TWI764896B - 有效率的ｎｋｔ細胞活化技術 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於活化NKT細胞使NKT細胞增殖、IFN-γ產生及/或強力誘導細胞毒活性之NKT細胞配位體脈衝人類(Ligand pulsed human)CD14陽性細胞之製造方法，具體為該方法的特徵為含有將經分離的CD14陽性細胞在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-4的培養基中進行培養。又，本發明係關於製造NKT細胞配位體脈衝人類CD14陽性細胞株的方法，具體為該方法的特徵為含有將經分離的CD14陽性細胞在含有NKT細胞配位體，而實質上未含有GM-CSF及IL-4的培養基中進行培養。本發明係又關於含有NKT細胞配位體脈衝人類CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝人類CD14陽性細胞株之細胞製劑或其醫藥用途。
Description
本發明係關於有效率的NKT細胞活化技術。更具體為本發明係關於具有優良NKT細胞活化活性之NKT細胞配位體脈衝細胞的製造方法，藉由該方法所得之細胞、該細胞之醫藥用途等。
自然殺手細胞(以下稱為NK)T細胞係為顯示與其他淋巴球系列(T、B、NK細胞)相異特徴之屬於新穎淋巴球系列的免疫細胞。因於NKT細胞內存在細胞毒性穿孔素顆粒，故與NK細胞為類似物(非專利文獻1)。然而，NKT細胞不僅表現NK細胞標記物，亦表現T細胞受體(TCR)，故其為決定性相異新細胞群(非專利文獻2)。NKT細胞具有產生Th-1型細胞因子(主要為IFN-γ)與Th-2型細胞因子(主要為IL-4)之雙方的能力(非專利文獻3)，故被記載可擔任免疫系統的平衡調節的角色(非專利文獻4)。因此，若可控制NKT細胞的作用，即可治療因免疫系統平衡異常所造成的種種疾病，特別對於癌症及感染症的治療。
作為NKT細胞的特性，最被注目的點為，於
NKT細胞所表現的TCR之α鏈在某1種之間其全個體為相同。此即表示具有同種間之生物的NKT細胞全被辨識為相同物質而被活化。該α鏈在人類為Vα24，在老鼠為Vα14，在兩種間具有非常高的相同性。又，與α鏈成對的已知的β鏈種類非常有限。因此，該TCR亦稱為「不變性TCR」。又，通常T細胞的TCR會辨識蛋白片段，對於此NKT細胞的TCR係以可辨識糖脂質者為特徴。
α-半乳糖基神經醯胺(α-GalCer)係由海綿的一種之Agelas mauritianus的萃取液經分離所得之糖脂質，有報告指出可加強NKT細胞之活化(非專利文獻5)。α-半乳糖基神經醯胺被樹突狀細胞(DC)等為代表的抗原呈遞細胞(APC)吞入後，於主要組織適合基因複合體(MHC)等級I分子藉由類似CD1d蛋白質顯示於細胞膜上。該CD1d分子的種屬亦僅為1種類，故全人類為共通，故α-GalCer可成為所有人類之共通藥劑。將NKT細胞如此表現的CD1d蛋白質與α-半乳糖基神經醯胺之複合體可藉由使用NKT細胞唯一的TCRα鏈進行辨識而使其活化，開始種種免疫反應。
近年來，著重於如上述之NKT細胞的功能，含有α-GalCer作為有效成分之癌症治療藥已被開發。然而，藉由α-GalCer之投與而活化的NKT細胞為，產生可對使用於癌症及感染症治療為有用的細胞性免疫賦活之細胞因子的IFN-γ之同時，對於細胞性免疫具有抑制的IL-4亦同時產生。其結果，被指出因兩者作用互相消滅，對於癌
症及感染症治療並非有十足的效果。
其中，將NKT細胞強力活化，比IL-4而優先產生IFN-γ之α-GalCer衍生物已被多數開發(專利文獻1~5)。
藉由α-GalCer使其活化的NKT細胞因會表現穿孔素(perforin)等種種殺細胞誘導因子，故對於標的細胞顯示直接細胞毒活性(非專利文獻1、6)。又，經活化的NKT細胞會急速且大量地產生的干擾素-γ等Th1型的細胞因子或藉著樹突狀細胞(DC)之成熟化等，可發揮NK細胞或CD8+T細胞的細胞毒活性之增強效果，故其為非常獨特的細胞(非專利文獻7)。且對於老鼠癌轉移模型，比單獨投與α-GalCer，於樹突狀細胞(DC)呈現後投與的細胞治療方法，可更明顯地發揮更強力抗腫瘤效果(非專利文獻8)。經過這些研究，藉由將α-GalCer等NKT細胞配位體經脈衝的DC進行投與，可活化活體內NKT細胞，利用該抗腫瘤效果對癌症及感染症做治療．預防的將NKT細胞作為標的的免疫細胞治療之臨床開發正進行。
例如於非專利文獻9中，已記載對於非小細胞肺癌之α-GalCer脈衝DC療法中，藉由α-GalCer脈衝DC投與的末梢血細胞中之IFN-γ產生細胞的增加已被認定的症例群與非增加症例群做比較時，認定有顯著全生存期間之延長。α-GalCer反應性IFN-γ產生細胞通常為NKT細胞，於α-GalCer脈衝DC投與後可加入NK細胞(非專利文獻10、11)，藉由α-GalCer脈衝DC療法經活化的NKT細胞對於其
他免疫細胞的輔助劑(adjuvant)效果已被揭示。又，IFN-γ產生細胞的增加與生存期間延長效果之密切關連性可得知，如何增強IFN-γ產生，其中藉由使用將α-GalCer等NKT細胞配位體經脈衝的抗原呈遞細胞之免疫細胞療法，提高癌症及感染症治療．預防成績上為重要。
對於非專利文獻9的α-GalCer脈衝DC療法，將在成分採血所採取的患者末梢血細胞全部在GM-CSF及IL-2的存在下進行1~2週培養後，取得樹突狀細胞。且對患者之投與前日對樹突狀細胞將α-GalCer脈衝，經1日培養後，將所得之α-GalCer脈衝DC以點滴投與於靜脈內。對於該培養系統，藉由含於培養細胞之T細胞所產生的IL-4、TNF-α使來自單核細胞的DC成熟化，增強α-GalCer呈現能。
又，一般而言採用以下方法，將末梢血中之單核細胞在GM-CSF及IL-4之存在下進行6天程度培養後，取得未熟樹突狀細胞，且將未熟樹突狀細胞與發炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)同時進行2天程度培養後，得到成熟樹突狀細胞，並在成熟樹突狀細胞上使α-GalCer等NKT細胞配位體脈衝，活化NKT細胞之方法(非專利文獻5、12)。
如此作為對於NKT細胞之抗原呈遞細胞，一般使用成熟樹突狀細胞，在單核細胞或未熟樹突狀細胞中，對於NKT細胞適切地呈現抗原，此被認為不會有效率地活化。另一方面，成熟樹突狀細胞之調製中需要長期間
培養。
[專利文獻1]WO 2008/102888 A1
[專利文獻2]WO 2009/119692 A1
[專利文獻3]WO 2010/030012 A1
[專利文獻4]WO 2011/552842 A1
[專利文獻5]WO 2013/162016 A1
[非專利文獻1]Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 5690-5693
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[非專利文獻3]J. Immunol. 1998, 161, 3271-3281
[非專利文獻4]Science, 1997, 278, 1623-1626
[非專利文獻5]Science, 1997, 278, 1626-1629
[非專利文獻6]Cancer Res 1999; 59: 5102-5105
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[非專利文獻11]Cancer Sci 2008; 99: 638-645.
