KR100809873B1 - 자연 살해 ｔ 세포의 리간드와 항원을 적재한 ｂ 세포를매개로 하는 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 B 세포를 포함하는 면역 예방 및 치료용 백신에 관한 것으로, 구체적으로 자연살해 T 세포 리간드이자 당지질의 일종인 알파-갈락토실세라마이드를 매개로 한 B 세포를 포함하는 면역 예방 및 치료용 백신에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 B 세포가 수지상 세포에 비해 수득이 용이하며 기존의 수지상 세포백신과 비교하여 유사한 수준의 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 뿐 아니라 피하암 및 전이암의 예방 및 치료 효과가 있으므로 항암 면역 치료제로 이용될 수 있다.
알파-갈락토실세라마이드, 자연 살해 T 세포, B 세포, 세포 독성 T 세포, 항암 효과
Description
도 1은 알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)가 적재된 B 세포 및 자연살해 T세포(iNKT) 사이에서의 양방향 활성화를 나타내는 그림으로,
도 1a는 CD11c+ 세포를 제거한 후, 마우스의 비장으로부터 B 세포를 순수 분리한 다음 유세포 분석기로 CD19, CD11c 및 CD1d의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 1b는 C57BL/6 야생형 또는 Jα281-/- 마우스에 비히클 단독, αGalCer, αGalCer가 적재된 B 세포(B/αGalCer) 또는 수지상 세포(DC/αGalCer)를 투여한 다음, IL-4 또는 IFN-γ를 생성하는 세포의 수를 ELISPOT으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이고
도 1c는 비히클 또는 αGalCer가 적재된 B 세포를 CFSE로 표지하여 C57BL/6 마우스에 투여한 후, 비장 세포로부터 분리된 CFSE+ 세포를 분석한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 2는 펩티드(OVA257-264)와 αGalCer가 함께 적재된 B 세포에 의한 펩티드 특이적인 CD8+ T 세포의 활성화를 나타낸 그림으로,
도 2a는 CFSE로 표지된 OVA257-264에 특이적인 CD8+ T 세포(OT-I T 세포)를 C57BL/6 마우스에 이식한 다음 비히클 단독, B/αGalCer, B/pep, 또는 B/αGalCer/pep를 투여한 후 OT-I T 세포의 분열과 사이토카인 생성을 유세포분석기로 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 2b는 C57BL/6 마우스에 B 세포 단독, B/αGalCer, B/pep 또는 B/αGalCer/pep를 투여한 후, 1주, 3주, 또는 5주 후에 CFSE로 표지된 동종의 표적을 주입하여 생체내의 세포독성 T 림프구 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
CFSEhigh : peptide가 적재된 표적군
CFSElow : peptide가 적재되지 않은 대조군
도 2c는 생체 내에 B 세포백신을 투여하고 7일 후에 마우스의 비장 세포를 분리하여 IFN-γ를 생성하는 CD8+ T 세포의 반응을 측정한 것과(왼쪽), 이를 체외에서 OVA257-264를 적재한 동종의 비장 세포로 재자극한 경우에 나타나는 IFN-γ를 생성하는 CD8+ T 세포의 수를 측정한(오른쪽) 그래프이다.
도 3은 B 세포를 매개로 하는 세포백신 및 수지상 세포(DC)를 매개로 하는 세포백신과의 세포독성 T 림프구 형성에 있어서의 효율성 비교를 나타낸 그림으로,
도 3a는 OVA257-264 펩티드가 적재된 B/αGalCer/pep 및 DC/αGalCer/pep을 순 차적으로 희석하여 마우스에 투여하고 이후 OVA257-264 펩티드에 대한 생체 내 세포독성 T 림프구 활성을 측정한 그래프이고,
도 3b는 OVA257-264 펩티드와 비히클이 적재된 B/vehicle/pep 및 DC/vehicle/pep를 상기와 같은 방법으로 투여함으로써 유도되는 OVA257-264 펩티드에 대한 생체 내 세포독성 T 림프구 활성을 나타낸 그래프이고,
도 4는 B 세포를 매개로 하는 백신에 의하여 세포독성 T 림프구 반응을 유도하는데 관여하는 면역 세포의 종류를 나타낸 그림으로,
도 4a는 αGalCer와 OVA257-264 펩티드가 함께 적재된 B 세포를 투여하기 전 또는 후에 특정 면역 세포를 제거하는 항체를 주입한 후 OVA257-264 펩티드에 대한 생체 내 세포독성 T 림프구 활성을 나타낸 그래프이고,
도 4b는 야생형, Jα281-/-, 또는 MHC class II-/- 마우스에 αGalCer와 OVA257-264 펩티드가 함께 적재된 B 세포를 투여한 다음 OVA257-264 펩티드에 대한 생체외 세포독성을 표준 51Cr 방출 분석을 실시하여 나타낸 그래프이고,
도 5는 αGalCer와 OVA257-264 펩티드가 함께 적재된 B 세포가 CD8+ T 세포에 직접적인 항원제시 세포로 작용한다는 것을 나타낸 그림으로,
도 5a는 야생형 또는 bm-1 마우스로부터 분리된 B 세포에 αGalCer와 OVA257- 264 펩티드를 함께 적재한 후 각각 야생형 마우스에 투여한 후 OVA257-264 펩티드에 대한 생체내 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 5b는 αGalCer와 OVA257-264 펩티드가 함께 적재된 B 세포 또는 OVA257-264 펩티드가 적재된 B 세포와 αGalCer가 적재된 B 세포를 이용하여 각각 C57BL/6 마우스를 면역화한 후 유도되는 OVA257-264 펩티드에 대한 생체내 세포독성을 나타낸 그래프이고,
도 6은 B 세포를 매개로 하는 백신이 OVA를 발현하는 B16 흑색종양에 대한 예방적 및 치료적 항암 면역 활성을 제공한다는 것을 나타낸 그림으로,
도 6a는 C57BL/6 마우스를 B 세포 단독, B/αGalCer, B/pep, B/αGalCer/pep, DC/pep, 또는 DC/αGalCer/pep로 면역화시킨 후 7일 후에 MO-5 암세포를 상기 마우스 피하에 이식하여 마우스의 종양 크기를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 6b는 6a에서 종양이 생성되지 않은 마우스에 첫 번째 종양을 이식한지 70일 후, MO-5 세포(2×105개)을 재이식하고 종양 크기를 측정하여 나타낸 그래프이고,
도 6c와 도 6d는 C57BL/6 마우스에 MO-5 암세포(2×105개)를 피하에 이식하고, 1일 후와 9일 후에 B 세포 단독, B/αGalCer, B/pep, B/αGalCer/pep, DC/pep, 또는 DC/αGalCer/pep로 각각 면역화하여 마우스의 종양 크기를 측정한 결과를 나 타낸 그래프이다.
