
  • step (3) The number of regulatory ⁇ cells evaluated in step (2) and / or the number of regulatory ⁇ cells obtained with CD25 + CD4 + T cells with a na ⁇ ve phenotype in the absence of compounds. Compared with Oihiro or immunosuppressive ability
  • Controllability A step of obtaining a compound capable of increasing the production efficiency of a gonococcal cell that has increased the number and / or immunosuppressive ability of the cell.
  • the screening method of the present invention can be used to attract regulatory gonocytes.
  • the compound is useful as an anti-epileptic drug that induces regulatory ⁇ cells, or as a north for its development.
  • it is possible to efficiently produce CD-controlled ⁇ cells having a na ⁇ ve phenotype. It is possible.
  • Nyif table Vaginal cells are a relatively large population of vaginal cells that are easy to prepare. 01 is a CD45RA + CD25 + CD4 + T cell and a CD45RA + CD25—CD4 + T cell.
  • 0 2 shows CD45RA CD25hlh + CD4 ⁇ CD45RA + CD25 + CD4 +, na ⁇ ve / memory extension of CD45RA image and Treg with relatively high specificity.
  • the specific antibody against the displayed antigen is indicated by a line.
  • the genotype control for each phenotype is a stage where the number of T cells (A) and the number of cells in the isolated scale has increased by about 100-150 times the proliferation of total CD4 + T cells.
  • the inhibitory effect of the recovered CD45RA + CD25 + CD4 + T cell line (rahamainone untreated) (B)
  • the lanes of the rod craft are called lanes 1-7 in order from the left.
  • CD45RA + CD25— CD4 + T cell line function is a Lahamino for CD45RA + CD25— CD4 + T cell line function.
  • A CD45RA + CD25- CD4 + T cell line showing proliferation. Shows the relative value when the number of cells at the start of vertical culture is 1, and shows the number of horizontal axes. Cultured in the absence of non-treated Lahamano. day 0, 19 Rahaminno was added as the number of days of cultivation.
  • B Increase of total CD4 + T cells The effect of CD45RA + CD25-CD4 + T cell line is shown.
  • FIG. 06 shows the results of flow cytometry analysis showing CD45RA + CD25 + CD4 + T cell lines and CD45RA + CD25 CD4 + T differences.
  • the results of analysis using the displayed anti-antibodies are shown by thick solid lines.
  • the phenotypes of each phenotype are shown with lines.
  • the left hanel shows the suppressive effect by CD45RA + CD25-CD4 + T cell line, and the suppressive effect by CD45RA + CD25 + CD4 + T cell line.
  • APC CD4 Total CD4 + T cells, cellline T cell line.
  • Lane 2 (() Allogeneic PBMC + total CD4 + T cells, Ray allogeneic PBMC + CD45RA + CD25 + CD4 + T cell line, Lanes 4-8 Allogeneic cells + CD45RA + CD25 + CD4 + ⁇ cell line (display) The percentage of CD4RA + CD25 + CD4 + T cell lines added to the total number of CD4 + cells.
  • 0 10 shows the effect of the CD45RA + CD25 CD4 + T cell line cultivated in the presence of herolimus on the proliferation of all CD4 + T cells. Les CD4 + T cells, Lane 2 ( ⁇ ) Allogeneic PBMC + All CD4 + T cells, Allogeneic PBMC + CD45RA + CD25— CD4 + T cell line, Lanes 4-8 Allogeneic T cells + CD45RA + CD25— CD4 + T cell line (added number of CD45RA + CD25 CD4 + T cell lines as indicated (total CD4 + T combined)).
  • the present invention relates to a regulatory T cell comprising culturing a Naif phenotype cell in the presence of a lahaminono compound to obtain a regulatory T cell.
  • Regulatory T cells are reactive T cells (for example, all CD4 + T cells, cultured with CD, and activated (proliferation, cytokino production, etc.) when stimulated via T cell receptors)
  • Ability to inhibit for example, mice, rodents such as mormonos, laboratory animals such as Usaki, domestic animals such as Puta, Uchinone, Minok, and hens such as cats It can be one of the following: mosquito salmon, marmosenoto, oranou itano, chinohanon.
  • the mammal is preferably a primate and more preferably.
  • the CD4 + T cells used in the method of the present invention can be prepared from bone marrow from any tissue (eg peripheral blood, spleen, Renoha node, intestinal tract, liver, etc.). Considering the ease of preparation, the cells are preferably in peripheral blood or spleen.
  • the CD4 + T cell used in the method of the present invention is a phenotype having a na ⁇ ve “na ⁇ ve phenotype” which is exported from the thymus and antigen-stimulated (if T cells).
  • the naive phenotype may be CD45RA positive (CD45RA +), CD45R0 weakly positive or negative (CD45R CD45RB strong positive (CD45RB hlgh + ), CD62L strong positive (CD62L hlgh + ), or CD3 phenotype.
  • the CD4 + T cells used in the present invention have a small phenotype selected from the group consisting of C CD45RB hlsh ⁇ CD62L hl h ⁇ and CD38 +, preferably in the case of humans , More preferably, even if all of these phenotypes are derived from mammals other than cells or humans, the marker molecule may be represented by this species or not inherently possessed by the animal species This is done by the flow cytometry analysis used. “Marker property” means that the marker molecule is confirmed on the cell surface (or in the cell) to be specific binding by the antibody against the marker molecule.
  • the expression level of the marker molecule is relatively high, the marker population is relatively large in the cell population, the cell population expressing the marker molecule is large.
  • “weakly positive” means that the expression level of a marker molecule or phase cell molecule expression level is relatively high compared to the cell (or cell population) of This means that the proportion of the cell population is relatively small.
  • CD45R0 weakly positive CD45R0 low +
  • CD45RB strong CD62L strong positive
  • CD62L hlgh + CD62L hlgh +
  • the cells of the comparison versus Akira Compared to Akira's memory T cells include CD45RA—CD25 hlgh + CD4 0 1
  • CD25 + cells and CD25 ⁇ cells which can be CD25 + cells, CD25 cells, or a mixture of cells. Good.
  • CD25 + CD4 + T cells with a na ⁇ ve phenotype were selected from the group consisting of F0XP3 intracellular CTLA-4 positive (CTLA-4 +) and TNFRI I +.
  • CTLA-4 + intracellular CTLA-4 positive
  • TNFRI I + TNFRI I +.
  • F0XP is weaker in CD25 CD4 + T cells having a na ⁇ ve phenotype, and the expression intensity is usually about 1/4 or less, preferably about 1 / of that of regulatory T cells (eg, CD45 cells) in the periphery.
  • CD25—CD4 + T cells with a phenotype that can be less than 20 are very weakly expressed in intracellular CTLA-4 compared to regulatory T cells in the periphery (eg CD45RA CD25 hlgh + CD4 + T cells, etc.)
  • the expression level of intracellular CTLA-4 can be about 1/3 or less, preferably 1/8 or less of CD45RA CD2, usually about 1/3 or less of cell surface TNFRI CD45RA CD25 hlgh + CD4 + T cells, preferably 1 / 8 CD4 + T having the na ⁇ ve phenotype used in the method of the present invention is preferred.
  • Isolation and purification of the cells can be carried out according to the above-mentioned phenotype and other methods known per se from the above-mentioned mammalian tissues (for example, peripheral blood spleen, Renoha node, intestinal tract, liver, etc.), blood, etc.
  • mononuclear cells can be obtained using rico r1 Hypaque (Amersham Biosciences-Uppsala), etc., or by alpha lanes.
  • a mononuclear cell fraction is expressed with a marker antigen (CD45RA, CD45RB, CD62L, CD38 specific antibodies) that are expressed specifically on the cell surface of the target cell, which is fluorescently dyed or magnetically recognized. Stain, isolate and purify the cell notor or magnetic fraction, and use a single nota to achieve high purity.
  • Cell culture is commonly used in Renoha sphere culture technology.
  • the culture temperature is usually about 30 to 40 ° C, and the range is about 37 ° C.
  • the C 0 2 concentration is typically about 1 to 10% or about 5%.
  • Humidity is typically in the range of about 70-100% and is exemplified by about 95-100%.
  • basal medium of the medium used for culturing in the present or the present invention can be used and whether regulatory T cells can be produced by the method of the present invention, for example, DMEM, EMEM, R PM I — 1 6 4 0, — 1 2, F— 1 0 M— 1 9 9, HAM, etc.
  • DMEM fetal calf serum
  • EMEM e.g., fetal calf serum
  • R PM I — 1 6 4 0, — 1 2, F— 1 0 M— 1 9 9, HAM, etc.
  • Medium modified for sphere culture etc. eg ALyS505N etc.
  • ground mixture can be used .
  • the medium may contain a known additive.
  • a known additive e.g, sodium hilnoate
  • amino acids e.g, L-reducing agents (eg, 2-mercaptoethanol, etc.)
  • buffers eg, For example, antibiotics (eg, Streptominono, Heninrino, Kenotama).
  • the additive is contained within a concentration range known per se.
  • the medium can also contain serum.
  • serum can be used to produce regulatory T cells by the method of the present invention.
  • regulatory T cells whether or not regulatory T cells can be produced according to the method of the present invention or not, such as IL-2, IL-15, IFN- ⁇ , etc. ⁇ cell proliferation added in the ground
  • concentration of the factor is not particularly limited within the range that can be produced according to the method of the present invention.
  • IL-2 is usually 0 1 to 10,000 U / ml, for example, 1 to 5000 U / ml.
  • the concentration of is exemplified.
  • culture of a na ⁇ ve phenotype cell in the presence of substance X refers to the presence of substance X in the presence of substance X, and only in the presence of substance X. Includes cases where CD4 + T cells are not included in the culture, or are live T cells with a na ⁇ ve phenotype, including CD4 + T cells with a naive phenotype To do.
  • the present invention in the present invention, it can be cultured in the presence of CD4 + having a naive phenotype.
  • the anti-T cells can be produced by culturing in the presence of the antigen.
  • Antigen is a generic term for substances that can stimulate cells via the antigen receptors (eg, T cell receptors) on cultured cells.
  • Antigens such as anti-human CD3 antibodies that recognize antigenic molecules such as heptites, protein, lipids, glycolipids, cells, antigen receptor components (CD3, TCR, TCRa, etc.) and side-stabs It also includes antigen antigens such as 0KT-3.
  • immunological non-self cells For example, if the regulatory T is specific to a specific immunological non-self cell, it is cultured in the presence of CD4 + T cells having a naive phenotype or Lahama immunological non-self cells.
  • the immunological non-self is left, for example, radiation (canoma line, etc.), it is preferable that it is inactivated by an anticancer agent (mitoma, etc.).
  • Desired tissue of immunological non-self cells Cells (eg, peripheral blood mononuclear cells (PB).
  • PB peripheral blood mononuclear cells
  • transplantation from allogeneic toners can be used to produce Renhenoto-regulated sputum cells that are specific to donor-derived cells.
  • the cells are cultured in the presence of a CD4 + T cell compound having a naive phenotype derived from Renchenoto and a cell derived from toner, even if the cell is derived from the same organ as the organ that can be transplanted. It may be a cell.
  • cells are cultured in the presence of naive phenotype cells, lahaminone compounds and the antigenic molecules.
  • cell- or tissue-derived antigens such as histocompatibility antigens, causative antigens or autoimmune disease causative antigens (food-derived antigens, substances coexisting in antigenic drugs or preparations, or artificial organs)
  • related denatured products such as sputum denatured products
  • Histocompatibility Histocompatibility antigens MHC antigens
  • non-required histocompatibility antigens are listed as causative substances such as environmental pollen antigen, fungal antigen Food antigen, artificial antigen
  • the cells may be cultured in the presence of cells that reliably achieve antigen presentation to the CD4 + T cells.
  • Antigen-presenting cells are not particularly limited as long as they can produce more regulatory T cells, or antigens obtained from individuals derived from CD4 + T cells that are allogeneic with CD4 + T cells having the usual na ⁇ ve phenotype
  • the type of the original presentation cell is not particularly limited as long as it has antigen-presenting ability and can be produced according to the method of the present invention / deletion, for example, PBMC dendritic cell or the like.
  • radiation (comma line, etc.) Akira Tomino Non C, etc.) It is preferable that it is inactivated by treatment or the like.
  • the CD4 + T cells An agonistic antibody that recognizes a component molecule of an antigen receptor (CD, etc.) (eg, an agonistic antibody that recognizes an anti-human CD3 antibody (eg, CD28)) (eg, an anti-human CD28 antibody) (Blood, 104, p Blood, 104, p 453-61, 2004)
  • an antigen receptor CD, etc.
  • an antigenic antibody that recognizes an anti-human CD3 antibody eg, CD28
  • an anti-human CD28 antibody eg, an anti-human CD28 antibody
  • a combination of a sex antibody and a CD28 antibody can be used, etc.
  • a regulatory T cell population having a specificity can be produced using the antigen antigen.
  • the immunosuppressive ability is induced in the living T cell, the induced regulatory T cell is maintained at a high level, or the immunosuppressive ability of the regulatory T cell is increased.
  • the term “rahaminono compound” Also referred to as a class defining a class of immunosuppressive compounds that contain a core nucleus (shown below)).
  • rahamino compounds such as ethanol, ethenole, okinome, histanono and humans, such as functional groups on the rahamino nuclei, such as reduced or acidated lahamino compounds.
  • rahaminno compounds such as ethanol, ethenole, okinome, histanono and humans, such as functional groups on the rahamino nuclei, such as reduced or acidated lahamino compounds.
  • Ranomynone esters and ethers are examples of Ranomynone esters and ethers.
  • JP-A-8-5 0 2 2 6 6 (US Pat. No. 5,665,772) discloses a suitable rahaminono compound represented.
  • R 1 and R 2 are each independently H, alkyl, thioalkyl quinole, hi troquino ano quinole, nohi troquino ano quinole, hi tro quino eno eno quinole, nohi troquino alkyl arole alkyl, arco Norquinoalkyl, aminoalkyl, alkylaminoalkylaminoaminoalkyl, arylaminoalkyl, arylsulkyl, aryl, nitroquinoalkylalyl, noquinolanyl lucoquinoalkyl and (R 3 ) 3 S 1 (formula In which R 3 is independently selected from ethyl, inoprohill, t-ptyl and phenyl, where the term “alk-” or “alkyl” is a branched chain Or straight chain C alkyl, preferably, the carbon chain of which may be optionally ether (mono-O-) bridged and R 4 is methyl. Or R 4 and
  • both R 1 and R 2 are not H and R 1 (in the case of R alkyloquinoalkyl, both X and Y are preferably compounds of the formula (II) X and Y or both 0, R 2 and R 1 or H Excluded 4 2—O—Substituted lahaminone
  • R 1 is human quinoalkyl, human quinoalkoxyalkyl, aluminum Yohyaminoalkyl, especially selected from 4 2 quino) ethinore rahamaino, 4 2— O— (3— troquino) mynon, 4 2— O— [2— (2— troquino) etokino]
  • R 1 and R 2 are independently selected from:
  • R 6 and R 7 and N attached thereto are not substituted or — NR 6 C0 2 — ⁇ — 6 alkyl— R 7
  • R 1 and R 2 are not hydrogen at the same time
  • R 1 1 is selected from
  • Te as hereinbefore defined Te triflate Ruo Russia methyl, phenyl or naphthyl,
  • two adjacent X, Y and Z may be joined together to form a ring selected from Nolaninole, Nohi Trofuraninore, Nohi Trohiraninore, and Noki. ]
  • JP-A 9-5 1 20 18 discloses a suitable rahaminno compound or a pharmaceutically acceptable product.
  • R 1 and R 2 are each independently hydrogen or —CO (C It may form a chloroalkyl ring having a prime number of 3 to 8 (if desired,-(CR 3 R 4 ) f OR or trisubstituted)
  • R 7 is hydrogen, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkynyl having 7 to 7 carbon atoms,-(CR 3 R 4 ) f OR 1 () , -CF 3 , -F, or -CC
  • R 8 And R 9 are each independently hydrogen, alkenyl having 1 to 6 carbon atoms, alkynyl having 2 to 7 carbon atoms,-(CR 3 R 4 ) f OR 10 , or -C0 2 R u Or R 8 and R 9 together form a 3 to 8 primed noroalkyl ring (optionally substituted with-(CR 3 R 4 ) f OR or trisubstituted). May be
  • R 1 () is hydrogen, alkyl having 1 to 6 carbons, or alkyl having 2 to 7 carbons.
  • R 11 is hydrogen, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkynyl having 2 to 7 carbon atoms or alkynyl having 7 to 10 carbon atoms, or phenylalkyl having 7 to 10 carbon atoms.
  • X is 5- (2,2-no- (carbon number) 1-6 alkyl)) [1,3] N-Shiro (3-8 carbonic alkyl)) [1, 3] noxano- (1-6 alkyl)) [1, 3] noxanil , 4 _ (2 to 8 cycloalkyl)) [1, 3] Noxanyl, 4- (2, 2-noalkyl)) [1, 3] Noxalanyl, or 4- (2-Suhiro (charcoal)
  • at least one of R 1 or R 2- (CR 3 R or-(CR 3 R 4 ) f OR 10 is substituted with 3 to 8 carbon atoms.]
  • R 1 () is tri- (alkyl having 1 to 6 carbons) nori 1 to 6 alkyl) nrylethyl, triphenylmethyl, alkynomethyl of henone, tri- (alkyl having 1 to 6 carbons) norylloroethyl And tetrahytrohyranyl group.
  • particularly preferred menoher includes 3-Hytroquino-2- (Lahaminone 42-ester with 2-methylprohinoic acid. Therefore, examples of Lahaminono compounds include any of the above patents.
  • the preferred 2 7-esters and ethers of lahaminone are 5,256,790, which is hereby incorporated by reference. The preparation of these esters and ethers is described above.
  • the patents are the preferred Okinom of Lahaminon, Hitranon Oohito Toro US Pat. Nos. 5, 373, 014, 5, 378, 836, 5, 023, 264 (these are given by indicating the source)
  • the production of okinome, hydranone, and troquinoramino which is part of this specification, is disclosed. Part of the document).
  • Lahamai nono compounds include Lahamai Nono [
  • salts contain organic and mechanical acids, such as acetic acid, lactic acid, quenoic acid, tartaric acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, if they contain a lahaminone compound moiety.
  • the salt should contain a Lahamino compound or an appropriate acid moiety.
  • the concentration of the Lahaminone compound added to the medium is
  • T cells are not particularly limited as long as the production of T cells can be achieved, and is usually about 1 or about 5 to 25 nM.
  • the timing of adding the Lahamaino compound to the medium is particularly limited as long as the production of the method cell of the present invention can be achieved.
  • La may be added from the beginning of the culture, and the Lahaminone compound may be added from the middle of the culture. Therefore, CD4 + T cells (especially CD25 + CD4 + T cells) that have a type to which a rahamino compound is added from the beginning of the culture, or the number of regulatory T cells that are obtained after the culture is inhibited or proliferated.
  • the Lahaminono compound is added to the medium at least 1 week to 15 days after the start of the culture.
  • the rahaminono compound is more preferably added to 3 from the start of the culture. Further, it is preferable that the lahamino compound is added to the medium, for example, at the latest by 100 days, preferably by 70 days.
  • the period of time in which the culture is performed in the presence of the lahaminono compound is not particularly limited as long as more regulatory T cells can be produced, or ⁇ 100 days, for example, 3 to 70 days, preferably 5 ⁇ 50 days, more than 5 days. If the period is too short, it induces immunosuppressive activity or control of T cells derived from CD vesicles with a na ⁇ ve phenotype
  • the T cells are cultured in the absence of the source, as described above, except that no inno compound is added. It can stop the growth of culturing in the absence of antigen.
  • the duration of the further cultivation is usually 1 to 20 days, for example, 1 to 10 days, preferably 1 to 3, and the rahaminono compound contaminated in the cells is further removed.
  • the ability to be cultured with the reactive T cells acquired by the method of the present invention and to inhibit the activation of reactive ⁇ cells by receiving stimulation through the T cell receptor may also have unresponsive properties.
  • regulatory T cells that can be acquired when cultured in the presence of an antigen having a na ⁇ ve phenotype can be specific for the antigen.
  • the obtainable regulatory T cells depend on cell contact. That is, in this case, the cells that can be obtained can be cultured together with the reactive T cells under the conditions of the reactive T cells, and when the T cell receptor is used, the activation of the reactive T cells can be inhibited. Have ability It may have a function as an acquired cell or a regulatory T cell.