[非專利文獻12]Nat Immunol, 2002, 3(9): 867-874
本發明係以提供比較短期間製造具有強力NKT細胞活化能的NKT細胞配位體脈衝細胞之技術為目的。
本發明者們欲解決上述課題進行詳細檢討之結果，發現顛覆所謂「藉由樹突狀細胞之抗原呈現與藉此的T細胞活化」之常識，活化NKT細胞時，與其樹突狀細胞，於發生學上未分化階段之單核細胞，即CD14陽性細胞可作為優良的抗原呈遞細胞．脈衝細胞。而將該CD14陽性細胞在IL-4不在下，藉由在僅含有NKT細胞配位體及GM-CSF的培養基中進行培養，於NKT細胞的活化上為必要的CD40表現上昇，可取得將NKT細胞可強力活化的NKT細胞配位體脈衝細胞。另一方面，將單核細胞、CD14陽性細胞作為細胞系化CD14陽性細胞株時，在GM-CSF及IL-4不在下，藉由在僅含有NKT細胞配位體的培養基中進行培養，可取得NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株。所有製造步驟亦僅培養期間2天左右即充分。此不需要自CD14陽性細胞對樹突狀細胞之分化步驟，以經分離的CD14陽性細胞或者CD14陽性細胞株方式可直接取得NKT
細胞配位體脈衝細胞。所取得的NKT細胞配位體脈衝細胞(NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株)可強力誘導NKT細胞之增殖、藉由NKT細胞之IFN-γ產生及細胞毒活性。
發明者們依據上述見解進一步檢討結果，完成本發明。
即，本發明如下述所示：
[1]含有將自人類末梢血液經分離的CD14陽性細胞，在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-4的培養基中進行培養的步驟(製造方法1)或將經分離的CD14陽性細胞株，在含有NKT細胞配位體，而實質上未含有GM-CSF及IL-4的培養基中進行培養的步驟(製造方法2)之NKT細胞配位體脈衝細胞(即，NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株)的製造方法。
[2]培養基為實質上未含SCF及/或Flt3L之[1]所記載的方法。
[3]經分離的CD14陽性細胞之純度為70%以上之[1]或[2]所記載的方法。
[4]NKT細胞配位體添加後，培養細胞至少16小時之[1]~[3]中任一所記載的方法。
[5]NKT細胞配位體添加後進行16~72小時細胞培養之[4]所記載的方法。
[6]NKT細胞配位體為下述式(VI)：
(式中，X表示伸烷基或者-NH-；R1及R2表示相同或相異的氫原子、烷基、羥基、烷氧基，或可具有取代基之芳基，R1及R2與鄰接的氮原子可共同形成5~6員環；R3表示碳數1~20的烴基；R4表示碳數1~30的烴基)所示化合物，或其鹽之[1]~[5]中任一所記載的方法。
[7]NKT細胞配位體為下述式
所示化合物，或其鹽之[6]所記載的方法。
[8]培養基中之NKT細胞配位體濃度至少為30ng/ml之[1]~[7]中任一所記載的方法。
[9]含有將CD14陽性細胞在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-4的培養基中進行培養之步驟(製造方法1)，或將CD14陽性細胞株在含有NKT細胞配位體，而實質上未含有GM-CSF及IL-4的培養基中進行培養的步驟(製造方法2)之NKT細胞配位體脈衝細胞(NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株)的製造方法。
[10]培養基為實質上未含有SCF及/或Flt3L之[9]所記載的方法。
[11]NKT細胞配位體添加後培養細胞至少16小時之[9]或[10]所記載的方法。
[12]NKT細胞配位體添加後培養細胞40~72小時之[11]所記載的方法。
[13]NKT細胞配位體為下述式(VI)：
(式中，X表示伸烷基或者-NH-；R1及R2表示相同或相異的氫原子、烷基、羥基、烷氧基，或可具有取代基之芳基，R1及R2與鄰接的氮原子可共
同形成5~6員環；R3表示碳數1~20的烴基；R4表示碳數1~30的烴基)所示化合物，或其鹽之[9]~[12]中任一所記載的方法。
[14]NKT細胞配位體為下述式
所示化合物，或其鹽之[13]所記載的方法。
[15]培養基中之NKT細胞配位體濃度至少為30ng/ml之[9]~[14]中任一所記載的方法。
[16]藉由[1]~[15]中任一所記載的方法所得之NKT細胞配位體脈衝細胞。
[17]含有[16]所記載的細胞之細胞製劑。
[18]含有[16]所記載的細胞之NKT細胞活化劑。
[19]含有[16]所記載的細胞之癌症或感染症之治療或預防劑。
[20]含有將[16]所記載的細胞，或[17]所記載的細胞製劑投與於被驗體之於該被驗體中之NKT細胞的活化方法。
[21]被驗體為罹患癌症或感染症，或具有癌症或感染症之罹患歷的[20]所記載的方法。
[22]含有將[16]所記載的細胞，或[17]所記載的細胞製劑投與於被驗體之該被驗體中之癌症或感染症的治療或預防方法。
[23]使用於NKT細胞活化的[16]所記載的細胞。
[24]使用於癌症或感染症的治療或預防之[16]所記載的細胞。
[25]使用於NKT細胞活化中的[17]所記載的細胞製劑。
[26]使用於癌症或感染症的治療或預防中的[17]所記載的細胞製劑。
[27]使用於NKT細胞活化用醫藥的製造中之[16]所記載的細胞之使用。
[28]使用於癌症或感染症的治療或預防用醫藥的製造中之[16]所記載的細胞之使用。
依據本發明，可期待可在比較短期間製造具有強力NKT細胞活化能的NKT細胞配位體脈衝細胞。藉由本發明之方法所得之NKT細胞配位體脈衝細胞因可強力誘導NKT細胞之增殖、NKT細胞之IFN-γ產生及細胞毒活性，故可作為癌症或感染症等疾病的治療或預防；癌症轉移或復發的治療或預防上的細胞製劑。
[圖1]表示藉由將人類末梢血CD14陽性細胞(RK-163脈衝前)、CD14陽性細胞在NKT細胞配位體RK-163與GM-CSF存在下進行2天培養後所得之「RK-163脈衝人類CD14陽性細胞」及NKT細胞配位體RK-163與GM-CSF及IL-4存在下進行6天培養的「RK-163脈衝人類樹突狀細胞」之表面抗原表現圖的比較。陰影表示陰性控制抗體。又，表示將自人類末梢血的血液分離(apheresis)液使用自動細胞分離機藉由淘析方法所得之CD14陽性細胞在NKT細胞配位體RK-163與GM-CSF存在下進行2天培養後所得之「RK-163脈衝人類Elu-CD14陽性細胞」之表面抗原表現圖合併表示。「RK-163脈衝人類Elu-CD14陽性細胞」表示在其他分離法所得之與RK-163脈衝CD14陽性細胞相同結果(CD14陽性、CD1d陽性、CD40陽性)。
[圖2]表示自人類末梢血CD14陽性細胞所製作的「RK-163脈衝人類CD14陽性細胞」、自CD14陰性細胞所製作的「RK-163脈衝人類CD14陰性細胞」及「RK-163脈衝人類樹突狀細胞」的IFN-γ產生誘導能(NKT細胞活化作用)之比較結果。
[圖3]表示將人類末梢血CD14陽性細胞在種種RK-163脈衝濃度下進行培養所製作的「RK-163脈衝人類CD14陽性細胞」之IFN-γ產生誘導能(NKT細胞活化作用)。
[圖4]表示將人類末梢血CD14陽性細胞與NKT細胞配位體之RK-163進行種種時間的脈衝培養後所製作的「RK-
163脈衝人類CD14陽性細胞」對NKT細胞的IFN-γ產生誘導能(NKT細胞活化作用)、回收率及生存率。比較以α-GalCer進行脈衝的人類CD14陽性細胞之NKT細胞活化能(IFN-γ產生誘導能)、回收率及生存率。
[圖5]表示將人類末梢血CD14陽性細胞與RK-163以種種播種密度，在GM-CSF含有培養基中進行48小時脈衝培養後所得之RK-163脈衝人類CD14陽性細胞的活細胞數、生存率及回收率。
[圖6]表示比較「α-GalCer或RK-163脈衝人類CD14陽性細胞」與「α-GalCer或RK-163脈衝人類樹突狀細胞」的誘導NKT細胞之增殖能力之結果。
[圖7]表示自人類末梢血CD14陽性細胞所製作的「RK-163脈衝人類CD14陽性細胞」與「RK-163脈衝人類樹突狀細胞」的NKT細胞誘導細胞毒活性之能力比較結果。
[圖8]表示以種種NKT細胞配位體(RCAI-85、RCAI-137、RK-163)將在人類末梢血CD14陽性細胞於GM-CSF存在下進行48小時培養後所得之「NKT細胞配位體脈衝人類CD14陽性細胞」的NKT細胞活化(IFN-γ產生誘導)能力。
[圖9]表示來自人類末梢血的「RK-163脈衝人類CD14陽性細胞」之抗腫瘤效果
[圖10-1]表示人類CD14陽性細胞株THP-1細胞之表面抗原表現圖。
[圖10-2]表示人類CD14陽性細胞株U937細胞之表面抗原表現圖。
[圖10-3]表示人類iPS-CD14陽性細胞株之表面抗原表現圖。
[圖11]表示將RK-163經脈衝的對於人類THP-1、U937及人類iPS-CD14陽性細胞株人類NKT細胞株之IFN-γ產生誘導效果。
[圖12]表示於RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株製作時中RK-163脈衝時間與對於人類NKT細胞株之IFN-γ產生誘導效果的相關性。
[圖13]表示藉由RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株(THP-1,iPS-CD14陽性細胞株)的NKT細胞之細胞毒活性的誘導。
[圖14A]表示藉由將RK-163或α-GalCer經脈衝的老鼠樹突狀細胞所衍生的抗腫瘤效果。
[圖14B]表示藉由RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株(THP-1細胞、U937細胞)所誘導的抗腫瘤效果。
[圖15A]表示藉由RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞投與所誘導的NKT細胞之輔助劑作用所引起的NK細胞之活化。
[圖15B]表示藉由將RK-163經脈衝的人類CD14陽性細胞株投與所誘導的NKT細胞之輔助劑作用所引起的NK細胞之活化。
[圖16A]表示在經投與的RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞之體內動態，快速自體內消失的樣子。
[圖16B]表示在經投與的RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株之體內動態，快速自體內排除的樣子。
[圖17A]表示投與RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株時的血中急性毒性標記物(AST及ALT)水準之經時性變化。
[圖17B]表示投與RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株時的肝臟與脾臟之重量的經時性變化。
[圖18]表示藉由軟寒天群體形成法(soft-agar colony formation assay)，照射放射線的RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株之致腫瘤性試驗結果。
[圖19A]表示藉由RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞的記憶T細胞之誘導。
[圖19B]表示藉由RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株的記憶T細胞之誘導。
本發明為提供NKT細胞配位體脈衝細胞。本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞，即NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞及NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株具有將NKT細胞活化、NKT細胞增殖、IFN-γ產生、輔助劑作用、長期免疫記憶誘導及/或對腫瘤細胞的細胞毒活性之誘導活
性。