*, p < 0.05 : 'B 세포 단독' 대조군(도 6a, 6c 및 6d) 또는 주령이 보정된 백신을 투여받지 않은 마우스군(도 6b)과의 유의적인 차이를 나타냄
도 7은 B 세포를 매개로 하는 백신이 실제 암항원인 Her-2/neu를 발현하는 종양에서 항암 면역반응을 유도한다는 것을 나타내는 결과로,
도 7a는 B세포 단독, αGalCer가 적재된 B세포, Her-2/neu 63-71(hP63)이 적재된 B세포, αGalCer와 hP63이 함께 적재된 B세포, hP63이 적재된 수지상 세포, αGalCer와 hP63이 함께 적재된 수지상 세포를 각각 BALB/c 마우스에 면역화시킨 후 유도되는 생체내 세포독성을 나타낸 그래프이고,
도 7b와 도 7c는 상기와 같은 방법으로 CT-26-Her2/neu 를 꼬리 정맥(도 7b) 또는 피하(도 7c)로 이식한 후 상기 B 세포 또는 수지상 세포(DC)로 면역화시킨 후 마우스의 생존율(도 7b) 또는 종양 크기(도 7c)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 8은 B 세포에 바이러스로 전체 항원을 형질도입하는 방법을 B세포 백신에 적용할 수 있는지를 확인한 그림으로,
도 8a는 종양 관련 항원인 Her-2/neu의 세포외 영역과 세포막 영역을 발현할 수 있는 아데노바이러스(AdHM)를 B 세포에 감염시킨 후 B 세포 표면에 발현되는 Her-2/neu를 측정하여 나타낸 그래프이고,
도 8b는 AdHM으로 형질 전환된 B세포가 αGalCer를 적재하여 DN32.D3 세포를 활성화할 수 있는 것을 보여주는 실험으로, B세포, αGalCer를 적재한 B세포, AdHM으로 형질 전환된 B세포, 그리고 AdHM으로 형질 전환하고 αGalCer를 적재한 B세포와 DN32.D3 세포를 함께 배양한 배양 상층액의 IL-2를 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 종양 관련 항원인 Her-2/neu로 형질도입된 B 세포가 마우스에서 효과적으로 세포독성 면역 반응을 유도하는지를 나타낸 그림으로,
도 9a는 BALB/c 마우스의 비장 세포로부터 분리된 B 세포에 아데노바이러스로 형질도입된 세포(B/AdHM), 추가적으로 αGalCer를 적재한 세포(B/AdHM/αGalCer), B 세포 단독 및 B/αGalCer로 각각 면역화시킨 다음, 세포독성 T 세포의 항원결정 펩티드를 적재한 표적 세포를 이식한 후 체내에서 유도된 항원 특이적인 세포독성 T 림프구 반응을 측정하여 나타낸 그래프이고,
도 9b는 B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer 백신으로 각각 마우스를 면역화시킨 후 세포독성 T 세포 반응이 오랜 기간 지속됨을 나타낸 그래프이고,
도 9c는 B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer 백신으로 각각 마우스를 면역화시킨 다음, 체외에서 세포독성 T 세포 펩티드로 자극했을 때 또는 자극하지 않았을 때 CD8+ T 세포의 IFN-γ의 생성을 측정한 것을 나타낸 그래프이고,
naive : 백신을 투여받지 않은 마우스군
도 10은 아데노바이러스로 형질도입된 B 세포(B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer)백신에 의하여 자연살해(NK) 세포의 활성화가 유도되고, 세포 독성 T세포가 효율적으로 작용하는 것을 나타낸 그림으로,
도 10a는 자연살해 세포의 활성화를 나타낸 그래프이고,
도 10b는 백신 집단 사이에서 세포독성 T 세포를 유도하는 효율성을 측정하기 위하여 세포백신의 농도에 따라 유도되는 표적 세포의 용해도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 AdHM으로 형질 도입된 B 세포(B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer) 백신이 Her-2/neu에 특이적인 항체 유도를 나타내는 결과로,
도 11a는 BALB/c 마우스에 B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer로 각각 면역화시킨 다음, 혈청내의 항 Her-2/neu 항체가 Her-2/neu를 표면에 발현하는 마우스 암세포인 TAUF 세포에 결합하는 정도로 항-Her-2/neu 항체의 역가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 11b는 각 군에서의 체액성 면역 반응을 나타낸 그래프이고,
도 12는 아데노바이러스로 형질도입된 B 세포백신의 항암활성을 나타내는 것으로, Her-2/neu를 발현하는 마우스 암세포를 투여하여 폐암을 유도한 마우스를 B 세포백신으로 면역화시킨 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 자연살해 T 세포의 활성화 지표인 IL-2를 생성하는데 있어, αGalCer 농도에 따라 αGalCer를 적재한 B세포가 자연살해 T 세포를 활성화시켜 IL-2 생성을 유도하는 정도 및 세포수에 따라 αGalCer를 적재한 B 또는 수지상 세포(DC)가 자연 살해 T세포를 활성화하는 정도를 나타낸 그림이고,
도 14는 생체 내에 CD4+, CD8+, 또는 NK1.1 세포를 제거할 수 있는 항체를 투여하여 특정 면역 세포가 제거되는 현상을 나타낸 그래프이고,
도 15는 흉선종(EG-7)에 대한 B 세포를 매개로 하는 세포백신의 항암 면역 활성을 나타낸 그림이고,
*, p<0.001 : B 세포 단독 처리된 군과의 통계적인 유의성
본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 B 세포를 포함하는 면역 예방 및 치료용 백신에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자연살해 T 세포 리간드이자 당지질의 일종인 알파-갈락토실세라마이드를 매개로 한 B 세포를 포함하는 면역 예방 및 치료용 백신에 관한 것이다.
인체에서는 항원 제시 세포에 의하여 종양세포의 항원이 효율적으로 제시되지 않기 때문에 이에 대한 면역반응이 효과적으로 유도되지 않는다. 암 치료백신은 암세포에 특이적으로 작용하는 면역기전을 인위적으로 활성화시켜(항원제시 세포 도입 등) 강력한 면역반응을 유발하여 암세포를 파괴하는 새로운 개념의 치료용 백신이다.
이용 가능한 백신의 접근방법으로 사용되는 것 중에서 수지상 세포(dendritic cells, DC)와 같은 항원제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 사용한 세포백신은 효과적인 T 세포 면역을 생성시키는데 확실한 방법으로 알려져 있 다(Rosenberg, S. A. et al., Nat. Med., 10, 909-915, 2004). 특히, 수지상 세포 백신은 항원 특이적인 효과 T 세포(Antigen-specific effector T cell)와 기억 T 세포(memory T cell)를 효율적으로 유도하는 것으로 알려져 있고 많은 임상 시험에서 항암 치료에 적용되고 있다(Rosenberg, S. A. et al., Nat. Med., 10, 909-915, 2004). 이러한 수지상 세포(DC)는 항원을 수용하고 항원을 그에 상응하는 T 세포에 제시하는 장소인 림프 기관(lymphoid organ)으로 이동하는 능력이 있기 때문에 면역 치료를 위한 이상적인 항원제시 세포라 할 수 있다. 더욱 중요한 것은 수지상 세포는 T 세포에 강한 공-자극(co-stimulation)을 제공한다(Figdor, C. G. et al., Nat. Med., 10, 475-480, 2004; 및 Banchereau, J. et al., Cell, 106, 271-274, 2001). 수지상 세포백신을 이용한 접근법이 실험적으로나 임상 시험들에서 잘 정립되어 있음에도 불구하고 혈액과 림프 조직에 수지상 세포가 소수이고 혈액 중의 단핵 세포로부터 체외에서(ex vivo) 증식시키기 어렵다는 점은 백신으로 널리 사용되는 데에 장애가 되고 있다(Schultze, J. L. et al., Trends Immunol., 25, 659-664, 2004).