  • acquired cells or reactive T cells for example, whole CD cultured, stimulated by antigen and anti-reactive
  • T cell activation or measurement As an indicator of cell activation, cell proliferation is usually (Eg, [ 3 H] only) or cytokino (IL-2, IL-4, IFN y, etc.) produced or used, and if the activation or suppression of reactive T cells is suppressed, It can be judged that it has the function of.
  • cell contact may be confirmed as to whether the acquired cells have immunosuppressive ability.
  • it is cultured with the following two conditions (A) cell contact or (B) cell contact or inhibition, acquired cells or cells are all CD4 + T cells), stimulated by antigen, reaction Or measured.
  • the condition of (B) is, for example, that Cyanhar is a liquid force, a membrane with a pore that is so large that cells cannot pass through it, and a reactive T cell is acquired in one side.
  • Cyanhar is a liquid force, a membrane with a pore that is so large that cells cannot pass through it, and a reactive T cell is acquired in one side.
  • the acquired cells must have immunosuppressive ability independent of cell contact. Come over.
  • regulatory T cells that can be produced according to the present invention / regulatory cells can have regulatory sputum cells (eg, peripheral blood CD45RA—CD25 hlgh + CD4 + T cells high CD45RB expression level (CD45RB hlgh +
  • the CD45RB expression of peripheral blood CD T cells is 5 to 100 times (for example, about 50 times) fluorescence intensity of inotype conotrol antibody.
  • the CD45RB expression level of regulatory T cells that can be produced by or after is usually about 15 to 20 times (preferably about 4 times) that of CD45RA—CD25 hlgh + CD4 + T cells) .
  • the J comparison of the flow cytometry hell is produced by comparing the expression intensity in the heater of the histogram with the vertical axis indicating the number of cells and the horizontal axis indicating the expression intensity (fluorescence intensity).
  • Regulatory T cells that can be obtained can have a phenotype of at least one, more preferably 3) selected from the group consisting of GI CD45RB hlgh + .
  • regulatory T cells that can be produced by the method of the present invention CD4 + T cells having the naive phenotype used in the present invention / existing expression of CD25, etc. I can do it.
  • the regulatory T cells that can be produced by the method of the present invention can be CD or the intensity of expression differs from the case of using CD25 + T cells and CD25 ⁇ T cells in the method of the present invention.
  • Cells can be lower in CD2 (CD25 lQW + ) than in the heavens in the periphery (eg, CD45RA—CD25 hlgh + CD4 + T cells in peripheral blood, etc.).
  • CD25 CD4 + T cells having the present naive phenotype are used under the same conditions as described above, the CD25 expression level of T cells is low in the blood CD45RA_CD25 hlgh + CD4 + T cells 5-12 Double (preferably about l Z l 0 to: LZ 3 times (for example, there can be about 1).
  • CD25 + T cells are used in the CD62L expression method of regulatory T cells that can be produced by the method of the present invention
  • CD25- T cells that is, CD25 + CD having a na ⁇ ve phenotype in the present invention
  • the regulatory T cells obtainable, present in peripheral Te naturally e.g., peripheral blood CD45RA- CD25 hlgh + CD4 + T cells, etc.
  • CD62L 1 may have a lower CD.
  • CD62L hlgh + In the condition that can give the fluorescence intensity of (Eg, CD45RA CD25 hlgh + CD4 + T cells in peripheral blood, etc.) can be almost equivalent (referred to as CD62L hlgh + ).
  • CD25—CD4 + T cells with a na ⁇ ve phenotype can be used in the same conditions as described above.
  • Regulatory T cells have a CD62L expression level of about 16 to 3 times that of CD45RA—C in peripheral blood (preferably Is about 1 to 4 to 2 times.
  • Regulatory T cells that can be produced by the method of the present invention are capable of reversing CD45RA, and their expression intensity differs from the case of using T cells using CD25 + T cells in the present invention.
  • the regulatory T cells that can be obtained are CD25 + CD4 + T cells (for example, CD45RA + CD25 + CD4 + T in peripheral blood).
  • Cells can have more reher (denoted CD45RA mid + ).
  • the CD45RA + CD25 + C CD45RA expression in peripheral blood is 0,000 times (for example, about 600 times) when the genotype conotrol antibody is used.
  • CD45RA + CD25 + expression level in CD45RA + CD25 + in peripheral blood is about 1 20 to 12 times (preferably using CD25 + CD4 + T cells with a na ⁇ ve phenotype in a method that can give strength) About 1 1 0 to 1 3 times (ex.
  • CD25 CD having a naive phenotype in the method of the present invention CD25—CD4 + T cells with a naive phenotype in the method obtained.
  • CD45RA expression level of CD45RA in peripheral blood CD45RA + CD25 about 16 to 6 times (preferably about 1/3 to 3 times (preferably For example, the CD45RA expression level of CD45RA + CD25 + CD4 + T cells in peripheral blood is almost the same as that of CD45RA + CD25—CD4 + T cells (0 1 A).
  • CD25 + T cells are used in the CD45R0 generation method of regulatory T cells that can be produced by the method of the present invention and CD25- T cells are used, that is, the CD25-CD4 + T cell having a na ⁇ ve phenotype is used in the method of the present invention.
  • the CD45R0 expression of the regulatory T cells that can be obtained is substantially negative.
  • the method of the present invention depends on the timing and the culture period of adding the CD25 + CD4 + T-fine lahaminone compound having a naive phenotype to the medium. It can change again.
  • regulatory T cells that can be obtained when cultured in the presence of Laha for a relatively long period of time (for example, 50 days or more) from the start of CD25 + having a na ⁇ ve phenotype.
  • a relatively long period of time for example, 50 days or more
  • CD45R0 may be expressed (CD45R0).
  • the CD45 protein of the regulatory T cells that can be obtained is obtained.
  • CD25 + CD4 + T cells with phenotype eg peripheral blood CD45RA + CD2
  • the regulatory T cells that can be produced when CD25 + having a naive phenotype in the method of the present invention is at least one selected from the group (A) or (B) (preferably two or more). Preferably, it may have 4 phenotypes.
  • at least one selected from the group of (C) above preferably preferably 3 types, and more preferably, which can be produced when CD25 D4 + T cells having the phenotype of the present invention are used. Can have four phenotypes.
  • the present invention provides a regulatory T cell having any one of the following groups (A) to (C) (preferably 2, and more preferably 3, and more preferably). There is something to do
  • Immunomodulatory agent comprising regulatory T cells Regulatory epilepsy cells that can be produced by the method of the present invention have a strong immunity, and the immune response is abnormally enhanced due to some cause. When an undesirable immune response occurs or when it is expected to occur, it is possible for the S subject to have an abnormally enhanced immune response in the subject's body due to the controllability, etc.
  • a na ⁇ ve CD4 + T cell derived from the third subject is cultured in the original form of the lahaminone compound and the autoimmune disease, so that a regulatory regulatory cell specific for the causative antigen can be obtained.
  • Manufacture Suppressing the autoimmune reaction by administering the regulatory sputum cells to the S person.
  • the CD4 + T cells derived from the S person are treated as the cause of the lahaminone compound and the allerky.
  • the present invention comprises a regulatory tt T cell that can be produced by the above method.
  • An immunomodulator is provided.
  • the agent is for immunosuppression.
  • the immunomodulator is rejection in organ transplantation.
  • Allergic disease (Lugi, drug allele, panting, atherodermatitis, eczema, food allergic rhinitis, allele Conjunctivitis), autoimmune disease S (multi-eumatism, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, blistering mononos psoriasis, Crohn's disease, ulcerative colitis, autoimmune hepatitis type 1 diabetes, etc.), graft Anti-shukuoji disease (GVHD), infertility, etc. are predicted. ,
  • the immunomodulating agent of the present invention can be made into a parenteral preparation by mixing with an effective amount of the above-mentioned pharmaceutically acceptable carrier according to conventional means.
  • the immunomodulator of the present invention is usually produced as a pesticide, a turbid agent, or a preparation.
  • carriers such as isotonic solutions (eg, DD-mannonitol, sodium chloride) containing saline, sugar and other adjuvants as carriers that can be included in the parenteral formulation
  • the immunomodulating agent of the present invention includes, for example, a buffer (for example, sodium phosphate buffer), a soothing agent (for example, henosarcino chloride), a stabilizer (for example, human serum alpmino, polyethylene) And) a preservative, an antioxidant and the like. It is convenient to give. For other animals, it can be given per 60 kg.
  • the present invention provides a CD4 + T cell having a na ⁇ ve phenotype, and provides a control T cell production quinoto containing a lahama myino compound. It may be labeled with. It is possible to enumerate antigens specifically expressed in CD4 + T cells having the antibody phenotype (eg, anti-CD4 antibody, anti-CD45RA antibody, anti-CD45RB antibody, anti-CD62 antibody, etc.). .
  • antigens specifically expressed in CD4 + T cells having the antibody phenotype eg, anti-CD4 antibody, anti-CD45RA antibody, anti-CD45RB antibody, anti-CD62 antibody, etc.
  • a body or more can be included.
  • the quinoto is further described as a reagent in the above-described method (antigen, T cell growth factor, medium, additive for medium, protocol of the method for producing regulatory T cells of the present invention). If the quinoto is used, it is possible to manufacture cells according to the above-mentioned method.
  • the present invention provides an agent for inducing CD4 + T cells having a naive phenotype, and an agent containing a Rahaminno compound
  • auxiliary agents eg, D-northitol, D-mannonitol, isotonic solutions containing sodium chloride, etc.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate, stabilizers (eg, human blood clot alfmino, polyethylene crico)
  • Antioxidants, excipients, preservatives, binders, solubilizers, non-ionics can be mentioned
  • the agent of the present invention can be used in the medium used to produce / remove isotonic aqueous solutions, powders, etc. It is used as it is not added.
  • Lahaminono compounds can also be used for regulatory T from CD4 + T cells having a na ⁇ ve phenotype in medical tea and the body by methods known per se. It can be included as a pharmaceutical containing a lahaminono compound alone or as a mixture of any other medical treatment. They are also manufactured by one or more well-known in the field of mixing together with one or more carriers acceptable as pharmaceutical preparations.
  • Liquid preparations such as pills include water, sugar, norhinoto, fructose and other nocricols, pro-Hillenocriconole and other cricols, sesame oils such as soybean oil, P-hytroquine benzoic acid Manufactured using preservatives such as esters, flavours such as Lecher and Heharminoto, etc. Powders and condyles include lactose, fucose, voice sugar, manoninoto, etc.
  • parenteral agents may be supplemented with the above auxiliary components selected from diluents, anti-degradants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers and the like exemplified as oral agents.
  • auxiliary components selected from diluents, anti-degradants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers and the like exemplified as oral agents.
  • the dosage and frequency of administration of the rahaminono compound varies depending on the dosage form, the nature or severity of the symptom treated, or, usually, in the case of oral administration, per adult (weight 60 kg), Administer about once a day or several times a day. In the case of oral administration, about 2 to 15 mg is administered once a day or several times a day (as an adult g). It is possible to administer an amount converted per 60 kg.
  • the dose and the number of doses vary depending on the various conditions described above (5 agents for maintaining the immunosuppressive ability of regulatory T cells)
  • an immunocompound in the method for producing regulatory T cells of the present invention it is possible to suppress a decrease in immunosuppressive ability that occurs with high-magnification cell proliferation and to immunize regulatory T cells.
  • High suppressive or regulatory T cell immunosuppressive ability can be enhanced.
  • An agent for maintaining immunosuppressive capacity when producing regulatory T cells by obtaining CD4 + regulatory T cells having a na ⁇ ve phenotype containing a lahaminone compound, and providing a lahamino compound It is.
  • the CD4 + T cells are CD25 + or CD25_ or CD25 +.
  • “Maintaining immunosuppressive ability of regulatory T cells” The brightening agent is used as an isotonic aqueous solution, powder or the like in the production method of the present invention.
  • the present invention provides a chemical knock method capable of inducing regulatory T cells comprising the following steps.
  • step (3) A step capable of inducing regulatory T cells from the test compound when it is isolated in step (1) and has the ability as a result of the evaluation in step (2).
  • a CD4 + T cell having a test compound loop phenotype is further cultured, and the T cell from the culture is 1).
  • the CD4 + T cell may be CD25 + or CD25 ⁇ , preferably the test compound may be any known compound or novel compound, acid, carbohydrate, lipid, protein, heptite, low molecular weight organic compound, Examples include compound life rally produced using cono-story technology, lanotame heptoli triflies produced by solid-phase combined spraying / leaving, animals and plants, marine life and other unnatural elements.
  • Macrolite compound refers to a compound having 14 to 16 members.
  • immunosuppressive compounds are chemically modified groups. Derivatives obtained by substituting with other groups can also be obtained.
  • step 1 The culture conditions in step 1 were described in the above section (1 Method for producing regulatory T cells), except in the absence of a lahaminone compound, and then evaluated for the immunosuppressive ability of the T cells obtained in step 1 (Immunosuppressive ability is measured by, for example, measuring the extent to which cell contact is allowed and cultured with T cells (eg, total CD4 + T cells) and stimulated by antigen to suppress activation. As an indicator of the reaction, cell proliferation (eg, [] Tyminone's forceino (I-2, IL-4 IFN y, etc.) production is usually used. It is possible to use the same antigen as that used in the cell production process.
  • T cells eg, total CD4 + T cells
  • step 3 when the T cell obtained in the step 1 is used, the compound capable of inducing the test compound or the regulatory T cell is combined (step 3). It is useful to use regulatory T cells because it is possible to induce cells to the Rahaminno compound in the production / department of regulatory T cells of the invention obtained by the screening method of the present invention.
  • Control from CD4 + T cells with na ⁇ ve phenotype (1) A step of obtaining CD25 + CD4 regulatory T cells having a na ⁇ ve phenotype in the presence of a test compound
  • step (3) Number of regulatory T cells evaluated in step (2) and number of regulatory T cells obtained with CD25 + CD4 + T cells with na ⁇ ve phenotype in the absence of Z or exogenous compounds (4) A step of obtaining as a compound capable of increasing the production efficiency of a subject T cell having an increased number of regulatory T cells or immunosuppressive ability. “Increasing the production efficiency of regulatory T cells” means that the number of regulatory T cells that can be produced by regulatory T cells and / or the number of regulatory T cells that can be obtained.
  • the CD25 + CD4 + T cells having the test compound-phof phenotype are further cultured and controlled from the culture (step 1).
  • the test compound one similar to the above (6 method of screening of regulatory T compound / left) can be mentioned.
  • LA in the method for producing regulatory T cells of the present invention, By using LA, it is possible to suppress the decline in regulatory ability that can occur with high-magnification cell proliferation, and to enhance the immunosuppressive ability of regulatory T cells to enhance the immunosuppressive ability of regulatory T cells. . Therefore, an immunosuppressive compound similar to a product can be a suitable test compound. Derivatives obtained by substituting a group with another group can also be obtained.
  • Step 1 The cell culture conditions in Step 1 are described in the above section (1 Method for producing regulatory T cells), except in the absence of a lahaminono compound.
  • step 2 the number of regulatory T cells obtained in Step 1 and / Or immunosuppression (step 2).
  • the number of regulatory T cells is measured by a method known per se.
  • the immunosuppressive ability of regulatory T cells is, for example, cell contact, permissive regulatory T cells or reactive T cells (eg, total CD4 + T cells).
  • the degree to which activation of reactive T cells is suppressed by culture stimulation is measured.
  • an antigen used for cell proliferation incorporation of minono
  • cytokino IL-2, IL-4 IFN y, etc.
  • the number of regulatory T cells evaluated in Step 2 and / or the number of regulatory T cells obtained by culturing CD25 + CD4 + T cells having a na ⁇ ve phenotype in the absence of immune compound is preferably based on the presence or absence of a significant difference in the number of regulatory T cells obtained in the absence of the test compound or the immune compound.
  • the number of regulatory T cells obtained in the presence of or immunosuppression Whether measured in advance or measured simultaneously, measured from the viewpoint of reproducibility It is preferable.
  • the present invention provides a method for inducing naive expressed CD25 + CD4 + T cells in vivo, comprising the following steps (1 ) Liver transplantation process for mammals
  • a step of confirming that C induction having a naive phenotype is induced in the peripheral tissue of the mammal As the mammal used in the induction method of the present invention, the mammal described above can be used. The age of the mammal is particularly limited. Preferably, the mammal can be, induces a larger number of CD25 + CD4 + T cells than the younger, or the mammal is a child. A child is sexually mature
  • the body is a sexually mature individual. In general, humans are 18 children, individuals older than 18 years or adults.
  • the liver is first transplanted or given to a mammal.
  • the genotype of the liver to be transplanted is particularly limited: immunological self (is immunological non-self (ie allogeneic or xenogeneic). Or non-self, more preferably allogeneic.
  • Liver transplantation includes orthotopic liver transplantation and power, inclusion, and liver transplantation.After orthotopic liver transplantation, all livers of Shukuo have been removed. The ectopic liver transplantation exists, and the transplanted liver is moved into the abdominal cavity to a different site from the original liver location. Next, in the peripheral tissues of mammals that have undergone liver transplantation,
  • CD25 + CD4 + T cells have been induced (step 2).
  • CD25 + CD4 + T cells with a naive phenotype in normal blood were measured, and it was confirmed that the number (or percentage) of the cells (or percentage) increased before the liver transplantation.
  • Detection of CD2 (or percentage) with a na ⁇ ve phenotype is performed by, for example, using a specific antibody or the like based on the CD25 + type having a naive phenotype and capable of detecting the phenotype. Is called.
  • the present invention includes the following steps, and represents a na ⁇ ve expression in vivo.
  • step (1) A step of administering a test compound to the mammal of step (1)
  • the mammal used for the screening method of the present invention can be the same as the method for inducing CD25 + CD4 + T cells having a leaf phenotype.
  • liver transplantation is the same as described above (induction method with 8 naive phenotypes).
  • the test compound is administered to the liver transplanted mammal (as a compound, the same as the above (6 / Left of compounds capable of inducing regulatory T cells) can be mentioned.
  • step 2 having a na ⁇ ve phenotype in the periphery of the mammal in step 2
  • Number is evaluated (process 3).
  • the number (or percentage) of peripheral tissues eg, CD25 + CD4 + T cells with a peripheral blood phenotype
  • the number (or percentage) of CD25 + CD4 + T cells having a naive phenotype is used.
  • Performing by tomography or the like is preferably 1 to 3 months after liver transplantation.
  • CD25 + CD4 + transplants with a na ⁇ ve phenotype assessed in step 3 were given and compared to the number of CD25 + CD4 + T cells in the periphery of mammals not receiving the test compound ( Process 4).
  • the number of cells is based on the difference of to .
  • Administered test compound Can enhance the induction of CD25 + CD4 + T cells with the phenotype.
  • Venous blood was obtained from a healthy volunteer. Peripheral blood M C sword, Ficoll l- Hypaque (Amersham Biosciences- Uppsala) was isolated closely. Cells were colored for 30 minutes with alophyconanoanino (APC) conjugated anti-CD4 mo (mAb), phycoerythrino (PE) conjugated anti-CD25 mAb and funnel thionoanato (FITC) conjugated anti-CD45RA mAb. Later, it was isolated using the following 6 different cell fractions (BD FACSAria Dickinson) (see 0 1 A). (a) CD45RA + CD25 + CD4 + T cells
  • CD45RA CD25 hlgh + CD4 + T cells All mAbs were purchased from Becton Dickinson. It was 9 8%. Anti-CD4 mAb microhyein ink (MACS) nostem magnetic column (Milteniy Biotec positively isolated) after removing rate-bound cells for cell separation for functional anomaly. Purity is> 9 5% (FACS analysis)
  • BD FACSAriase FACSDiVA software Becton Dickinson
  • PerCP-conjugated anti-CD4 mAb PerCP-conjugated anti-CD4 mAb
  • hyotino-conjugated anti-CD25 mAb FITC-conjugated PE-conjugated anti-CD45RB mAb
  • CD45RA + CD25 + CD4 + T cells or CD45RA + CD 1 4 cells Zwel l), isolated as described above, in a 96-well round bottom culture plate, add 1 ⁇ g growth medium (2% human serum Supplemented AlyS505N (Cel l Scie Institute)) with human IL-2 (1000 U / ml, Cel scienc It was removed vigorously and 100 U / ml I in the absence of cells or rahamainone. After 3 rounds, the cells are used for functional annotases (suppressed annotases)
  • RNA or CD4 + T cell fractions Extracted from total RNA or CD4 + T cell fractions according to Isogen reagent (Nippon Gen manufacturer's instructions and 10 mM DTT, 0.5 mM RT buffer, 40 ng lanthanum primer p (dN) 6, 6U Incorporated Rihonukule and 40UM-MLV reverse transcriptase (Invitrogen), 20 ⁇ 1 and then incubate for 1 hour, then 70. C.