所謂「NKT細胞配位體脈衝」表示將NKT細胞配位體進入細胞後，藉由CD1d蛋白質在細胞膜上呈現的意思。「NKT細胞」及「NKT細胞配位體」「CD14陽性細胞」「CD14陽性細胞株」的定義如下詳述。NKT細胞配位體為結合於CD1d，呈現於CD1d分子上時，藉由NKT細胞上之NKT細胞固有T細胞受體(NKT細胞受體)做特異性(專一性)辨識，將NKT細胞可特異性地活化而得之化合物即可，並無特別限制，例如為前述具有活性之糖脂質，較佳為α-GalCer或其類似物，由可強力地誘導NKT細胞之IFN-γ產生的觀點來看，以下所記載的NKT細胞配位體之中，亦以III或VI所記載的化合物為佳，其中亦以RCAI-85、RCAI-137或RK-163(RCAI-124)為佳。NKT細胞配位體最佳為RK-163(RCAI-124)。
本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞可為哺乳動物細胞。作為哺乳動物，例如可舉出老鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等囓齒類或兔子等實驗動物；豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等家畜；狗、貓等寵物；人類、猴子、恒河猴、絨猴、猩猩、黑猩猩等靈長類。哺乳動物較佳為靈長類，更佳為人類。
使用本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞進行治療時，本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞以與被驗體(患者)同種者為佳。例如將NKT細胞配位體脈衝人類細胞投與於人類。本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞為來自
自身細胞(遺傳性同種．同系)，或來自其他細胞(遺傳性同種．異系)。
本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞較佳為CD14陽性。本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞中之CD14陽性細胞的比例，例如50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞較佳為CD1d陽性。本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞中之CD1d陽性細胞的比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞較佳為CD40陽性。本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞中之CD40陽性細胞的比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
對於較佳態樣，本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞為CD14陽性CD1d陽性CD40陽性。本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞中之CD14陽性CD1d陽性CD40陽性細胞的比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
對於一態樣，本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞係由單核細胞或單核細胞所構築之細胞株。細胞株之構築若為任意選自斯業者所公知的方法即可進行。CD14為已知的單核細胞標記物。
本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞並非樹突
狀細胞。因此，本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞中的樹突狀細胞標記物之表現為限定者，或本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞不表現樹突狀細胞標記物(marker)。本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞中之CD209(樹突狀細胞標記物)陽性細胞的比例，例如為40%以下，較佳為30%以下、20%以下、10%以下、5%以下或1%以下(例如0%)。樹突狀細胞一般為CD14陰性。
本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞為被分離者。所「分離」表示進行除去作為目的的細胞或成分以外的因子之操作，脫離存在於天然的狀態之意思。「經分離的NKT細胞配位體脈衝細胞」之純度(總細胞數中NKT細胞配位體脈衝細胞數所佔百分率)一般為70%以上，較佳為80%以上，90%以上、95%以上、98%以上、99%以上或99.5%以上，最佳為100%。
本發明之NKT細胞配位體脈衝細胞，例如可藉由以下所記載的方法所製造。
本發明為提供含有將經分離的CD14陽性細胞在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-4的培養基中進行培養的步驟之NKT細胞配位體脈衝細胞的製造方法(本發明之製造方法1)。
CD14為分子量53-55kDa之糖基-磷脂醯肌醇
(GPI)結合型單鏈膜糖蛋白質，已知作為單核細胞之標記物細胞表面抗原。相當於該CD14陽性細胞之細胞，較佳為自所有哺乳動物中之造血幹細胞經分化，分化為巨噬細胞或樹突狀細胞前之前驅細胞，更佳為單核細胞。
對於本說明書，將細胞表現型在標記物分子(抗原)表現有無下表示時，若無特別說明，可以藉由對於該標記物分子之抗體的特異性結合之有無標記出細胞表現型。藉由標記物分子的表現有無之細胞表現型鑑定，藉由一般使用對於該標記物分子之特異性抗體等流式細胞儀分析而進行。所謂標記物分子之表現為「陽性」為，該標記物分子表現於細胞表面上，藉由對於該標記物分子之抗體的特異性結合而可確認。
在製造方法1中所使用的CD14陽性細胞可為來自哺乳動物。作為哺乳動物，在藉由製造方法1之NKT細胞配位體脈衝細胞所製造的範圍中即可，並無特別限定，例如可出老鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等囓齒類或兔子等實驗動物；豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等家畜；狗、貓等寵物；人類、猴子、恒河猴、絨猴、猩猩、黑猩猩等靈長類。哺乳動物較佳為靈長類，較佳為人類。
本說明書中，CD14的命名法可依據人類CD14之命名法者。
且，對於人類以外的哺乳動物，可為不具有對應人類CD14之抗原基因的情況。對於本發明中之如此哺乳動物，與CD14表現之有無無關，可將單核細胞作為
相當於「CD14陽性細胞」之細胞使用。
使用藉由製造方法1所得之細胞進行治療時，與在製造方法1中所使用的CD14陽性細胞(例如單核細胞)與被驗體同種者為佳。使用於本發明的CD14陽性細胞(例如單核細胞)為來自自身的細胞(遺傳性同種．同系)，或來自其他的細胞(遺傳性同種．異系)。
在製造方法1所使用的CD14陽性細胞(例如單核細胞)係由含有CD14陽性細胞的組織分離。作為該組織，可舉出末梢血、臍帶血、骨髓、脾臟、胸腺、淋巴節、肝臟、腫瘤組織等，但並未限定於此等。於製造方法1中所使用的CD14陽性細胞(例如單核細胞)，較佳為自末梢血或臍帶所分離者。經分離的CD14陽性細胞亦可為自含有CD14陽性細胞之組織所分離的CD14陽性細胞，由此作為細胞株所構築的CD14陽性細胞株。細胞株的構築可選自任意斯業者的公知方法進行。且，經分離的CD14陽性細胞亦可為將任意細胞初期化後，復次藉由誘導分化所構築的CD14陽性細胞。作為將任意細胞的初期化之方法，可舉出美國專利8048999號、美國專利8058065號、美國專利8129187號、美國專利8278104號、美國專利8791248號、美國專利9145547號所記載的方法的例子，但並未限定於此等。自初期化的細胞得到CD14陽性細胞之方法，例如可參照Grigoriadis et al.,Blood.2010 Apr 8；115(14)：2769-76或Stem Cells.2016 Dec；34(12)：2852-2860進行，若為斯業者可任意將方法做最適化，故
並無限定於此等。
於製造方法1中所使用的CD14陽性細胞(例如單核細胞)係經分離者。所謂「分離」表示經由除去作為目的之細胞或成分以外的因子之操作後，脫離於天然存在之狀態。「經分離的CD14陽性細胞」之純度(總細胞數中所佔的CD14陽性細胞數之百分率)通常為70%以上，較佳為80%以上，90%以上、95%以上、98%以上、99%以上或99.5%以上，最佳為100%。對於其他種類細胞亦為相同定義。
CD14陽性細胞(例如單核細胞)為，使用對於CD14為特異性結合的抗體，藉由抗體結合磁珠、細胞分選機、篩選(panning)等方法，可自含有上述CD14陽性細胞(例如單核細胞)之組織中分離。又，自人類末梢血的血液分離液使用自動細胞分離機藉由淘析方法分離CD14陽性細胞(例如單核細胞)。
例如，首先藉由末梢血或臍帶血等調製出單核細胞組分。單核細胞組分之調製，例如如使用Ficoll-Paque PLUS(GE醫療保健．JAPAN)的密度梯度離心或藉由血液分離(apheresis)等進行。其次，對於藉由螢光色素或磁珠等進行標識的CD14，藉由以特異性結合的抗體染色單核細胞組分，使用細胞分選機或磁性管柱等，分離CD14陽性細胞(例如單核細胞)。藉由附著於培養皿的簡單平移法，可自單核細胞組分分離CD14陽性細胞(例如單核細胞)。又，可使用自人類末梢血的血液分離液使
用自動細胞分離機(Terumo公司製等)的淘析方法所得之CD14陽性細胞(例如單核細胞)濃縮組分。
取代對於CD14為特異性結合的抗體，可使用對單核細胞及巨噬細胞之其他標記物(例如MHC Class I樣分子(CD1d等)、CD11b、CD15、CD86等)以特異性結合的抗體。
對於培養開始時，於製造方法1中所使用的經分離之CD14陽性細胞中CD1d陽性細胞所佔比例通常為70%以上，較佳為80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上或99.5%以上，最佳為100%。
其此，將經分離的CD14陽性細胞在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-4的培養基中進行培養。較佳為將自上述活體組織所分離的CD14陽性細胞之初代培養在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-4的培養基中進行。
NKT細胞為表現NKT細胞固有T細胞受體(不變性TCR)與NK受體的2個抗原受體之淋巴球。與一般T細胞相異，NKT細胞上之T細胞受體的細胞庫(repertoire)受到非常限制。例如老鼠NKT細胞(有時稱為Vα14 NKT細胞)上的T細胞受體之α鏈藉由不變性Vα14及Jα18基因片段所編碼(Proc Natl Acad Sci USA,83,p.8708-8712,1986；Proc Natl Acad Sci USA,88,p.7518-7522,1991；J Exp Med,180,p.1097-1106,1994)、人類NKT細胞上的T細胞受體之α鏈藉由與老鼠的Vα14相同性
高之不變性Vα24及Jα18基因片段所編碼。NKT細胞為藉由該細胞上之T細胞受體(將此稱為NKT細胞受體)辨識表現於CD1d分子上之「NKT細胞配位體」。
所謂NKT細胞配位體呈現於CD1d分子上時，藉由NKT細胞上之NKT細胞固有T細胞受體(NKT細胞受體)做特異性辨識，將NKT細胞經特異性活化而得之化合物。可使用在本發明之NKT細胞配位體，例如結合於CD1d，具有前述活性之糖脂質，較佳為α-GalCer或其類似物。例如可舉出以下化合物。
I.式(I)之化合物或其鹽或者溶劑化物。