반면에, B 세포는 림프 조직이나 혈액에 다량 존재하고 체외에서 쉽게 증식될 수 있기 때문에 세포백신을 위한 수지상 세포의 효율적인 대체제가 될 뿐 아니라(Schultze, J. L. et al., Trends Immunol., 25, 659-664, 2004; von Bergwelt-Baildon, M.S. et al., Blood, 99, 3319-3325, 2002; 및 Schultze, J. L. et al., J. Clin. Invest., 100, 2757-2757, 1997) 비경구 투여 후에 림프 기관으로 이동하게 된다.
이러한 장점들에도 불구하고 B 세포는 약한 면역원성 때문에 항원제시 세포백신으로서는 널리 이용되지 못했다. 실제적으로 B 세포가 CD4+와 CD8+ T 세포의 자가 면역 관용(tolerance)을 직접적으로 유도하는데, 이는 공-자극(costimulation)이 결여되었기 때문일 것이라는 증거들이 있는데(Bennett, S. R. et al., J. Exp. Med., 188, 1977-1983, 1998; 및 Eynon, E. E. et al., J. Exp. Med., 175, 131-138, 1992), 공-자극은 항원 특이적인 T세포가 활성화되기 위하여 T 세포가 인식할 수 있는 항원과 함께 요구되는 두 번째 신호를 일컫는다. 그러나 활성화된 B 세포가 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 모두 자극할 수 있다는 것은(von Bergwelt-Baildon, M. S. et al., Blood, 99, 3319-3325, 2002; Schultze, J. L. et al., J. Clin. Invest., 100, 2757-2765, 1997; Lapointe, R. et al., Cancer Res., 63, 2836-2843, 2003; 및 Heit, A. et al., J. Immunol., 172, 1501-1507, 2004) 적절한 자극에 의하여 활성화된 B 세포가 항원 특이적인 T 세포 면역을 유도하는 면역원성을 지닌 항원제시 세포로 작용할 수 있다는 것을 시사한다.
불변성 자연살해 T(iNKT) 세포가 여러 면역 반응 및 면역 병리현상을 총괄하는 중추적인 역할을 담당한다는 것은 잘 알려져 있다. 비록 마우스에서 전체 림프구 중 1% 미만으로 존재한다 하더라도 자연살해 T 세포는 자가 항원 및 외래 항원에 대한 반응을 관리하고 자가 면역 또는 면역반응을 유도할 것인지를 결정한다(Kronenberg, M., Annu. Rev. Immunol., 23, 877-900, 2005; 및 Park, S. H. & Bendelac, A., Nature, 406, 788-792, 2000). 또한, 이 세포는 암, 당뇨 및 면역반응이 일어나지 않는 부위(immune-privileged site)에서 면역 반응을 억제하는 기 능을 한다고 보고되었다(Sonoda, K. H., et al., J. Exp. Med., 190, 1215-1226, 1999).
한편, 리간드로 활성화된 불변성 자연살해 T 세포는 수지상 세포뿐만 아니라 T, B 및 자연살해 세포의 활성화를 유도하는데, 불변성 자연살해 T 세포의 리간드인 알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)를 주입하면 자연살해 세포와 T 세포를 통해 항암면역을 일으킨다(Moodycliffe, A. M., et al., Nat. Immunol., 1, 521-525, 2000).
알파-갈락토실세라마이드(a-galactosylceramide, αGalCer)는 원래 해면동물에서 추출된 당지질(glycolipid)로 Vα14+ T 세포 수용체(TCR)를 가지고 있는 자연 살해 T(Natural Killer T) 세포의 리간드(ligand)이고, 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에 있는 CD1d 분자에 의해 제시됨이 알려져 있다(Kawano et al., Science, 278: 1626, 1997). 자연 살해 T 세포가 활성화되면 많은 양의 IFN-γ 및 IL-4를 생산하고, 이것은 특정 질병 또는 감염에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다(Chen et al., J. Immunol., 159: 2240, 1997; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 10913, 2003).
단백질 항원과 알파-갈락토실세라마이드를 함께 투여한 마우스에서는 세포 독성 T 세포 반응을 포함한 세포성 면역반응(cell-mediated immunity) 및 체액성 면역반응(humoral-mediated immunity)이 일어난다(Hermans, I. F., et al., J. Immunol, 171, 5140-5147, 2003; 및 Stober, D. et al., J. Immunol., 170, 2540-2548, 2003). 더 나아가 최근의 연구에서 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 수지 상 세포는 자연형의 알파-갈락토실세라마이드에 비하여 오래 지속되는 자연살해 T 세포 반응을 생성시키는 것으로 나타나 자연살해 T 세포 리간드의 면역 증강 효과는 전문적인 항원제시 세포(professional APC)를 표적으로 함으로써 증가시킬 수 있음을 시사하고 있다.
이에, 본 발명자들은 자연 살해 T 세포 리간드를 B 세포에 적재하여 이 세포들의 자가 면역 관용성을 면역원성으로 변화시킴으로써 B 세포의 MHC 분자에 의해 제시되는 항원에 대하여 활발한 면역 반응을 생성할 수 있음을 확인하였고, 이를 검증하기 위하여 알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)와 펩티드가 적재된 B 세포 및 알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)와 암 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 전환된 B 세포가 항원 특이적인 면역 반응과 항암 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 자연 살해 T 세포 리간드, 특히 알파-갈락토실세라마이드와 항원을 적재한 B 세포에 의하여 활성화된 자연 살해 T 세포를 통하여 B 세포의 면역 관용성을 면역원성으로 변화시킴으로써 항원을 제시하는 B 세포를 통하여 항원 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 면역 예방 및 치료용 백신을 제공하는 것이다.
본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 B 세포를 포함하는 면역 예방/치료용 백신 및 항암용 백신을 제공한다.
또한, 본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드를 적재하고 암 항원을 발현하는 B 세포를 매개로 하는 항암용 백신을 제공한다.
또한, 본 발명은 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B 세포를 매개로 하는 자연 살해 T 세포 활성화제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 암 항원을 발현하는 B 세포를 포함하는 세포 독성 반응 유도제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드를 적재한 B 세포 또는 자연 살해 T 세포의 리간드와 항원을 적재한 B 세포를 포함하는 면역 예방/치료용 백신 및 항암용 백신을 제공한다.
