CN101861167A - 包含装载有抗原和自然杀伤t细胞配体的单核细胞或未成熟骨髓细胞(imc)的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗传染性疾病或癌症的免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体，更确切地说，本发明涉及免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或IMC，上述两种细胞装载有抗原和α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)，所述α-半乳糖神经酰胺是一种糖脂且为自然杀伤T细胞配体。不同于树突状细胞，其中的单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)可容易地得到，上述两种细胞不仅诱导显著的细胞毒性T淋巴细胞应答水平，并且还对恶性肿瘤具有预防和治疗的作用。因此，本发明所述的免疫治疗性和预防性疫苗可有效地用作免疫治疗剂。

Description

包含装载有抗原和自然杀伤T细胞配体的单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的疫苗
技术领域
本发明涉及用于预防和治疗传染性疾病或癌症的免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。更确切地说，本发明涉及免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或IMC，上述两种细胞装载有抗原和α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)，所述α-半乳糖神经酰胺是一种糖脂且为自然杀伤T细胞配体。
背景技术
由于医学的进步，癌症患者的生存率正在提高。然而，随着环境因素的变化和平均寿命的延长，癌症的患病率也在提高。迄今为止，为治疗癌症已经进行了许多研究，并因此开发出了对于癌症患者治疗效果更好的新型药物以及治疗癌症的方法。然而，尽管在癌症治疗剂和治疗方法(例如手术、放疗和化疗)方面取得了突破，但对于恶性肿瘤的治疗效果仍然比较有限。此外，由非特异性细胞毒性产生的副作用以及癌症的复发仍然是需要考虑的问题。为克服上述问题，已经对包括免疫疗法在内的新型治疗方法进行了积极的试验并正在研制当中。免疫疗法具有下述优点：通过诱发肿瘤特异性毒性，减少由全身性毒性引起的副作用；通过建立对于肿瘤抗原的阳性记忆应答，改进常规的癌症治疗方法。
使用抗原递呈细胞的细胞抗癌疫苗可有效地活化CD8+T细胞和CD4+T细胞，从而产生出色的抗癌作用。用于抗原递呈细胞疫苗的最常用细胞为树突状细胞，所述树突状细胞摄取抗原并将其与共刺激信号一起递呈至效应细胞，因此，树突状细胞可活化效应细胞并诱导强的免疫应答。使用树突状细胞的细胞免疫治疗剂通过下述步骤制备并作用于患者：从患者的骨髓或外周血分离出树突状细胞或单核细胞(树突状细胞的前体)；将所得细胞进行增殖并分化；导入抗原；以及将所述细胞给予所述患者。所给予的树突状细胞将特异性抗原递呈至T细胞，并因而将T细胞有效地活化以诱导抗原特异性免疫应答。尽管具有这些优点，使用树突状细胞的细胞免疫治疗剂的开发仍然受到限制，这是因为：存在于外周血和淋巴组织的树突状细胞数目少；树突状细胞的分离较为困难；并且当所述细胞由单核细胞分化而来时，离体培养可能需要几天的时间。因此，需要开发替代的改进型细胞免疫治疗剂。
已经公知的是，稳定的自然杀伤T细胞(iNKT细胞)在各种免疫应答和免疫病理学方面总体上起关键作用。配体介导的iNKT细胞活化使得T细胞、B细胞、NK细胞以及树突状细胞发生活化。注射作为iNKT配体的α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)可通过NK细胞和T细胞的活化产生抗肿瘤免疫性(Moodycliffe AM等人，Nat Immunol 1：521-525，2000)。所述iNKT细胞支配(govern)着对于自身抗原和外源性抗原的响应，并决定是否诱导自身免疫或免疫应答(Kronenberg M，Annu Rev Immunol23：877-900，2005；Park SH & Bendelac A，Nature 406：788-792，2000)。
α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)是一种从海生海绵(marine sponge)提取的糖脂，其是具有Vα14+T细胞受体(TCR)的自然杀伤T细胞(NKT细胞)配体，并且由抗原递呈细胞(APC)上的CD1d分子递呈至NKT细胞(Kawano等人，Science 278：1626，1997)。自然杀伤T细胞配体对自然杀伤T细胞的活化使得细胞因子(例如IFN-γ和IL-4)大量产生，通过细胞因子的产生可控制对于特定疾病或感染的免疫应答(Chen等人，J Immunol 159：2240，1997；Wilson等人，Proc Natl Acad Sci USA100：10913，2003)。
不同于健康人群，癌症患者体内未成熟骨髓细胞(IMC)的数目会增加，所述未成熟骨髓细胞包括未成熟巨噬细胞、粒细胞、未成熟树突状细胞、单核细胞以及处于分化早期的骨髓细胞。在移植有肿瘤细胞的动物模型的血液、骨髓、脾脏和肿瘤组织中，也检测到IMC水平的显著增加。特别是在小鼠模型中，在IMC的表面上观察到CD11b和Gr-1的表达。在健康小鼠的血液和脾脏中，CD11b+/Gr-1+细胞的水平低达4％，这是因为CD11b+/Gr-1+细胞为巨噬细胞和树突状细胞的前体，如果提供适当的细胞因子，它们可分化为成熟的巨噬细胞和树突状细胞。然而，癌症患者体内的CD11b+/Gr-1+细胞由于肿瘤来源的因子(IL-6、IL-10、VEGF、GM-CSF等)不再进行分化，而是发生积聚。由于IMC在癌症患者的血液中以高水平积聚，所以可以容易地得到大量所述细胞。此外，当分离单核细胞来生产树突状细胞疫苗时，很难生产出(gate out)大量的IMC。已知在癌症患者和移植有肿瘤的动物体内所增殖并积聚的IMC会抑制免疫系统。然而，人们非常期待通过给予适当的刺激来改进免疫原性。
最近已经证明，通过活化自然杀伤T细胞可增强树突状细胞的免疫原性(Kronenberg M等人，Annu Rev Immunol 23：877-900，2005；Park SH等人，Nature 406：788-792，2000)。基于这一点，本发明者首次通过将自然杀伤T细胞配体递呈至B细胞来活化自然杀伤T细胞，并通过利用自然杀伤T细胞增加所述B细胞的免疫原性来进一步诱导细胞毒性T细胞对装载于B细胞上的抗原的响应，然后证实其效果类似于树突状细胞疫苗(Chung Y等人，Cancer Res 66(13)：6843-6850，2006)。然而，还没有报道指出，通过活化自然杀伤T细胞对免疫原性进行的改进不仅呈现于B细胞中，而且还呈现于单核细胞(树突状细胞的前体)或未成熟骨髓细胞(IMC)中。因此，为研究单核细胞和IMC是否可有效地用于所述抗癌细胞疫苗，本发明者将抗原肽和αGalCer同时装载至单核细胞或IMC，或者将αGalCer装载至用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞或IMC，然后将其给予至受试者体内。此外，本发明者通过证实用基于单核细胞或IMC的疫苗进行免疫诱导了所述抗原特异性免疫应答并产生显著的抗癌效果，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，所述疫苗可活化自然杀伤T细胞并诱导抗原特异性免疫应答，上述两种细胞装载有抗原；以及自然杀伤T细胞配体，特别是α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)。
为实现上述目的，本发明提供了免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。
本发明还提供了一种自然杀伤T细胞活化剂，所述活化剂包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)。