  • a or F0XP3 mRNA expression level was quantified by real-time PCR using ABI / PRISM7700 Nostem (Applied Biosystems) and QuantiTect Probe PCR k F0XP3-specific part fluorescence Taqman pro-Fuka, as described above (Int I Revelation of F0XP3: 6 different cell fractions under U
  • the CD25-CD4 + T cell fraction was considered to be free of regulatory T cells from which the F0XP3 gene was generated Different tests were performed and similar results were obtained.
  • CD45RA + CD25 + CD4 + phenotype T fine ⁇ shed CD45RA + CD25 _ CD4 + T cells CD45RA + CD25 + CD4 + (a ) CD45RA CD25 hlgh + CD4 + (b), ⁇ Hi CD45RA + C (0 1 ⁇ SanAkira ) Or Na ⁇ ve memory cell phenotype, as well as cell surface TNFRI I (0 2) CD45RA + CD25— CD4 + T CD45RB hlgh + , CD62L hlgh ⁇ and CD38 + CD45RB hlgh ⁇ CD62L hl6h ⁇ and CD38 + and the phenotype was equivalent to CD45RA + C.
  • CD45RA + CD25 CD4 + T cells did not show intracellular CTLA-. Unlike this cell fraction, CD45RA CD25 hlg CD45RA + CD25 + CD4 + T cells showed intracellular CTL specific for regulatory T cells.
  • CD45RA CD25 hlgh + CD4 + T cells have a CD25 expression intensity of approximately 100 times the fluorescence intensity when the body is used, and CD45RA + CD25 + CD4 + T intensity is approximately 60 times the fluorescence intensity when the control antibody is used. Two or more tests from 0 individuals were performed with similar results (functional characteristics of expanded CD45RA + CD25 + CD4 + T cells) CD45RA + CD25 + CD4 of scales isolated from the periphery + T cells are
  • CD45RA + CD25 + CD4 + T cells were stimulated with anti-CD3 / CD28 antibody-conjugated heath in the presence of IL-2, and the number of cells increased with high efficiency. Increased to 0 0 0 times.
  • the CD45RA + CD25 + CD4 + T cell line obtained by removing heath and feeding 100 U / ml IL-2, increases the number of CD4 + T cells Proliferation was strongly suppressed (0 3 B) When proliferation continued, the growth inhibitory function of the T cell line was attenuated.
  • adding Lahaminone from the beginning of the culture suppresses the proliferation of T cells, and the number of cells in the culture is 5 CD45RA + CD25 + CD4 + T cells were grown in the absence of lahaminone.
  • the effect of lahaminono on CD45RA + CD2 proliferation and CD4 + T cell proliferation inhibitory function was examined when added with myon.
  • CD45RA + CD25 + CD4 + T cells were suppressed from the time of addition (0 4 A, day 7, day 39).
  • the number of cells in the culture did not increase by 50 from the start of culture.
  • the number of cells in the culture was increased from about 30 to 50 days after the start of culture, and after 50 days from the start of culture, the heat was applied from the culture as described above.
  • the CD45RA + CD25 + CD4 + T cell line in the Hirahama culture is cultured in the presence of 100 U / ml IL-2, and the growth inhibitory function of the resulting CD45RA + CD25 + CD4 + T cell line is adjusted to the T cell
  • the strain was CD4 + T-suppressed by stimulation with alloantigen-presenting cells (0 4 B, day 7, day 39).
  • CD45RA + CD25 CD4 + T cells proliferated more than 100-fold in the presence of IL-2 by anti-CD3 / CD28 antibody in about 35 days (0 5 dayO). After culturing for about 35 days in the presence of Lahamaino, the T cell line that had been cultivated for 2 days in the presence of 100 U / ml IL-2 was removed from the culture. Suppressed to CD4 + force (0 5 B, dayO).
  • CD45RA + CD25 CD4 + T cells proliferated in the absence of rahaminno
  • Cultivation of rahaminone had little effect on the growth of the T cell line (0 to about 35 days after the beginning of the culture, heat and remove from the culture as above, 100 U / ml Incubate for additional 2 days in the presence of IL-2.
  • the cell line was CD4 + T cells against stimulation by alloantigen-presenting cells (0 5 B, dayl9).
  • regulatory T cells were induced by culturing Naif CD25 CD4 + T cells in the presence of the Lahamaino compound.
  • regulatory T cells can be produced from CD4 + T cells that have a CD25 expression expression phenotype.
  • Figure 6 shows the flow cytometry analysis results.
  • the T cell line obtained using human peripheral blood CD45RA + CD25 + CD4 + T cells and added to Lahaminono is a natural T cell (peripheral blood CD45RA-CD25). Similar to hlgh + CD4 + T cells), CD45RB expression of the GITR T cell line is CD45RA—CD25 hlgh + CD4 + T cells (about 4 times) in peripheral blood (CD45RB hlgh + ).
  • CD25 expression of the T cell line was almost the same as that of CT cells in peripheral blood (about 08 times) (CD25 hlgh + ) and lower than CD62L CD45RA CD25 hlgh + CD4 + T cells (about 16 times) (CD6
  • the expression intensity of CD45RA and CD45R0 in the strains were those of CD cells at the start of culture and those of peripheral blood CD45RA CD25 hlgh + CD4 + T cells (CD45RA mid + CD45R0 mid + ) CD45RA expression was about CD45RA + in peripheral blood.
  • CD45R0 expression in peripheral blood CD45RA CD25 hlgh + CD4 + Peripheral blood CD45RA + CD25— CD4 + T cells and T cells obtained when added to Lahaminono are expressed as GITR + CTLA4 + CD45RB hlgh + as in the case of peripheral blood CD45RA + CD25 +. Had a mold. Expression is lower than the peripheral blood CD45RA-CD25 hlgh + CD4 + T cells (approximately 1/3 times that of about 1 5 CD62L expression in peripheral blood CD45RA- CD25 hlgh + CD4 + T cells) (CD62L hlgh +). The CD45RA expression intensity of the T cell line was almost the same as that of the CD45RA + CD25—CD4 + T cell (about 1 time). The T cell line was CD45R0 negative (CD45R0—).
  • the regulatory T cells that can be produced by the method of the present invention / existing are present in the regulatory T cells (peripheral blood CD45RA CD25 hlgh + CD4 + T-type and its phenotype. It was shown that the type of CD4 + T cells having the present type used in the present invention / existing (for example, whether the expression of CD25 expression can be changed depending on the timing of addition to the medium.
  • Example 3
  • peripheral blood whole CD4 + T cells were isolated. 0 T cell lines or 5 X 10 4 isolated peripheral blood whole CD4 + T radiation-irradiated (40 Gy) allogeneic PBMC and 10 ng / ml (0KT- 3) Along with the round bottom 9 6-well microphone mouthplate, in 10% medium, it was stimulated accordingly. All freshly isolated for Toranosuueru testing CD4 + T cells and 1 X 1 0 6 one T cell lines all CD4 + T cells and T cell lines or allogeneic PBMC (3 X 1 0 6 cells) and co And cultured separately. The cultures were inoculated for 4 days and lahered with [3H] tyminono in between. The culture is collected and [f
  • CD45R and CD45RA + CD25—CD4 + T cell lines both increased in total CD4 + T cells under conditions that allowed contact with T cell lines and total CD4 + T cells (07).
  • inhibition of T-cell lines and total CD4 + by tranosuel increased total CD4 + T cells by CD45RA + CD25 + CD4 + T cell lines, or CD45RA + CD25- CD4 + T cell lines continue to increase total CD4 + T cells. Therefore, in the method of the present invention, the regulatory T cells obtained when using a CD having a na ⁇ ve phenotype can be relieved depending on cell contact, and when CD25 CD4 + T cells having a naive phenotype are used.
  • Can T cells exert their immunosuppressive ability independently of cell contact? ) In the presence of HI IL-2 (1000 U / ml, Cell Science & Techno), 1 xl (T5 cells / wel l radiation irradiation (40 Gy) was stimulated .
  • Aerolimus 100 nM or 1000 nM Nohartisphama was added to the culture medium from the beginning.
  • Gerolimus was purified as follows: 0 25 mg tablets (manufactured by Nohartes Pharma) Then, the solution was filtered, and the filtrate was spun and the precipitate was dissolved in DMF and separated by HPLC (column C18 4 ⁇ ⁇ , after separation. Was lyophilized and purified.
  • CD45RA + CD25— CD4 + T cell line either alone or with allogeneic PBMC used in culture with autologous responder 1 ( ⁇ 4 / wel l) Stimulated by ⁇ 1 ( ⁇ 5 pcs. Zwel l) in microplate, in growth medium, and cultured for 7 hours, [] Taino (2 Ci / wel l) after the last 16 hours Cells are recovered and [] thyminono uptake or 1450 Microbet
  • the CD45RA + CD25 + CD4 + T cell line suppressed the proliferation of CD4 + T cells in response to stimulation by the presenting cells more than the control. (From 0 and above, it adds herolimus as in the case of rahaminone. It was shown that the CD45RA + CD25 + CD4 + T cell line can maintain its immunosuppressive ability at a high level.
  • CD45RA + CD25 effect of herolimus on the function of CD4 + T cell line.
  • herolimus ⁇ or ⁇ was added to increase the proliferation of CD45RA + CD25 CD4 + T cells (0 8 B)
  • CD45RA + CD25—CD4 + T cell line obtained by culturing it suppressed more strongly against stimulation by alloantigen-presenting cells (0 10).
  • CD25-CD4 + T cells harboring can be induced by culturing CD25-CD4 + T cells in the presence of herolimus as in the case of rahaminone.
  • herolimus was superior in enhancing CD45RA + CD25 ⁇ propagation.
  • herolimus can be produced from CD4 + T cells with a na ⁇ ve phenotype (CD45RA +) associated with CD2. It was.
  • APC-anti-CD4 antibody PE-anti-CD25 antibody, FITC- and the optimal amount determined by squeezing were used.
  • the screening method of the present invention can be used to attract regulatory T cells.
  • the compound is useful as an anti-inhibitory drug that induces regulatory T cells, or as a north for the development thereof. Also, if the method of the present invention is used, is it possible to produce a mammal in a well-controlled manner? It is possible. As a regulator produced by this method, it is useful for preventive treatment of rejection in organ transplantation, allergic diseases, autologous host disease (G V H D), infertility and the like.