상기의 자연 살해 T 세포의 리간드는 스핑고모나스 속(Sphingomonas spp.) 기원의 알파-갈락투로노실세라마이드(alpha-galacturonosylceramide)와 알파-글루쿠로노실세라마이드(alpha-glucuronosylceramide, Mattner, J. et al. Nature 434:525, 2005, Kinjo, Y. et al. Nature 434:520, 2005). M. 투버굴로시스(M. tuberculosis) 유래의 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드(phosphatidylinositoltetramannoside, Fischer, K. et al. PNAS 101:10685, 2004)
자가 항원인 이소글로보트리섹소실세라마이드(isoglobotrihexosylceramide, Zhou, D. et al. Science 306:1786, 2004)와 갱글리오사이드 GD3(ganglioside GD3, Wu, D. Y. et al. J. Exp. Med. 198:173, 2003), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, J. Immunol. 175:977, 2005), 베타-갈락토실세라마이드(beta-galactosylceramide, betαGalCer, Ortaldo JR et al. J. Immunol. 172:943), Leishmania 표면 당결합 리포포스포글리칸(lipophosphoglycan)과 글리코이노시톨 포스포리피드(glycoinositol phospholipids, J. Exp. Med. 200:895, 2004), 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드들(beta-anomeric GalCer)과 알파-아노머 갈락토실세라마이드들(alpha-anomeric GalCer; J. Immunol. 173:3693, 2004), 알파-갈락토실세라마이드의 변이체(J. Am. Chem. Soc. 126:13602, 2004) 및 박테리아 지질 항원, 예를 들어 노카디아 팔시니카(Nocardia falcinica) 유래의 글루코스 모노마이콜레이트(glucose monomycolate, Moody, D. B. et al. J. Exp. Med. 192:965, 2000)을 포함한다.
이미, 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 수지상 세포(dendritic cell, DC)가 불변성 자연 살해 T(iNKT) 세포를 활성화시킨다는 것은 공지된 사실이므로(van der Vliet HJ, et al., J Immunol Methods., 1;247(1-2):61-72, 2001), 본 발명자들은 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B 세포가 상기의 수지상 세포와 유사한 효과를 나타내는지 확인해 보았다.
마우스로부터 CD19를 발현하는 B 세포(도 1a)와 수지상 세포를 분리하여 알파-갈락토실세라마이드 및 자연 살해 T 세포 하이브리도마와 함께 배양한 후, 배양 액 내의 IL-2 농도를 측정한 결과, 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 수지상 세포(DC/αGalCer)와 B 세포(B/αGalCer) 모두 자연 살해 T 세포 하이브리도마를 자극하여 IL-2를 생성하였다(도 13 참조). 따라서, B/αGalCer 및 DC/αGalCer 모두 체외에서 불변성 자연살해 T 세포를 활성화시킬 수 있음을 확인하였다.
B/αGalCer 및 DC/αGalCer 투여가 체내에서 면역 세포를 활성화시킬 수 있는지 확인하기 위하여 C57BL/6 마우스에서 수득한 B세포와 DC를 이용하여 제조한 B/αGalCer 또는 DC/αGalCer를 동종의 마우스에 정맥 주사하여 엘리스팟(ELISPOT)을 통해 IL-4 및 IFN-γ 레벨을 측정하였다. 구체적으로, 야생형 C57BL/6 또는 Jα281-/- 마우스에 비히클, αGalCer, αGalCer를 적재한 B세포 또는 αGalCer를 적재한 수지상 세포를 정맥주사하였다. 일주일 후, 비장세포를 적출하여 단일세포로 만든 다음에 엘리스팟용 플레이트에 넣고, 비히클 또는 αGalCer를 넣고 자극하였다. 이후는 제조사(IL-4 ELISPOT kit, IFN-γ ELISPOT kit, R&D system)의 설명서에 따라 IL-4와 IFN-γ를 생성하는 세포를 측정하기 위한 엘리스팟 시험을 실시하였다.
그 결과, B/αGalCer 및 DC/αGalCer 그룹 모두에서 IL-4 및 IFN-γ를 생성하는 세포를 현저하게 많이 유도하였다(도 1b). 그러나 불변성 자연 살해 T 세포가 결여된 Jα281-/- 마우스의 경우에는, 정상 마우스와 달리 상기와 같은 사이토카인을 생성하는 세포가 유도되지 못하는데, 이는 IFN-γ와 IL-4를 생성하는 세포가 불변성 자연 살해 T 세포에 의존적으로 유도된다는 것을 시사한다(도 1b 참조).
본 발명자들은 B/αGalCer을 체내로 투여하였을 때 유도되는 자연 살해 T세 포의 활성화로 인하여 B세포가 어떠한 영향을 받는지 알아보기 위하여, 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B세포를 CFSE로 표지하여 정맥으로 면역화되지 않은 마우스(naive mouse)에 이입하고, 24시간 또는 48시간 후에 비장 세포의 면역 세포 중 CFSE+ 세포 상의 보조자극분자를 유세포 분석기로 분석하였다. 그 결과, CD80는 어떠한 변화도 없었지만, CD86는 높은 레벨로 발현이 유도되었고(도 1c 참조) CD40 및 MHC class II 분자도 약하게 증가하였다. 즉, B/αGalCer를 체내로 투여하면 24시간 또는 48시간 후에 B세포가 활성화되는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 알파-갈락토실세라마이드와 MHC I 분자에 결합하는 항원의 에피토프 펩티드를 B 세포에 함께 적재함으로서 펩티드 특이적인 CD8+ T 세포를 자극하여 항원 특이적인 세포 분해를 일으킬 수 있는지 알아보았다. 이를 위하여, CFSE로 표지된 OVA 특이적인 CD8+ T 세포를 마우스에 이식한 후, B 세포 단독, B/αGalCer, 비히클+펩티드를 첨가한 B 세포(B/pep) 또는 αGalCer+펩티드를 첨가한 B 세포(B/αGalCer/pep)를 정맥주사하고 비장과 임파절로부터 수득한 림프구들로부터 CD8+ T 세포 반응을 측정하였다. 그 결과, B 세포 단독 또는 B/αGalCer를 투여한 군에서는, OVA 특이적인 CD8+ T 세포의 분열이 거의 유도되지 않았고 B/pep을 투여한 군에서는 상당히 많은 CD8+ T 세포의 분열을 유도하였으며 B/αGalCer/pep를 투여한 군에서는 세포의 현저한 분열이 나타났고, 분열한 세포의 40% 이상이 IL-2를 생성하며, 90% 이상이 IFN-γ를 생성하고, 그 레벨이 B/pep군에 비하여 월등히 높았다(도 2a 참조). 상기 결과는, B 세포에 알파-갈락토실세라마이드와 펩 타이드를 함께 적재함으로서 CD8+ T 세포를 훨씬 높은 레벨로 활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
본 발명자들은 마우스에 B 세포 단독, B/αGalCer, B/pep 또는 B/αGalCer/pep을 각각 정맥 투여한 후 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 세포독성 T 림프구 활성을 측정하였다. 그 결과, 오직 B/αGalCer/pep를 투여한 군에서만 펩티드가 적재된 표적을 완전하게 파괴하였고(도 2b), 펩티드에 대한 IFN-γ를 생성하는 CD8+ T 세포가 현저하게 증가함을 관찰하였다(도 2c, 왼쪽). 또한, 동일한 항원으로 체외에서 재자극한 경우, B 세포 단독 또는 B/αGalCer를 투여한 마우스의 경우에는 정상적으로 면역 반응이 유도되어 펩티드 특이적인 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포를 유도한 반면(도 2c, 오른쪽), B/pep를 투여한 마우스는 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포의 증가가 나타나지 않았으며, B/αGalCer/pep을 투여한 마우스는 B 세포 단독 또는 B/αGalCer를 투여한 군에 비해 월등히 많은 펩티드에 반응하는 CD8+ T 세포를 형성하였다.