本发明进一步提供了一种细胞毒性响应诱导剂，所述诱导剂包含表达肿瘤抗原的单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)。
本发明还提供了用于疾病的免疫治疗和免疫预防的方法，所述方法包括下述步骤：将所述包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的免疫治疗性和预防性疫苗给予受试者，上述两种细胞装载有所述抗原和所述自然杀伤T细胞配体。
作为本发明组合物的单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)比树突状细胞更易于分离。在单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)装载有抗原和自然杀伤T细胞配体(特别是αGalCer)的情况下，用上述两种细胞进行的免疫不仅会在显著水平上诱导细胞毒性T细胞响应，还会诱导对于恶性肿瘤的预防作用和治疗作用。因此，包含所述细胞的疫苗可有效地用作癌症的预防剂和治疗剂。此外，即使没有CD4+T细胞的辅助，本发明所述的疫苗也可诱导免疫应答。因此，其可用于使感染HIV的患者进行免疫，所述患者患有由缺乏CD4+T细胞造成的免疫缺陷。
附图说明
本发明中优选实施方式的应用参考附图可以得到更好的理解，其中：
图1为显示单核细胞疫苗抗癌效果的图，所述疫苗装载有αGalCer和抗原肽。
图2为显示单核细胞疫苗抗癌效果的图，所述疫苗装载有αGalCer并且用表达抗原的腺病毒进行转导。
图3为显示IMC疫苗抗癌效果的图，所述疫苗装载有αGalCer和抗原肽。
图4为显示IMC疫苗抗癌效果的图，所述疫苗装载有αGalCer并且用表达抗原的腺病毒进行转导。
图5为显示由IMC疫苗对具有抗癌效果的免疫细胞进行确认的图：
a：NK细胞的清除；以及
b：CD4或CD8细胞的清除。
图6为显示抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活性的图，所述活性由装载有αGalCer和抗原肽的单核细胞疫苗进行诱导。
图7为显示抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞的剂量依赖活性的图，所述活性由装载有αGalCer和抗原肽的单核细胞疫苗进行诱导。
图8为显示抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活性的图，所述活性由装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞疫苗进行诱导。
图9为显示抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞的剂量依赖活性的图，所述活性由装载有αGalCer和抗原肽的IMC疫苗进行诱导。
图10为显示抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活性的图，所述活性由装载有αGalCer和抗原肽的IMC疫苗进行诱导。
图11为显示抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞的剂量依赖活性的图，所述活性由装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的IMC疫苗进行诱导。
图12为显示抗原特异性抗体反应的图，所述反应由装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞进行诱导。
图13为显示抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活性的图，所述活性由装载有αGalCer和OT-1抗原肽的IMC疫苗进行诱导。
具体实施方式
在下文中将对本发明进行详细描述。
由于人们已经普遍接受装载有α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)的树突状细胞(DC)会将稳定的自然杀伤T(iNKT)细胞活化(van der Vliet HJ等人，J Immunol Methods 1，247(1-2)：61-72，2001)这一观点，本发明者检验了装载有αGalCer的单核细胞或IMC是否具有同样作用。
单核细胞是来源于骨髓的前体细胞，具有分化为树突状细胞(DC)或巨噬细胞的潜力。本发明者从小鼠体内分离出表达CD11b的单核细胞，并制备出装载有αGalCer和抗原肽的单核细胞疫苗。通过使用表达肿瘤相关抗原Her-2/neu的HER-2/CT26(Penichet ML等人，Lab Anim Sci49：179-88，1999)细胞，研究了所述疫苗的抗癌效果。结果证实所述疫苗具有显著的抗癌效果(参见图1)。为证实所述疫苗是否可通过将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化来诱导细胞毒性免疫应答，进行了体内CTL分析。结果，观察到能够以高水平破坏靶细胞的细胞毒性免疫应答(参见图6)。事实上，只有1×106细胞就足以诱导有效的细胞毒性免疫应答(参见图7)。
然而，装载有抗原肽的细胞疫苗在临床应用中局限于主要组织相容性复合体(MHC)的单倍型(haplotype)。也就是说，所述疫苗不能广泛使用，而只能递呈单表位(single epitope)。与上述疫苗不同，由于使用表达抗原的病毒的疫苗传递了全抗原(whole antigen)，所以该疫苗不局限于主要组织相容性复合体的单倍型，并可应用于各种倍型，因此，该疫苗不仅诱导细胞介导的免疫应答，还会诱导体液免疫应答。因此，本发明者制备了装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞疫苗并研究了其抗癌效果。结果，移植了肿瘤并用所述单核细胞疫苗进行治疗的小鼠显示出存活时间的显著延长，这表明所述疫苗对于肿瘤细胞具有出色的抗癌效果(参见图2)。为研究所述疫苗是否可通过将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化来诱导细胞毒性免疫应答，进行了体内CTL分析。结果，只有2×106细胞足以诱导有效的细胞毒性免疫应答(参见图8)。相比于装载有抗原肽的单核细胞疫苗，该疫苗以较低水平诱导细胞毒性响应，但该疫苗所延长的存活时间要比装载有抗原肽的单核细胞疫苗更长。上述结果表明，除细胞毒性T细胞响应以外，所述腺病毒疫苗还诱导了另外的免疫应答。为证实用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞疫苗是否可同时诱导细胞介导的免疫应答和体液免疫，对通过给予所述单核细胞疫苗生成Her-2/neu特异性抗体进行研究。结果，在给予2×106细胞的组中观察到了最高的抗体生成，在给予1×106或5×105细胞的组中也观察到了显著的抗体生成(参见图12)。然而，在用低于2.5×105细胞治疗的组中没有检测到抗体生成。与此同时，除了将所述抗原肽替换为卵清蛋白，以与上述相同的方式制备IMC疫苗。将所述疫苗给予C57BL/6小鼠，并对细胞毒性进行研究。结果证实了对于卵清蛋白抗原的有效的细胞毒性响应，这表明由所述IMC疫苗诱导的免疫应答不限于特异性抗原，而是对各种抗原都具有响应(参见图13)。