(上述式中，R11為H或OH，X1為7~27中任一之整數，R21為選自由下述(a)~(e)所成群的取代基(其中，Y1為5~17中任一之整數)、(a)-CH2(CH2)Y1CH3、(b)-CH(OH)(CH2)Y1CH3、(c)-CH(OH)(CH2)Y1CH(CH3)2、(d)-CH=CH(CH2)Y1CH3、(e)-CH(OH)(CH2)Y1CH(CH3)CH2CH3，而R31~R91為下述i)或ii)所定義的取代基：i)R31、R61及R81為H時，R41為H、OH、NH2、NHCOCH3，或選自由下述基(A)~(D)：
所成群的取代基，R51為OH，或選自由下述基(E)及(F)：
所成群的取代基，R71為OH或選自由下述基(A)~(D)：
所成群的取代基，R91為H、CH3、CH2OH，或選自由下述基(A’)~(D’)：
所成群的取代基；ii)R31、R61及R71為H時，R41為H、OH、NH2、NHCOCH3，或選自由下述基(A)~(D)：
所成群的取代基，R51為OH，或選自由下述基(E)及(F)：
所成群的取代基，R81為OH，或選自由下述基(A)~(D)：
所成群的取代基，R91為H、CH3、CH2OH或選自由下述基(A’)~(D’)：
所成群的取代基)
其中亦以(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-半乳吡喃糖)-2-二十六烷醯胺基-1,3,4-十八烷三醇(本說明書中，亦稱為α-半乳糖基神經醯胺、α-GalCer)為佳。下述式(a)中表示α-GalCer之結構式。
式(I)之化合物可藉由WO94/09020、
WO94/02168、WO94/24142、WO98/44928、Science,278,p.1626-1629,1997等記載的方法所製造。
II.式(II)所示化合物或其鹽。
[式中，R1表示α-卡巴糖殘基，R2及R3各獨立表示碳數1~28的取代或非取代的烴基，X表示氧原子、硫原子、-CH2-或-NH-，Y表示-CH2-、-CH(OH)-或-CH=CH-]其中亦以以下化合物為佳。
[1](2S,3S,4R)-1-(5a-卡巴-α-D-半乳吡喃糖氧基)-2-(二十六烷醯胺基)-3,4-十八烷二醇
[2](2S,3S,4R)-1-(5a-卡巴-α-D-半乳吡喃糖硫代基)-2-(二十六烷醯胺基)-3,4-十八烷二醇
[3](2S,3S,4R)-1-(5a-卡巴-α-D-吡喃葡萄糖基氧基)-2-(二十六烷醯胺基)-3,4-十八烷二醇
[4](2S,3S,4R)-1-(5a-卡巴-α-D-吡喃葡萄糖基硫代基)-2-(二十六烷醯胺基)-3,4-十八烷二醇
[5](2S,3S,4R)-1-(5a-卡巴-α-D-吡喃岩藻糖基氧基)-2-(二十六烷醯胺基)-3,4-十八烷二醇
式(II)的化合物或其鹽可藉由WO2008/102888、US patent No.8299223等揭示的方法而製造。
III.式(III)所示化合物或其鹽。
[式中，R1表示氫原子、碳數1~7的烷基、碳數1~6的烷氧基或鹵素原子，R2及R3各獨立表示碳數1~28的取代或非取代的烴基，Y表示-CH2-、-CH(OH)-或-CH=CH-。但，R1為氫原子時，R2表示碳數24~28的取代或非取代的烴基]
其中亦以以下化合物為佳。
式(III)的化合物或其鹽可藉由WO2009/119692、US patent No.8551959等揭示的方法而製造。
IV.式(IV)所示化合物或其鹽。
(式中，R1表示碳數1~30的烴基，R2表示碳數1~20的烴基，R3表示氫原子或碳數1~5的烴基，R4及R5可為相同或相異表示氫原子或碳數1~5的烴基，或R4與R5共同成為碳數1~5的2價烴基，亦可與隣接伸乙二氧基共同形成環結構)
式(IV)所示化合物或其鹽可藉由WO2010/030012、US patent No.8580751等揭示的方法而製造。
V.式(V)所示化合物或其鹽。
[式中，R1表示第6位羥基可經烷基化的醛吡喃糖殘基，R2表示可具有取代基的碳數1~26的烴基，R3表示氫原子或可具有取代基的碳數1~26的烴基，R4表示可具有取代基之碳數1~21的烴基，X表示氧原子或-CH2-，Y表示-CH2-、-CH(OH)-或-CH=CH-]
其中亦以以下化合物或其鹽為佳。
[1](2S,3S,4R)-1-(α-D-半乳吡喃糖氧基)-2-(二十四脲)-3,4-十八烷二醇
[2](2S,3S,4R)-1-(α-D-半乳吡喃糖氧基)-2-(十六脲)-3,4-十八烷二醇
[3](2S,3S,4R)-1-(6-O-甲基-α-D-半乳吡喃糖氧基)-2-(二十四脲)-3,4-十八烷二醇
式(V)所示化合物或其鹽可藉由WO2011/552842、US patent No.8853173等揭示的方法而製造。
VI.式(VI)所示化合物，或其鹽。
(式中，X表示伸烷基或者-NH-；R1及R2表示相同或相異的氫原子、烷基、羥基、烷氧基，或可具有取代基之芳基，R1及R2與鄰接的氮原子可共同形成5~6員環；R3表示碳數1~20的烴基；
R4表示碳數1~30的烴基)所示化合物，或其鹽。
其中，亦以以下化合物為佳。
式(VI)的化合物或其鹽可藉由WO 2013/162016 A1、US 2015/152128 A1等揭示的方法而製造。
由可強力地誘導NKT細胞之IFN-γ產生的觀點來看，於上述記載的NKT細胞配位體之中，以上述III或VI所記載的化合物為佳，其中亦以
RK-163(RCAI-124)為較佳。
使用於製造方法1的NKT細胞配位體，最佳為RK-163(RCAI-124)。
使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基中的NKT細胞配位體之濃度為，僅可藉由製造方法1所得的NKT細胞配位體脈衝細胞使NKT細胞活化者即可，並無特別限定，通常為1ng/mL以上，較佳為10ng/mL以上，更佳為30ng/mL以上。理論上，培養基中之NKT細胞配位體的濃度上限值為該溶解度，即使在必要以上的高濃度，因NKT細胞配位體脈衝細胞使NKT細胞的活化作用達到平穩狀態，故由培養成本之觀點來看，通常為10000ng/mL以下，較佳為1000ng/mL以下，更佳為300ng/mL以下。因此，添加於培養基中之NKT細胞配位體的濃度範圍，通常為1~10000ng/mL，較佳為10~1000ng/mL，更佳為30~300ng/mL。
於使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基中添加GM-CSF。該培養基中之GM-CSF濃度僅對於經培養後所得之NKT細胞配位體脈衝細胞中之CD40的表現被誘導出即可，並無特別限定，通常為6.7ng/mL以上，較佳為33.3ng/mL以上，更佳為53.3ng/mL以上。理論上，培養基中之GM-CSF濃度的上限值為該溶解度，即使在必要以上的高濃度時，該活性會達到平穩，故由培養成本之觀點來看，通常為666.7ng/mL以下，較佳為133.3ng/mL以下，更佳為66.7ng/mL以下。因此，培養
基中之GM-CSF濃度，通常為6.7~666.7ng/mL，較佳為33.3~133.3ng/mL，更佳為53.3~66.6ng/mL。且，將GM-CSF濃度以該生物學上活性(IU)表示時，上述濃度係由以下換算式所得。
其中重要事項為，使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基為實質上未含有IL-4。將經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)，在含有GM-CSF及IL-4的培養基中培養時，會誘導出未成熟樹突狀細胞，但對於該樹突狀細胞，幾乎未確認到CD1d之表現，對於NKT細胞表現NKT細胞配位體，活化NKT細胞之能力為低。相對於此，對於製造方法1，將經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)在含有GM-CSF，而實質上未含有IL-4之培養基中進行培養後，不僅可維持CD1d之表現，亦可得到活化NKT細胞之能力高的細胞。所謂「實質上未含有IL-4」表示，培養基中之IL-4濃度降至，將經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)誘導為未成熟樹突狀細胞的濃度以下的意思。使用於CD14陽性細胞之培養的培養基中之IL-4濃度，通常為未達0.01ng/mL，較佳為未達0.001ng/mL，更佳為未達0.0001ng/mL(例如0ng/mL)。因此，對於較佳態樣，於經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)之培養中，未將外源性IL-4添加於培養物中。
使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基，較佳為實質上未含有Flt-3L。Flt-3L雖促進
CD14陽性細胞對樹突狀細胞之分化，對於製造方法1中，並未期待能往樹突狀細胞分化。又，藉由Flt-3L之添加，有降低CD14陽性細胞培養後之細胞生存率、活細胞數及細胞回收率的可能性。所謂「實質上未含有Flt-3L」表示培養基中之Flt-3L濃度降低至，將經分離的CD14陽性細胞誘導為未成熟樹突狀細胞的濃度以下的意思。對於其中一態樣，使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基中的Flt-3L濃度，通常為未達0.01ng/mL，較佳為未達0.001ng/mL，更佳為未達0.0001ng/mL(例如0ng/mL)。因此，對於較佳態樣，經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)之培養中，未將外源性Flt-3L添加於培養物中。
使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基，較佳為實質上未含有SCF。雖有報告指出SCF對樹突狀細胞之分化的關連性，但對於製造方法1，並未期待對樹突狀細胞之分化。又，藉由SCF之添加，有降低CD14陽性細胞培養後之細胞生存率、活細胞數及細胞回收率之可能性。所謂「實質上未含有SCF」表示，培養基中之Flt-3L濃度為降至對樹突狀細胞之分化促進濃度以下。對於其中一態樣，使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基中的SCF濃度，通常為未達0.01ng/mL，較佳為未達0.001ng/mL，更佳為未達0.0001ng/mL(例如0ng/mL)。因此，對於較佳態樣，於經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)之培養，未將
外源性SCF添加於培養物中。
使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基，較佳為實質上未含有IL-2。IL-2為使混入於培養物中之T細胞活化而誘導IL-4產生，該IL-4可促進CD14陽性細胞對樹突狀細胞的分化。所謂「實質上未含有IL-2」表示，培養基中之IL-2濃度降至活化T細胞的濃度以下。對於其中一態樣，使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基中的IL-2濃度，通常為未達0.01ng/mL，較佳為未達0.001ng/mL，更佳為未達0.0001ng/mL(例如0ng/mL)。因此，對於較佳態樣，於經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)之培養中，未將外源性IL-2添加於培養物中。
藉由製造方法1，只要可製造出有效率地活化NKT細胞之NKT細胞配位體脈衝細胞，於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基中，除GM-CSF，亦可含有上述以外的1種或複數種細胞因子(白細胞介素、趨化因子、干擾素、造血因子、細胞增殖因子、細胞毒性因子、脂肪細胞因子、神經營養因子等)。
對於其中一態樣，於使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基中，實質上未含有GM-CSF以外的細胞因子(白細胞介素、趨化因子、干擾素、造血因子、細胞增殖因子、細胞毒性因子、脂肪細胞因子、神經營養因子等)。對於該態樣，GM-CSF以外的各細胞因子之培養基中濃度，例如未達0.01ng/mL，較佳為