본 발명자들은 B 세포를 매개로 하는 백신의 세포 독성 효과를 수지상 세포 백신의 세포 독성 효과와 비교하기 위하여 세포 독성 T 림프구 분석을 이용하여, 완전하게 표적을 용해하는 데 필요한 최소한의 세포수를 측정해보았다. 그 결과, 수지상 세포의 큰 표면적을 고려할 때, B/αGalCer/pep 투여군은 DC/αGalCer/pep 투여군과 유사한 효율로 체내에서 세포 독성을 일으킴을 확인하였다. 이와 더불어, 체내 세포 독성의 효과가 DC/pep와 DC/αGalCer/pep 투여군이 유사했는데 이는 αGalCer를 수지상 세포에 적재하는 것이 펩티드를 적재한 수지상 세포의 백신 효 율을 증가시키지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명자들은 세포 독성 T 림프구 반응을 유도하는데 관여하는 면역 세포의 종류를 확인하기 위하여, 각각의 면역 세포를 제거하는 항체를 투여한 후, B/αGalCer/pep으로 면역화하였다. 그 결과, CD4+T 세포 또는 NK1.1 세포 제거가 세포 독성 T 림프구 반응 유도를 저해하지 않는 반면, CD8+ T 세포를 제거하면 표적 세포의 파괴가 일어나지 않았다(도 4a).
본 발명자들은 펩티드를 적재한 B 세포가 항원제시 세포로서 기능하는 것인지, 아니면 B 세포가 운반한 펩티드를 수지상 세포가 회수하여 세포 독성 T 림프구 반응을 유도하는 것인지 알아보았다. 이를 위하여, OVA의 CTL 에피토프 펩티드를 MHC I에 적재할 수 있으나, H-2K 영역의 돌연변이로 인하여 CD8+ T 세포가 MHC I-펩티드 복합체를 인식하지 못하는 bm-1 마우스로부터 수득한 B 세포를 이용한 결과, 상기 세포는 αGalCer와 반응하여 자연 살해 T 세포의 활성화를 자극함을 확인하였다. 또한, 야생형의 B 세포로부터 준비된 B/αGalCer/pep를 야생형 마우스에 주사하면, 체내에서 OVA 특이적인 세포 독성이 완벽하게 생성되나 bm-1 마우스의 B 세포로부터 준비된 B/αGalCer/pep를 야생형 마우스에 주사하면 OVA 특이적인 세포 독성 활성을 생성하지 못하므로, B 세포가 항원제시 세포로서 기능하는 것임을 확인하였다(도 5a).
이어, 본 발명자들은 αGalCer와 펩티드를 개별적으로 투여한 경우, 그리고 함께 투여한 경우에 세포 독성 T 림프구를 형성할 수 있는지 조사하였다. 그 결과, B/αGalCer와 B/pep를 함께 투여한 마우스에서는 체내 세포 독성이 전혀 유도 되지 않음을 확인하였다(도 5b). 이는 펩티드와 αGalCer가 동일한 B 세포에 의해 제시되는 것이 OVA 특이적인 세포 독성을 생성하는데 있어서 필수적임을 나타낸다.
본 발명자들은 B/αGalCer/pep의 백신 투여가 항암면역을 유도하는지 조사하였다. 먼저, 예방적 항암면역 활성을 시험하기 위하여 B 세포 단독, B/αGalCer, B/pep, B/αGalCer/pep, DC/pep, 또는 DC/αGalCer/pep 백신을 투여하고 OVA를 형질도입한 흑색종을 피하로 이식하였다. 그 결과, B/αGalCer를 투여한 마우스에서는 암을 형성한 반면, B/αGalCer/pep, DC/pep, 또는 DC/αGalCer/pep를 투여한 마우스에서는 암이 성장하지 않았다(도 6a 참조). 이어, 최초로 암을 이식한 지 70일이 되는 시점에서 생존한 마우스에 암세포를 다시 이식한 결과, 암의 성장이 나타나지 않았는데 이는 B/αGalCer/pep 백신 투여로 상기 암에 대한 기억 면역 반응을 확립하였음을 시사한다(도 6b 참조).
다음으로는, B/αGalCer/pep 백신을 투여함으로써 이미 존재하고 있는 암을 제거할 수 있는지 알아보았는데 DC/pep, DC/αGalCer/pep 또는 B/αGalCer/pep 백신을 투여한 마우스는 완벽하게 암의 성장을 감소시키는 것을 관찰하였다(도 6c 및 6d 참조).
본 발명자들은 B 세포를 매개로 하는 백신 투여가 실제로 암 항원에 적용될 수 있는지 알아보기 위하여, Her-2/neu 모델을 이용한 결과, αGalCer 및 Her-2/neu 63-71를 제시하는 B 세포를 투여한 마우스군에서 체내 Her-2/neu에 대한 세포 독성이 의미 있는 수준으로 나타남을 확인하였다(도 7a 참조). 또한, Her-2/neu를 발현하는 암세포를 마우스에 주입한 후, B 세포 백신을 투여한 결과, B/αGalCer 또는 B/pep 백신 투여한 경우에는 B 세포 단독 투여군과 비교하여 생존기간이 약간 연장되는 것을 확인하였고(도 7b 참조), αGalCer와 Her-2/neu 63-71를 적재한 B세포를 투여한 마우스는 전체 실험기간 동안 생존하는 것을 관찰하였다. 또한 암을 지닌 마우스를 B세포 백신 또는 수지상 세포 백신으로 면역화하면, αGalCer와 Her-2/neu 63-71를 적재한 B세포 투여군은 수지상 세포 백신과 유사한 수준으로 Her-2/neu를 발현하는 암세포의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 7c 참조).
따라서, 본 발명의 B 세포를 매개로 하는 백신 투여는 항암 면역의 예방효과 및 치료 효과에 있어서 수지상 세포를 기반으로 하는 백신만큼 효율적임을 입증하였다.
또한, 본 발명은 자연 살해 T 세포의 리간드를 적재하고 항원을 발현하는 B 세포를 포함하는 면역 예방 및 치료용 백신 및 항암용 백신을 제공한다.