在具有可移植的肿瘤或慢性炎症的小鼠体内，未成熟骨髓细胞(IMC)的水平在癌瘤和脾脏等中显著增加，同样的情况也出现在癌症患者的外周血中。所述IMC是骨髓细胞的前体，其具有分化为包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞在内的各种细胞的潜力，并且已知会通过利用精氨酸酶I、氧化氮、反应性氧类和TGF-β抑制癌症抗原特异性或非特异性T淋巴细胞的功能来加速肿瘤细胞生长。另外，还已知在荷瘤(tumor-bearing)小鼠体内增殖并积聚的IMC会在其表面同时表达Gr-1和CD11b，并且以高比例(high portion)包含单核细胞样细胞。因 此，本发明者研究了基于IMC的细胞疫苗是否具有抗癌效果，所述疫苗以与制备单核细胞疫苗类似的方法进行制备。本发明者从移植有Her-2/CT26细胞的小鼠体内分离出脾细胞，然后除去B细胞和树突状细胞。将αGalCer装载至所述细胞并分离出CD11b+细胞，然后再用抗原肽装载分离出的细胞，从而制得IMC疫苗。在制备该疫苗期间，自然杀伤T细胞和IMC共存，这意味着自然杀伤T细胞在IMC上识别出装载有αGalCer的CD1d，然后将IMC活化，从而产生更为有效的IMC疫苗。通过使用Her-2/CT26对所述疫苗的抗癌效果进行了研究。结果，所述疫苗显示出显著的抗癌效果(参见图3)。通过体内CTL分析，研究了所述疫苗是否通过将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化来诱导细胞毒性免疫应答。结果，检测到显著的细胞毒性免疫应答水平(参见图9)。上述结果表明，IMC疫苗通过诱导抗原特异性细胞毒性免疫应答来破坏癌细胞，从而具有显著的抗癌效果。
本发明者还制备了装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的IMC疫苗，并对其抗癌效果进行了研究。结果，IMC疫苗的给予显著延长了存活时间，表明对肿瘤细胞具有出色的抗癌效果(参见图4)。所述IMC疫苗的抗癌效果在除去NK细胞的组(参见图5a)或除去CD8+细胞的组(参见图5b)中显著降低，这表明所述的两个免疫亚型(immunesubset)在由IMC疫苗接种诱导的抗癌活性中起到关键作用。另一方面，相比于正常组，所述IMC疫苗的抗癌效果在除去CD4+细胞的动物组中没有降低(参见图5b)，这表明所述IMC疫苗可在没有CD4+T细胞的情况下诱导免疫应答。因此，所述疫苗可有效地作用于CD4+T细胞显著减少的HIV患者以进行免疫。通过体内CTL分析，进一步研究了所述疫苗是否可通过将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化来诱导细胞毒性免疫应答。结果，所述疫苗诱导了高水平的细胞毒性免疫应答(参见图10)。这一水平低于由装载有肽的IMC疫苗诱导的水平。然而，肽冲击(peptide-pulsed)的细胞疫苗只装载有单表位肽，而腺病毒转导的细胞疫苗可递呈多表位肽。此外，由于转导效率并非100％，因而估计特异性抗原肽特异性细胞毒性免疫应答水平相对较低。尽管如此，这一疫苗仍然具有同时诱导各种免疫应答的优点。当通过8×106细胞的所述疫苗诱导免疫时，诱导出近90％细胞毒性免疫应答，这表明用病毒转导的IMC疫苗有效地诱导了细胞毒性免疫应答(参见图11)。
本发明提供了免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。
所述自然杀伤T细胞配体包括α-半乳糖醛酸神经酰胺(GSL-1′)和α-葡糖醛酸神经酰胺(α-glucuronosylceramide)(GSL-1)(Mattner J等人，Nature 434：525，2005；Kinjo Y等人，Nature 434：520，2005)、来源于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas spp.)的GSL-4(Eur J Immunol 35：1692，2005)、来源于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的磷脂酰肌醇四甘露糖苷(Fischer K等人，PNAS 101：10685，2004)、作为自身抗原的异红细胞三己糖基神经酰胺(isoglobotrihexosylceramide)(Zhou D等人，Science306：1786，2004)和神经节苷脂GD3(Wu DY等人，J Exp Med 198：173，2003)、磷脂酰胆碱(J Immunol 175：977，2005)、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇(Immunity 12：211)、硫苷脂(J Exp Med 199：947，2004)、β-半乳糖神经酰胺(β-GalCer，Ortaldo JR等人，J Immunol 172：943)、利什曼原虫(Leishmania)表面糖苷键脂磷酸聚糖和糖化肌醇磷脂(glycoinositolphospholipids)(J Exp Med 200：895，2004)、作为αGalCer衍生物的β-端基异构GalCer和α-端基异构GalCer(J Immunol 173：3693，2004)、αGalCer变体(Nature 413：531，2001；Angew Chem Int Ed Engl 43：3818，2004；J Am Chem Soc 126：13602，2004；PNAS 102：1351，2004；PNAS102：3383，2005；J Am Chem Soc 128：9022，2006；J Immunol Methods312：34，2006；J Med Chem 50：585，2007；PNAS 104：10299，2007)以及细菌脂类抗原(bacteria lipid antigen)例如来源于皮疽诺卡氏菌(Nocardia falcinica)的葡萄糖单霉菌酸酯(Moody DB等人，J Exp Med192：965，2000)，但不总限于此。
本文所述的抗原可为能作为疫苗诱导免疫应答的任何抗原，例如由病原体(如病原细菌、病毒和寄生虫)获得的抗原和癌症抗原。此时可使用全长抗原或抗原片段。所述来源于病原细菌的抗原例如：百日咳杆菌(Bordetella pertussis)抗原(百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素)、破伤风类毒素、白喉类毒素、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)抗原(血清群A、B、C、Y和W-135的荚膜多糖(capsula polysaccharides))、肺炎球菌(pneumococcal)抗原(3型肺炎链球菌(Streptococcus pnemoniae)荚膜多糖)、结核抗原(tuberculosis antigen)、霍乱抗原(霍乱毒素B亚基)、葡萄球菌(staphylococcal)抗原(葡萄球菌肠毒素B)、志贺氏菌(shigella)抗原(志贺氏菌多糖)、疏螺旋体菌属(Borrelia sp.)抗原、白色念珠菌(Candida albicans)抗原和疟原虫(Plasmodium)抗原。所述来源于病毒的抗原例如：流感病毒抗原(血凝素抗原和神经氨酸酶抗原)、人乳头状瘤病毒(HPV)抗原(糖蛋白)、水疱性口炎病毒抗原(水疱性口炎病毒糖蛋白)、巨细胞病毒(CMV)抗原、肝炎病毒抗原(甲型肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、丁型肝炎(HDV)和庚型肝炎(HGV)的抗原)(核心抗原和表面抗原)、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、单纯疱疹病毒抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、GP-160、p18、Tat、Gag、Pol、Env)以及它们的复合物。所述癌症抗原选自于由下列物质所组成的组：Her-2/neu、蛋白酶3、维尔姆斯瘤(Wilm’stumor)相关基因(WT-1)、鼠球蛋白(murinoglobulin)(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、G250、黑素瘤抗原(MAGE)、B黑素瘤抗原(BAGE)、G黑素瘤抗原(GAGE)、NY-ESO-1(纽约-食道癌-1)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)、gp100(糖蛋白100)、T细胞识别的黑素瘤抗原-1(MART-1)、黑皮质素-1受体(MCIR)、免疫球蛋白独特型(Ig Idiotype)、细胞周期蛋白D依赖性激酶(CDK4)、胱天蛋白酶-8(caspase-8)、β-链蛋白(β-catenin)、胶原诱发性关节炎(CIA)、BCR/ABL、人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7、Ebstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2a)、丙型肝炎病毒(HCV)、人疱疹病毒(HHV-8)、5T4、癌胚抗原(CEA)、p53以及甲胎蛋白(α-fetoprotein)，但不总限于此。