未達0.001ng/mL，更佳為未達0.0001ng/mL(例如0ng/mL)。對於較佳態樣，於經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)之培養中，未將除GM-CSF以外的外源性細胞因子添加於培養物中。
對於製造方法1，添加於培養基中的蛋白質性之因子，可與培養之CD14陽性細胞(例如單核細胞)為來自相同動物種，亦可來自相異動物種，但較佳為來自相同動物種。例如培養人類CD14陽性細胞(例如人類單核細胞)時，添加來自人類的蛋白質性因子(例如人類GM-CSF等)。其中，對於蛋白質性因子，所謂「來自人類」表示該因子之胺基酸序列與人類在天然所表現的該因子之胺基酸序列相同的意思。
使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)的培養之培養基的基礎培養基可使用自身公知者，藉由製造方法1製造NKT細胞配位體脈衝細胞之範圍並無特別限定，例如可舉出RPMI-1640、DMEM、EMEM、α-MEM、F-12、F-10、M-199、HAM等。又，亦可使用改為淋巴球培養用等之培養基(例如AIM-V)，亦可使用上述基礎培養基之混合物。
該培養基可含有自身公知的添加物。作為添加物，僅藉由製造方法1製造NKT細胞配位體脈衝細胞之範圍即可，並無特別限定，例如可舉出有機酸(例如丙酮酸鈉等)、胺基酸(例如非必須胺基酸、L-谷氨醯胺等)、還原劑(例如2-巰基乙醇等)、緩衝劑(例如
HEPES等)、抗生物質(例如鏈黴素、青黴素、慶大霉素等)等。該添加物以含在各自身公知濃度範圍內者為佳。
又，該培養基可含有或不含有血清。作為血清若為來自哺乳動物的血清即可，藉由製造方法1製造NKT細胞配位體脈衝細胞之範圍並無特別限定，較佳為來自上述哺乳動物之血清(例如牛胚胎血清、人類血清等)。亦可使用採用經培養的CD14陽性細胞(例如單核細胞)的被驗體之自身血清。取代血清，亦可使用血清的代替添加物(例如剔除血清替代物(Knockout Serum Replacement(KSR))(Invitrogen公司製)等)。血清的濃度雖並無特別限定在藉由製造方法1製造NKT細胞配位體脈衝細胞之範圍內，通常為0.1~30(v/v)%之範圍。
由欲避開化學性未決定的成分之混入的觀點來看，使用於CD14陽性細胞(例如單核細胞)之培養的培養基，較佳為使用無血清培養基。所謂無血清培養基表示未含有無調製或未純化之血清的培養基，於混入來自經純化的血液之成分或來自動物組織之成分(例如增殖因子)的培養基相當於無血清培養基。
經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)之培養，例如將自上述活體試料所分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)經離心分離等回收細胞，除去上清培養基，於含有上述NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-4之培養基中懸浮，可藉由於培養皿播種並培養所定時間而實施。將經分離的CD14陽性細胞(例如單核細
胞)懸浮於未含有NKT細胞配位體及/或GM-CSF，且實質上未含有IL-4的培養基中，於培養皿播種後，可將NKT細胞配位體及/或GM-CSF添加於培養基中至所定濃度。培養之規模提高為配合期待的目的，可藉由調節培養皿等適宜實施。
在培養開始時的CD14陽性細胞(例如單核細胞)之播種密度於藉由製造方法1製造NKT細胞配位體脈衝細胞之範圍內即可並無特別限定，但由期待達成比較高生存率、回收率及生存細胞數之觀點來看，通常為0.42×106~3.42×106(cells/cm2)，較佳為1.68×106~3.42×106(cells/cm2)。且，分母面積表示培養容器之底面積。
在含有NKT細胞配位體之培養基中的經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)之培養時間(即，藉由NKT細胞配位體之脈衝時間)對於藉由製造方法1製造NKT細胞配位體脈衝細胞之範圍中並無特別限定，但由確實呈現NKT細胞配位體，提高NKT細胞之能力的觀點來看，通常為16小時以上，較佳為16~72小時，更佳為20~72小時。
其他培養條件可使用在淋巴球培養技術中通常使用的培養條件。例如培養溫度通常約30~40℃之範圍，較佳為約37℃可例示。CO2濃度通常約1~10%之範圍，較佳為約5%可例示。濕度通常約70~100%之範圍，較佳為約95~100%可例示。
藉由如此培養操作，NKT細胞配位體進入CD14陽性細胞(例如單核細胞)後，藉由CD1d蛋白質可呈現於細胞膜上，進而可得到NKT細胞配位體脈衝細胞。
藉由製造方法1所得之NKT細胞配位體脈衝細胞為，具有誘導活化NKT細胞，NKT細胞之增殖、IFN-γ產生及/或對於腫瘤細胞之細胞毒活性的活性。
欲得到NKT細胞配位體脈衝細胞，將培養後細胞與經分離的NKT細胞共培養，藉由評估IFN-γ產生而可確認。將NKT細胞配位體脈衝細胞與經分離的NKT細胞共培養後，誘導出NKT細胞被活化，IFN-γ之產生。
藉由製造方法1所得之NKT細胞配位體脈衝細胞，其較佳為CD14陽性。藉由製造方法1所得之NKT細胞配位體脈衝細胞中的CD14陽性細胞之比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
藉由製造方法1所得之NKT細胞配位體脈衝細胞，較佳為CD1d陽性。由上述培養所得之細胞集團中的CD1d陽性細胞之比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
藉由製造方法1所得之NKT細胞配位體脈衝細胞，其較佳為CD40陽性。藉由上述培養所得之細胞集團中的CD40陽性細胞之比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
對於較佳態樣，藉由製造方法1所得之NKT細胞配位體脈衝細胞為CD14陽性CD1d陽性CD40陽性。藉由
上述培養所得之細胞集團中的CD14陽性CD1d陽性CD40陽性細胞之比例，例如50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。將經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含IL-4之培養基中進行培養後，不僅可維持CD1d之表現，亦可誘導對於NKT細胞之活化為重要之CD40的表現，期待得到NKT細胞經活化的能力為高的細胞。
製造方法1為將經分離的CD14陽性細胞(例如單核細胞)在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-4的培養基中進行培養，回收NKT細胞配位體脈衝細胞後，欲除去於培養基中游離的過剩量之NKT細胞配位體而可含有洗淨步驟。於洗淨中可使用適切培養基、生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、林格氏液等。
本發明為提供一種含有將使單核細胞等CD14陽性細胞經株化(永生化)所得之CD14陽性細胞株，在含有NKT細胞配位體，而實質上未含有GM-CSF及IL-4的培養基中進行培養之步驟的NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株的製造方法(本發明之製造方法2)。
CD14陽性細胞株為自單核細胞等CD14陽性細胞所構築的細胞株。CD14陽性細胞株，例如可在實質上未含有GM-CSF及IL-4之培養基中進行培養後而調製。該CD14陽性細胞株之調製為，除使用於培養之培養基為可
未含有NKT配位體以外，可依據上述製造方法1進行。
又，自由單核細胞等所構築的細胞株之中，即使選擇滿足CD14陽性CD1d陽性之表現形式的細胞株，亦可獲得達到目的之CD14陽性細胞株。作為如此細胞株，例如可舉出THP-1或U937。
又，可使用自iPS細胞等初期化細胞(多能性幹細胞)所誘導分化而構築之CD14陽性細胞株。自經初期化細胞得到CD14陽性細胞株之方法，例如可參照Grigoriadis et al.,Blood.2010 Apr 8；115(14)：2769-76或Stem Cells.2016 Dec；34(12)：2852-2860而進行，若為斯業者可任意地使方法最適化，故並無限定於此。
於製造方法2所提供的CD14陽性細胞株，較佳為經分離者。
提供於製造方法2之CD14陽性細胞株，較佳為CD14陽性。對於培養開始時，於製造方法2所使用的經分離的CD14陽性細胞株所佔的CD1d陽性細胞之比例，通常為70%以上，較佳為80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上或99.5%以上，最佳為100%。
CD14陽性細胞株在含有NKT細胞配位體之培養基中的培養為，除去使用於培養的培養基為實質上未含有GM-CSF以外，可依據上述製造方法1進行。
使用於CD14陽性細胞株的培養之培養基中的GM-CSF濃度，通常為未達0.01ng/mL，較佳為未達0.001ng/mL，更佳為未達0.0001ng/mL(例如0ng/mL)。
因此，對於較佳態樣，於CD14陽性細胞株之培養中，未將外源性GM-CSF添加於培養物中。
且，在含有NKT細胞配位體之培養基中經分離的CD14陽性細胞株之培養時間(即，藉由NKT細胞配位體之脈衝時間)對於藉由製造方法2製造NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株之範圍下並無特別限定，通常為2小時以上，較佳為2~72小時。對於製造方法2，與製造方法1比較時為短時間較佳，例如即使為2小時程度的脈衝時間，亦可獲得活化NKT細胞之能力。因此，在製造方法2中之脈衝時間，例如可為32小時以下，24小時以下、8小時以下、7小時以下、4小時以下者。
藉由製造方法2所得之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株為具有誘導活化NKT細胞、NKT細胞之增殖、IFN-γ產生及/或對腫瘤細胞的細胞毒活性之活性。
藉由製造方法2所得之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株，較佳為CD14陽性。藉由上述培養所得之細胞集團中的CD14陽性細胞之比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
藉由製造方法2所得之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株，較佳為CD1d陽性。藉由上述培養所得之細胞集團中的CD1d陽性細胞之比例，例如為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
藉由製造方法2所得之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株，較佳為CD40陽性。藉由上述培養所得
之細胞集團中的CD40陽性細胞之比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。
對於較佳態樣，藉由製造方法2所得之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株成為CD14陽性CD1d陽性CD40陽性。藉由上述培養所得之細胞集團中的CD14陽性CD1d陽性CD40陽性細胞的比例，例如為50%以上，較佳為60%以上、70%以上、80%以上或90%以上。將CD14陽性CD1d陽性細胞株在含有NKT細胞配位體，而實質上未含有GM-CSF及IL-4之培養基中進行培養後，可快速地使NKT細胞配位體表現於CD1d上，可期待得到CD40為表現增強，活化NKT細胞之能力高的細胞。