펩티드를 적재한 세포 백신에 반해 바이러스를 매개로하여 전체 항원을 도입한 세포 백신은 주조직 적합성 복합체의 일배체형에 국한되지 않고 모든 사람에 적용 가능하며, 여러 항원결정기에 특이적인 면역반응을 유도할 수 있으며, 특히 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 동시에 유도할 수 있다는 장점이 있다. 종양 관련 항원인 Her-2/neu를 표적으로 하여 Her-2/neu의 세포외 영역 및 세포막 영역을 발현하는 유전자를 가진 아데노바이러스(AdHM)로 B 세포를 감염시킨 결과, B 세 포가 알파-갈락토실세라마이드를 제시하는데 있어서도 별다른 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(도 8b 참조). 또한, 면역화하고 1주가 지난 시점에서 B와 B/αGalCer로 면역화된 마우스 군에서는 표적 세포의 분해를 관찰할 수 없었던 반면, B/AdHM과 B/AdHM/αGalCer로 면역화된 마우스 군에서는 세포 독성 T 세포 반응을 확인할 수 있었다(도 9a 및 9c 참조).
알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)가 적재된 아데노바이러스로 형질도입된 B 세포(B/AdHM/αGalCer)는 아데노바이러스로 도입된 B 세포(B/AdHM)에 비하여 세포 독성 T 세포 반응이 다소 높게 장기간 지속되는 경향성을 보이지만 유의할만한 수준의 차이가 나타나지 않는 것으로 보아, 세포 독성 T 세포 반응을 유도하는데 있어서 펩티드를 적재한 B 세포 백신과는 달리, 알파-갈락토실세라마이드의 적재가 결정적인 역할을 담당하지는 않는 것으로 보여진다. 그러나 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B 세포 백신을 마우스에 투여하면, 형질도입만 된 B 세포 백신 투여군과는 달리 체내에서 NKT 세포를 자극하며 결과적으로 자연 살해 세포를 활성화시키는 것을 확인하였다(도 10a 참조).
본 발명자들은 B 세포 백신이 세포 독성 T 세포를 유도하는 효율성을 측정하기 위하여, 완전한 세포 독성 T 세포를 유도하는 수준 이하로 세포 백신을 투여하였을 때 유도되는 표적 세포의 용해 정도를 비교하였다. 그 결과, 아데노바이러스로 형질도입된 B 세포(B/AdHM)의 경우 전체 세포 수의 약 20% 정도만이 항원제시세포로 기능할 것을 감안한다면, 항원을 아데노바이러스로 도입된 B 세포 백신은 펩티드가 적재된 B 세포 백신에 비하여 많은 수의 B 세포 투여가 필요함에도 불구하 고, 효율적으로 항원 특이적인 세포 독성 T 세포 반응을 유도할 수 있다고 판단된다. 또한 적은 수의 B 세포가 투여되었을 때, 알파-갈락토실세라마이드의 적재로 NKT의 도움을 받는 경우 표적 세포를 용해하는 데 다소 유리한 것을 확인하였다.
상기에서 암 항원 발현을 위해 B 세포에 도입되는 바이러스는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스(Pox virus), Sindbis virus 등이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 바이러스를 이용한 방법 외에도 항원 유전자 전달로 적용 가능한 것은 1) DNA를 리포좀(liposome)에 결합시켜 형질도입하여 효소 분해로부터 DNA를 보호하거나 엔도솜(endosome)으로 흡수하도록 하는 방법 2) DNA에 단백질로 구성된 분자 콘쥬게이트(molecular conjugate)나 합성 리간드를 결합하여 세포로 DNA를 전달 효율을 높이는 방법[예: 아시알로글리코프로테인(Asialoglycoprotein), 트랜스페린( transferrin), 폴리머 IgA (polymeric IgA)] 3) PTD(Protein transduction domain)을 이용한 새로운 DNA 전달 시스템으로 세포로 DNA의 전달 효율을 높임으로서 항원 유전자를 전달하는 방법[예: Mph-1] 4) 상기 방법 외에도 펩티드를 사용하거나 항원 단백질을 B세포에 적용함으로써 B세포가 항원을 제시하도록 할 수 있다.
또한, 본 발명은 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B 세포를 매개로 하는 자연 살해 T 세포 활성화제를 제공한다.
상기에서와 같이, 본 발명의 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B세포는 수지상 세포와 마찬가지로 생체외에서 자연 살해 T 세포 하이브리도마를 자극하여 IL-2를 생성하고(도 13 참조) 생체 내에서도 불변성 자연살해 T 세포를 활성화하여 결과적으로 면역 세포의 활성을 유도하였다(도 1b 참조). 따라서, 본 발명의 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B 세포는 기존의 수지상 세포와 마찬가지로 자연 살해 T 세포 활성화제로 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 암 항원을 발현하는 B 세포를 포함하는 세포 독성 반응 유도제를 제공한다.
아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포 백신은, 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 펩티드를 적재한 B 세포 백신과는 달리 세포성 면역반응 및 체액성 면역 반응을 동시에 유도할 수 있다는 장점이 있다. AdHM으로 형질 도입된 B 세포 백신이 Her-2/neu 특이적인 항체를 유도할 수 있는지 알아보기 위하여 마우스를 B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer로 각각 면역화시킨 다음, 혈청 중의 항-Her-2/neu 항체의 역가를 측정한 결과, B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer 두 집단 모두에서 오랫동안 항-Her-2/neu 항체가 높은 역가로 유지됨이 관찰되었고(도 11a 참조), B 세포(B) 및 B/αGalCer와 달리 B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer 백신 투여 집단에서는 모두 체액성 면역 반응이 생성됨을 확인하였다(도 11b 참조).
본 발명자들은 마우스를 B세포 백신으로 면역화한 후 7일째에 Her-2/neu를 발현하는 마우스 암세포(TAUF)를 정맥 주사하여 생존율을 측정한 결과, B 세포만 투여받은 마우스 군에 비하여 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 B 세포(B/αGalCer)를 투여받은 마우스 군에서 생존기간이 다소 연장되었고 암 항원을 발현하 는 아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포 백신으로 면역화된 마우스에서 뛰어난 항암 예방 효과를 확인할 수 있었다(도 12a 참조). 따라서 알파-갈락토실세라마이드를 적재하고 아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포 백신으로 유도된 면역 반응이 효과적으로 암을 예방한다는 것을 알 수 있었다.
다음으로 B 세포 백신의 치료 효과를 확인하기 위하여 BALB/c 마우스를 B, B/αGalCer, B/AdHM, B/AdHM/αGalCer로 각각 면역화한 다음, 암세포(TAUF)를 꼬리 정맥으로 주사하여 폐암을 유도한 결과, B 세포만 단독으로 투여받은 마우스 군이 가장 짧은 생존 기간을 나타내었고, B/αGalCer 백신 투여군도 이와 비슷한 경향으로 관찰되었다. B/AdHM 백신으로 면역화된 마우스 군은 B, B/αGalCer 투여군에 비하여 생존 기간이 연장되었으나 완벽하게 암의 생성을 억제하지는 못했다. 반면 B/AdHM/αGalCer 투여군은 다른 투여군에 비하여 생존 기간이 유의적으로 증가하였고, 따라서 B, B/αGalCer 또는 B/AdHM의 면역화로 유도되는 항암 효과에 비하여 뛰어난 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 12b 참조).