上述抗原可以以肽、脂多糖、多糖、糖蛋白或多核苷酸的形式直接装载到单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，或者可以通过被负载于重组病毒上然后在其中进行表达，从而引入单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)。不同于装载有肽的细胞疫苗，通过用编码所述抗原的病毒进行转导而导入全抗原的细胞疫苗不限于主要组织相容性复合体(MHC)的单倍型，其可应用于所有倍型，并且具有诱导各种表位特异性免疫应答，特别是同时诱导体液免疫应答和细胞介导的免疫应答的另一优点。
所述被引入单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的用于表达抗原的病毒可为腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒或辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)，但不总限于此。除使用病毒外，用于传递所述抗原基因的可能的方法为：(1)将DNA结合于脂质体然后进行转染以防止所述DNA与酶发生作用或被吸收入核内体的方法；(2)将DNA结合至由蛋白组成的分子结合体或合成配体以提高DNA转染效率的方法(例如：去唾液酸糖蛋白、转铁蛋白和聚合IgA)；(3)使用具有PTD(蛋白转导域)的新的DNA转染系统的方法，其中由于DNA转染效率增加而将抗原基因传递到细胞(例如：Mph-1)；以及(4)将肽或抗原蛋白装载于单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)中的方法。
除自然杀伤T细胞配体以及单核细胞或IMC外，本发明所述的疫苗可另外包含一种或多种与它们具有相同或相似效果的有效成分。除上述有效成分外，所述疫苗还可包含一种或多种药学上可接受的载体用于给药。所述药学上可接受的载体可选自于由下列物质所组成的组或通过将其中一种以上的成分进行混合而制备：盐水、林格氏溶液(Ringer’ssolution)、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽右旋糖(maltodextrose)溶液、甘油和乙醇。可加入其他通用的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等。为制备可注射的溶液例如水溶液、悬浮液和乳液，可另外加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。通过Remington’sPharmaceutical Science(最新版)(Mack Publishing Company，Easton PA)中提供的方法，可将本发明所述的疫苗针对每种疾病或根据其成分进一步制备为适当的形式。
本发明所述的疫苗可通过胃肠外进行给药，所述胃肠外给药包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和胸腔内注射。为将所述疫苗制备为用于胃肠外给药的制剂，将装载有所述自然杀伤T细胞配体的单核细胞或IMC、装载有肽和所述自然杀伤T细胞配体的单核细胞或IMC、或者用表达肿瘤抗原的病毒进行转导并装载有所述自然杀伤T细胞配体的单核细胞或IMC与稳定剂或缓冲剂进行混合，从而制得溶液或悬浮液，然后以安瓿或小瓶的形式进行制剂。
本发明所述的疫苗可根据给药途径制备为各种形式。例如，本发明所述的疫苗可制剂为用于注射的灭菌水溶液或分散体，或制剂为冻干剂。所述冻干疫苗通常贮藏于4℃，并可通过使用稳定溶液(例如盐水、或/和含有或不含有补充物的HEPES)进行复水。
在本发明优选的实施方式中，可影响所述疫苗剂量确定的因素为给药方法、给药频率、正在治疗的具体疾病、疾病的严重程度、临床史、正在使用的其他治疗剂以及个体特征(例如年龄、身高、体重、健康状况和身体状况)。通常，随着接受治疗的患者体重的增加，优选增加所述组合物的剂量。
所述疫苗可通过有效剂量的给予来诱导患者体内的免疫应答。举例来说，所述疫苗可以以一天一次或一天数次的频率给予人类，给药剂量为1×103细胞/kg-1×109细胞/kg，优选1×104细胞/kg-1×108细胞/kg。为制备装载有αGalCer的单核细胞或IMC疫苗，需要以每1×106-1×107细胞/ml中以1-2μg/ml浓度的αGalCer对培养基进行补充。为制备共同装载有αGalCer和肽的单核细胞或IMC疫苗，需要以每1×106-1×107细胞/ml中以1-2μg/ml浓度的αGalCer、以及每1×106-1×107细胞/ml中以1-10μg/ml的肽对培养基进行补充。
αGalCer似乎不会在啮齿类动物和猿的体内诱导毒性(Nakata等人，Cancer Res 58：1202-1207，1998)。根据报道，当将2200μg/kg的αGalCer给予小鼠时，并没有产生副作用(Giaccone等人，Clin Cancer Res 8：3702，2000)。从临床试验中已经报道，αGalCer全身性给药的副作用为轻微头痛(Mie Nieda等人，Blood 103：383-389；Giaccone等人，Clin Cancer Res8：3702，200)，可通过给予对乙酰氨基酚防止所述副作用。有很小的机率会出现轻微的全身性副作用(Giaccone等人，Clin Cancer Res 8：3702，2002)。
本发明还提供了一种自然杀伤T细胞活化剂，所述活化剂由装载有αGalCer的单核细胞或IMC进行介导。
如上文所解释的那样，类似于装载有αGalCer的树突状细胞，本发明中装载有αGalCer的单核细胞或IMC在体内将iNKT细胞活化，以诱导抗癌免疫性。因此，正如装载有αGalCer的树突状细胞那样，本发明中装载有αGalCer的单核细胞或IMC可用作自然杀伤T细胞活化剂。
本发明还提供了一种细胞毒素响应诱导物，所述诱导物包含表达肿瘤抗原的单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)。
不同于为诱导细胞介导的免疫反应而装载有肽的单核细胞或IMC疫苗，用腺病毒进行转导的单核细胞或IMC疫苗可同时诱导细胞介导的免疫应答和体液免疫应答(参见图8、图10和图12)。
本发明还提供了用于疾病的预防和免疫治疗的方法，所述方法包括下述步骤：将所述包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的免疫治疗性和预防性疫苗给予受试者，上述两种细胞装载有抗原和所述自然杀伤T细胞配体。
本发明可适用的受试者为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选实验动物(例如大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、狗、猫等)，并且最优选猿类(例如黑猩猩和大猩猩)，但不总限于此。
实施例
在下面的实施例中，对本发明实用的和现有的优选实施方式进行说明。
但是，可以理解的是，在考虑本发明所公开的内容后，本领域技术人员可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：装载有αGalcer和抗原的单核细胞疫苗的抗癌活性
单核细胞是来源于骨髓的未成熟细胞，并具有分化为树突状细胞(DC)或巨噬细胞的潜力。在本发明中，研究了作为树突状细胞或巨噬细胞前体的单核细胞在自然杀伤T细胞的辅助下，是否具有抗原特异性抗癌效果。
<1-1>装载有αGalcer和抗原肽的单核细胞疫苗的抗癌活性