製造方法2為將CD14陽性細胞株，在含有NKT細胞配位體，而實質上未含有GM-CSF及IL-4的培養基中進行培養，回收NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株後，欲除去游離於培養基中之過剩量NKT細胞配位體而可含有洗淨步驟。洗淨中可使用適切培養基、生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、林格氏液等。
本發明為亦提供含有上述本發明之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株之細胞製劑。該NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞及NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株各可藉由上述本發明之
製造方法1及製造方法2而得。含於本發明之細胞製劑的NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株為，各細胞在浮遊狀態、凝集成為細胞塊之狀態，或浮遊細胞與凝集塊混在之狀態亦可。NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株，通常懸浮於醫藥上可被許可的稀釋用載體，例如生理食鹽水、緩衝液等。NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株，視必要可加入白蛋白等蛋白質或藥理活性成分等添加劑，可放入任意樣品瓶、袋子、注射器等容器而成為細胞製劑。1樣品瓶單位(vial)或1用量單位之NKT細胞配位體脈衝細胞之細胞數，例如可調整至1×105~1×109個。又，亦可作為將該NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株經濃縮後使用的細胞製劑。稀釋用載體或蛋白質、添加劑可適宜地選擇出適合於含於該細胞製劑之細胞集團者。細胞製劑中除進一步添加DMSO等保護劑以外，亦可經冷凍作為細胞製劑。
本發明之細胞製劑為，藉由NKT細胞活化劑以及藉由NKT細胞活化經誘導的NKT細胞之增殖(NKT細胞數之增加)、IFN-γ之產生及/或細胞毒活性可直接或間接地達成預防或治療效果之疾病(於下述詳述)的預防或作為治療劑使用。
依據本發明，藉由經上述本發明之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株，或含有該NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株的細胞製劑投與於被驗體後，可活化該被驗體中之NKT細胞。特別為本發明中，可誘發活化被驗體中之NKT細胞、NKT細胞之增殖(NKT細胞數之增加)、IFN-γ之產生、輔助劑作用、長期免疫記憶及/或細胞毒活性。因此，將上述本發明之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株，或含有該NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株的細胞製劑投與於被驗體時，藉由該被驗體中經NKT細胞活化誘導的NKT細胞之增殖(NKT細胞數之增加)、IFN-γ之產生、輔助劑作用、長期免疫記憶及/或細胞毒活性而可直接或間接地預防或治療的其效果受到期待之疾病的預防或治療上。
所位在本說明書中之「被驗體」表示可藉由本發明之方法進行治療的對象，例如可舉出人類、老鼠、大鼠、兔子、狗、貓、牛、馬、猴、豬等哺乳動物。較佳為人類。
作為藉由NKT細胞活化所誘導的NKT細胞之
增殖(NKT細胞數之增加)、IFN-γ之產生、輔助劑作用、長期免疫記憶及/或藉由細胞毒活性可直接或間接地預防或治療的效果可被期待之疾病，可舉出各種癌(例如乳癌、大腸癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝臟癌、膽道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巢癌、甲狀腺癌、胰臟癌、腦腫瘤、卵巢癌、皮膚癌、血液腫瘤(例如成人T細胞白血病、慢性骨髓性白血病、惡性淋巴瘤等)等)；各種感染症，例如可舉出病毒性疾病(例如B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒所引起的病毒性肝炎、皰疹病、後天性免疫不全症候群(AIDS)、流行性流感等)、細菌感染症(例如藥劑耐性結核、非定形抗酸菌感染症等)、真菌症(例如念珠菌感染等)等。被驗體較適合為罹患癌症者或具有癌症罹患歷的哺乳動物(例如人類)，或罹患感染症者，或具有感染症之罹患歷的哺乳動物(例如人類)。本發明之細胞製劑亦可適用於感染症、癌症轉移或復發治療或預防上。
NKT細胞因可活化具有對體內癌細胞或病原體感染細胞直接作用之種種免疫細胞(例如細胞傷害性T細胞、NK細胞等)，本發明之細胞製劑與癌症或病原體種類無關，可適用於癌症或感染症之預防或治療。
作為投與方法，若為將本發明之細胞製劑達到患部或存在於該周邊之NKT細胞的方法即可，並無限定。例如可舉出靜脈內投與、動脈內投與、黏膜內投與、淋巴節內投與、患部組織內投與等。具體為可對於患者的
疾病部位通過注射針直接送達細胞製劑。又，亦可於靜脈或動脈通過導管，投與細胞製劑。
一次投與細胞集團的數目，若可活化患部或存在於該周邊之NKT細胞，可預防或治療作為目的之疾病的充分數目即可，並無特別限定，例如1×104~1×109個/體重kg，較佳為1×105~1×107個/體重kg，更佳為1×105~1×106個/體重kg。又，細胞製劑中之細胞濃度通常為1×104~1×107個/mL，較佳為1×105~5×106個/mL，更佳為3×105~3×106個/mL。投與可配合被驗體之狀態或疾病的嚴重程度等進行複數次。
投與於被驗體之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株係由來自自身CD14陽性細胞(例如單核細胞)(遺傳性同種．同系)，或來自其他(遺傳性同種．異系)CD14陽性細胞(例如單核細胞)或CD14陽性細胞株(含有自iPS細胞等初期化細胞所誘導分化而構築的CD14陽性細胞株)所製作而得。將由被驗體本人的CD14陽性細胞(例如單核細胞)所製作的NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞投與於該被驗體者為佳，但亦可投與於已被預測為對於被投與的對於來自其他的NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞或NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株具有適合性的被驗體為佳。
含有本說明書中所舉出的專利及專利申請說明書的所有刊物中所記載的內容藉由在本說明書的引用，
全明確記載於本說明書中。
以下舉出實施例更詳細說明本發明，但本發明並未受限於下述實施例等。
使用來自義工健常人末梢血300mL的Ficoll-Paque PLUS(GE醫療保健．JAPAN、編碼號碼17144002)，分離單核球層(回收細胞數：9.7x108)，使用抗CD14抗體結合微珠(Miltenyi Biotech,Order no.130-050-201)，分離純化CD14陽性細胞(回收細胞數：10.7x108、回收率：10.5%、CD14陽性率：99.2%、生存率：98.0%)。將一部分細胞提供於樹突狀細胞之分化培養。在抗CD14抗體結合微珠未分離的細胞組分作為CD14陰性細胞回收。
由義工健常人末梢血血液分離液99mL使用細胞分離
裝置(Terumo公司製：Elutra)進行單核細胞細胞組分的分取(回收細胞數：1.1x109)、人類CD14陽性細胞(人類Elu-CD14陽性細胞)分離(回收總細胞數：1.1x109、單核細胞回收率：49.1%、CD14陽性率：75.1%、生存率：98.3%)。藉由本方法的分離純化與使用CD14抗體進行分離純化做比較，其回收率有著戲劇性地改善，作為結果可得到大量CD14陽性細胞。
使用HES(hydroethyl starch)除去大量紅血球，以含有葡聚醣(dextran)之冷凍劑所冷凍之人類臍帶血(理化學研究所生物資源中心、筑波)(含有全白血球)，使用抗CD14抗體結合微珠(Miltenyi Biotech,Order no.130-050-201)使CD14陽性細胞(單核細胞)分離純化(回收細胞數：10.7x108、回收率：10.5%、CD14陽性率：99.2%、生存率：98.0%)。將一部分細胞提供於樹突狀細胞之分化培養。將以抗CD14抗體結合微珠未被分離的細胞組分作為CD14陰性細胞回收。
由使用抗CD14抗體進行分離後的人類單核細胞．CD14陽性細胞及人類末梢血之血液分離液藉由淘析方法所得之單核細胞．CD14陽性細胞(人類Elu-CD14陽性細胞)，各於添加細胞因子[53.3ng/mL Recombinant Human GM-CSF(Miltenyi Biotech)單獨]之AIM-V培養基中復懸浮，以3x106/mL的細胞密度於24-well培養盤(Falcon)以1mL/well的細胞密度播種。同時添加RK-163(原料粉末溶解於添加DMSO及0.5% Tween20的PBS)至最終濃度為100ng/mL，在37℃ 5%CO2下進行48小時培養，作為“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”及“RK-163脈衝人類Elu-CD14陽性細胞”。生存率、回收率及NKT活化作用(IFN-γ產生、細胞數增大、細胞毒活性)的測定由下述所示要領進行。
欲將新穎技術與過去方法做比較，將由1)所得之人類CD14陽性細胞(單核細胞)懸浮於AIM-V(Gibco、code no.0870112-DK)培養基，以1x106/mL的細胞濃度於6-well培養盤(Falcon)以5mL/well播種。添加Recombinant Human GM-CSF 53.3ng/mL及IL-4 34.7ng/mL(皆為Miltenyi Biotech)，在37℃、5%CO2下進行6天培養，誘導分化成樹突狀細胞後，添加RK-163(將原料粉末溶解於添加DMSO及0.5%Tween20的PBS)至最終濃度
100ng/mL，在37℃ 5%CO2下進行48小時培養，作為“RK-163脈衝人類樹突狀細胞”。
以0.4%台盼藍(Trypan blue)(Bio-Rad)染色後，使用TC20TM全自動細胞計數器(Bio-Rad)測定未被染色的活細胞及染成藍色的死細胞2次，計算其平均，算出活細胞數及生存率。
對於細胞，添加對於以下各抗原之藻紅蛋白(Phycoerythrin)標識化抗人類抗體[CD14(clone HCD14、Biolegend)、CD11c(clone3.9、Biolegend)、CD11b(clone ICRF44、BD Biosciences)、CD45(clone HI30、Biolegend)、HLA-DR(clone L243、Biolegend)、CD1d(clone 51.1、Biolegend)、CD40(clone 5C3、Biolegend)、CD95(Fas)(clone DX2、Biolegend)、CD80(clone 2D10、Biolegend)、CD86(clone IT2.2、Biolegend)、及CD209(clone DC-SIGN、Miltenyi Biotech)]，遮光30分鐘後在4℃靜置反應。經離心、洗淨後，於0.5%人類血清白蛋白加PBS使細胞懸浮，藉由流式細胞儀分析(FACSCantoII、BD
Biosciences)調查CD14陽性細胞之純度及各種表面抗原的表現。