  • G V H D autologous host disease
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2 0 0 5— 2 8 9 2 2 4 (issued September 30) filed in Japan, the contents of which are included in this specification.

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Abstract

本発明は、以下の工程を含む、制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物のスクリーニング方法を提供する：（１）被検化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するCD4+Ｔ細胞を培養し、培養物からＴ細胞を単離する工程；（２）工程（１）で単離されたＴ細胞の免疫抑制能を評価する工程；（３）工程（２）における評価の結果、工程（１）で単離されたＴ細胞が免疫抑制能を有する場合に、前記被検化合物を制御性Ｔ細胞を誘導し得る化合物として得る工程。また、本発明は、ラパマイシン化合物の存在下で、ナイーブ表現型を有するCD4+Ｔ細胞を培養し、制御性Ｔ細胞を得ることを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法を提供する。当該方法により製造された制御性Ｔ細胞は免疫調節薬として臓器移植における拒絶反応、アレルギー疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、不妊症等の予防・治療に有用である。

Description

明細書
制御性 T細胞の製造を向上させる薬剤のスクリ一ニンク方法の 制性のマクロライ ト系抗生剤を用いる制御 i生 τ細胞の 技術分野
本発明は、 制御性 T細胞を誘導し得る化合物のスクリーニノ ノン化合物を用いる制御性 T細胞の製造方/去、 免疫調節剤、 免 法、 制御 tt T細胞製造用キノ ト、 制御性 T細胞を誘導するため 背景技術
臓器移植の術後、 拒絶反 i を抑制するために免疫抑制剤か使 か 免疫抑制剤により感染症か菴起されることかしばしはあり、 死亡原因の一番は、 感染症てある。 このように、 現在の移植医 手技は確立されたものの、 拒絶抑制対策と感染症対策とか冶療 み、 この両者を両立させることか緊 の課題となっている。 こ 免疫寛容一すなわち免疫抑制剤を使用せすに移植臓器か十分に とのようなメカニスムて成立するのか、 また免疫寛容をとのよ 誘導するのかについての研究か移植医療の領域ては大きな柱と これは、 移植医療の研究か、 臓器保存や手術/去の改良というレ 瞭に第二層に入ったことを意味するものてある。
近年、 CD25+CD4+制御性 T細胞 (制御性 T細胞を Treg (s)とい る （Int Immunol , 16卷， 1189- 1201頁， 2004) 。 これらのこ 植医療においても、 免疫寛容を積極的に誘導する有効な方/去と 胞の試験管内ての増殖、 S者への移入、すなわち細胞養子免疫療 試験管内て制御性 T細胞を増殖させた場合に、 その制御能か維 とは細胞養子免疫療法を行う うえて、 須てあり （Nat Rev Imm 199-210, 2003) 、 ヒ ト制御性 T細胞を免疫制御能を失うことな 率に増殖させるための幾つかの試行错誤かなされている。
ヒ ト CD25+CD4+制御性 Τ細胞は、 イノヒホて、 内在性の自己抗 容において、 そしてより最近ては臓器移植後の移植免疫寛容、 て 必須な役割を果たしていること、 G V H D (移植片対宿王 予防に有用てあることか報告されている （Annu Rev Immunol ， 2 Nat Rev Immunol ， 2, 389 - 400, 2002、 Nat Rev Immunol ， 3, 199 - 103, 2410-2416, 2004、 Lancet, 363， 608-615, 2004、 Tren 563-565 2004)。 ィノヒホにおいて ヒ ト Tregsは、細胞表面 C F0XP3発現、 細胞内 CTLA-4、 細胞表面 GITR、 TNFRI I, 及ひ自己 する不応答性/免疫抑制能等の特性に加えて、メモリー表現型 特徴付けられる （J I瞧 unol , 167, 1245-1253, 2001、 J Exp Med , 2001、 J Exp Med ， 193， 1295-1302, 2001、 Blood, 98， 2736-2 Immunol ， 32, 1621-1630, 2002, Int Immunol , 16, 1643 - 1656, 2 32, 622-629, 2004) 。 実験的には、 胸腺細胞から CD25+CD4+細 を免疫不全宿王に対して養子移入すると、自己免疫疾患を発症 本発明者らは、 ヒ ト末梢中の CD45RA+CD25+CD4+細胞を IL-2の Cて刺激すると、 該細胞は増殖し、 制御能を獲得し得ることを Transplant ， supplement 11， vol 5， p 257, 2005) 。 この方 T細胞を試験管内て増殖し 誘導することかてきる点て極めて かしなから、 培養に用いる末梢中の CD45RA+CD25+CD4+細胞か、 集団てあるため、 大量の制御性 T細胞を製造しょうとする場合 を行って、 培養開始時における CD45RA+CD25+CD4+細胞の数を増 期に亘る培養を必要とした。
一方、 Roncarolo らは、 マウス CD4+T細胞をラハマイノンの り刺激すると、 CD4+CD25+F0XP3+制御性 T細胞か選択的に増殖す いる （Blood, vol 105, No 12， p 4743-4748, 2005) 。 この中 CD4+CD25+T細胞をラハマイノンの存在下て刺激すると 該細胞 の結果、 抑制能を有し、 高いハーセンテーノの CD4+CD25b"ght+T 集団を生しることか示されている。 一方、 CD4+CD25 T細胞をラ 下て刺激すると、 抑制能を有さない T細胞集団を生し、 F0XP3 いことか示されている。 従って、 Roncarolo らの方/去によれば、 T細胞を増幅することは出来るか、 CD4+CD25— T細胞から制御性 ことはてきない。 該方/去に用いる末梢中の CD4+CD25+細胞は、 比 団てあるため その調製には大量の採血を行う必要かある。
そこて、 採取することか容易なより大きい T細胞集団を用い を効率よく製造する方法や、 制御性 T細胞を効率よく誘導する H A B ker ら， J Antibiot ， 31, 539(1978)、 米囯特許第 3， 92 およひ米国特許第 3， 993， 749号明細書]。 さらに、 ラハマイノ 特許第 4， 885, 171号）、 あるいは、 ヒ ノハニルと組み合わせて（
4, 401,653号）、 抗腫瘍活性を有することか示されている。
ラハマイノンの免疫抑制効果は、 FASEB, 3, 3411(1989)に開 クロスホリノ Aや FK-5 0 6なとの大環状分子か免疫抑制剤と ことも示されており、 移植拒絶反応を予防するのに有用てある Transplant Proc ， 35 (Suppl 3A), 7S-14S, 2003 R Y Cal 1183(1978) ，およひ米囯特許第 5, 100,899号明細書]。 Luo HY ノか、 実験的なアレルキー性脳脊髄炎モテル（すなわち、 多発 ゃァノュハント性関節炎モテル（すなわち、 I曼性関節リゥマチの 有効てあり、 I g E様抗体の形成を効果的に阻害したことを開 ら， Clin Immunol Immunopathol , 61(3) 410-420, 1991) 。
ラハマイノノは、 全身性エリテマトーテス [米国特許第 5， 078 症 [米国特許第 5, 080, 899号]、 イノスリ ノ依存性糖尿病 [米国 号]、 皮膚の障害、 例えば、 乾癣 [米国特許第 5， 286， 730号]、 第 5， 286, 731号]、 血管損傷後の平滑筋細胞増殖およひ内膜肥
5, 288,711号およひ第 5,516,781号] 成人 Τ細胞白血病/リノハ 第 525,960 A1号]、 眼の炎症 [米国特許第 5, 387， 589号]、 悪性 5, 206,018号]、 心臓の炎症性疾患 [米国特許第 5,496,832号]お 許第 5, 561, 138号]を予防または冶療するのにも有用てあること 本発明者らは、 上記目的を達成すへく鋭書研究を進めた。
ます、本発明者らは、ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T細 大量の制御性 T細胞を製造することを試みた。すると、培養期間 獲得される制御性 T細胞の免疫抑制能か徐々に低下してしまう 出された。 そこて、 該問題点を解決すへく、 培養条件の検討を マイノノ化合物の存在下てナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T ば、 免疫抑制能の低下を防く ことか可能てあることを見出した。 ことに、 ラハマイ ンノ化合物を用いれは、 制御性 T細胞へ派生 いと考えられてきたナイーフ表現型を有する CD25_CD4+T細胞か 御性 T細胞か誘導されることか钊明した。 以上の知見等から、 ハマイ ノン化合物を用いれは、 CD25の発現の有 に関わらす 有する CD4+T細胞から制御性 T細胞を製造し得ること そして れば制御性 T細胞を効率よく誘導し得る化合物を探索し得るこ 明を完成するに至った。 即ち、 本発明は以下に関する。
即ち、 本発明は以下に関する。
[ 1 ] 以下の工程を含む、 制御性 T細胞を誘導し得る化合物の 法
( 1 )被検化合物の存在下て、（l) CD45RA+、 ^^DASRO1 又は CD45 及ひ（4) CD38+からなる群から選択される少なく ともいすれかの 有する CD4+T細胞を培養し、 培養物から T細胞を単離する工程
( 2 ) 工程 （ 1 ) て単離された T細胞の免疫抑制能を評価する [5] 該 CD4+T細胞か霊長類由来てある、 [ 1] 記載の方/去。
[6] 該 CD4+T細胞か抗原存在下て培養される、 [ 1] 記載の [7]該 CD4+T細胞か T細胞増殖因子の存在下て培養される、 [ [8] 被検化合物か免疫抑制 I·生化合物又はその誘導体てある、 [9] 以下の工程を含む、 制御性 T細胞の製造効率を増大させ リーニンク方法
( I )被検化合物の存在下て、 (1)CD45RA\ ^ DASRO1 又は CD45 及ひ（4)CD38+からなる群から選択される少なく ともいすれかの 有する CD25+CD4+T細胞を培養し、 制御性 T細胞を得る工程
(2) 工程 （1) て得られた制御性 T細胞の数及ひ/又は免疫 工程
(3) 工程 （2) て評価された制御性 T細胞の数及ひ/又は免 化合物の不在下て、 （l)CD45RA+、 （2)CD45R01<3W+又は CD45R0—、 (3) (4) CD38+からなる群から選択される少なく ともいすれかのナイ る CD25+CD4+T細胞を培養することにより得られた制御性 T細 免疫抑制能と比較する工程
(4) 制御性 T細胞の数及ひ 又は免疫抑制能を増大させた被 性 T細胞の製造効率を増大させ得る化合物として得る工程。
[1 0] 工程 （ 1) 及ひ （3) におけるナイ一フ表現型か CD45 記載の方/去。
[I I]工程（1)及ひ （3) における CD25+CD4+T細胞か霊長類 [ 1 5]ラハマインノ化合物の存在下て、 （l)CD45RA+、 （2) CDASRO (3)CD45R0hlgh+、 及ひ（4)CD38+からなる群から選択される少なく ィーフ表現型を有する CD4+T細胞を培養し、 制御性 T細胞を得 御 ttT細胞の製造方法。
[1 6] 該ナイ一フ表現型か CD45RA+てある、 [ 1 5] 記載の方 [ 1 7] 該 CD4+T細胞か CD25+てある、 [ 1 5] 記載の方/去。
[ 1 8] 該 CD4+T細胞か CD25—てある、 [ 1 5] 記載の方法。
[ 1 9] 該 CD4+T細胞か霊長類由来てある、 [ 1 5] 記載の方 [20] 該 CD4+T細胞か抗原存在下て培養される、 [1 5] 記 [2 1] 該 CD4+T細胞か T細胞増殖因子の存在下て培養される 方法。
[2 2] ラハマイノン化合物か培養開始から早く とも 1週間以 される、 [1 5] 記載の方法。
[2 3]得られうる制御性 T細胞か細胞接触に依存的な免疫抑 7] 記載の方法。
[24] 得られうる制御性 T細胞か細胞接触に非依存的な免疫 [ 1 8] 記載の方法。
[2 5] ラハマイ ノノ化合物かラハマイ ノノてある、 [ 1 5] [2 6] ラハマイ ノノ化合物かェへロリムスてある、 [ 1 5] [2 7] (1)CD45RA\ (2) CD45R01<)W+又は CD45R0—、 （3)CD45R0hlgh+ らなる群から選択される少なく ともいすれかのナイーフ表現型 導方法。
[2 9] [ 1 5] の方/去により得られ得る制御性 T細胞てあって (C) のいずれか 1つの群から選択される少なく ともいすれか する制御 Τ細胞
(A) CD45R0mid\ CD45RAmid\ CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+
(B) CD45RO—、 CD45RAmid+、 CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+
(C) CD45R0" CD45RAhl h\ CD62Lhlgh\ 及ひ CD25low+。
[30] 以下の （B) 又は （C) のいずれかの群から選択され れか 1種の表現型を有する制御性 T細胞
(B) CD45R0—、 CD45RAmld+、 CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+
(C) CD45R0—、 CD45RAhlsh\ CD62Lhlgh\ 及ひ CD25l0W+ o
[3 1] [2 9] 又は [3 0] に記載の制御性 T細胞を有効成分 る、 免疫調節剤。
[3 2] 免疫抑制用てある、 [3 1 ] 記載の剤。
[3 3] 以下の工程を含む、 免疫調節剤の製造方法
( 1 ) ラパマイノン化合物の存在下て （l)CD45RA+、 （2 045Κ (3)CD45R0hlgh+、 及ひ（4) CD38+からなる群から選択される少なく ィーフ表現型を有する CD4+T細胞を培養し、 制御性 T細胞を得
(2) 該制御性 T細胞を医薬として許容される担体と混合し、 する工程。
[34] 該免疫調節剤か免疫抑制用てある [3 3] 記載の方 らなる群から選択される少なく ともいすれかのナイ一プ表現型 胞を培養し、 制御性 T細胞を得ることにより制御性 T細胞を製 御 ttT細胞の免疫抑制能を維持するための剤てあって、 ラハマ 有する、 剤。
[3 8] 該 CD4+T細胞か CD25+てある、 [3 7] 記載の剤。
[3 9] (1)CD45RA\ ϋΑδΚΟ1^又は CD45R(T、 （3)CD45R0hlgh+ らなる群から選択される少なく ともいすれかのナイーフ表現型 胞を調製するための抗体及ひラハマイノン化合物を含む、 制御 ノ 卜。
[4 α]以下の工程を含む、 生体内においてナイーフ表現型を Τ細胞を誘導する方法
( 1) 非ヒ ト哺乳動物に、 肝移植を施す工程
(2) 前記非ヒ ト哺乳動物の末梢組織中に、 ナイーフ表現型を Τ細胞か誘導されたことを確認する工程。
[4 1 ] 以下の工程を含む、 生体内においてナイーフ表現型を Τ細胞数を増大させ得る化合物のスクリーニノク方法
( 1 ) 非ヒ ト哺乳動物に、 肝移植を施す工程
(2) 工程 （ 1 ) の哺乳動物に被検化合物を投与する工程
(3) 工程 （2) の哺乳動物の末楨組織中のナイーフ表現型を Τ細胞の数を評価する工程
(4) 工程 （3) て評価されたナイーフ表現型を有する CD25+CD [4 3] (1)CD45RA\ (2) CD45R01 又は CD45R0—、 （3)CD45R0hlgh+ らなる群から選択される少なく ともいずれかのナイーブ表現型 胞から制御性 T細胞を誘導するための剤を製造するための、 ラ の使用。
[44] (l)CD45RA+、 （2) CD45R0lc)W+又は CD45R0、 （3)CD45R0hlgh+ らなる群から選択される少なく ともいずれかのナイーブ表現型 胞を培養し、 制御性 T細胞を得ることにより制御性 T細胞を製 御性 T細胞の免疫抑制能を維持するための剤を製造するための 合物の使用。
[4 5 J ラハマイ ンノ化合物の存在下て、 ナイーブ表現型を有 培養し、 制御性 T細胞を得ることを含む、 制御性 T細胞の製造
[46] 以下の工程を含む、 免疫調節剤の製造方法
( 1 ) ラハマイ ノン化合物の存在下て、 ナイーフ表現型を有す 養し、 制御性 T細胞を得る工程
(2) 該制御性 T細胞を医薬として許容される担体と混合し、 する工程。
[4 7] ナイーフ表現型を有する CD4+T細胞から制御性 T細胞 剤てあって、 ラハマイ ノノ化合物を含有する、 剤。
[48] ナイーフ表現型を有する CD4+T細胞を培養し、 制御性 により制御性 T細胞を製造する場合に、 制御性 T細胞の免疫抑 めの剤てあって、 ラハマイ ノノ化合物を含有する、 剤。 (2) 工程 （1) て単離された T細胞の免疫抑制能を評価する
(3) 工程 （2) における評価の結果、 工程 （1) て単離され 制能を有する場合に、 前記被検化合物を制御性 Τ細胞を誘導し 得る工程。
[5 1] 以下の工程を含む、 制御性 Τ細胞の製造効率を増大さ クリーニノク方法
( 1 )被検化合物の存在下て、ナイーフ表現型を有する CD25+CD4 制御性 Τ細胞を得る工程
(2) 工程 （1) て得られた制御性 Τ細胞の数及ひ/又は免疫 工程
(3) 工程 （2) て評価された制御性 Τ細胞の数及ひ/又は免 化合物の不在下て、ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T細胞を り得られた制御性 Τ細胞の数及ひ 又は免疫抑制能と比較する
(4) 制御性 Τ細胞の数及ひ 又は免疫抑制能を増大させた被 性 Τ細胞の製造効率を増大させ得る化合物として得る工程。
本発明のスク リーニンク方/去を用いれは、 制御性 Τ細胞を誘 得ることかてきる。 該化合物は 制御性 Τ細胞を誘導するとい 疫抑制薬として、 あるいはその開発のためのノースとして有用 また、 本発明の方法を用いれは ナイーフ表現型を有する CD 御性 Τ細胞を効率よく製造することか可能てある。 ナイ一フ表 Τ細胞は比較的大きな Τ細胞集団てあり、 その調製か容易てあ 0 1は、 CD45RA+CD25+CD4+ T細胞及ひ CD45RA+CD25—CD4+ T細胞 0てある。 （A) CD45RA+CD25+CD4+ T細胞（a)、 CD45RA—CD25hlgh+CD4+ CD45RA 025^ 04+丁細胞（c)、 CD45RA_CD25— CD4+ T細胞（d)、 及ひ T細胞（e)の定義を示す 0てある。 （B)各細胞分画における F0XP すクラフてある。
0 2は、 CD45RA CD25hl h+CD4\ CD45RA+CD25+CD4+、 及ひ CD45RA 画のナイープ/メモリ一及ひ Tregに比較的特異性の高い表現 解析を示す 0てある。 表示された抗原に対する特異的抗体を用 線て示す。 それそれの表現型のためのァイノタイプコン トロー 0 3は、 全 CD4+T細胞の増殖に対する、 単離されたはかりの T細胞（A)及ひ細胞数か 100-150倍程度まて増加した段階て回収 CD45RA+CD25+CD4+T細胞株（ラハマイノン未処理）（B)の抑制効果 棒クラフのレーンを左から順にレーン 1— 7と呼ふ。 レーン 1 PBMC +全 CD4+T細胞、 レーン 2 (45RA+25+) 同種異系 PBMC + CD 細胞、 レーン 3〜 7 同種異系 PBMC+全 CD4+T細胞 + CD45RA+CD は T細胞株） （表示された割合 （全 CD4+T細胞数に対する割合） CD45RA+CD25+CD4+T細胞 （又は T細胞株） か^加されている） 。
0 4は、 CD45RA+CD25+CD4+ T細胞株の機能に対するラハマイ ノ てある。 （A) CD45RA+CD25+CD4+ T細胞株の増殖を示す 0てある。縦 培養開始時の細胞数を 1 としたときの相対値として示し、 横軸 数を示す。 非処理 ラハマイ ノノ不在下て培養。 day 0， 7, 39 ノ不在下て培養。 day 0, 7, 39 培養開始後それそれの日数て、 ^加された。
13 5は、 CD45RA+CD25— CD4+T細胞株の機能に対するラハマイノ てある。 （A) CD45RA+CD25— CD4+T細胞株の増殖を示す 0てある。縦 培養開始時の細胞数を 1 としたときの相対値として示し、 横軸 数を示す。 非処理 ラハマイ ノノ不在下て培養。 day 0， 19 培 の日数て、 ラハマインノか^加された。 （B)全 CD4+T細胞の増 CD45RA+CD25— CD4+T細胞株の効果を示す 0てある。 レ一ノ 1 (CD4 +全 CD4+T細胞 レーン 2 (cel l l ine) 同種異系 PBMC + CD45R 株、 レ ~ノ 3〜 7 同種異系 PBMC +全 CD4+ T細胞 + CD45RA+CD25— 示された割合 （全 CD4+T細胞数に対する割合） の数の CD45RA+C か^加されている） 、 非処理 ラハマイノノ不在下て培養。 da 後それそれの日数て、 ラハマイ ノノか^加された。
0 6は、 CD45RA+CD25+CD4+ T細胞株及ひ CD45RA+CD25 CD4+T細 違を示すフローサイ トメ トリー解析結果てある。 表示された抗 抗体を用いた解析結果を太い実線て示す。 それそれの表現型の プコノ ト口一ルを 線て示す。