从BALB/c小鼠体内分离出单核细胞。
具体而言，从BALB/c小鼠(Orient，韩国)体内分离出外周血单核细胞(PBMC)和脾脏，然后进行匀浆。通过Ficoll(Sigma，美国)密度梯度离心除去粒细胞和红血球(RBC)。在使用抗B220微珠(Miltenyibiotec，德国)和抗CD11c微珠(Miltenyibiotec，德国)去除B220+和CD11c+细胞后，本发明者使用抗CD11b微珠(Miltenyibiotec，德国)分离出CD11b+细胞。
将通过上述方法分离并纯化的单核细胞与αGalCer(1.5μg/ml)或载体(0.5％Tween溶于PBS中)一起在CO2培养箱中培养14小时。将2.5μg/mL的细胞毒性T淋巴细胞的表位肽Her-2/neu63-71(Anygen，韩国)加入所述细胞培养基中再培养1小时，然后将所述表位肽装载到所述单核细胞上的H-2Kd中。洗去未装载的肽，从而制备出单核细胞疫苗。
通过使用表达肿瘤相关抗原Her-2/neu的癌细胞系Her-2/CT26(Penichet ML等人，Lab Anim Sci 49：179-88，1999)，研究了所述装载有αGalCer和/或抗原肽的单核细胞疫苗的抗癌效果。
首先，将HER-2/CT26细胞通过静脉注射移植入BALB/c小鼠体内(2×105细胞/小鼠)。次日，分别给予单核细胞/pep(只装载有抗原肽)、单核细胞/αGC(只装载有αGalCer)以及单核细胞/pep/αGC(同时装载有αGalCer和所述抗原肽)。然后，对存活时间进行比较。
结果，用单核细胞/pep治疗的组的存活时间与只用癌细胞进行攻击(challenge)(通过静脉注射)的对照组的存活时间同样长。然而，用单核细胞/αGC治疗的组的存活时间稍稍延长。与此同时，给予单核细胞/pep/αGC的组的存活时间显著延长，这表明所述疫苗具有抗癌效果(图1)。
<1-2>装载有αGalcer并用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞疫苗的 抗癌活性
通过与实施例<1-1>所描述的相同的方式分离并纯化单核细胞，将得到的单核细胞用腺病毒(AdHM；Viromed Co.，Ltd.，韩国)在无血清培养基中转导90分钟，所述腺病毒含有编码Her-2/neu胞外域和跨膜域的基因，所述转导过程在CO2培养箱中以100MOI(感染复数)进行。向其中加入血清，并加入αGalCer(1.5μg/mL)或载体(0.5％Tween溶于PBS中)，然后再培养14小时。从而制备出单核细胞疫苗。
通过与实施例<1-1>所描述的相同的方式，使用HER-2/CT26来研究所述装载有αGalCer和/或用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞疫苗的抗癌效果。
首先，将HER-2/CT26细胞通过静脉注射移植入BALB/c小鼠体内(2×105细胞/小鼠)。次日，分别给予单核细胞/AdHM(用表达抗原的腺病毒进行转导)、单核细胞/αGC(只装载有αGalCer)以及单核细胞/AdHM/αGC(装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导)。然后，对存活时间进行比较。
结果，用单核细胞/AdHM治疗的组的存活时间与只用癌细胞进行攻击(通过静脉注射)的对照组的存活时间同样长。然而，用单核细胞/αGC治疗的组的存活时间稍稍延长。与此同时，给予单核细胞/AdHM/αGC的组的存活时间显著延长，这表明所述疫苗具有抗癌效果(图2)。
实施例2：装载有αGalcer和抗原的未成熟骨髓细胞(IMC)疫苗的抗癌 活性
<2-1>装载有αGalcer和抗原肽的IMC疫苗的抗癌活性
从BALB/c小鼠体内分离出未成熟骨髓细胞(IMC)。
将HER-2/CT26细胞经皮下移植入BALB/c小鼠体内。4周后，当肿瘤体积增长到至少1500mm3时，从所述小鼠体内分离出脾脏，然后进行匀浆。通过使用抗B220微珠(Miltenyibiotec，德国)和抗CD11c微珠(Miltenyibiotec，德国)除去B220+B细胞或CD11c+树突状细胞。
将这些细胞在CO2培养箱中培养14小时，所述培养过程在含有αGalCer(1.5μg/mL)的培养基、维生素A(ATRA，全反式维甲酸，20μM；Sigma，美国)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，20ng/ml；R &D systems，美国)或载体(0.5％Tween溶于PBS中；Sigma，美国)中进行。通过使用抗CD11b微珠(Miltenyibiotec，德国)从中得到CD11b+细胞。然后，将2.5μg/mL的Her-2/neu63-71(Anygen，韩国)肽向其中装载1小时。从而制备出IMC疫苗。
通过使用Her-2/CT26来研究所述装载有αGalCer和/或抗原肽的IMC疫苗的抗癌效果。
首先，将HER-2/CT26细胞通过静脉注射移植入BALB/c小鼠体内(2×105细胞/小鼠)。次日，分别给予IMC/pep(只装载有抗原肽)、IMC/pep/ATRA(装载有抗原肽并在含有维生素A的培养基中进行培养)、IMC/pep/GM-CSF(装载有抗原肽并在含有GM-CSF的培养基中进行培养)以及IMC/pep/αGC(装载有αGalCer和抗原肽)。然后，对存活时间进行比较。
结果，用IMC/pep或IMC/pep/ATRA治疗的组的存活时间与只用癌细胞进行攻击(通过静脉注射)的对照组的存活时间同样长。然而，用IMC/pep/GM-CSF治疗的组的存活时间稍稍延长。与此同时，给予IMC/pep/αGC的组的存活时间显著延长，这表明所述疫苗具有抗癌效果(图3)。
<2-2>装载有αGalcer并用表达抗原的腺病毒进行转导的IMC疫苗的抗癌 活性
制备装载有αGalcer并用表达抗原的腺病毒进行转导的IMC疫苗。
通过与实施例<2-1>所描述的相同的方式分离并纯化未成熟骨髓细胞(IMC)，将所述未成熟骨髓细胞用表达抗原的腺病毒在无血清培养基中感染60分钟，所述感染过程在CO2培养箱中以100MOI进行。然后，向其中补充入血清，按下来再进一步培养5小时，以制备IMC疫苗。
将HER-2/CT26细胞通过静脉注射移植入BALB/c小鼠体内(2×105细胞/小鼠)。次日，分别给予IMC、IMC/AdHM(用表达抗原的腺病毒进行转导)以及IMC/AdHM/αGC(装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导)。然后，对存活时间进行比较。
结果，用IMC/AdHM治疗的组的存活时间稍稍延长，而用IMC/AdHM/αGC治疗的组的存活时间显著延长，这表明所述疫苗具有出色的抗癌效果(图4)。
实施例3：通过IMC疫苗接种而诱导抗癌活性所需要的免疫细胞
对通过IMC疫苗接种而活化的抗癌免疫细胞的亚型进行研究。
为除去免疫细胞，从通过静脉注射将HER-2/CT26癌细胞移植入BALB/c小鼠体内的前一天起，以4天的间隔通过腹膜内注射免疫细胞清除抗体(抗CD4清除抗体：GK1.5杂交瘤(ATCC，美国)；抗CD8清除抗体：2.43杂交瘤(ATCC，美国)；抗NK清除抗体：α-去唾液酸GM1抗体(Wako，美国))对BALB/c小鼠进行处理。在注射所述癌细胞后一天，通过静脉注射向所述小鼠给予IMC/AdHM/αGC疫苗，所述疫苗通过与实施例<2-2>所描述的相同的方式制备。对存活时间进行比较。
结果，缺乏NK的组(IMC/AdHM/αGC/a-NK)的存活时间与只用癌细胞进行攻击的组类似，这表明NK细胞是重要的免疫细胞，其在由IMC疫苗接种诱导的抗癌活性中起到一定作用(图5a)。相比于正常的免疫组(IMC/AdHM/αGC)，缺乏CD8+T细胞的组(IMC/AdHM/αGC/a-CD8)的存活时间显著缩短，这表明由IMC疫苗接种诱导的抗癌效果是由所述CD8+T细胞介导的(图5b)。然而，相比于正常的免疫组(IMC/AdHM/αGC)，缺乏CD4+T细胞的组(IMC/AdHM/αGC/a-CD4)的存活时间稍稍延长或是与其类似，这表明所述CD4+细胞对于通过IMC疫苗接种诱导抗癌效果不是必需的(图5b)。