將使用抗CD14抗體進行分離後的人類CD14陽性細胞(單核細胞)與人類CD14陰性細胞或人類Elu-CD14陽性細胞(單核細胞)，與GM-CSF及NKT細胞配位體RK-163同時進行2天培養的細胞(各稱為“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”“RK-163脈衝人類CD14陰性細胞”“RK-163脈衝人類Elu-CD14陽性細胞”)、及在2)-(2)添加GM-CSF與IL-4的6天培養所誘導分化的樹突狀細胞(稱為“RK-163脈衝人類樹突狀細胞”)之調製中，於各細胞中添加RK-163(將原料粉末溶解於添加DMSO及0.5% Tween20的PBS)至最終濃度為100ng/mL，在37℃ 5%CO2下進行48小時培養後，製作出“RK-163脈衝細胞”。培養後將回收細胞進行2次離心洗淨，藉由Trypan blue染色將活細胞數以TC20TM全自動細胞計數器計算。將RK-163脈衝細胞與人類NKT細胞株各成1x106/mL而懸浮於添加10%牛胚胎血清(Sigma、Lot No.114K525)的RMPI-1640(Invitrogen)，以1x105/0.1mL/well的細胞濃度將各細胞懸浮液播種於96-well丸底培養盤中，在37℃ 5%CO2下進行48小時培養。培養後回收200μL的上清液，將產生分泌的IFN-γ以市售的ELISA套組(BD Biosciences)進行測定。
本研究為依據理化學研究所「有關人類作為
對象的研究之倫理規定」，已於同研究所倫理審査委員會在研究開始前得到認可。本研究為遵守前項規定及「有關將人作為對象之醫學研究的倫理指針」(文部科學省、厚生勞働省)進行。
在自人類末梢血分離後的CD14陽性細胞(單核細胞)中，CD1d及CD14抗原的表現極高，樹突狀細胞的特徴(CD14陰性、CD209陽性)幾乎未被確認。
另一方面，對於在NKT細胞配位體RK-163與2天GM-CSF存在下進行培養的「RK-163脈衝人類CD14陽性細胞」，活化NKT細胞，引起INF-γ產生的CD40之表現雖急速亢進，但未確認到樹突狀細胞之特徴(CD14陰性、CD209陽性)。「RK-163脈衝人類CD14陽性細胞」及「RK-163脈衝人類Elu-CD14陽性細胞」仍然表現CD14及CD1d，由CD14陽性細胞可確認其為與樹突狀細胞相異的細胞。
對於將CD14陽性細胞(單核細胞)在GM-CSF+IL-4存在下進行6天培養之「RK-163脈衝人類樹突狀細胞」，雖確認到CD40之高表現，但幾乎未見到CD14抗原之表
現，CD1d的表現亦顯著降低。(圖1)。CD1d與NKT配位體(RK-163)結合，因與CD40的表現同時為NKT細胞活化上必須分子，故「RK-163脈衝CD14陽性細胞」為該雙方的表現高，對於NKT細胞活化最適合。另一方面，對於「RK-163脈衝人類樹突狀細胞」中之CD1d表現的降低，即使見到於NKT細胞活化為必須的CD40分子之表現，其可能為造成NKT細胞活化降低的原因。
將人類NKT細胞株提供於“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”與共培養時的IFN-γ產生做調查時，比與“RK-163脈衝人類樹突狀細胞”共培養時高出3倍程度。對於藉由CD14抗體結合微珠的分離後之「CD14陰性細胞」使配位體脈衝的「RK-163脈衝人類CD14陰性細胞」之NKT細胞活化能(即由NKT細胞之IFN-γ產生)為低(圖2)。此結果得知，“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”為與“RK-163脈衝人類樹突狀細胞”及“RK-163脈衝人類CD14陰性細胞”相比較，其顯示極高NKT細胞活化作用。
分取抗CD14抗體結合微珠分離後的CD14陽性細胞，將NKT配位體之RK-163及其他NKT細胞配位體之α-GalCer在100ng/mL與含有濃度GM-CSF(53.3ng/mL)之培養基中進行種種時間(0,16,48,64及72小時)脈衝培養，比較對於誘導NKT細胞之IFN-γ產生的活性之影響。其結果，自脈衝16小時後確認IFN-γ產生誘導活性，於48~72小時後確認到高活性(圖4左)。調查此時的回收率與生存率時，皆為48小時間為最高(圖4右)，故表示抗CD14抗體結合微珠分離後的CD14陽性細胞在RK-163脈衝48小時後的NKT細胞之活化能(IFN-γ產生誘導)、回收率、生存率皆為良好條件(圖4)。
將人類NKT細胞在含有FCS(5%)(sigma,lot 14K525)、丙酮酸鈉(sodium pyrubate)、NEAA(非必須胺基酸)、2-ME、IL-2(100U/mL)(Imunesu)之AIM-V(50%)與RPMI-1640(45%)之混合培養基中，與上述同樣地製作的“α-GalCer或RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”或“α-GalCer或RK-163脈衝人類樹突狀細胞“共同進行8~10天培養而使其受到刺激，測定NKT細胞之增殖活性。NKT細胞與RK-163脈衝CD14陽性細胞或RK-163脈衝樹突狀細胞的混合比為1：1.5~5。
其結果，RK-163或者α-GalCer脈衝CD14陽性細胞皆比RK-163或者α-GalCe脈衝樹突狀細胞顯示更強力之NKT細胞之增殖誘導。且在α-GalCer脈衝CD14陽性細胞與RK-163脈衝CD14陽性細胞之間，NKT細胞增殖誘導活性並無特別顯示其差異(圖6)。
將人類NKT細胞在含有FCS(5%)(對iPS細胞細胞增殖的適合量)、丙酮酸鈉、NEAA、2-ME、IL-2(100U/mL)(Imunesu)之AIM-V(50%)與RPMI-1640(45%)之混合培養基中，與上述同樣地製作的“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”或“RK-163脈衝人類樹突狀細胞”共同進行8~10天培養而使其受到刺激。NKT細胞與RK-163脈衝CD14陽性細胞或RK-163脈衝樹突狀細胞的混合比為1：1.5~5。將所得之人類NKT細胞在96孔圓底盤上，含有FBS(10%)之complete RPMI-1640培養基中，與NCI H460細胞(人類肺癌細胞株)共同培養4小時後，對於NCI H460細胞進行細胞毒活性的調查。將目標(NCI H460細胞)之細胞數作為1×104cells/well，效應子(effector)：目標(target)比為3：1及10：1。
其結果顯示將人類NKT細胞與“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”共培養而得之人類NKT細胞，比與“RK-163脈衝人類樹突狀細胞”共培養而得之人類NKT細胞更具有強力細胞毒活性(圖7)。又，RK-163與α-GalCer相比，對於人類NKT細胞具有更強的細胞毒活性誘導。
藉由取代RK-163使用RCAI-85(100ng/mL)、RCAI-137(100ng/mL)，將自人類末梢血所分離的CD14陽性細胞(單核細胞)進行48小時脈衝，得到各配位體脈衝CD14陽性細胞。將1x105個RK-163脈衝CD14陽性細胞或其他配位體脈衝CD14陽性細胞於96孔圓底盤播種，1x105個人類NKT細胞與含有10% FBS之complete RPMI-1640培養基中進行48小時共培養，測定培養液中之IFN-γ濃度。其結果為RK-163脈衝CD14陽性細胞或其他配位體脈衝CD14陽性細胞顯示，與RK-163脈衝CD14陽性細胞之同樣強力地自NKT細胞誘導IFN-γ產生(圖8)。
驗證“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”對於罹癌動物的實際顯示抗腫瘤效果。
於C57BL/6雌老鼠之脾臟內移植B16老鼠黑色素瘤細胞，4日後依據實施例1的方法調製之“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”進行靜脈內投與。10日後使其安樂死後取出肝臟，製作出其勻漿後溶解於1N NaOH，回收澄清液。以分光光度計測定澄清液中的黑色素吸光度，藉由劃標準曲線，定量自脾臟轉移至肝臟的腫瘤細胞數。
其結果，“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”顯示強抗腫瘤效果，顯著抑制黑色素腫瘤細胞之轉移(圖9)。
THP-1細胞及U937細胞係由ECACC、JCRB獲得。iPS-CD14陽性細胞株為使用熊本大千住氏所構築的細胞(Senju et al.Stem Cells,27：1021-1031,2009)。
將人類CD14陽性細胞株THP-1細胞及U937細胞懸浮在RPMI1640/10%FBS培養液至1~3x106cells/ml，於24-well培養盤(Falcon)以1mL/well之細胞密度播種。同時添加RK-163(將原料粉末溶解於添加DMSO及0.5% Tween 20的PBS)至最終濃度為100ng/mL，在GM-CSF非存在下，在37℃，5% CO2下進行8~48小時，做成“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株”。
iPS-CD14陽性細胞為與THP-1及U937同樣地在RK-163存在下進行8~48小時培養，做成“RK-163脈衝人類iPS-CD14陽性細胞株”。
以0.4% Trypan blue(Bio-Rad)染色後，使用TC20TM全自動細胞計數器(Bio-Rad)測定未染色的活細胞及染色成藍色的死細胞2次，計算其平均，算出活細胞數及生存率。
於細胞，添加對於以下各抗原之Phycoerythrin標識化抗人類抗體[CD14(clone HCD14、Biolegend)、CD11c(clone 3.9、Biolegend)、CD11b(clone ICRF44、BD Biosciences)、CD45(clone HI30、Biolegend)、HLA-DR(clone L243、Biolegend)、CD1d(clone 51.1、Biolegend)、CD40(clone 5C3、Biolegend)、CD95(Fas)(clone DX2、Biolegend)、20、CD80(clone 2D10、Biolegend)、CD86(cloneIT2.2、Biolegend)及CD209(cloneDC-SIGN、Miltenyi Biotech)]，經遮光30分鐘，於4℃靜置反應。離心並洗淨後於0.5%人類血清白蛋白添加PBS懸浮細胞，以流式細胞儀分析(FACSCantoII、BD Biosciences)對CD14陽性細胞的純度及各種表面抗原之表現做調查。
來自人類的CD14陽性細胞株(其中使用THP-1、
U937、及來自人類的iPS-CD14陽性細胞)中任一種與GM-CSF在存在下或非存在下，與NKT細胞配位體RK-163同時進行8~48小時培養，製作出“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株”。培養後將回收細胞進行2次離心洗淨，將藉由Trypan blue染色的活細胞數以TC20TM全自動細胞計數器算出。將各RK-163脈衝細胞與人類NKT細胞株懸浮於各成1x106/mL之添加10%胎牛血清(Sigma、Lot No.114K525)的RMPI-1640(Invitrogen)，以1 x 105/0.1mL/well之細胞濃度將各細胞懸浮液於96-well丸底培養盤中播種，在37℃ 5% CO2下進行48小時培養。培養後，回收200μL的上清液，將產生分泌之IFN-γ以市售ELISA套組(BD Biosciences)進行測定。
將THP-1、U937及來自人類的iPS-CD14陽性細胞之表面抗原表現圖各以圖10-1、10-2及10-3表示。在NKT細胞配位體脈衝THP-1細胞、iPS-CD14陽性細胞中，於NKT配位體之抗原表現上成為必須的CD1d分子之表現與在NKT細胞活化為必須的CD40分子之表現藉由FACS解析確認到。又，對於U937細胞之CD1d的表現亦藉由FACS解析確認，於RK-163脈衝後CD40mRNA表現上昇。因此，不僅於實施例1所記載的來自人類末梢血的CD14陽性細胞，藉由
CD14陽性細胞株亦可有效率地活化NKT細胞。
將人類NKT細胞株與各“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株”進行共培養，對人類NKT細胞株之IFN-γ產生做調查。又與人類末梢血CD14陽性細胞所製作的“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞”同樣地，顯示“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株”亦具有高NKT細胞活化作用(圖11)。