0 7は、 全 CD4+T細胞の増殖に対する抑制効果の細胞接触依 てある。 左ハネルは CD45RA+CD25—CD4+T細胞株による抑制効果 CD45RA+CD25+CD4+T細胞株による抑制効果を、それそれ示す。 APC CD4 全 CD4+T細胞、 cel l l ine T細胞株。 四角て囲まれた構 T細胞 レーン 2 ( Ρ ) 同種異系 PBMC +全 CD4+T細胞、 レー 異系 PBMC + CD45RA+CD25+CD4+ T細胞株、 レーン 4〜 8 同種異 細胞 + CD45RA+CD25+CD4+ Τ細胞株（表示された割合（全 CD4+ Τ細 の数の CD45RA+CD25+CD4+T細胞株か^加されている） 。
0 1 0は 全 CD4+T細胞の増殖に対する、 ェへロリムス存在 養された CD45RA+CD25 CD4+T細胞株の効果を示す てある。 レ CD4+T細胞、 レーン 2 ( Ρ ) 同種異系 PBMC +全 CD4+ T細胞、 同種異系 PBMC + CD45RA+CD25— CD4+T細胞株、レーン 4〜 8 同種 T細胞 + CD45RA+CD25— CD4+T細胞株 （表示された割合 （全 CD4+T 合） の数の CD45RA+CD25 CD4+ T細胞株か 加されている） 。
1 1は、 肝移植後の末梢血中の CD45RA+CD25+CD4+T細胞数 すクラフてある。 國 小児、 ♦ 成人。 発明の詳細な説明
( 1 制御性 T細胞の製造方法）
本発明は、 ラハマイノノ化合物の存在下て、 ナイーフ表現型 胞を培養し、 制御性 T細胞を得ることを含む、 制御性 T細胞の るものてある。
制御性 T細胞とは、 反応性 T細胞 （例えは全 CD4+T細胞、 CD と共に培養され、 T細胞受容体を介する刺激を受けたときに、 の活性化 （増殖、 サイ トカイノ産生等） を阻害し得る能力 （免 胞か製造され得る限り特に限定されないか 例えは、 マウス 一、 モルモノ ト等のけつ歯類やゥサキ等の実験動物、 プタ、 ウ ヒノン、 ミノク等の家畜、 ィヌ ネコ等のへノ ト、 ヒ ト、 サル ァカケサル マーモセノ ト、 オラノウ一タノ、 チノハノン一な ることか出来る。 哺乳動物は、 好ましくは霊長類てあり、 より める。 本発明の方/去において使用される該 CD4+ T細胞は、 任意の組 織 （例えは末梢血液、 脾臓、 リノハ節、 腸管、 肝臓等） 骨髄 から調製することかてきる。 調製か容易てあることを考慮すれ は、 好ましくは末梢血液又は脾臓中の細胞てある。
/
本発明の方法において使用される該 CD4+ T細胞は、 ナイーフ 「ナイーブ表現型」 とは、 胸腺から移出し、 抗原刺激を受けて ィーフ T細胞） か有する表現型をいう。 ナイーブ表現型として 胞の場合、 CD45RA陽性（CD45RA+)、 CD45R0弱陽性又は陰性（CD45R CD45RB強陽性 (CD45RBhlgh+) 、 CD62L強陽性 (CD62Lhlgh+) 、 CD3 の表現型を挙げることか出来るか、 これらに限定されない。 本 て使用される該 CD4+T細胞は、例 はヒ トの場合、好ましくは C CD45RBhlsh\ CD62Lhl h\ 及ひ CD38+からなる群から選択される少 ィーフ表現型を有し、 より好ましくはそれら全ての表現型を有 細胞かヒ ト以外の哺乳動物由来てある場合においても、 当該表 てあり得るか、 動物種か生来的に保有していないマーカー分子 用いたフローサイ トメ トリー解析等により行われる。 マーカー 性」 とは、 該マーカー分子か細胞表面上 （或いは細胞内） に発 マーカー分子に対する抗体による特異的結合か確認てきること 「強陽性」 とは、 特に断りのない限り、 比較対昭てある他の細 と比へて、 マーカー分子の発現量か相対的に高い、 マーカー分 細胞集団か相対的に多い、 マーカー分子を発現している細胞集 に多いこと等をいう。 「弱陽性」 とは、 特に断りのない限り、 の細胞 （又は細胞集団） と比へて マ一カー分子の発現量か相 カー分子の発現量の低い細胞集団か相対的に多い、 マーカー分 細胞集団の割合か相対的に少ないこと等をいう。
ナイーフ表現型として、 CD45R0弱陽性 (CD45R0low+)、 CD45RB強 、 CD62L強陽性 （CD62Lhlgh+) と表される場合、 比較対昭の細胞 細胞 （胸腺から移出し、 抗原刺激を受けた後に、 生存している れる。 比較対昭のメモリー T細胞としては CD45RA— CD25hlgh+CD4 0 1 A中 bてケートされた領域に含まれる T細胞等） を挙ける 本発明の方/去に使用されるナイーフ表現型を有する CD4+ T細 の有條により、 CD25+細胞と CD25—細胞とに分類することかてき は、 CD25+細胞てあってもよく、CD25細胞てあってもよく、或いは 細胞の混合物てあってもよい。
このうち、 ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+ T細胞は、 F0XP3 細胞内 CTLA-4陽性 （CTLA- 4+) 、 及ひ TNFRI I+からなる群から選 一方、ナイーフ表現型を有する CD25 CD4+T細胞における F0XP めて弱く、 該発現強度は、 末梢中の制御性 T細胞 （例えは CD45 細胞等） の通常約 1/4以下、 好ましくは約 1/20以下てあり得る 表現型を有する CD25— CD4+T細胞は、 末梢中の制御性 T細胞 （例 CD45RA CD25hlgh+CD4+T細胞等） と比較すると、 細胞内 CTLA - 4及 の発現か極めて弱く、細胞内 CTLA-4の発現レヘルは CD45RA CD2 通常約 1/3以下、好ましくは 1/8以下てあり得、細胞表面 TNFRI CD45RA CD25hlgh+CD4+T細胞の通常約 1/3以下、 好ましくは 1/8 本発明の方法に使用されるナイーフ表現型を有する CD4+T細 されていることか好ましい。 該細胞の単離 精製は、 上述の哺 梢組織 （例えば末梢血液 脾臓、 リノハ節、 腸管、 肝臓等） 、 血等）から、上述の表現型等に基つき 自体公知の方/去により行 例 は、 ヒ トのナイーフ表現型を有する CD4+T細胞を単離 す、 例えは末梢血液等より、 卓核球分画か調製される。 単核球 えば、 r ico丄 1一 Hypaque (Amersham Biosciences- Uppsala)等を用 や、 ァフエレーンス等により行われる。 次に、 蛍光色素や磁気 識された、 目的とする細胞の細胞表面に特異的に発現している ナイーフ表現型のマーカー抗原（CD45RA、 CD45RB, CD62L、 CD38 特異的抗体により単核球分画を染色し、 セルノーターや磁性カ 的とする分画を単離 精製する。 高い精製度を達成するため、 ノータ一か用いられる。 細胞培養は、 リノハ球培養技術において通常用いられている ことかてきる。 例えは、 培養温度は通常約 3 0〜4 0°Cの範囲 は約 3 7°Cか例示される。 C 02濃度は通常約 1〜 1 0 %の範 くは約 5 %か例示される。 湿度は通常約 7 0〜 1 0 0 %の範囲 は約 9 5〜 1 0 0 %か例示される。
本発明の方/去における培養に用いられる培地の基礎培地は、 用いることかてき、 本発明の方法により制御性 T細胞を製造し されないか、 例えは DMEM、 EMEM、 R PM I — 1 6 4 0、 — 1 2、 F— 1 0 M— 1 9 9、 HAM等を挙けることかてき 球培養用等に改変された培地 （例えば ALyS505N等） を用いても 地の混合物を用いてもよい。
当該培地は、 自体公知の^加物を含むことかできる。 ^加物 の方法により制御性 T細胞を製造し得る限り特に限定されない 酸 （例えはヒルヒノ酸ナトリ ウム等） 、 アミノ酸 （例えは L— 還元剤 （例 は 2—メルカプトエタノール等） 、 緩衝剤 （例えは 抗生物質 （例えばス トレブトマイノノ、 へニンリノ、 ケノタマ けられる。 当該^加物は、 それそれ自体公知の濃度範囲内て含 しい。
また、 当該培地は、 血清を含むことかてきる。 血凊としては、 血清てあれは、 本発明の方法により制御性 T細胞を製造し得る 限定されないか 好ましくは上記哺乳動物由来の血清 （例えは 因子としては、 本発明の方/去により制御性 T細胞を製造し得る ないか、 例えは I L— 2 、 I L— 1 5 、 I F N— γ 等を挙ける 地中に^加される Τ細胞増殖因子の濃度は、 本発明の方/去によ 製造し得る範囲において特に限定されないか、 例えは I L— 2 れは、 通常 0 1〜 10000 U/ml、 例えは 1〜5000 U/ml 好ましく 程度の濃度か例示される。
本明細書において、 「物質 Xの存在下ての、 ナイーフ表現型 胞の培養」 とは、 物質 Xの存在時に、 培養物中にナイーブ表現 細胞か含まれる場合のみならす、 物質 Xの存在時に、 培養物中 を有する CD4+T細胞は含まれないか、 ナイ一プ表現型を有する 生した T細胞てあって、 ナイーフ表現型を有する CD4+T細胞と 有する T細胞か含まれる場合をも包含する。
また、 本発明の方/去において、 ナイーブ表現型を有する CD4+ 在下て培養され得る。 抗原存在下て培養することにより、 該抗 性 T細胞か製造され得る。
抗原とは、 培養細胞上の抗原受容体 （例えは T細胞受容体） 容体を介して細胞を刺激し得る物質を包括的に f味する。 抗原 ヘプチト、 タノハク質、 脂質、 糖脂質等の抗原分子のみならす、 細胞、 抗原受容体の構成分子 （CD3、 TCR 、 TCR a 等） や副刺 を認識する作動性抗体 （例えば抗ヒ ト CD3抗体てある 0KT- 3等） なとの抗原ミミ ノクをも含む。 ここて 免疫学的非自己細胞と 例えは、 ある特定の免疫学的非自己細胞に特異的な制御性 T とする場合は、 ナイーブ表現型を有する CD4+T細胞か、 ラハマ 免疫学的非自己細胞の存在下て培養される。 該免疫学的非自己 の方/去、 例えは放射線 （カノマ線等） 昭射ゃ抗癌剤 （マイ トマ 等て不活化されていることか好ましい。 免疫学的非自己細胞の れす、 所望の組織由来の細胞 （例えは末梢血単核球細胞 （P B することか可能てある。 例えは、 同種異系のトナーからの移植 ナー由来細胞に特異的なレンヒエノト制御性 Τ細胞の製造か書 には、 レンヒェノ ト由来のナイーブ表現型を有する CD4+T細胞 化合物及ひトナー由来の細胞の存在下て培養される。 この場合、 細胞は、 移植されうる臓器と同一臓器由来の細胞てあっても、 細胞てあってもよい。
また、 ある特定の抗原分子 （ヘプチト、 タノハク質、 脂質、 的な制御性 Τ細胞を製造しようとする場合は、 ナイーフ表現型 胞か、 ラハマイ ノン化合物及ひ当該抗原分子の存在下て培養さ しては、 例えは、 組織適合抗原なとの細胞及ひ組織由来抗原、 原因抗原又は自己免疫疾 Sの原因抗原 （食品由来抗原、 抗原性 される薬剤若しくは製剤中に共存する物質、 又は人工臓器関連 の変性物 （例えは埶変性物等） ） なとか挙けられる。 組織適合 組織適合抗原 （MH C抗原） や非王要組織適合抗原か挙げられ 原因物質には環境 花粉抗原、 真菌抗原、 食物抗原、 人工抗原 この場合、 該 CD4+T細胞に対する抗原提示を確実に達成する 細胞の存在下て培養か行わ,れてもよい。 抗原提示細胞としては より制御性 T細胞を製造し得る限り特に限定されないか、 通常 れるナイーフ表現型を有する CD4+T細胞と同種同系の抗原提示 CD4+T細胞か由来する個体から得られた抗原提示細胞） か用い 原提示細胞の種類は、 抗原提示能を有し、 本発明の方/去により 造し得る限り特に限定されないか、 例えば PBMC 樹状細胞等か 提示細胞は、 自体公知の方/去、 例えば放射線 （カンマ線等） 昭 トマイ ノノ C等） 処理等て不活化されていることか好ましい。 一方、 培養に供される上記 CD4+T細胞の集団か有している抗 トリーの多様性を保持し、 当該多様性を反映した制御性 T細胞 とする場合には、 該 CD4+T細胞か、 抗原受容体の構成分子 （CD 等） を認識する作動性抗体 （例 は抗ヒ ト CD3抗体てある 0KT- 子 （CD28等） を認識する作動性抗体 （例えば抗ヒ ト CD28抗体） なとの抗原ミ ミ ノクによる刺激下て培養される （Blood, 104, p Blood, 104, p 453-61, 2004) 。 当該抗原ミ ミ ノクは複数種類 ことも可能てあり 例えは CD3を認識する作動性抗体と、 CD28 抗体との組み合わせ等か用いられ得る。 当該抗原ミ ミ ノクを使 様性を有する制御性 T細胞集団を製造することか出来る。
また、 複数種類の抗原を組合せて用いることも可能てあり、 自己細胞と抗原受容体の構成分子を認識する作動性抗体との組 制御性 T細胞の免疫抑制能の低下か抑制され、 制御性 Τ細胞の レヘルて維持され、 或いは制御性 Τ細胞の免疫抑制能か増強さ ここて、 ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T細胞を、 ラハマ 在下て培養することによつても制御性 Τ細胞を得ることかてき Transplant ， supplement 11, vol 5, p 257, 2005) 、 ラノヽマ いることにより、 特に、 高倍率の細胞増殖に伴い起こり得る制 抑制能の低下か抑制され 制御性 T細胞の免疫抑制能か高いレ 或いは制御性 T細胞の免疫抑制能を増強することかてきる。
一方、 ナイーブ表現型を有する CD25— CD4+ T細胞を、 ラハマイ 下て培養しても、 制御性 T細胞を得ることは困難てあるか、 ラ を用いることにより ナイーブ表現型を有する CD25 CD4+T細胞 生した T細胞に免疫抑制能か誘導され、 誘導された制御性 T細 高いレヘルて維持され、 或いは制御性 T細胞の免疫抑制能か増 本明細書において、 「ラハマイ ノノ化合物」 なる用語は、 基 ノ核（以下に示す）を含有する免疫抑制性化合物の部類を定義す 類ともいう） 。 ラハマイ ノノ化合物としては、 依 として免疫 から、 ラハマイノン核の誘導体として化学的または生物学的に よい化合物か挙けられる。 従って、 「ラハマイ ンノ化合物」 な ィノンのエステノレ、エーテノレ、ォキノム、 ヒ トラノノおよひヒ ト ならひにラハマイノノ核上の官能基か、 例 ば、 還元または酸 ているラハマイ ノノ化合物を包含する。 また、 「ラハマイ ンノ
Figure imgf000025_0001
ラ /《マイシン
ラノ マイノンのエステルおよひエーテルはラハマイノン核の ί
たは 3 1位におけるヒ トロキノル基に関するもの、 （2 7 -ケト 後の） 2 7位におけるヒ ト口キンル基のエステノレおよひエーテノ ひに、 ォキノム、 ヒ トラノンおょひヒ ト口キノルァミンは（4 2 の酸化後の） 4 2位におけるケトンに関するもの、 およひラハマ ケトノに関するものてあることか好ましい。
ラハマイノンの好ましい 4 2 -およひ/または 3 1 -エステルお 以下の特許（これらは出典を示すことによりすへて本明細書の一 されている アルキルエステル（米囯特許第 4， 316， 885号） ア テル（米国特許第 4, 650, 803号） フノ素化エステル（来囯特許第 アミ トエステル（米国特許第 5， 118, 677号） カルハメートエス 5, 118, 678号） ノリルエーテル（米囯特許第 5， 120, 842号） ア (未囯特許第 5,262,423号） カルハメ一ト（未囯特許第 5， 302， 5 ノエステル（米国特許第 5, 362, 718号） ， ヒノタート エステル 5, 385, 908号） ヘテロ環式エステル（米囯特許第 5,385,909号） テル（米国特許第 5， 385, 910号） ァミノアル力ノエステル（米国 号） ホスホリルカルハメートエステル（米囯特許第 5, 391， 730 エステル（米国特許第 5,411,967号） カルハメートエステル（ 5,434, 260号） アミメノカルハメートエステル（米囯特許第 5， 4 ハメートエステル（未囯特許第 5,480,988号） カルハメートエス 5, 480, 989号） 力ルハメートエステル（米囯特許第 5, 489, 680 N -ォキノトエステル（未囯特許第 5, 491, 231号） ， ヒォチノエス 5,504, 091号） 0-アルキルエーテル（米囯特許第 5,665,772号 ィンノの P EGエステノレ（米囯特許第 5,780,462号）。 これらの —テルの製造は 上記の特許に開示されている。
特表平 8— 5 0 2 2 6 6号 （米国特許第 5, 665, 772号） には、 表される好適なラハマイノノ化合物か開示されている。
Figure imgf000026_0001
R1およひ R2は、 それそれ独立して H、 アルキル、 チォアルキ キノレ、 ヒ トロキノァノレキノレ、 ノヒ トロキノァノレキノレ、 ヒ トロキ ノレアノレキノレ、 ノヒ トロキノアルキルァリールアルキル、 アルコ ノルォキノアルキル、 アミノアルキル、 アルキルアミノアルキ ルホニルァミノアルキル、 ァノルアミノアルキル、 ァリールス キル、 ァリル、 ノヒ トロキノアルキルァリル、 ノォキノラニル ルコキノアルキルおよひ （R3) 3S 1 (式中、 R3はそれそれ独立 ェチル、 イノプロヒル、 t一プチルおよひフエニルから選択さ から選択されるものてある ここて、 "アルコ （alk -） " また (alkyl) " の語は 分枝鎖または直鎖 C アルキル、 好ましく を書味し、 その炭素鎖は所望によりエーテル （一 O— ) 架橋に てもよい およひ R4はメチルまたは R4と R1か一緒になつて C2 成する
但し、 R1およひ R2は両方ともに Hてはない およひ R1か （R ルホアルコキノアルキルてある場合、 Xおよひ Yは両方ともに 式 （ I I ) の化合物は、 好ましくは Xおよひ Yか両方 0、 R2 ルおよひ R1か H 外てある 4 2—O—置換ラハマイノンてある R1はヒ ト口キノアルキル、 ヒ ト口キノアルコキンアルキル、 ア ルおよひァミノアルキルから選択されたものてある 特に 4 2 口キノ） ェチノレ一ラハマイノノ、 4 2— O— (3—ヒ トロキノ） マイノン、 4 2— O— [2— （2—ヒ トロキノ） エトキノ] ェ
Figure imgf000028_0001
〔式中、 R 1およひ R 2は、 独立して、 以下から選択され
Figure imgf000028_0002
(2 フエ二ノレ，
(3 置換されたフエニルてあつて、 該置換基か X、 Y及ひ Zて (4 1—又は 2—ナフチル
(5 置換された 1一又は 2—ナフチルてあつて、該置換基か X、 (6 ヒフエ二ノレ
(7 置換されたヒフエニルてあつて、 該置換基か X、 Y及ひ Z (8 C i— i 0アルキノレ
(9 置換された
Figure imgf000028_0003
アルキルてあって、 1以上の置換基か る
a) ヒ トロキノ、 (g) — NR6R7、 て R 6及ひ R 7は独立して以下から選択 (i) 水素、
(11) 非置換又は以下から選択される 1 上の置換基により アルキル
(a，） 非置換又は X、 Y及ひ Zにより置換されたフエニ
(b — OH、
(c C 6アルコキノ
(d 一 C02H、
(e — co2— アルキル、
(f — C3— 7ノクロアルキル、 及ひ
(g，） -OR1 \
(in) 非置換又は以下から選択される 1以上の置換基によ0アルケニル
(a') 非置換又は X、 Y及ひ Zにより置換されたフエニ (b 一 OH、
(c C — 6ァノレコキン、
(d — C〇2H、
e ) — co2— C^— 6アルキル、
(f ) —C 3— 7ノクロアルキル、 及ひ
(g，） -OR11,
(iv)又は R 6及ひ R 7及ひそれらか付着した Nは、 非置換又 — NR6C02—〇 — 6アルキル— R 7
J) 一 NR6CONR6R7、
k) — OCONR6R7、
1) 一 COOR6、
m) 一 CHO、
n) フエ二ノレ、
o) 置換されたフエニルてあつて、 該置換基か X、 Y及ひ Z p) フエニノレ才キノ、
q) 置換されたフエニルォキノてあって、 該置換基か X、 Y r) —又は 2—ナフチル、
s) 置換された 1一又は 2—ナフチルてあつて、 該置換基か t) ヒ フエ二ノレ、
u) 置換されたヒフエニルてあつて、 該置換基か X、 Y及ひ V) -OR1 \ 及ひ
w) — S (O) p— (^— 6アルキル
(10) C3— 10アルケニル，
(1 ) 置換された C3_10アルケニルてあつて、 1 上の置換基 れる
a) ヒ トロキノ、
b) ォキノ、 (h) — NR6CO— C i_6アルキルてあって、 R6は上て定義 (1) — COOR6てあつて R6は上て定義された通りてある
(j) 一 CHO、
(k) フエ二ノレ、
(1) 置換されたフエニルてあつて、 該置換基か X、 Y及ひ Z (m) 1—又は 2—ナフチル、
(n) 置換された 1—又は 2—ナフチルてあつて、 該置換基か る、
(0) ヒフエ二ノレ、
(p) 置換されたヒフエニルてあつて、 該置換基か X Y及ひ
(q) -OR1 \ 及ひ
(r) - S (O) p— ^— 6アルキル
(12) Cs— i。アルキニノレ
(13) 置換された C3_10アルキニルてあつて、 以上の置換基 れる
(a ヒ トロキノ、
(b ォキノ、
(c C卜 6アルコキノ、
(d フェニル一 C — 3ァノレコキノ、
(e 置換されたフエ二ルー ( ^ 3アルコキノてあって、 フエ
Y及ひ Zてある、 (1) 置換されたフエニルてあつて、 該置換基か X、 Y及ひ Z (m) 1—又は 2—ナフチル、
(n) 置換された 1一又は 2—ナフチルてあつて、 該置換基か る、
(0) ヒフエニル、
(p) 置換されたヒフエニルてあつて、 該置換基か X、 Y及ひ
(q) -OR11
たたし、 R1及ひ R2は同時には水素てなく ，
R1 1は以下から選択され