实施例4：由装载有αGalCer和抗原的单核细胞疫苗对抗原特异性细胞毒 性T淋巴细胞进行的活化
为研究所述单核细胞疫苗是否可将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化来诱导细胞毒性免疫应答，进行体内CTL分析。
<4-1>由装载有αGalCer和抗原肽的单核细胞疫苗对抗原肽特异性细胞毒 性T淋巴细胞进行的活化
为研究所述单核细胞疫苗是否可将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化来诱导细胞毒性免疫应答，进行体内CTL分析。
具体而言，将BALB/c小鼠用单核细胞、单核细胞/pep或单核细胞/pep/αGC进行免疫，上述三组疫苗通过与实施例<1-1>所描述的相同的方式制备。九天后，进行细胞毒性分析。首先，将来自于首次用于试验的同系小鼠的脾细胞分成两组：一组装载有Her-2/neu63-71肽(2.5μg/mL)，并用20μM的CFSE(羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯，Invitrogen，美国)进行标记(CFSE高)；另一组用2.5μM的CFSE进行标记，并且未装载肽(CFSE低，用作对照组)。将等量的两组细胞混合，并给予免疫后的小鼠。次日，通过流式细胞术分析脾细胞中的CFSE高和CFSE低细胞群。CFSE高细胞的百分比越低，所述细胞毒性免疫应答越高。
免疫过程还用不同细胞浓度(5×106、1×106、2×105和4×104)的单核细胞/pep/αGC疫苗进行。九天后，通过与上述相同的方式进行体内CTL分析。
结果，在只用单核细胞和用单核细胞/pep治疗的组中，几乎无法检测到细胞毒性免疫应答，而在用单核细胞/pep/αGC治疗的组中，检测到装载有肽的靶细胞受到破坏(图6)。通过与上述相同的方式，使用不同细胞浓度的单核细胞/pep/αGC疫苗进行体内CTL分析。结果，只有1×106细胞就有效地诱导了细胞毒性免疫应答(图7)。
<4-2>由装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞疫苗 对抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞进行的活化
为研究在装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的情况下，所述单核细胞疫苗是否可将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化来诱导细胞毒性免疫应答，进行体内CTL分析。
具体而言，通过与实施例<1-2>所描述的相同的方式，以2×106、1×106、5×105和2.5×105的不同细胞浓度将BALB/c小鼠用单核细胞/AdHM/αGC疫苗进行免疫。十天后，通过与实施例<4-1>所描述的相同的方式进行体内CTL分析。
结果，在用2×106细胞的所述单核细胞疫苗进行免疫的小鼠体内，检测到了有效的细胞毒性免疫应答。然而，当所述免疫作用以低于1×106细胞进行时，检测到了微弱的细胞毒性免疫应答(图8)，其低于由单核细胞/pep/αGC疫苗诱导的细胞毒性免疫应答。但是，就抗癌效果而言，相比于用单核细胞/pep/αGC疫苗治疗的组，该组的存活时间有所延长。上述结果表明，所述腺病毒疫苗不仅诱导了细胞毒性T细胞应答，还诱导了其他免疫应答。
实施例5：由装载有αGalCer和抗原的IMC疫苗对抗原特异性细胞毒性 T淋巴细 胞进行的活化
为研究所述IMC疫苗是否可将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化，进行体内CTL分析。
<5-1>由装载有αGalCer和抗原肽的IMC疫苗对抗原肽特异性细胞毒性T 淋巴细胞进行的活化
为研究所述IMC疫苗是否可将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化，进行体内CTL分析。
具体而言，将BALB/c小鼠用IMC/pep、IMC/pep/αGC、IMC/pep/ATRA或IMC/pep/GM-CSF进行免疫，上述四组疫苗通过与实施例<2-1>所描述的相同的方式制备。十天后，通过与实施例<4-1>所描述的相同的方式进行体内CTL分析。
结果，在用IMC/pep和IMC/pep/ATRA治疗的组中，检测到低水平的细胞毒性免疫应答，而在用IMC/pep/GM-CSF治疗的组中，检测到稍高水平的细胞毒性免疫应答。然而，用IMC/pep/αGC疫苗治疗的组诱导出高水平的细胞毒性免疫应答(图9)。上述结果表明，IMC/pep/αGC疫苗有效地诱导了抗原特异性细胞毒性免疫应答，所述免疫应答足以破坏靶细胞，这表明如实施例<2-1>所述，所述疫苗具有出色的抗癌效果。
<5-2>由装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的IMC疫苗对抗 原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞进行的活化
为研究所述IMC疫苗是否可将抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞活化来诱导细胞毒性免疫应答，进行体内CTL分析。
具体而言，将BALB/c小鼠用IMC、IMC/AdHM、IMC/αGC或IMC/AdHM/αGC进行免疫，上述四组疫苗通过与实施例<2-2>所描述的相同的方式制备。十天后，通过与实施例<4-1>所描述的相同的方式进行体内CTL分析。
并且，以8×106、2×106、5×105和1.25×105的不同细胞浓度，将BALB/c小鼠用IMC/AdHM/αGC疫苗进行免疫。十天后，通过与实施例<4-1>所描述的相同的方式进行体内CTL分析。
结果，相比于只用IMC和用IMC/αGC治疗的组，在用IMC/AdHM治疗的组中，细胞毒性免疫应答显著增加，并且在用IMC/AdHM/αGC治疗的组中，细胞毒性免疫应答的增加更为显著(图10)。所述水平不如用实施例<5-1>中装载有肽的细胞疫苗进行治疗的结果那样高，似乎是因为所述装载有肽的细胞疫苗只装载有CD8+T细胞表位，而用包含全抗原的病毒进行转导的细胞疫苗不只表达特异性单表位，还因为转导效率的不完全，造成相对低水平的抗原肽特异性细胞毒性免疫应答。
用不同细胞浓度的IMC/AdHM/αGC疫苗再次进行体内CTL分析。结果，当免疫作用以8×106细胞进行时，检测到接近90％的细胞毒性免疫应答，这表明所述IMC/AdHM/αGC疫苗有效地诱导了抗原特异性细胞毒性免疫应答(图11)。
实施例6：由装载有αGalCer并用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞 疫苗诱导的抗原特异性抗体响应
为研究所述用表达抗原的腺病毒进行转导的单核细胞疫苗是否可同时诱导细胞介导的免疫应答和体液免疫应答，对由用AdHM进行转导的单核细胞疫苗生成的Her-2/neu特异性抗体进行检验。
更准确地说，以不同的细胞浓度通过静脉注射向BALB/c小鼠给予单核细胞/AdHM/αGC疫苗，所述疫苗通过与实施例<1-2>所描述的相同的方式制备。用首次用于试验的小鼠的血清作为对照。十天后，进行眼部采血，采集的血液在室温下放置2小时，然后以8000rpm离心10分钟以分离血清。为检验血清中抗Her-2/neu抗体的生成，将表达Her-2/neu的鼠癌细胞系HER-2/CT26与所述血清在4℃染色60分钟。使用FITC标记的抗小鼠二抗，通过流式细胞术研究所述小鼠抗体与HER-2/CT26细胞的结合能力。
结果，在用2×106细胞治疗的组中，观察到了最高的抗体生成，在用1×106或5×105细胞治疗的组中，检测到了显著的抗体生成(图12)。然而，在用小于2.5×105细胞治疗的组中，未检测到抗体生成。
实施例7：由装载有αGalCer和卵清蛋白肽的IMC疫苗对抗原肽特异性 细胞毒性T淋巴细胞进行的活化