본 발명의 백신은 자연 살해 T 세포의 리간드와 B 세포에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 백신은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제 성분을 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 등으로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 백신은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 자연 살해 T 세포의 리간드를 적재한 B 세포, 자연 살해 T 세포의 리간드와 펩티드를 적재한 B 세포 또는 암 항원을 발현하는 바이러스로 감염된 B 세포는 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다(기존의 수지상 세포의 형질 도입에 적용되는 바이러스 벡터의 기준을 참고).
백신은 환자에서 면역반응을 자극하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 백신은 인간에게 일회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 세포수가 1x103 개/kg ~ 1x109/kg 개, 바람직하게는 1x104 개/kg ~ 1x108 개/kg 이다. 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 B 세포 백신을 제작하는 경우, B 세포 1x106 ~ 1x107 개/ml 당 알파-갈락토실세라마이드 1~2㎍/ml가 든 배지를 사용하여 배양한다. 알파-갈락토실세라마이드와 펩티드를 적재한 B 세포 백신을 제작하는 경우, B 세포 1x106 ~ 1x107 개/ml 당 알파-갈락토실세라마이드 1~2㎍/ml가 든 배지를 사용하고, 펩티드는 B 세포 1x106 ~ 1x107 개/ml 를 1~10㎍/ml 펩티드가 포함된 배지에서 배양하여 세포에 적재시킨다.
알파-갈락토실세라마이드는 설치류 및 원숭이에서 독성을 유도하지 않는 것으로 보이고 있다(Nakata et al., Cancer Res., 58: 1202-1207, 1998). 2200 ㎍/Kg의 αGalCer가 주입된 마우스에도 부작용은 보고되고 있지 않다(Giaccone et al., Clin. Cancer Res., 8: 3702, 200). 진행 중인 임상 시험에서도 αGalCer의 전신 투여에 의하여 경미한 두통과 같은 부작용이 일부 보고되었으나(Mie Nieda et al., Blood, 103: 383-389, Giaccone et al., Clin. Cancer Res., 8: 3702, 200) 파라세타몰(paracetamol) 투여에 의해 예방될 수 있었고, 이들 대상에서도 미약한 전신적 부작용이 반드시 나타나는 것은 아니다(Giaccone et al., Clin. Cancer Res., 8: 3702, 200). 본 발명에서도 αGalCer는 용량제한독성(dose-limiting toxicity)(50-4800 ㎍/m2)을 야기하지 않고, 용량증가실험(dose escalation study)에서도 내성을 보여 αGalCer는 안전한 물질로 판단된다.
상기에서 펩티드는 바이러스, 박테리아, 균류, 기생충 및 암 유래의 항원 펩티드가 포함되며, 바이러스를 매개로 하여 발현이 유도된 항원은 바이러스, 박테리아, 균류, 기생충 및 암 유래의 항원이 포함된다.
"항원"은 숙주의 체내에 들어왔을 때, 숙주의 면역계에 의하여 인식되어 면 역반응을 일으킬 수 있는 모든 물질 (예를들면, 단백질, 펩타이드, 암세포, 당단백질, 당지질, 생바이러스, 사바이러스, DNA 등)을 의미한다.
항원은 또한 정제된 또는 정제되지 않은 형태로 제공될 수 있으며, 정제된 형태로 제공되는 것이 바람직하다.
본 발명은 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 펩티드, 다당류, 당단백질, 지질다당류 및 DNA 분자(폴리뉴클레오티드), 암세포, 생바이러스, 사바이러스를 포함하는 항원에도 적용될 수 있다.
하기 항원 목록은 실시예의 암항원을 대신하여 면역 반응을 유도하는 수단으로 제공될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다: 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 항원(haemagglutinin 및 neuraminidase 항원), 백일해균(Bordetella pertussis) 항원(pertussis toxin, filamentous haemagglutinin, pertactin), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV) 항원(glycoprotein), 헬리토박터파이로리(Helicobacterpylori) 항원(capsula polysaccharides of serogrup A, B, C, Y 및 W-135), 파상풍균 항원(tetanus toxoid), 디프테리아균(diphtheria) 항원(diphtheria toxoid), 폐렴균(pneumococcal) 항원(Streptococcus pnemoniae type 3 capsular polysaccharide), 결핵균(tuberculosis) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 항원(GP-120, GP-160, p18, Tat, Gag, Pol, Env), 콜레라(cholera) 항원(cholera toxin B subunit), 포도상구균(staphylococcal) 항원(staphylococcal enterotoxin B), 적리균(shigella) 항원(shigella polysaccharides), 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 항원(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 항원, 간염바이러스(hepatitis) 항원(hepatitis A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원)(core antigen and surface antigen), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV) 항원, 허피스 심플렉스(herpes simplex) 항원 또는 그의 조합(예, 디프테리아, 백일해균 및 파생풍균, DPT), 보렐리아(Borrelia sp.) 항원 (예, OspA, OspB, OspC antigen), 칸디다(Candida albicans) 항원(예, MP65), 플라스모디움(Plasmodium) 항원(예, CS protein)
암 항원은 정상적인 유전자의 체세포 변이 결과로 생성되며 암세포의 유전적 불안정성에 기인하는 산물인 암 특이 항원(tumor-specific antigen)과 암 항원의 대부분을 차지하며 암세포에서 발현이 증가하는 항원으로 발생단계에서 일시적으로 발현되거나 특정 조직에만 발현되는 단백질로 정상적으로 체내에 존재하는 자가 항원인 암 공유 항원이 포함된다. 암 특이 항원의 예로는 HPV E6/E7 등의 암 바이러스에 의한 암 항원이 있으며 암 공유 항원의 예로는 gp100, 티로시나제(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase-related protein-1), TRP-2(tyrosinase-related protein-2), MAGE, MUC-1, CEA(arcinoembryonic antigen), p53, 알파-페토프로테인(alpha-fetoprotein) 및 Her-2/neu 등이 있다(Rosenberg SA., Nature, 17;411(6835):380-4, 2001).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 B 세포 및 자연살해 T 세포 사이에서의 양방향 활성화
<1-1> B 세포와 수지상 세포의 자연 살해 T세포 활성화 효과 비교
알파-갈락토실세라마이드(Kim, S., et a., Synthesis, 847, 2004)가 적재된 수지상 세포(dendritic cell, DC)가 불변성 자연 살해 T(iNKT) 세포를 활성화시킨다는 것은 공지된 사실이므로, 본 발명에서는 우선 이러한 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B 세포가 상기의 수지상 세포와 유사한 효과를 나타내는지 확인해 보았다.