(a) - PO (OH) O一 M+、 ここて M+は正の電荷を有する イオンてある、
(b) — S03- M+、
(c) —CO (CH2) qC02— M+、 ここて qは 1— 3てある
(d) — CO— C^— eアルキル一 NR6R7、 ここて R 6及ひ R 7 通りてあり、 アルキルは舰置換てあるか又は 下から選択され により置換されている
(I) ヒ トロキノ、
(II) C — 6アルコキノ、
(in) — NR16R17、ここて R16及ひ R17は独立して以 (a') 水素、 及ひ
(b，） C — 6アルキル、 (a) 水素
(b) C^— 7アルキル、
(c) C 2— 6アルケニル、
(d) ノヽロケノ、
(e) ― (CH2) m— NR6R7、 ここて R 6及ひ R 7は上て定 り、 mは 0から 2てある、
(f) 一 CN、
(g) 一 CHO、
(h) — CF3、
(l) — SR8、 ここて R 8は水素、 — 6アルキル、 トリフル はフエニルてある、
(j) — SOR8、 ここて R8は上て定義された通りてある、
(k) — S02R8、 ここて R8は上て定義された通りてある、
(1) — CONR6R7、 ここて R6及ひ R7は上て定義された通
(m) R90 (CH2) m―、 ここて R9は水素、 Ci— 3アルキル、
2— 3アルキル、 トリフルォロメチル、 フエニル又はナフチルて 義された通りてある、
(n) -CH (OR12) (OR13) 、 ここて R 12及ひ R 13は あるか、 又は合わさってェチル又はプロヒルフリ ノノを形成す (o)
Figure imgf000033_0001
o
0 II
R9OC(CH2)m— ここて R9及ひ mは上て定義された通りてある、 及ひ
(q) -OR11
または、 隣接した X、 Y及ひ Zのいすれか 2つか結合すること ノレァニノレ、 ノヒ トロフラニノレ、 ノヒ トロヒラニノレ、 及ひノォキ から選択される環を形成することかてきる。 ]
特表平 9— 5 1 20 18 (米国特許第 5， 362, 718号） には、 される好適なラハマインノ化合物、 あるいは医薬上許容される されている。
Figure imgf000034_0001
[式中、 R1およひ R2は、 各々独立して、 水素または- CO(C 素数 3〜8のノクロアルキル環 （所望により、 -（CR3R4)fOR 換、 もしくは三置換されている） を形成していてもよい
R7は、 水素、 炭素数 1〜6のアルキル、 炭素数 2〜 7のァルケ 7のアルキニル、 -（C R3R4)fOR1()、 -C F3、 -F、 または- CC R8およひ R9は、 各々独立して、 水素、 炭素数 1〜6のアルキ のァルケニル、 炭素数 2〜7のアルキニル、 -(CR3R4)fOR10、 たは- C02Ruてある力 、 あるいは、 R8およひ R9は、 一緒にな 素数 3〜8のノクロアルキル環 （所望により、 -（CR3R4)fOR 換、 もしくは三置換されている） を形成していてもよい
R1()は、 水素、 炭素数 1〜6のアルキル、 炭素数 2〜 7のァル ί
〜 7のアルキニル、 トリ- (炭素数 1〜6のアルキル）ノリノレ ト のアルキル） ノリルェチル、 トルフエニルメチル、 ヘンノル、 ルコキノメチル、 トリ -（炭素数 1〜 6のアルキル）ノリルェトキ ェチル、 またはテ トラヒ トロヒラニル
R11は、 水素、 炭素数 1〜6のアルキル、 炭素数 2〜 7のアル 〜 7のアルキニル または炭素数 7〜 10のフエニルアルキル Xは、 5-(2， 2-ノ -（炭素数 1〜6のアルキル）） [1， 3] ンォ -スヒロ（炭素数 3〜 8のノクロアルキル）） [1, 3] ノォキサニ ノ-（炭素数 1〜6のアルキル）） [ 1, 3] ノォキサニル、 4 _( 2 〜8のンクロアルキル）） [1, 3] ンォキサニル、 4-(2， 2-ノ アルキル）） [ 1, 3] ノォキサラニル、 または 4 -(2-スヒロ（炭 さらに R1または R2のいすれかか少なく とも 1つの -（CR3R たは -（C R3R4)f OR10て置換された炭素数 3〜8のノクロアル る。 ]
式 （ I V) において、 炭素数 1〜6のアルキル、 炭素数 2〜 およひ厌素数 2〜 7のアルキニルという用語は、 直鎖およひ分 すれをも含むものとする。 式 （ I V) の化合物は 1個以上の- ( を含有するのて、 R3、 R\ f 、 およひ R1()は同一または異なる 同様に、 他の包括的な置換基に関する説明か同一の構造につい 合、それらは同一または異なるものてあり得る。 R1か、一緒にな Xは 5-(2， 2-ン -（炭素数 1 ^6のアルキル）） [ 1, 3] ノォキ る R8およひ R9を含有し Xのアルキル基か 1個の炭素原子を = 0てある化合物の場合、 R1は次の構造を有する。
-
Figure imgf000036_0001
同様に、 R1力、、 一緒になつて X [ここて、 Xは 4 -（2-スヒロ ノクロアルキル）） [1 , 3] ノォキサニル] を形成する R8およ のノクロアルキル基か 6個の炭素原子を有し、かつ、 d = 0てあ R1は次の構造を有する。
一 CO(CR3R4) らの基は、 元来、 生物活性てあるたけてなく、 遊離ヒ トロキノ の中間体てある。 R1()は、 トリ- (炭素数 1〜6のアルキル）ノリ 1〜 6のアルキル）ンリルェチル、 トリフエニルメチル、 へノン のアルコキノメチル、 トリ-（炭素数 1〜6のアルキル）ノリルェ ロロェチル、 およひテトラヒ トロヒラニル基を包含する。 他の は、 当業者に公知てあり、 式 （ I V) の化合物の一部てあると 式 （ I V) の化合物のうち、 好ましいメ ノハーは、 R2か水 か水素、 b = 0、 かつ、 d = 0てあるもの R2か水素、 b = 0 R8およひ R9か、 各々独立して、 水素、 アルキル または-（C るか、 あるいは、 一緒になつて、 Xを形成するものてある。 式 のうち、特に好ましいメノハーとしては、 3-ヒ トロキノ- 2- (ヒ 2-メチルプロヒオノ酸とのラハマイノン 42-エステルを挙け 従って、 ラハマイ ノノ化合物の例としては、 上記特許のいす れている、 式
Figure imgf000037_0001
ラハマイノンの好ましい 2 7 -エステルおよひエーテルは、 5， 256， 790号（これは出典を示すことにより本明細書の一部をな いる。これらのエステルおよひエーテルの製造は、上記の特許に ラハマイノンの好ましいォキノム、 ヒ トラノンおょひヒ トロ 米囯特許第 5， 373, 014号、 第 5, 378, 836号、 第 5， 023， 264号お 号（これらは出典を示すことにより本明細書の一部をなす）に開 れらのォキノム、 ヒ トラノンおょひヒ トロキノルァミノの製造 開示されている。 4 2 -ォキノラハマイ ノノの製造は、 第 5, 023 典を示すことにより本明細書の一部をなす）に開示されている。
特に好ましいラハマイ ノノ化合物としては、 ラハマイ ノノ [
3， 929, 992号]、 3 -ヒ トロキノ- 2 - (ヒ トロキノメチル）- 2 -メ とのラハマイノノ 4 2 -エステノレ [未囯特許第 5， 362， 718号]およ ヒ トロキノ）ェチル—ラハマイノン [未囯特許第 5, 665, 772号] ( 挙げられる。
適用可能なとき、 医薬上許容される塩は ラハマイノン化合 部分を含有する場合には、 有機酸およひ 機酸、 例 は、 酢酸、 乳酸、 クエノ酸、 酒石酸、 コハク酸、 フマル酸、 マレイノ酸 ル酸、 リ ノコ酸、 フタル酸、 塩酸、 臭化水素酸、 リ ノ酸、 硝酸、 ノレホン酸 ナフタレノスノレホン酸、 へノセノスルホノ酸、 トル カノファースルホノ酸、 およひ同様に公知の許容される酸から きる。 塩は、 ラハマイ ノノ化合物か適当な酸部分を含有する場 培地中に^加されるラハマイノン化合物の濃度は、 本発明の
T細胞の製造を達成し得る限り特に限定されないか、 通常約 1 しくは約 5〜 2 5 nMてある。
ラハマインノ化合物を培地に^加する時期は、 本発明の方法 胞の製造を達成し得る限り特に限定されす、 培養開始時からラ を^加してもよく、 また培養の途中からラハマイノン化合物を しかしなから、 培養開始時からラハマイ ンノ化合物を^加する 型を有する CD4+T細胞 （特に CD25+CD4+T細胞） 又は該細胞か の増殖か抑制され、 培養後に得られる制御性 T細胞の数か低下 て、 培養の途中からラハマイ ノノ化合物を^加することか好ま ラハマイ ノノ化合物は、 培養開始から例えば早く とも 1週間以 1 5日以降に培地中に^加される。 特に、 ナイーフ表現型を有 胞を用いる場合には、 ラハマイ ノノ化合物は、 培養開始から 3 に 加されることかより好ましい。 また、 ラハマイ ノノ化合物 例えば遅く とも 1 0 0 日まてに、 好ましくは 7 0日まてに、 よ 日まてに、 培地中に^加されることか好ましい。
また、 ラハマイ ノノ化合物の存在下て培養か行われる期間は、 より制御性 T細胞の製造を達成し得る限り特に限定されないか、 〜 1 0 0 日、 例 ば 3〜 7 0 日、 好ましくは 5〜 5 0日、 より 5 日てある。 該期間か短すきると、 ナイーフ表現型を有する CD 胞から派生した T細胞に免疫抑制能を誘導する、 或いは制御性 イ ノノ化合物を^加しないことを除き、 上述と同様てあり得る 原の不在下て、 T細胞か培養される。 抗原不在下て培養するこ の増殖を一端止めることかてきる。 また、 更なる培養の期間は いか、 通常 1〜 2 0日、 例えば 1〜 1 0日 好ましくは 1〜3 なる培養により、 細胞中に混入したラハマイ ノノ化合物をより とかてきる。
上述の様に培養することにより、ナイーブ表現型を有する CD4 3 0日間以上もの長期間に渡り、 数として 1 0 0 0倍以上にも 培養の結果、 培養物中に制御性 τ細胞か獲得される。
即ち、後述の実施例に示される様に、本発明の方法により獲得 反応性 T細胞と共に培養され、 T細胞受容体を介する刺激を受 反応性 τ細胞の活性化を阻害し得る能力 （免疫抑制能） を有す される細胞は、 不応答性の特性をも有し得る。
重要なことに、本発明の方法において、ナイーフ表現型を有す 抗原存在下て培養された場合、 獲得され得る制御性 T細胞は、 た抗原に特異的てあり得る。
ここて、 本発明の方法において、 ナイーフ表現型を有する CD 用した場合、 得られうる制御性 T細胞は、 細胞接触に依存的な る。 即ち この場合、 得られうる細胞は、 反応性 T細胞との細 る条件て 当該反応性 T細胞と共に培養され、 T細胞受容体を たときに、 当該反応性 T細胞の活性化を阻害し得る能力を有す 獲得された細胞か、 制御性 T細胞としての機能を有している もよい。 例えば、 獲得された細胞か反応性 T細胞 （例 ば全 CD 培養され、 抗原により刺激され 反] ΪΓ性 T細胞の活性化か測定 細胞の活性化の指掙と しては、 通常、 細胞増殖 （例 ば [3H] み） やサイ トカイノ （IL- 2、 IL-4、 IFN y 等） 産生か用いられ 反応性 T細胞の活性化か抑制された場合には、 獲得された細胞 しての機能を有していると判断することか出来る。
このとき、 獲得された細胞か有する免疫抑制能か、 細胞接触 確認してもよい。 例えば、 以下の 2つの条件 （A) 細胞接触か 及ひ （B ) 細胞接触か阻害された条件て、 獲得された細胞か反 は全 CD4+T細胞） と共に培養され、 抗原により刺激され、 反応 か測定される。 （B ) の条件は、 例えは、 チヤンハーを、 液性 力、、細胞は通過てきない程度の大きさの孔を有する膜により上 ランスゥエル） 、 その一方に反応性 T細胞を、 他方に獲得され 双方の細胞を抗原により刺激することにより、 作製することか 果、 （A ) の条件のみて、 反応性 T細胞の活性化か抑制された れた細胞は細胞接触に依存的な免疫抑制能を有していると判断 また、 （A) 及ひ （B ) の両方の条件て、 反応性 T細胞の活性 合には、 獲得された細胞は細胞接触に非依存的な免疫抑制能を することかてきる。
また、 刺激に用いられる抗原として、 制御性 T細胞の製造過 本発明の方/去により製造され得る制御性 T細胞は、 末梢中て る制御性 Τ細胞 （例えは、 末梢血中 CD45RA— CD25hlgh+CD4+T細胞 高い CD45RB発現レヘルを有し得る （CD45RBhlgh+) 。 例えは、 蛍 抗体を用いたフローサイ トメ トリー解析において、 末梢血中 CD T細胞の CD45RB発現として、アイノタイプコノトロール抗体を 5〜 1 0 0倍 （例えは約 5 0倍） の蛍光強度を与 得る条件に 方/去により製造され得る制御性 T細胞の CD45RB発現レヘルは CD45RA— CD25hlgh+CD4+T細胞の通常約 1 5〜 2 0倍 （好ましくは は約 4倍） ） 程度て有り得る。 なお、 フローサイ トメ トリー ヘルの J 較は、 縦軸に細胞数を、 横軸に発現強度 （蛍光強度） のヒス トクラムのヒータにおける発現強度を比較することによ 即ち 本発明の方/去により製造され得る制御性 T細胞は、 GI CD45RBhlgh+からなる群から選択される少なく ともいずれか 1種 より好ましくは 3種） の表現型を有し得る。
また、 本発明の方法により製造され得る制御性 T細胞の表現 本発明の方/去に使用されるナイーブ表現型を有する CD4+ T細胞 CD25の発現の有舰等） ゃラハマイノノ化合物を培地へ^加する わり得る。
例えは、 本発明の方法により製造され得る制御性 T細胞は CD てあり得るか、その発現強度は、本発明の方法に CD25+ T細胞を CD25— T細胞を使用する場合とて異なる。 1 0 0倍） の蛍光強度を与え得る条件において、 本発明の方法 表現型を有する CD25+CD4+T細胞を使用した場合に製造され得る CD25発現レヘルは末梢血中 CD45RA CD25hlgh+CD4+T細胞の通常約 ましくは約 1 / 3〜 3倍 （例 ば約 0 8倍） ） 程度て有り得 一方、本発明の方/去においてナイーフ表現型を有する CD25 CD た場合、 得られ得る制御性 T細胞は、 末梢中て天 に存在して (例えは、 末梢血中 CD45RA— CD25hlgh+CD4+T細胞等） より低い CD2 し得る （CD25lQW+) 。 例えは、 上述と同様の条件において、 本発 ナイーブ表現型を有する CD25 CD4+T細胞を使用した場合に製造 T細胞の CD25発現レヘルは、末 ¾血中 CD45RA_CD25hlgh+CD4+T細 5〜 1 2倍 （好ましくは約 l Z l 0〜： L Z 3倍 （例えは約 1 有り得る。
本発明の方法により製造され得る制御性 T細胞の CD62L発現 方法に CD25+ T細胞を使用する場合と、 CD25— T細胞を使用する 即ち、本発明の方/去においてナイーフ表現型を有する CD25+CD た場合、 得られ得る制御性 T細胞は、 末梢中て天然に存在して (例えば、 末梢血中 CD45RA— CD25hlgh+CD4+T細胞等） より低い CD 有し得る （CD62L1 とする） 。 例えは、 蛍光桴識抗 CD62L抗体 ィ トメ トリー解析において、 末梢血中 CD45RA CD25hlgh+CD4+T細 して、 ァイノタイプコノトロール抗体を用いたときの約 1 0 0 は約 3 0 0倍） の蛍光強度を与え得る条件において、 本発明の (例 ば 末梢血中 CD45RA CD25hlgh+CD4+T細胞等） とほぼ同等 ルを有し得る （CD62Lhlgh+とする） 。 例えは、 上述と同様の条件 の方法においてナイーフ表現型を有する CD25— CD4+ T細胞を使用 され得る制御性 T細胞の CD62L発現レヘルは末梢血中 CD45RA— C の通常約 1 6〜 3倍 （好ましくは約 1ノ4〜2倍 （例えは約 て有り得る。
本発明の方法により製造され得る制御性 T細胞は CD45RA陽 り得る力、、その発現強度は、本発明の方/去に CD25+ T細胞を使用 T細胞を使用する場合とて異なる。
即ち、本発明の方法においてナイーフ表現型を有する CD25+CD た場合、 得られ得る制御性 T細胞は、 使用されたナイーフ表現 CD25+CD4+T細胞 （例えは末梢血中 CD45RA+CD25+CD4+ T細胞） より レヘルを有し得る （CD45RAmid+とする） 。 例えは、 蛍光桴識抗 CD たフローサイ トメ トリー解析において、 末梢血中 CD45RA+CD25+C CD45RA発現として、 ァイノタイプコノトロール抗体を用いたと 0 0 0倍 （例えば約 6 0 0倍） の蛍光強度を与え得る条件にお 法においてナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T細胞を使用した 得る制御性 T細胞の CD45RA発現レヘルは末梢血中 CD45RA+CD25+ 約 1 2 0〜 1 2倍 （好ましくは約 1 1 0〜 1 3倍 （例 程度てあり得る。
一方、本発明の方法においてナイーフ表現型を有する CD25 CD 法においてナイーブ表現型を有する CD25— CD4+T細胞を使用した 得る制御性 T細胞の CD45RA発現レヘルは末梢血中 CD45RA+CD25— 約 1 6〜6倍（好ましくは約 1 / 3〜3倍（例 ば約 1倍） ) なお、 末梢血中 CD45RA+CD25+CD4+T細胞の CD45RA発現レヘルは CD45RA+CD25— CD4+ T細胞のそれとほぼ同等てある （0 1 A ) 。
本発明の方法により製造され得る制御性 T細胞の CD45R0発 方法に CD25+T細胞を使用する場合と CD25— T細胞を使用する 即ち、本発明の方法にナイーフ表現型を有する CD25— CD4+ T細 得られ得る制御性 T細胞の CD45R0発現は、実質的に陰性てあり 一方、本発明の方法にナイーブ表現型を有する CD25+CD4+ T細 ラハマイノン化合物を培地へ^加する時期や培養期間等に応し 度か変わり得る。
即ち、 本発明の方/去において、 ナイーフ表現型を有する CD25+ 養開始時から、 比較的長期間 （例 ば、 5 0日間以上） 、 ラハ 存在下て培養した場合、得られ得る制御性 T細胞の CD45R0発現 てあり得る （CD45R0 ) 。
一方、 ラハマイ ノノ化合物を培養の途中 （例えば培養開始か 培地へ 加し、 ラハマイノン化合物存在下ての培養期間か比較 5〜 1 5 日間程度） 場合には、 得られ得る制御性 T細胞の CD45 プ表現型を有する CD25+CD4+ T細胞（例 は末梢血中 CD45RA+CD2 使用した場合に製造され得る制御性 T細胞の CD45R0発現レヘル CD45RA— CD25hlgh+CD4+T細胞の通常約 1 200〜 1 20倍 （ 1 00〜 1 3 0倍 （例えは約 1 50倍） ） 程度て有り得る。 即ち、 本発明の方法により得られ得る制御性 T細胞は、 以下 のいずれか 1つの群から選択される少なく とも 1種 （好ましく しくは 3種、 更に好ましくは 4種） の表現型を有し得る
(A) CD45R0 d+、 CD45RAmid+、 CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+
(B) CD45R0—、 CD45RAraid+、 CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+
(C) CD45R0、 CD45RAhlgh+、 CD62Lhlgh+、 及ひ。0251(^+。
ここて 本発明の方法においてナイーブ表現型を有する CD25+ した場合に製造され得る制御性 T細胞は、 上記 （A) 又は （B) の群から選択される少なく とも 1種 （好ましくは 2種、 より好 に好ましくは 4種） の表現型を有し得る。 一方、 本発明の方/去 表現型を有する CD25 D4+T細胞を使用した場合に製造され得る 上記 （C) の群から選択される少なく ともいすれか 1種 （好ま 好ましくは 3種、 更に好ましくは 4種） の表現型を有し得る。
また、 本発明は下記の （A) 〜 （C) のいすれか 1つの群か く とも 1種 （好ましくは 2種、 より好ましくは 3種、 更に好ま 現型を有する制御性 T細胞を提供するものてある
(A) CD45R0mld\ CD45RAmid\ CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+
(B) CD45R0—、 CD45RAmid+、 CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+ ( 2 制御性 T細胞を含有してなる免疫調節剤） 本発明の方法により製造され得る制御性 Τ細胞は、 強力な免 のて、 何らかの原因により生体內て免疫反応か異常に亢進して て望ましくない免疫反応か起こっている場合、 あるいは望まし 起こることか ^来的に予測される場合等に、 S者に該制御性 Τ と等によって、 ¾者の体内における異常に亢進した免疫反応を ない免疫反応を抑制し、あるいは望ましくない免疫反応を回避 例; は、 同種異系のトナーからの臓器移植に先立ち、 ます、 のナイーブ表現型を有する CD4+T細胞を、 ラハマイノン化合物 細胞の存在下て培養することて、 当該トナー由来細胞に特異的 製造する。 そして、 当該制御性 Τ細胞を移植の前後にレンヒェ とて、 移植片に対する免疫寛容を誘導し、 移植片に対する拒絶 植片の生着を促進することか出来る。 従って、 本発明の免疫調 抑制剤による副作用、 細菌 ウィルス感染、 特に C型肝炎 ft者 C型肝炎再発を回避し得る。