將來自人類的CD14陽性細胞株(U937細胞)與NKT配位體之RK-163(100ng/mL)在GM-CSF存在下或非存在下進行種種時間(2~48小時)脈衝培養，比較對於誘導NKT細胞之IFN-γ產生的活性之影響後，確認經脈衝2小時後有IFN-γ產生誘導活性(圖12左)。
又，將THP-1在RK-163(100ng/mL)與GM-CSF非存在下，進行8~24小時脈衝培養後，將3x105個“RK-163脈衝THP-1細胞株”對於C57BL/6老鼠進行靜脈注射，經24小時後採血並定量血中IFN-γ量後，確認自脈衝7小時後血中IFN-γ濃度之上昇(圖12右)。
由以上結果得知，如THP-1、U937表現CD14及CD1d之細胞株在GM-CSF非存在下，即使進行非常短時間之脈衝處理，亦可誘導NKT細胞之IFN-γ產生。
與實施例1(7)同樣地，檢討對人類NKT細胞之細胞障礙活性的影響。即，將人類NKT細胞與“來自RK-163脈衝人類的CD14陽性細胞株“以混合比「1：1.5~5」進行16~24小時培養而受到刺激。將所得之人類NKT細胞株在96孔圓底盤上，含有FBS(10%)之complete RPMI-1640培養基中，與NCI H460細胞(人類肺癌細胞株)，或YAC-1細胞(來自老鼠淋巴瘤的細胞)同時培養4小時後，對於NCI H460細胞或YAC-1細胞之細胞毒活性進行調查。將目標(NCI H460細胞或YAC-1)之細胞數設定為1×104cells/well，將效應子：目標比設定為3：1及10：1。
其結果使用“來自RK-163脈衝人類的CD14陽性細胞株”時，NKT細胞的細胞毒活性亦被誘導(圖13)。
證明“RK-163或α-GalCer脈衝老鼠樹突狀細胞”及“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株”在罹癌動物上實際顯示抗
腫瘤效果。
於C57BL/6雌老鼠之脾臟內移植B16老鼠黑色素瘤細胞，4日後將依據實施例1之方法所調製的RK-163或α-GalCer脈衝老鼠樹突狀細胞(來自C57BL/6)進行靜脈內投與。於10日後經安樂死取出肝臟，製作該勻漿後，溶解於1N NaOH並回收其澄清液。藉由分光光度計測定澄清液的黑色素吸光度，藉由畫標準曲線，定量自脾臟轉移至肝臟之腫瘤細胞數。
其結果，“RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞”與“α-GalCer脈衝老鼠樹突狀細胞”相比較，顯示更強抗腫瘤效果，顯著抑制黑色素腫瘤細胞之轉移(圖14A)。
同樣地，“RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株”(THP-1細胞、U937細胞)亦顯示強力抗腫瘤效果(圖14B)。
NKT細胞之抗腫瘤效果不僅直接對腫瘤產生作用，反而藉由活化其他免疫擔當細胞的輔助劑作用而被誘導。其中，RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞及RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株為活化體內的NKT細胞，評估藉由該輔助劑作用是否活化自然免疫系NK細胞。
將RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞(來自C57BL/6)投與於C57BL/6老鼠的靜脈內，經14日後使其安樂死，進行脾臟細胞之FACS解析，調查於NK細胞組分(NK1.1陽性、
TCRβ陰性)中之活化標記物(CD69)的表現。其結果，確認幾乎所有(100%)NK細胞被活化(活化標記物CD69分子之表現亢進)，在活體內NKT細胞引起強輔助劑效果(圖15A)。
又，將OVA(卵白白蛋白)抗原視為人工腫瘤抗原，將經OVA脈衝的脾細胞與RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株(THP-1或U937)對C57BL/6老鼠進行靜脈內投與，同時活化活體內之OVA反應性T細胞與NKT細胞。復經4日後，投與RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株，並在投與1週後進行FACS解析。
其結果顯示，即使藉由RK-163脈衝人類CD14/CD1d陽性細胞株之投與，於NK細胞組分中之CD69的表現會亢進，藉由NKT細胞之輔助劑效果，使NK細胞活化(圖15B)。
使用B6.CD45.1(Ly.5.1)同類系(congenic)老鼠，將該老鼠作為接受者，將RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞經靜脈內投與後，調查於體內之RK-163脈衝樹突狀細胞的動態。其結果得知，於投與1小時後，主要分布於肺，其次為分布於肝臟，但24小時後減少，僅於肺上觀察到。72小時以後，於臟器中皆無確認到分布，表示自體內急速消失(圖16A)。
又，將RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株(其中為U937細胞)於C57BL/6老鼠進行靜脈投與後觀察體內動態，其快速自體內排除，經24小時後幾乎未觀察到腫瘤臟器，表示快速自體內排除(圖16B)。
這些結果表示RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株可作為安全性高之癌症免疫細胞治療藥。
欲評估RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株之急性毒性，將RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株(其中為U937細胞)，對C57BL/6老鼠以單次靜脈注射方式觀察到第14天的急性毒性。其結果，投與後第5天雖確認到AST、ALT之上昇，但第14日後恢復至投與前狀態(圖17A)。又，投與後第5天，確認肝臟與脾臟之重量增加，得知第14天後恢復至投與前之狀態(圖17B)。
由此可得知，本發明之方法為安全性高之癌症治療法。
RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株(其中為THP-1或U937)經永生化處理，在通常培養條件下時可無限地增殖。即在動物體內引起增殖時，恐怕會形成腫瘤。其中，使用對於RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株照射放射線後失去增殖性的試樣，實施藉由軟寒天群體形成法之致腫瘤
性試驗。
使用軟寒天群體形成分析套組(CytoSelect 96 Well Cell Transformation Assay Kit、Cell Biolabs公司)，依據套組之實驗程序書，實施實驗。對於RK-163脈衝人類CD14陽性細胞株(U937或THP-1)照射X線後，於軟寒天上播種，進行8天培養後測定其增殖性。其結果，未確認到增殖性，於人類體內亦無形成腫瘤，顯示對癌症免疫治療為有用(圖18)。
NKT細胞之抗腫瘤效果並非直接藉由NKT細胞之作用，亦可藉由活化其他免疫擔當細胞的輔助劑作用而發揮。又，經活化的免疫擔當細胞之一部分於體內長期間殘存，形成免疫記憶。證實藉由RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞活化的NKT細胞所引起的輔助劑作用，抗原特異性CTL被活化之同時形成長期記憶。
將卵白白蛋白(OVA)視為人工腫瘤抗原，將經OVA脈衝的脾細胞與RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞(皆來自C57BL/6)對於C57BL/6老鼠進行靜脈內投與，同時活化活體內之OVA反應性T細胞與NKT細胞。於4天後，復次投與RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞。投與1週後藉由經時性安
樂死後取出脾臟細胞，對於OVA反應性CTL之存在進行FACS解析。
藉由RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞之同時投與，於OVA反應可有效率地誘導產生IFN-γ之效應子CTL。解析該OVA反應性CTL之細胞表面分子(CD44及CD62L)後，藉由RK-163脈衝老鼠樹突狀細胞之同時投與，CD44+CD62L+之Effector Memory CTL數及CD44+CD62L-之Central Memory CTL數同時增加至第4週，皆顯示至6個月有效率地誘導且維持形成免疫記憶之記憶T細胞(圖19A)。其後確認可維持至9個月之長期記憶。
同樣地，在“來自RK-163脈衝人類的CD14陽性細胞株”(THP-1細胞、U937細胞)亦被誘導且維持形成免疫記憶之CD8記憶T細胞(圖19B)。
以強調說明本發明之較佳態樣，但對於較佳態樣之變更為斯業者可容易得知的事。本發明亦可實施除本發明在本說明書詳細記載以外之方法。因此，本發明亦含有「申請專利範圍」之精神及範圍所包含的所有變更。
含有於此所敘述的專利及專利申請說明書之所有刊物的記載內容皆引用於此，該所有內容皆以相同同程度記載於本說明書中。
依據本發明，可期待在比較短期間內製造具有強力NKT細胞活化能的NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞及NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株。藉由本發明之方法所得之NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞及NKT細胞配位體脈衝CD14陽性細胞株可強力誘導NKT細胞之增殖、NKT細胞之IFN-γ產生及細胞毒活性，故可作為使用於癌症及感染症等疾病的預防或治療上的細胞製劑。
本申請案係以在日本申請的日本特願2016-091674(申請日：2016年4月28日)為基礎，該內容皆包含於本說明書中。
Claims (16)
- 一種NKT細胞配位體脈衝人類(Ligand pulsed human)CD14陽性細胞的製造方法，其特徵為包含將經分離的人類CD14陽性細胞，在含有NKT細胞配位體及GM-CSF，而實質上未含有IL-14的培養基中進行培養的步驟；該NKT細胞配位體為，在呈現於α-半乳糖基神經醯胺或CD1d分子上時，藉由NKT細胞上之NKT細胞固有T細胞受體(NKT細胞受體)做特異性辨識，使NKT細胞進行特異性活性而得之該類似物。
- 一種NKT細胞配位體脈衝人類CD14陽性細胞株的製造方法，其特徵為含有將經分離的人類CD14陽性細胞株在含有NKT細胞配位體，而實質上未含有GM-CSF與IL-4的培養基中進行培養之步驟；該NKT細胞配位體為，在呈現於α-半乳糖基神經醯胺或CD1d分子上時，藉由NKT細胞上之NKT細胞固有T細胞受體(NKT細胞受體)做特異性辨識，使NKT細胞進行特異性活性而得之該類似物。
- 如請求項1或2之方法，其中培養基為實質上未含有SCF及/或Flt3L者。
- 如請求項1或2之方法，其中經分離的人類CD14陽性細胞之純度為70%以上。
- 如請求項1或2之方法，其中添加NKT細胞配位體後，至少進行16小時的細胞培養。
- 如請求項5之方法，其中添加NKT細胞配位體後，進行16~72小時的細胞培養。
- 如請求項1或2之方法，其中類似物為下述式(VI)：
- 如請求項7之方法，其中類似物為下述式
- 如請求項7之方法，其中類似物為下述式
- 如請求項1或2之方法，其中類似物為下述式(III)：
- 如請求項10之方法，其中類似物為下述式
- 如請求項1或2之方法，其中培養基中之NKT細胞配位體濃度至少為30ng/ml。
- 一種NKT細胞配位體脈衝人類CD14陽性CD1d陽性CD40陽性細胞，其特徵為藉由如請求項1~12中任一項之方法所得者。
- 一種細胞製劑，其特徵為含有如請求項13之細胞。
- 一種NKT細胞活化劑，其特徵為含有如請求項13之細胞。
- 一種癌症或感染症之治療或預防劑，其特徵為含有如請求項13之細胞。
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