为研究对于针对Her-2/neu以外的其他各种抗原的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，所述IMC疫苗是否可将其活化从而诱导细胞毒性免疫应答，使用装载有αGalCer和卵清蛋白的OT-1肽(由H-2Kb递呈的卵清蛋白257-264肽，序列编号1，SIINFEKL)的IMC疫苗进行体内CTL分析，所述OT-1肽已经广泛地用作模型抗原。
具体而言，将鼠胸腺瘤细胞系EL4细胞(ATCC，美国)移植入C57BL/6小鼠体内(Orient，韩国)。约4周后，当所述肿瘤体积达到至少1500mm3时，将脾细胞从所述小鼠体内分离，然后进行匀浆。通过使用抗B220微珠(Miltenyibiotec，德国)除去B220+B细胞。
将这些细胞与αGalCer(1.5μg/mL)或载体(0.5％Tween溶于PBS中)一起在CO2培养箱中培养14小时。通过使用抗CD11b微珠(Miltenyibiotec，德国)从中得到CD11b+细胞。然后，将2μg/mL的OT-1肽向其中装载1小时。从而制备出IMC疫苗。
具体而言，将C57BL/6小鼠用IMC/pep或IMC/pep/αGalCer进行免疫，所述的IMC/pep或IMC/pep/αGalCer通过与上述相同的方式进行制备。十天后，进行体内CTL分析。首先，将首次用于试验的脾细胞分成两组：一组装载有OT-1肽(2μg/mL；Anygen，韩国)，并用20μM的CFSE(羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯，Invitrogen，美国)进行标记(CFSE高)；另一组用2.5μM的CFSE进行标记，并且未装载肽(CFSE低，用作对照组)。将等量的两组细胞混合，并给予免疫后的小鼠。次日，通过流式细胞术分析脾细胞中的CFSE高和CFSE低细胞群。
结果，如图13所示，类似于未治疗的组，在用IMC/pep治疗的组中，几乎无法检测到细胞毒性免疫应答。相反，在用IMC/pep/αGalCer进行免疫的组中，检测到接近100％的显著的细胞毒性免疫应答。也就是说，相比于所述只装载有抗原肽的IMC疫苗(IMC/pep)，IMC/pep/αGalCer的给予在所述外源抗原卵清蛋白模型中诱导了有效的细胞毒性免疫应答。上述结果表明，由所述IMC疫苗诱导的有效免疫应答并不限于特异性抗原，而是可以应用于各种抗原。
制备例1：包含单核细胞/AdHM/αGC疫苗作为活性成分的注射液的制备 方法
本发明所述的抗癌疫苗的注射液通过下述步骤进行制备。
将α-半乳糖神经酰胺(1-2μg/mL)、单核细胞/AdHM/αGC疫苗(5×106细胞/ml)、肽(1-2μg/mL)、5′-氯-3，2′-二羟基查耳酮或5′-氯-2，3′-二羟基查耳酮盐酸盐(1g)、氯化钠(0.6g)以及抗坏血酸(0.1g)溶解于蒸馏水，制得100ml溶液。将所述溶液装入瓶中，在120℃灭菌30分钟。
制备例2：包含IMC/AdHM/αGC疫苗作为活性成分的注射液的制备方法
本发明所述的抗癌疫苗的注射液通过下述步骤进行制备。
将α-半乳糖神经酰胺(1-2μg/mL)、IMC/AdHM/αGC疫苗(8×106细胞/ml)、肽(1-2μg/mL)、5′-氯-3，2′-二羟基查耳酮或5′-氯-2，3′-二羟基查耳酮盐酸盐(1g)、氯化钠(0.6g)以及抗坏血酸(0.1g)溶解于蒸馏水，制得100ml溶液。将所述溶液装入瓶中，在120℃灭菌30分钟。
序列表
序列编号1为由H-2Kb递呈的卵清蛋白257-264肽的序列。
本领域技术人员将会明了的是，可容易地利用在上述说明书中所公开的概念和具体实施方式，作为改进或设计其他实现与本发明用途相同的实施方式的基础。本领域技术人员还将明了的是，这类等同的实施方式没有脱离如所附权利要求书中阐明的本发明的精神和范围。
序列表
<110>财团法人首尔大学校产学协力财团
 
<120>包含装载有抗原和自然杀伤T细胞配体的单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的疫苗
 
<130>7FPO-11-57
 
<160>1
 
<170>KopatentIn 1.71
 
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>由H-2Kb递呈的卵清蛋白257-264位氨基酸肽
 
<400>1
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
  1               5
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。
2.如权利要求1所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述自然杀伤T细胞配体选自于由下列物质所组成的组：α-半乳糖神经酰胺、α-葡糖醛酸神经酰胺、磷脂酰肌醇四甘露糖苷、异红细胞三己糖基神经酰胺、神经节苷脂GD3、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、硫苷酯、β-半乳糖神经酰胺、脂磷酸聚糖、糖化肌醇磷脂、作为α-半乳糖神经酰胺衍生物的β-端基异构半乳糖神经酰胺和α-端基异构半乳糖神经酰胺、以及细菌脂类抗原。
3.如权利要求1所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述抗原来源于包括病原细菌、病毒和寄生虫在内的病原体，或来源于肿瘤。
4.如权利要求3所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述来源于病原细菌的抗原选自于由下列抗原所组成的组：百日咳杆菌抗原(百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素)、破伤风类毒素、白喉类抗原(白喉类毒素)、幽门螺杆菌抗原(血清群A、B、C、Y和W-135的荚膜多糖)、肺炎球菌抗原(3型肺炎链球菌荚膜多糖)、结核抗原、霍乱抗原(霍乱毒素B亚基)、葡萄球菌抗原(葡萄球菌肠毒素B)、志贺氏菌抗原(志贺氏菌多糖)、疏螺旋体菌属抗原、白色念珠菌抗原和疟原虫抗原。
5.如权利要求3所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述来源于病毒的抗原选自于由下列抗原所组成的组：流感病毒抗原(血凝素抗原和神经氨酸酶抗原)、人乳头状瘤病毒(HPV)抗原(糖蛋白)、水疱性口炎病毒抗原(水疱性口炎病毒糖蛋白)、巨细胞病毒(CMV)抗原、肝炎病毒抗原(甲型肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、丁型肝炎(HDV)和庚型肝炎(HGV)的抗原)(核心抗原和表面抗原)、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、单纯疱疹病毒(HSV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、GP-160、p18、Tat、Gag、Pol、Env)以及它们的组合。
6.如权利要求3所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述肿瘤抗原选自于由下列抗原所组成的组：Her-2/neu、蛋白酶3、维尔姆斯瘤相关基因(WT-1)、鼠球蛋白(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、G250、黑素瘤抗原(MAGE)、B黑素瘤抗原(BAGE)、G黑素瘤抗原(GAGE)、NY-ESO-1(纽约-食道癌-1)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)、gp100(糖蛋白100)、T细胞识别的黑素瘤抗原-1(MART-1)、黑皮质素-1受体(MCIR)、免疫球蛋白独特型、细胞周期蛋白D依赖性激酶(CDK4)、胱天蛋白酶-8、β-链蛋白、胶原诱发性关节炎(CIA)、BCR/ABL、人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7、Ebstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2a)、丙型肝炎病毒(HCV)、人疱疹病毒(HHV-8)、5T4、癌胚抗原(CEA)、p53以及甲胎蛋白。