また、 自己免疫疾 ¾の¾者において 当該 ¾者由来のナイー CD4+T細胞を、 ラハマイノン化合物及ひ当該自己免疫疾崈の原 培養することて、 当該原因抗原に特異的な制御性 Τ細胞を製造 該制御性 Τ細胞を S者に投与することて、自己免疫反応を抑制 更に、 アレルキー疾 ¾の¾者において、 当該 S者由来のナイ る CD4+T細胞を、 ラハマイノン化合物及ひァレルキーの原因抗 或いは、 当該ハートナー由来抗原を保持する胎児に対する免疫 児に対する拒絶反応を回避し、 妊娠の維持を促進することかて 即ち、 本発明は、 上記方法により製造され得る制御 tt T細胞 含有してなる、 免疫調節剤を提供する。 該剤は免疫抑制用てあ 免疫調節剤は、 臓器移植における拒絶反 )ΐ：、 アレルキー疾¾ ( ルギ一、 薬剤アレルキー、 喘き、 ァ トヒー性皮膚炎、 湿疹、 食物 アレルキー性鼻炎、 アレルキ一性結膜炎） 、 自己免疫疾 S (多 ユウマチ、 全身性エリテマトーノス、 全身性硬化症、 水ほう症 一ノス 乾癣症、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 自己免疫性肝炎 1型糖尿病等） 、 移植片対宿王病 （G V H D ) 、 不妊症等の予 める。 、
本発明の免疫調節剤は、 常套手段に従って、 有効量の上記制 として許容される担体と混合する等して、 経ロ 非経口製剤と か出来る。 本発明の免疫調節剤は、 通常は、 住射剤、 濁剤、 製剤として製造される。 当該非経口製剤に含まれ得る担体とし 理食塩水、フ トゥ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えは、 D D—マノニトール、 塩化ナトリウムなと） なとの庄射用の水性 出耒る。 本発明の免疫調節剤は、 例えは、 緩衝剤 （例えは、 リ 酸ナトリ ウム緩衝液） 、 痛化剤 （例えば、 塩化へノサルコニ イノなと） 、 安定剤 （例えば、 ヒ ト血清アルプミノ、 ポリエチ と） 、 保存剤、 酸化防止剤なとと配合してもよい。 与するのか好都合てある。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たり 与することかてきる。
( 3 制御 tt T細胞製造用キノ ト） また、 本発明は、 ナイーブ表現型を有する CD4+ T細胞を調製 ひラハマイ ノノ化合物を含む、 制御性 T細胞製造用キノ トを提 蛍光色素や磁気ヒース等により標識されていてもよい。 該抗体 プ表現型を有する CD4+T細胞に特異的に発現している抗原に対 (例 ば抗 CD4抗体、 抗 CD45RA抗体、 抗 CD45RB抗体、 抗 CD62 等抗体等） を挙けることかてきる。 ナイーブ表現型を有する CD CD25+細胞又は CD25—細胞を更に単離 精製するために、 上記抗
/
体か更に含まれ得る。 当該キノ トは、 更に上述の方法において の試薬 （抗原、 T細胞増殖因子、 培地、 培地のための^加物、 本発明の制御性 T細胞の製造方法のプロ トコールか記載された むことか出来る。 当該キノ トを用いれは、 上述の方/去に従い、 胞を製造することか可能てある。
( 4 制御性 T細胞を誘導するための剤）
また、 上述のように、 本発明の制御性 T細胞の製造方法にお ノ化合物を用いることにより、 ナイーブ表現型を有する CD4+ T ら派生した T細胞に免疫抑制能か誘導され、 制御性 T細胞を獲 る。 従って、 本発明は、 ナイーブ表現型を有する CD4+T細胞か 誘導するための剤てあって、 ラハマインノ化合物を含有する剤 助薬 （例えば、 D—ノルヒ トール、 D—マノニトール、 塩化ナ 含む等張液等） 、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液 酢酸ナト 安定剤 （例えは、 ヒ ト血凊アルフミノ、 ポリエチレンクリコー 酸化防止剤、 賦形剤、 防腐剤、 結合剤、 溶解補助剤、 非イオン 挙けることかてきる。 本発明の剤は、 等張な水溶液、 粉末等の 製造方/去に用いる培地に^加されるなとして用いられる。
また、 ラハマイ ノノ化合物は、 自体公知の方法により医茶と 体内においてナイーフ表現型を有する CD4+T細胞から制御性 T めに用いることもてきる。 ラハマイ ノノ化合物を含有する医薬 としてラハマイ ノノ化合物単独て、 あるいは任意の他の冶療の の混合物として含有することかてきる。 また、 それら医某製剤 薬として許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合 分野においてよく知られている任 fの方/去により製造される。
投与経路は、 冶療に際し最も効果的なものを使用するのか望 は、 例えは静脈内等の非経口を挙げることかてきる。 投与形態 散剤、 顆粒剤 ノロ ノブ剤、 注射剤等かある。 経口投与に適当 プ剤のような液体調製物は、 水、 糖、 ノルヒ ノ ト、 果糖等の ノクリコール、 プロヒ レノクリコーノレ等のクリコール類、 こま 大豆油等の油類、 P-ヒ トロキン安き香酸エステル類等の防腐剤、 レーハー、へハーミノト等のフレーハー類等を使用して製造て 散剤およひ顆拉剤等は、 乳糖、 フ トウ糖、 声糖、 マノニノ ト等 たは塩水とフ トゥ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて庄射 る。 また、 これら非経口剤には、 経口剤て例示した希釈剤、 防 壊剤、 滑沢剤、 結合剤、 界面活性剤、 可塑剤等から選択される 以上の補助成分を^加することもてきる。
ラハマイノノ化合物の投与量およひ投与回数は、投与形態、 ¾ 冶療すへき症状の性質もしくは重篤度により異なるか、 通常、 経口投与の場合、 成人一人当り （体重 6 0 K gとして） 、 約 0 日一回ないし数回投与する。 また、 経口投与の場合、 成人一人 gとして）、約 2〜 1 5 m gを一日一回ないし数回投与する。他 6 0 k g当たりに換算した量を投与することかてきる。 しかし 与量およひ投与回数に関しては、 前述の種々の条件により変動 ( 5 制御性 T細胞の免疫抑制能を維持するための剤）
また、 上述のように、 本発明の制御性 T細胞の製造方法にお ノ化合物を用いることにより、 高倍率の細胞増殖に伴い起こり の免疫抑制能の低下を抑制し、制御性 T細胞の免疫抑制能を高い 或いは制御性 T細胞の免疫抑制能を増強することかてきる。 従 ラハマイノン化合物を含有する、 ナイーフ表現型を有する CD4+ 制御性 T細胞を得ることにより制御性 T細胞を製造する場合に、 免疫抑制能を維持するための剤てあって、 ラハマイ ノノ化合物 提供するものてある。 該 CD4+T細胞は、 CD25+又は CD25_てあり は CD25+てある。 ここて、 「制御性 T細胞の免疫抑制能の維持」 明の剤は、 等張な水溶液、 粉末等の状態て 本発明の製造方法 加されるなとして用いられる。
( 6 制御性 T細胞を誘導し得る化合物のスクリ一ニノク方法） 本発明は、 以下の工程を含む、 制御性 T細胞を誘導し得る化 ノク方法を提供するものてある
( 1 ) 被検化合物の存在下て、 ナイーフ表現型を有する CD4+T 養物から T細胞を単離する工程
( 2 ) 工程 （ 1 ) て得られた T細胞の免疫抑制能を評価する工
( 3 ) 工程 （2 ) における評価の結果、 工程 （ 1 ) て単離され 制能を有する場合に、 前記被検化合物を制御性 T細胞を誘導し 得る工程。
本発明のスク リーニンク方法においては、 ます、 被検化合物 ープ表現型を有する CD4+T細胞を培養し、 培養物から T細胞か 1 ) 。 該 CD4+T細胞は、 CD25+又は CD25-てあり得るか、 好まし 被検化合物は、 いかなる公知化合物及ひ新規化合物てあっても 酸、 糖質、 脂質、 蛋白質、 ヘプチト、 有機低分子化合物、 コノ ス トリー技術を用いて作製された化合物ライフラリー、 固相合 スプレイ/去により作製されたラノタムへプチトライフラリー、 動植物、 海洋生物等由未の天妖成分等か挙げられる。
上述の様に、 本発明の制御性 T細胞の製造方/去において、 ラ を用いることにより、 ナイーフ表現型を有する CD4+T細胞又は 物 （ラハマイ ノノ化合物、 F K 5 0 6、 サイクロスホリ ノ A等 化合物となり得る。 マクロライ ト系化合物とは、 1 4〜 1 6員 有する化合物をいう。 また、 免疫抑制 化合物を化学的に修飾 置の基を、 他の基により置換することにより得られる誘導体も 物となり得る。
工程 1における培養条件は、 ラハマイ ノン化合物不在下てあ 除き、 上記 （ 1 制御性 T細胞の製造方法） の項に記載された 次に、 工程 1て得られた T細胞の免疫抑制能か評価される （ の免疫抑制能は、 例 ば、 細胞接触か許容される条件て、 T細 (例えば全 CD4+T細胞） と共に /培養され、 抗原により刺激され 活性化を抑制する程度を測定することにより評価される。 反応 の指掙としては、 通常、 細胞増殖 （例えば [ ] タイミノンの 力イノ （Iい 2、 IL-4 IFN y 等） 産生か用いられる。 刺激に用 て、 工程 1の T細胞の製造過程て使用された抗原と同一の抗原 る抗原を用いることか可能てある。
次に、 工程 2における評価の結果、 工程 1て得られた T細胞 する場合に、 前記被検化合物か制御性 T細胞を誘導し得る化合 る （工程 3 ) 。 本発明のスクリーニンク方法により得られる化 明の制御性 T細胞の製造方/去において、 ラハマインノ化合物に 細胞を誘導することか可能てあるのて、 制御性 T細胞を用いる て有用てあり、 またナイーフ表現型を有する CD4+T細胞から制 ( 1 )被検化合物の存在下て、ナイーフ表現型を有する CD25+CD4 制御性 T細胞を得る工程
( 2 ) 工程 （ 1 ) て得られた制御性 T細胞の数及ひ 又は免疫 工程
( 3 ) 工程 （2 ) て評価された制御性 T細胞の数及ひ Z又は免 化合物の不在下て、ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T細胞を り得られた制御性 T細胞の数及ひ Z又は免疫抑制能と比較する ( 4 ) 制御性 T細胞の数及ひノ又は免疫抑制能を増大させた被 性 T細胞の製造効率を増大させ得る化合物として得る工程。 、 「制御性 T細胞の製造効率の増大」 とは、 制御性 T細胞の製 れ得る制御性 T細胞の数及ひ/又は得られ得る制御性 T細胞の させることを意味する。
本発明のスクリーニノク方 /去においては、 ます 被検化合物 ーフ表現型を有する CD25+CD4+T細胞を培養し、培養物から制御 れる （工程 1 ) 。 被検化合物としては、 上記 （6 制御性 T細 合物のスクリ一ニンク方/去） と同様のものを挙けることかてき 上述の様に、 本発明の制御性 T細胞の製造方法において、 ラ を用いることにより、 高倍率の細胞増殖に伴い起こり得る制御 制能の低下を抑制し、 制御性 T細胞の免疫抑制能を高いレヘル 制御性 T細胞の免疫抑制能を増強することかてきる。 従って、 物と同様の免疫抑制性化合物は、 好適な被検化合物となり得る。 置の基を、 他の基により置換することにより得られる誘導体も、 物となり得る。
工程 1における細胞培養条件は、 ラハマイノノ化合物不在下 とを除き、 上記 （ 1 制御性 T細胞の製造方法） の項に記載さ 次に、 工程 1て得られた制御性 T細胞の数及ひ/又は免疫抑 (工程 2 ) 。 制御性 T細胞の数は自体公知の方法により測定す また、 制御性 T細胞の免疫抑制能は、 例えは、 細胞接触か許容 御性 T細胞か反応性 T細胞 （例えば全 CD4+T細胞） と共に培養 刺激され、 反応性 T細胞の活性化を抑制する程度を測定するこ る。 反応性 T細胞の活性化の指稃と しては、 通常、 細胞増殖 （ ミ ノノの取込み） やサイ トカイノ （IL-2、 IL-4 IFN y 等） 産 刺激に用いられる抗原として、 制御性 T細胞の製造過程て使用 の抗原ゃ該抗原とは異なる抗原を用いることか可能てある。
次に、 工程 2て評価された制御性 T細胞の数及ひ/又は免疫 合物の不在下て、ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T細胞を培 得られた制御性 T細胞の数及ひ /又は免疫抑制能と比較される ひ Z又は免疫抑制能の比較は、 好ましくは有意差の有無に基つ 検化合物の不在下て得られた制御性 T細胞の数及ひ 又は免疫 合物の存在下て得られた制御性 T細胞の数及ひ 又は免疫抑制 事前に測定した値てあっても、同時に測定した値てあってもよ 再現性の観点から、 同時に測定した値てあることか好ましい。 ( 8 ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T細胞の誘導方法） 本発明は、 以下の工程を含む、 生体内においてナイーブ表現 CD25+CD4+T細胞を誘導する方法を提供するものてある ( 1 ) 哺乳動物に、 肝移植を施す工程
( 2 ) 前記哺乳動物の末梢組織中に、 ナイーブ表現型を有する C 誘導されたことを確認する工程。 本発明の誘導方法に用いられる哺乳動物としては、 上述の哺 とか出来る。 該哺乳動物の齢は特に限定されす、 該哺乳動物は り得るか、 若齢てあるほうかより多数の CD25+CD4+T細胞を誘導 該哺乳動物は小児てあることか好ましい。 小児とは性成熟して
/
体とは性成熟した個体を、 それそれいう。 ヒ トては一般に、 18 児、 18才より年上の個体か成体てある。 、 本発明の誘導方法においては、 まず哺乳動物に肝移植か施さ 移植される肝臓の遺伝型は、 特に限定されす、 免疫学的自己 （ は免疫学的非自己 （即ち同種異系又は異種異系） てあり得るか、 学的非自己てあり、 より好ましくは同種異系てある。
肝移植には、 同所性肝移植 (orthotopic l iver transplanta 移植 (heterotopic l iver transplantation) と力、含まれる力、、 肝移植てある。 同所性肝移植は 宿王の肝臓を全て摘出した後 を本来の解剖学的位置に再建する方/去てある。 異所性肝移植は、 存し、腹腔内に移植肝を本来の肝臓の位置とは異なる部位に移 次に、 肝移植を受けた哺乳動物の末梢組織中に、 ナイ一フ表
CD25+CD4+T細胞か誘導されたことか確認される （工程 2) 。 通常 は末梢血等） 中のナイーブ表現型を有する CD25+CD4+T細胞の 測定し、 該細胞数 （又は割合） を肝移植前の該細胞数 （又は割 の数か増加したことか確認される。ナイーフ表現型を有する CD2 (又は割合） の検出は、 例えば、 ナイ一ブ表現型を有する CD25+ 型に基つき、 該表現型を検出し得る特異的抗体等を使用し フ 一等により行われる。
上記本発明の制御性 T細胞の製造方法における原材枓てある 有する CD25+CD4+T細胞を、上記方法により大量に誘導すること 上記制御性 T細胞の製造において、 少量のサンプル （末梢血等） 御性 T細胞を誘導することか可能となる。
(9 ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+T細胞数を増大させ得 一ニンク方法）
本発明は、 以下の工程を含む、 生体内においてナイーフ表現
CD25+CD4+ T細胞数を増大させ得る化合物のスクリーニンク方法 てある
(1) 非ヒ ト哺乳動物に 肝移植を施す工程
(2) 工程 （1) の哺乳動物に被検化合物を投与する工程
(3) 工程 （2) の哺乳動物の末梢組織中のナイーフ表現型を
T細胞の数を評価する工程 本発明のスクリーニンク方法に用いられる哺乳動物としては、 ィーフ表現型を有する CD25+CD4+ T細胞の誘導方法） と同様のも 出来る。
本発明のスクリーニンク方法においては、ます哺乳動物に肝 程 1 ) 。 肝移植の態様は、 上述の （8 ナイーフ表現型を有す の誘導方法） と同様てある。 次に、 肝移植された哺乳動物に被検化合物か投与される （工 合物としては、 上記 （6 制御性 T細胞を誘導し得る化合物の /去） と同様のものを挙けることかてきる。
次に、工程 2の哺乳動物の末梢中のナイーフ表現型を有する
/
数か評価される （工程 3 ) 。 通常は、 末梢組織 （例えは末梢血 表現型を有する CD25+CD4+ T細胞の数 （又は割合） を/ ij定し 該 を肝移植前の該細胞数 （又は割合） と比較し、 その数か増加し る。ナイーフ表現型を有する CD25+CD4+ T細胞の数（又は割合）の ナイーブ表現型を有する CD25+CD4+T細胞の表現型に基つき、該 る特異的抗体等を使用し、 フローサイ トメ トリー等により行わ は肝移植から 1〜 3月後か好ましい。
次に、 工程 3て評価されたナイーフ表現型を有する CD25+CD4+ 植を施され、 被検化合物か投与されていない哺乳動物の末梢中 を有する CD25+CD4+T細胞の数と比較される （工程 4 ) 。 細胞数 くは有 差の有 toに基ついて行われる。 被検化合物を投与され —フ表現型を有する CD25+CD4+T細胞の誘導を増強し得る。 該化 記本発明の制御性 T細胞の製造方/去における原材枓てあるナイ る CD25+CD4+T細胞を大量に誘導することか可能となるのて 上 製造において、 少量のサンプル （末梢血等） から、 大量の制御 ることか可能となる。 以下、 実施例を示して本発明をより具体的に説明するか、 本 実施例によって何ら限定されるものてはない。
実施例
[実施例 1 ]
/
〔 1〕 材枓及ひ方法 (細胞調製）
健常ホランティア （ヒ ト） から静脈血か獲得された。 末梢血 M Cリ 刀、 Ficol l— Hypaque (Amersham Biosciences— Uppsala)密 単離された。 細胞は、 ァロフィコノアニノ （APC) 抱合抗 CD4モ (mAb) 、 フィコエリスリノ （PE) 抱合抗 CD25 mAb、 及ひフノレ チオノアナート （FITC) 抱合抗 CD45RA mAbにより、 3 0分間、 色された後に、以下の 6つの異なる細胞分画か、 BD FACSAriaセ Dickinson) を用いて単離された （0 1 A参昭） 。 (a) CD45RA+CD25+CD4+T細胞
(b) CD45RA CD25hlgh+CD4+T細胞 全ての mAbsは Becton Dickinsonから購入された。 それそれ 9 8 %てあつた。 機能ァノ ィをするための細胞分離のために レートに結合した細胞を除去した後に、 抗 CD4 mAbマイクロヒ ノーテインク （MACS) ノステム磁性カラム （Mi ltenyi Biotec 積極 （positively) 単離された。 CD4+細胞の純度は〉 9 5 %て (FACS解析）
対象者由来の PBMC、或いは増殖された T細胞株か、 3 0分間、 多様な抗体とイノキュ^ ^一トされ、 冼净され、 BD FACSAriaセ FACSDiVA ノフ トウエア （Becton Dickinson) を用いて解析され 体は perCP抱合抗 CD4 mAb、 ヒォチノ抱合抗 CD25 mAb、 FITC抱 PE抱合抗 CD45RB mAb、 抗 CD45R0 mAb、 抗 CD62L mAb、 抗 CD38 m 及ひ抗 TNFRI I mAbてある。 CTLA-4の細胞内染色を行うために、 面染色、 固定、 及ひ Cytofix/Cytoperm溶液 (Becton Dickinson 理の後に、 PE抱合抗 CTLA- 4により細胞内染色された。
全ての mAb、 ス 卜レプ卜ァヒンノ一APCは、 Beckton Dickins 又は Genzyme/Techneより購入された。
(細胞培養）
上述の様に分離された CD45RA+CD25+CD4+ T細胞又は CD45RA+CD 1( 4 細胞 Zwel l ) 力、、 96 ゥェル丸底培養プレートに、 1ゥヱ 増殖培地 （2%ヒ ト ΑΒ型血清か補充された AlyS505N (Cel l Scie Institute社製） ） 中て、 ヒ ト IL-2 (1000 U/ml, Cel l Scienc 気的に除去され、 細胞かラハマイノンの不在下て 100 U/mlの I された。 3回の冼净後、 細胞は機能ァノセィのために使用され (抑制ァノセィ）
表示された数の、 ヒ ト末梢血から単離されたはかりの CD45RA 増殖された CD45RA+CD25+CD4+T細胞株、又は増殖された CD45RA+ か、 単独て、 又は自家のレスホンタ一 CD4+T細胞 （5 X 1( 4 個 放射線昭射 (40Gy) された同種異系の PBMC (1 x 10"5 個 /wel 96ウェルマイク口プレート中、 増殖培地中て、 刺激された。 ノキュへートされ、 最後の 1 6時間の間に [ ] タイミノノ （2 へ された。その後細胞か回収され [ ]タイミノノ取込か 1450 i
(Wallac)により測定された。
(定量的 RT-PCR)
全 RNAか、 CD4+T細胞分画から、 Isogen試薬 (Nippon Gen 造者提供の指示書に従い抽出され、 そして、 10mMDTT、 0 5 mM RT緩衝液、 40 ngランタムプライマー p(dN)6、 6U リホヌクレ 一、及ひ 40UM-MLV逆転写酵素 （Invitrogen)を含む、 20μ 1 反 て 1時間ィノキュへ一トし、 引き続き 70。Cて 10分間加埶する Aか合成された。 F0XP3 mRNAの発現レヘルは、 ABI/PRISM7700 ノステム (Applied Biosystems) 及ひ QuantiTect Probe PCR k 用いて、 リアルタイム P CRにより定量された。 F0XP3特異的 部蛍光 Taqmanプロ一フカ、、既述のようにテサイノされた （Int I F0XP3の発現レヘルか： U下の 6つの異なる細胞分画について
(a) CD45RA+CD25+CD4+T細胞
(b) CD45RA— CD25hlgh+CD4+ T細胞
(c) CD45RA— CD251<)W+CD4+ T細胞
(d) CD45RA- CD25— CD4+T細胞
(e) CD45RA+CD25— CD4+T細胞、 及ひ
(f) 全 CD4+ T細胞
これらの細胞は セルノーターを用いて、 0 1 Aに示された PBMCから単離された。 CD45RA CD25hlgh+CD4+ (b)及ひ CD45RA+CD25+ 画か、 CD45RA—〇025^ 04+ ( 、 CD45RA"CD25"CD4+ (d) , CD45RA+CD 全 CD4+ (f) T細胞分画と比較してより高い F0XP3 レヘルを発現 CD45RA+CD25+CD4+細胞分画は、 Tregsからは異なるものと考えら わらす、 CD45RA— CD25hlgh+CD4+細胞分画のそれより さえも高い F0 していた。 CD45RA+CD25— CD4+ T細胞分画ては、 F0XP3遺伝子の発 られす、 制御性 T細胞の混入はないと考えられた。 異なった個 の試験か行われ、 同様の結果か得られた。
(CD45RA+CD25+CD4+ T細胞及ひ CD45RA+CD25_CD4+ T細胞の表現型 CD45RA+CD25+CD4+ (a) CD45RA CD25hlgh+CD4+ (b)、 及ひ CD45RA+C (0 1 Α参昭） か、 ナイーフ メモリー細胞表現型、 並ひに細 胞表面 TNFRI Iについて調へられた（0 2 )。CD45RA+CD25— CD4+ T CD45RBhlgh+、 CD62Lhlgh\ 及ひ CD38+てあり、 典型的なナイーフ表 CD45RBhlgh\ CD62Lhl6h\ 及ひ CD38+てあり、 該表現型は CD45RA+C それと同等てあった。 CD45RA+CD25 CD4+T細胞は、 細胞内 CTLA- とんと示さなかった。 この細胞分画とは異なり、 CD45RA CD25hlg CD45RA+CD25+CD4+ T細胞は、 制御性 T細胞に特異的な細胞内 CTL を示した。 なお、 CD45RA CD25hlgh+CD4+T細胞の CD25発現強度は 体使用時における蛍光強度の約 1 0 0倍、 CD45RA+CD25+CD4+T 強度は、 コン ト ロール抗体使用時における蛍光強度の約 6 0 0 つた個体からの 2回以上の試験か行われ、 同様の結果か得られ (増殖された CD45RA+CD25+CD4+T細胞の機能的特性） 末梢から単離されたはかりの CD45RA+CD25+CD4+T細胞は、 ァ
/
よる刺激に対する CD4+ T細胞の増殖をわすかに抑制した （0 3
0 4 Aに示すように、 CD45RA+CD25+CD4+T細胞は IL- 2の存 に抗 CD3/CD28抗体抱合ヒースによる刺激により、 高い効率て増 細胞数は培養開始から 5 0日て約 3 0 0 0倍にまて増加した。 倍程度まて増加した後、 ヒースを除去し、 100 U/mlの IL- 2の 養することにより得られた CD45RA+CD25+CD4+T細胞株は、 ァロ る刺激に対する CD4+T細胞の増殖を強力に抑制した （0 3 B ) さらに増殖を続けると、 該 T細胞株の増殖抑制機能か減弱した イノノ未処理） 。 ここて、 ラハマイノンを培養開始時より ^加することにより、 T細胞の増殖は抑制され、 培養物中の細胞数は培養開始から 5 CD45RA+CD25+CD4+T細胞をラハマイノン非存在下て増殖させた マイ ノンを^加した場合における ラハマイ ノノの CD45RA+CD2 増殖及ひ CD4+T細胞増殖抑制機能に対する効果を検討した。 ラ 開始 7日後又は 3 9 日後に^加すると、 CD45RA+CD25+CD4+T細胞 マイ ノノ^加時から抑制された （0 4 A、 day7, day39) 。 ラハ 始 7日後に^加すると、 培養物中の細胞数は培養開始から 5 0 か増加しなかった。 一方、 ラハマイ ノノを培養開始から 3 9 日 培養物中の細胞数は培養開始から 5 0日て約 7 0 0倍にまて増 から 5 0 日後に、 上述と同様に、 培養物からヒース及ひラハマ 培養物中の CD45RA+CD25+CD4+T細胞株を 100 U/mlの IL- 2の存 培養し、得られた CD45RA+CD25+CD4+T細胞株の増殖抑制機能を調 該 T細胞株は、 ァロ抗原提示細胞による刺激に対する CD4+T細 抑制した （0 4 B、 day7, day39) 。
以上の結果から、 ラハマインノ化合物を^加することにより、 T細胞株を、 その免疫抑制能を高いレヘルて維持しなから増殖 となることか示された。 また、 ラハマイ ノノ化合物を培養の初 加するよりも、 培養の後期 （day39) に^加するほうか 十分な 御能の維持か達成されることか示唆された。
(増殖された CD45RA+CD25— CD4+ T細胞の機能的特性）
CD45RA+CD25— CD4+T細胞は、 IL-2の存在下、 抗 CD3/CD28抗体 により、 約 3 5 日間て、 1 0 0 0倍以上の数に増殖した （0 5 dayO) 。 ラハマインノ存在下て約 3 5 日間培養後、 培養物から ィノンを除去し、 100 U/mlの IL-2の存在下て更に 2日間培養 られた T細胞株は、 ァロ抗原提示細胞による刺激に対する CD4+ 力に抑制した （0 5 B、 dayO) 。
CD45RA+CD25— CD4+T細胞をラハマインノ非存在下て増殖させた ハマイノンを^加した場合における、 T細胞株増殖及ひ CD4+T に対するラハマインノの効果を検討した。 ラハマイノンを培養 カロしても、 T細胞株の増殖に影響をほとんと与 なかった （0 養開始から約 3 5 日後に、 上述と同様に、 培養物からヒース及 除去し、 100 U/mlの IL-2の存在下て更に 2日間培養すること 細胞株は ァロ抗原提示細胞による刺激に対する CD4+T細胞の した （0 5 B、 dayl9) 。
以上の結果から、 ラハマインノ化合物の存在下て、 ナイーフ CD25 CD4+T細胞を培養することにより、 制御性 T細胞を誘導し た。 また、 ラハマイノノ化合物を用いれは、 CD25の発現の有彼 ーフ表現型を有する CD4+T細胞から制御性 T細胞を製造し得る
[実施例 2 ]
〔 1〕 方法
(細胞培養）
実施例 1 と同様に分離されたヒ ト末棹血中 CD45RA+CD25+CD4+ 地の半分か IL-2を含有する新鮮な増殖培地と交換された。 必要 分けられ、繰り返し抗 CD3/CD28抗体抱合ヒースて、 1 0〜 1 4 た。 培養開始から 5 0 日後に細胞か回収され、 FACS解析のため (FACS解析）
1 殖された T細胞株か、 3 0分間、 4 °C、 暗中にて、 多様な ートされ、 冼净され、 BD FACSAriaセルノーター及ひ FACSDiVA
(Becton Dicki nson) を用いて解析された。 使用された抗体及 施例 1 と同一てある。
〔2〕 結果
フローサイ トメ トリー解析結果を 6に示す。
ヒ ト末梢血中 CD45RA+CD25+CD4+T細胞を用い、 ラハマイ ノノ に^加した場合に得られる T細胞株は、 ヒ ト末梢血中に天^に 性 T細胞 （末梢血中 CD45RA— CD25hlgh+CD4+T細胞） と同様に GITR 該 T細胞株の CD45RB発現は末梢血中 CD45RA— CD25hlgh+CD4+ T細胞 (約 4倍） （CD45RBhlgh+) 。 該 T細胞株の CD25発現は末梢血中 C T細胞とほぼ同等てあり （約 0 8倍） （CD25hlgh+) 、 CD62L発 CD45RA CD25hlgh+CD4+ T細胞よりも低かった （約 1 6倍) (CD6 株の CD45RA及ひ CD45R0の発現強度は、 培養開始時における CD 細胞のそれらと、 末梢血中 CD45RA CD25hlgh+CD4+T細胞のそれら 示した （CD45RAmid+CD45R0mid+) 。 CD45RA発現は末梢血中 CD45RA+ 約 1 / 6倍てあり、 CD45R0発現は末梢血中 CD45RA CD25hlgh+CD4+ ヒ ト末梢血中 CD45RA+CD25— CD4+T細胞を用い、 ラハマイノノ に^加した場合に得られる T細胞株は、 末梢血中 CD45RA+CD25+ た場合と同様に、 GITR+CTLA4+CD45RBhlgh+の表現型を有していた。 発現は末梢血中 CD45RA-CD25hlgh+CD4+T細胞より低く （約 1 5 CD62L発現は末梢血中 CD45RA— CD25hlgh+CD4+T細胞のそれとほぼ 1 / 3倍） (CD62Lhlgh+) 。 該 T細胞株の CD45RA発現強度は、 る CD45RA+CD25— CD4+T細胞のそれとほぼ同等てあった （約 1倍） 該 T細胞株は CD45R0陰性てあった （CD45R0— ) 。
以上より、 本発明の方/去により製造され得る制御性 T細胞は 存在している制御性 T細胞 （末梢血中 CD45RA CD25hlgh+CD4+T細 現型を有しており、 また、 その表現型は、 本発明の方/去に使用 現型を有する CD4+T細胞の種類 （例えは、 CD25の発現の有 等 を培地へ^加する時期に応して変わり得ることか示された。 [実施例 3]
〔 1〕 方法
(細胞培養）
実施例 1 と同様に分離されたヒ ト末 血中 CD45RA+CD25+CD4+ CD45RA+CD25— CD4+T細胞 (5 x 10 4 細胞 /well) か、 96ゥエル に、 1 ゥエルあたり 200 / 1の増殖培地 (2%ヒ ト AB型血凊か補 (Cell Science & Technology Institute社製） ） 中て、 ヒ ト IL-2 (混合リノハ球反応 (MLR) )
実施例 1 と同様に末梢血全 CD4+T細胞か分離された。 0に示 された T細胞株か、 5 X 1 04個の単離された末梢血全 CD4+T 個の放射線昭射 （40Gy) された同種異系の PBMCと 10 ng/ml (0KT-3) と共に、 丸底 9 6ウェルマイク口プレート中、 1 0 % 培地中て、 それそれ、 刺激された。 トラノスゥエル試験のため の単離されたばかりの全 CD4+T細胞と 1 X 1 06個の T細胞株 全 CD4+T細胞と T細胞株か同種異系 PBMC ( 3 X 1 06個） と共 と上に分離培養された。 培養物は 4 日間イノキュへートされ、 間に [3H] タイミノノてラヘルされた。 培養物か回収され、 [ f
込か 1450 Microbeta TriLux (Wallac)により測定された。
〔2〕 結果
T細胞株と全 CD4+T細胞とか接触し得る条件において、 CD45R 株及ひ CD45RA+CD25— CD4+T細胞株は、 共に、 全 CD4+T細胞の増 た （07) 。 しかし、 トラノスゥエルにより T細胞株と全 CD4+ 阻害すると、 CD45RA+CD25+CD4+T細胞株による全 CD4+T細胞の増 れたか、 CD45RA+CD25— CD4+T細胞株は引き続き全 CD4+T細胞の 従って、 本発明の方法において、 ナイーフ表現型を有する CD 用したときに得られる制御性 T細胞は、 細胞接触に依存して免 る力、、ナイーフ表現型を有する CD25 CD4+ T細胞を使用したとき T細胞は、 細胞接触に非依存的に免疫抑制能を発揮することか 社製） ) 中て、 ヒ 卜 IL-2 ( 1000 U/ml, Cel l Science & Techno 社製）の存在下、 1 x l(T5 細胞 /wel lの放射線昭射（40Gy)され て刺激された。
ェへロ リムス （100 nM又は 1000 nM ノハルティスファ一マ 始時から培地に^加された。 ェへロリムスは以下のように精製 0 25mg錠剤 （ノハルテイスファーマ社製） を粉砕し、 アセ トン れから、 溶液をろ過し、 ろ過液を回転苤発させて、 沈殿物を真 れた抽出物を DMFに溶解し、 HPLCて分離 （column C18 4 μ πι, た。 分離後のェへロリムスを凍結乾燥し、 精製した。
3〜4 日毎に、培地の半分か IL - 2を含有する新鮮な増殖培地 要てあれは、 細胞か分けられ、 繰り返し放射線昭射（40Gy)され て、 1 0〜 1 4 日毎に再刺激された。 培養開始から 5 0曰後に 機能ァノセィのために使用された。
(抑制ァノセィ）
表示された数の、 増殖された CD45RA+CD25+CD4+T細胞株、 又
CD45RA+CD25— CD4+T細胞株か、 単独て、 又は自家のレスポノター 1(Γ4 個 /wel l) と共に 培養に用いた同種異系の PBMCと同し 放射線昭射 （40Gy) された PBMC ( 1 χ 1(Γ5 個 Zwel l) により、 マイクロプレート中、 増殖培地中て、 刺激された。 培養物は 7 トされ、 最後の 1 6時間の間に [ ] タイミ ンノ (2 Ci/wel l) その後細胞か回収され、 [ ] タイミノノ取込か 1450 Microbet た CD45RA+CD25+CD4+T細胞株は、 コントロールと比較して、 より 提示細胞による刺激に対する CD4+T細胞の増殖を抑制した （0 以上より、 ラハマイノンと同様に、 ェへロリムスを^加する CD45RA+CD25+CD4+T細胞株を、その免疫抑制能を高いレヘルて維 せることか可能となることか示された。
(CD45RA+CD25— CD4+T細胞株の機能に対するェへロリムスの効果 驚くへきことに、 ェへロリムス （ΙΟΟηΜ又は ΙΟΟΟηΜ) を^加 CD45RA+CD25 CD4+T細胞の増殖か増強された （0 8 B ) 。 ェへロ より得られた CD45RA+CD25— CD4+T細胞株は、 ァロ抗原提示細胞 る CD4+T細胞の増殖を弱く抑制した （0 1 0、 コントロール） 。 ムス存在下ての培養により得られた CD45RA+CD25— CD4+T細胞株 と比較して、 より強力にァロ抗原提示細胞による刺激に対する を抑制した （0 1 0 ) 。
以上より ラハマイノンと同様に、 ェへロリムスの存在下て、 (CD45RA+) を有する CD25— CD4+T細胞を培養することにより、 導し得ることか示された。 特に、 ェへロリムスは、 CD45RA+CD25— 殖を増強する点て優れていた。
また、 ラハマイノンと同様に、 ェへロリムスを用いれは、 CD2 関わらす、 ナイーフ表現型 （CD45RA+) を有する CD4+T細胞から 造し得ることか示された。 た。 抗体としては、 APC-抗 CD4抗体 PE-抗 CD25抗体、 FITC- らかしめ適定して定められた至適量用いられた。
(結果） CD45RA+CD25+CD 4 + T細胞分画は小児ては肝移植後著 3ヶ月てヒークを認めた。 一方、 成人ては、 同分画は小児に見 な増加は認められなかったものの、 該細胞分画の割合は緩やか 1 ) o 産業上の利用可能性
本発明のスクリーニンク方法を用いれは、 制御性 T細胞を誘 得ることかてきる。 該化合物は、 制御性 T細胞を誘導するとい 疫抑制薬として、 あるいはその開発のためのノースとして有用 また、 本発明の方/去を用いれは、 イノヒ トロて哺乳動物の制 よく製造することか可能てある。 当該方法により製造された制 調節薬として臓器移植における拒絶反応、 アレルキー疾 ¾、 自 片対宿主病 （G V H D ) 、 不妊症等の予防 冶療に有用てある。 本出願は日本て出願された特願 2 0 0 5— 2 8 9 2 2 4 (出 9月 3 0 日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包

Claims

請求の範囲 1 以下の工程を含む、制御性 T細胞を誘導し得る化合物のスク( 1 )被検化合物の存在下て、 (1)CD45RA\ (2)CD45R01。W+又は CD45 及ひ（4)CD38+からなる群から選択される少なく ともいすれかの 有する CD4+T細胞を培養し、 培養物から T細胞を単離する工程(2) 工程 （ 1 ) て単離された T細胞の免疫抑制能を評価する(3) 工程 （2) における評価の結果、 工程 （ 1 ) て単離され 制能を有する場合に、 前記被検化合物を制御性 T細胞を誘導し 得る工程。 / 2 該ナイ一プ表現型か CD45RA+てある 請求項 1記載の方法。 3 該 CD4+T細胞か CD25+てある、 請求項 1記載の方/去。 4 該 CD4+T細胞か CD25てある、 請; k項 1記載の方法。 5 該 CD4+T細胞か霊長類由来てある、 請求項 1記載の方/去。 6 該 CD4+T細胞か抗原存在下て培養される、 請求項 1記載の + ( 1 )被検化合物の存在下て、 (1)CD45RA+ (2)CD45R01<)W+又は CD45 及ひ（4)CD38+からなる群から選択される少なく ともいずれかの 有する CD25+CD4+T細胞を培養し 制御性 T細胞を得る工程 (2) 工程 （ 1 ) て得られた制御性 T細胞の数及ひ/又は免疫 工程， (3) 工程 （2) て評価された制御性 T細胞の数及ひ 又は免 化合物の不在下て （l)CD45RA+、 （2)。045Κ0^+又は CD45R0—、 (3) (4) CD38+からなる群から選択される少なく ともいすれかのナイ る CD25+CD4+T細胞を培養することにより得られた制御性 T細 免疫抑制能と比較する工程 (4) 制御性 T細胞の数及ひ Z又は免疫抑制能を増大させた被 性 T細胞の製造効率を増大させ得る化合物として得る工程。 1 0 工程 （ 1) 及ひ （3) におけるナイーブ表現型か CD45R 9記載の方法。 1 1 工程 （ 1) 及ひ （3) における CD25+CD4+T細胞か霊長類 項 9記載の方法。 1 2 工程 （ 1) 及ひ （3) において、 CD25+CD4+T細胞か抗原 る、 請求項 9記載の方法。 1 5 ラハマイ ノノ化合物の存在下て、 （l) CD45RA+、 （2) CDASR (3) CD45R0hlgh+、 及ひ（4) CD38+からなる群から選択される少なく ィーフ表現型を有する CD4+T細胞を培養し、 制御性 T細胞を得 御性 T細胞の製造方法。 1 6 該ナイーフ表現型か CD45RA+てある、 請求項 1 5記載の 1 7 該 CD4+T細胞か CD25+てある、 請求項 1 5記載の方法。 1 8 該 CD4+T細胞か CD25—てある、 請末項 1 5記載の方/去。 1 9 該 CD4+T細胞か霊長類由来てある、 請求項 1 5記載の方 2 0 該 CD4+T細胞か抗原存在下て培養される、 請求項 1 5記 2 1 該 CD4+T細胞か T細胞増殖因子の存在下て培養される、 方法。 2 2 ラハマイノン化合物か培養開始から早く とも 1週間以降 れる、 請求項 1 5記載の方法。 2 5 ラハマイノン化合物かラハマイノンてある、 請求項 1 5 26 ラハマイノン化合物かェへロリムスてある、 請求項 1 5 2 7 (l)CD45RA+、 （2) CD SRO1 又は CD45R0—、 （3)CD45R0hlgh+、 なる群から選択される少なく ともいすれかのナイーブ表現型を T細胞を培養し、制御性 T細胞を得ることにより制御性 T細胞 制御性 T細胞の免疫抑制能を維持する方/去てあって、該 CD25+CD イ ノノ化合物の存在下て培養することを特徴とする、 方法。 28 ラハマイ ンノ化合物の存在下て、 （l)CD45RA+、 （2) ΟΟ δΚ (3)CD45R0hlgh\ 及ひ（4)CD38+からなる群から選択される少なく ィーフ表現型を有する CD25 CD4+T細胞を培養することを含む、 導方/去。 2 9 請^項 1 5記載の方法により得られ得る制御性 T細胞て 〜 （C) のいすれか 1つの群から選択される少なく ともいすれ 有する制御性 τ細胞 (A) CD45R0mid\ CD45RAmid+、 CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+ (B) CD45R0—、 CD45RAmid\ CD62Llow\ 及ひ CD25hlgh+ 3 1 請 *項 2 9又は 3 0に記載の制御性 T細胞を有効成分と 免疫調節剤。 3 2 免疫抑制用てある、 請求項 3 1記載の剤。 3 3 以下の工程を含む、 免疫調節剤の製造方法 ( 1 ) ラハマイ ノノ化合物の存在下て、 （l) CD45RA+、 （2) CD45R (3) CD45R0hlgh\ 及ひ（4) CD38+からなる群から選択される少なく ィーフ表現型を有する CD4+T細胞を培養し、 制御性 T細胞を得( 2 ) 該制御性 T細胞を医薬として許容される担体と混合し、 する工程。 3 4 該免疫調節剤か免疫抑制用てある、 請求項 3 3記載の方 3 5 (1) CD45RA\ (2) CD45R01 又は CD45R0、 (3) CD45R0hl6h+ なる群から選択される少なく ともいすれかのナイーフ表現型を から制御性 T細胞を誘導するための剤てあって、ラハマイノン 剤。 3 6 該 CD4+T細胞か CD25てある、 請求項 3 5記載の剤。 38 該 CD4+T細胞か CD25+てある、 請求項 3 7記載の剤。 3 9 (1)CD45RA\ (S^DASRO1 又は CD45R0—、 （3)CD45R0hlgh+、 なる群から選択される少なく ともいずれかのナイーフ表現型を を調製するための抗体及ひラハマイノン化合物を含む、 制御性 40 以下の工程を含む、 生体内においてナイーフ表現型を有 胞を誘導する方/去 (1 ) 非ヒ ト哺乳動物に、 肝移植を施す工程 (2) 前記非ヒ ト哺乳動物の末梢組織中に、 ナイーフ表現型を T細胞か誘導されたことを確認する工程。 4 1 以下の工程を含む、 生体内においてナイーフ表現型を有 胞数を増大させ得る化合物のスクリ一ニンク方法
(1 ) 非ヒ ト哺乳動物に、 肝移植を施す工程
(2) 工程 （ 1 ) の哺乳動物に被検化合物を投与する工程
(3) 工程 （2) の哺乳動物の末梢組織中のナイーフ表現型を T細胞の数を評価する工程
(4) 工程 （3) て評価されたナイーフ表現型を有する CD25+CD の使用。
4 3 ( 1) CD45RA\ (2) CDASRO1 又は CD45R0—、 （3) CD45R0hlgh+、 なる群から選択される少なく ともいずれかのナイーフ表現型を から制御性 T細胞を誘導するための剤を製造するための、 ラハ 使用。
4 4 (l) CD45RA+、 （2) CDASRO1 又は CD45R0—、 （3) CD45R0hlgh+、 なる群から選択される少なく ともいすれかのナイーブ表現型を を培養し、 制御性 T細胞を得ることにより制御性 T細胞を製造 ί
性 Τ細胞の免疫抑制能を維持するための剤を製造するための、 物の使用。
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