7.如权利要求1所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述抗原的特征在于其形式为肽、脂多糖、多糖、糖蛋白或多核苷酸。
8.如权利要求1所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述抗原通过用重组病毒转导而进行表达。
9.如权利要求8所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述重组病毒选自于由腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒和辛德毕斯病毒所组成的组，上述重组病毒导入有编码抗原的基因。
10.一种自然杀伤T细胞活化剂，所述活化剂包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)。
11.一种细胞毒性响应诱导剂，所述诱导剂包含递呈靶抗原的单核细胞或未成熟骨髓细胞。
12.一种用于疾病免疫治疗的方法，所述方法包括下述步骤：将包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的免疫治疗性和预防性疫苗给予受试者，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。
13.一种用于疾病免疫预防的方法，所述方法包括下述步骤：将包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的免疫治疗性和预防性疫苗给予受试者，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。
14.一种用于疾病免疫治疗的方法，所述方法包括下述步骤：将包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的免疫治疗性和预防性疫苗给予受试者，上述两种细胞装载有自然杀伤T细胞配体。
15.一种用于疾病免疫预防的方法，所述方法包括下述步骤：将包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的免疫治疗性和预防性疫苗给予受试者，上述两种细胞装载有自然杀伤T细胞配体。

Claims (13)

1.一种免疫治疗性和预防性疫苗，所述疫苗包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。
2.如权利要求1所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述自然杀伤T细胞配体选自于由下列物质所组成的组：α-半乳糖神经酰胺、α-葡糖醛酸神经酰胺、磷脂酰肌醇四甘露糖苷、异红细胞三己糖基神经酰胺、神经节苷脂GD3、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、硫苷酯、β-半乳糖神经酰胺、脂磷酸聚糖、糖化肌醇磷脂、作为α-半乳糖神经酰胺衍生物的β-端基异构半乳糖神经酰胺和α-端基异构半乳糖神经酰胺、以及细菌脂类抗原。
3.如权利要求1所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述抗原来源于包括病原细菌、病毒和寄生虫在内的病原体，或来源于肿瘤。
4.如权利要求3所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述来源于病原细菌的抗原选自于由下列抗原所组成的组：百日咳杆菌抗原(百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌粘附素)、破伤风类毒素、白喉类抗原(白喉类毒素)、幽门螺杆菌抗原(血清群A、B、C、Y和W-135的荚膜多糖)、肺炎球菌抗原(3型肺炎链球菌荚膜多糖)、结核抗原、霍乱抗原(霍乱毒素B亚基)、葡萄球菌抗原(葡萄球菌肠毒素B)、志贺氏菌抗原(志贺氏菌多糖)、疏螺旋体菌属抗原、白色念珠菌抗原和疟原虫抗原。
5.如权利要求3所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述来源于病毒的抗原选自于由下列抗原所组成的组：流感病毒抗原(血凝素抗原和神经氨酸酶抗原)、人乳头状瘤病毒(HPV)抗原(糖蛋白)、水疱性口炎病毒抗原(水疱性口炎病毒糖蛋白)、巨细胞病毒(CMV)抗原、肝炎病毒抗原(甲型肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、丁型肝炎(HDV)和庚型肝炎(HGV)的抗原)(核心抗原和表面抗原)、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、单纯疱疹病毒(HSV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、GP-160、p18、Tat、Gag、Pol、Env)以及它们的组合。
6.如权利要求3所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述肿瘤抗原选自于由下列抗原所组成的组：Her-2/neu、蛋白酶3、维尔姆斯瘤相关基因(WT-1)、鼠球蛋白(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、G250、黑素瘤抗原(MAGE)、B黑素瘤抗原(BAGE)、G黑素瘤抗原(GAGE)、NY-ESO-1(纽约-食道癌-1)、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)、gp100(糖蛋白100)、T细胞识别的黑素瘤抗原-1(MART-1)、黑皮质素-1受体(MCIR)、免疫球蛋白独特型、细胞周期蛋白D依赖性激酶(CDK4)、胱天蛋白酶-8、β-链蛋白、胶原诱发性关节炎(CIA)、BCR/ABL、人乳头状瘤病毒(HPV)E6/E7、Ebstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2a)、丙型肝炎病毒(HCV)、人疱疹病毒(HHV-8)、5T4、癌胚抗原(CEA)、p53以及甲胎蛋白。
7.如权利要求1所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述抗原的特征在于其形式为肽、脂多糖、多糖、糖蛋白或多核苷酸。
8.如权利要求1所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述抗原通过用重组病毒转导而进行表达。
9.如权利要求8所述的免疫治疗性和预防性疫苗，其中，所述重组病毒选自于由腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒和辛德毕斯病毒所组成的组，上述重组病毒导入有编码抗原的基因。
10.一种自然杀伤T细胞活化剂，所述活化剂包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)，上述两种细胞装载有抗原和α-半乳糖神经酰胺(αGalCer)。
11.一种细胞毒性响应诱导剂，所述诱导剂包含递呈靶抗原的单核细胞或未成熟骨髓细胞。
12.一种用于疾病免疫治疗的方法，所述方法包括下述步骤：将包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的免疫治疗性和预防性疫苗给予受试者，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。
13.一种用于疾病免疫预防的方法，所述方法包括下述步骤：将包含单核细胞或未成熟骨髓细胞(IMC)的免疫治疗性和预防性疫苗给予受试者，上述两种细胞装载有抗原和自然杀伤T细胞配体。
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