본 발명에서는 6-10 주령인 암컷 C57BL/6와 BALB/c를 사용하였다. OT-I 및 C57BL/6 bm1(bm1) 마우스는 The Jackson Laboratory에서 구입하였고, Jα281-/- 마우스 및 MHC II-/- 마우스는 각각 서울대학교 정두현 교수(Kim JH et al., Am J Pathol., 167(5):1231-41, 2005)와 고려대학교 박세호 교수(Park, S. H., et al., J. Exp. Med. 193:893, 2001)께서 제공해 주었다. 모든 마우스는 서울대학교 약학 연구소 동물 센터의 특정 병원체가 없는 조건(specific pathogen-free condition)하에서 보존되었다. 또한, 항체들은 GK1.5(항-CD4: ATCC number: TIB-207), 2.43(항-CD8; ATCC number: TIB-210 ) 및 PK136(항-NK1.1 ; ATCC number: HB-191) 하이브리도마로부터 수득하였고, 생체 내에서 각각에 대한 림프구를 제거하기 위해 마 우스 당 150 μg씩을 복강으로 투여하였다.
구체적으로, 각각의 마우스로부터 B 세포를 순수 분리하기 위하여, 마우스로부터 비장을 적출한 후 균질화(homogenization)하여, 비장 세포로부터 항-CD11c 마이크로비드(Miltenyibiotec)로 CD11c+ 세포를 제거한 후, 항 B220 마이크로비드(Miltenyibiotec)를 이용하여 B220+ 세포를 분리하였다. 상기 세포들은 99% 이상이 CD19를 발현하는 순수하게 분리된 B 세포이다(도 1a 참조).
비장으로부터 수지상세포를 분리하기 위해 마우스로부터 적출된 비장을 collagenase D(1mg/ml, 로슈) 및 DNase I (50㎍/ml, 시그마알드리치)를 포함한 7ml의 배지를 사용하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 EDTA(최종농도 10mM, pH7.2)를 첨가하고 5분간 더 반응시켰다. 15.5% Accudenz 밀도 구배(Accurate Chemical & Scientific사)를 사용하여 비장으로부터 분리된 세포로부터 수지상세포를 분리하였다.
상기와 같이 분리된 세포들은(B 세포 또는 수지상 세포) 준비된 알파-갈락토실세라마이드(1ug/ml) 또는 용매(0.5% 폴리솔베이트)와 함께 이산화탄소 배양기에서 14시간 동안 배양한 후, 자연 살해 T 세포 하이브리도마(DN32.D3)(Claire Forestier et al., The Journal of Immunology, 171: 4096, 2003)와 함께 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액에서 자연 살해 T 세포 하이브리도마의 활성화 지표인 IL-2 농도를 샌드위치 엘리사법으로 측정하였다.
그 결과, 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 수지상 세포(DC/αGalCer)는 DN32.D3을 자극하여 IL-2를 생성하였다. 이와 유사하게, 알파-갈락토실세라마이드 를 적재한 B 세포(B/αGalCer) 역시 효율적으로 DN32.D3를 자극하여 IL-2를 생성하였다. 하이브리도마와 항원제시세포를 높은 비율로 혼합한 B 세포군에서 생성되는 IL-2 레벨은 수지상 세포군에서 생성되는 IL-2의 양과 동일하였으나, 낮은 비율로 혼합하였을 때는 수지상 세포군의 IL-2 양보다 적은 것으로 나타났다(도 13 참조).
<1-2> 자연 살해 T세포 의존적 면역반응 활성화 확인
본 발명에서는 C57BL/6 마우스에서 수득한 B세포와 DC를 이용하여 제조한 B/αGalCer 또는 DC/αGalCer를 동종의 마우스에 정맥 주사하여 엘리스팟(ELISPOT)을 통해 IL-4 및 IFN-γ 레벨을 측정하였다. 구체적으로, 야생형 C57BL/6 또는 Jα281-/- 마우스에 비히클, αGalCer, αGalCer를 적재한 B 세포 또는 αGalCer를 적재한 수지상 세포를 정맥주사하였다. 일주일 후, 비장세포를 적출하여 단일세포로 만든 다음에 엘리스팟용 플레이트에 넣고, 비히클 또는 αGalCer를 넣고 6시간 동안 배양하여 자극하였다. 이후는 제조사(IL-4 ELISPOT kit, IFN-γ ELISPOT kit 모두 R&D system)의 설명서에 따라 IL-4와 IFN-γ를 생성하는 세포를 측정하기 위한 엘리스팟 시험을 실시하였다.
그 결과, B/αGalCer 및 DC/αGalCer 그룹 모두에서 IL-4 및 IFN-γ를 생성하는 세포를 현저하게 많이 유도하였다(도 1b). 그러나 불변성 자연 살해 T 세포가 결여된 Jα281-/- 마우스의 경우에는, 정상 마우스와 달리 상기와 같은 사이토카인을 생성하는 세포가 유도되지 못하는데, 이는 IFN-γ와 IL-4를 생성하는 세포가 불변성 자연 살해 T 세포 의존적으로 유도된다는 것을 시사한다(도 1b 참조).
<1-3> 자연 살해 T세포 활성화로 인한 B세포 활성화 확인
본 발명자들은 B 세포를 주사하면 생체 내에서 어떠한 변화가 일어나는지 알아보기 위하여, CFSE(Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester)가 표지된 B/αGalCer를 정맥 투여한 후 CFSE+ 세포에서 공-자극 분자를 분석하였다. 구체적으로, C57BL/6의 비장 및 림프절에서 단일세포를 수득한 다음, 항 CD11c 마이크로비드(Miltenyibiotec)를 사용하여 비장 및 림프 기관에서 분리한 림프구 중에서 CD11c+ 세포를 제거하고, 항 B220 마이크로비드(Miltenyibiotec)를 사용하여 B 세포를 분리한 후, 이 세포들을 10 μM의 CFSE로 표지하여 동종 마우스의 꼬리 정맥으로 이입하였다. CFSE 표지는 RPMI 배지에 적절한 농도로 CFSE(Molecular Probe)를 희석하여 37℃에서 15분간 배양하여 표지한 다음, RPMI 배지로 3회 세척하여 잔여의 CFSE를 제거하는 방법으로 실시하였다. 표지한지 24시간과 48시간 후, 상기 마우스의 임파절이나 비장에서 분리한 CFSE+ 세포의 공자극분자를 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다.
그 결과, 24시간 이내에 CD80는 어떠한 변화도 없었지만, CD86는 높은 레벨로 발현이 유도되었고 CD40 및 MHC II의 발현도 약하게 증가함을 관찰할 수 있었다(도 1c). 주사 후 48시간이 경과한 후에도 CD80의 증가는 관찰되지 않았지만, 나머지는 24시간의 레벨과 대부분 유사하였다. 즉, 24시간 이내에 B/αGalCer에 의해서 활성화된 자연 살해 T 세포에 의하여 투여된 B세포 역시 활성화되는 현상을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 <1-1>, <1-2>와 <1-3>의 결과에 따라, B/αGalCer 및 DC/αGalCer 모두 자연 살해 T세포를 활성화시킬 수 있으며, B 세포는 알파-갈락토실세라마이드를 제시받은 자연 살해 T세포에 의해 활성화되므로, 상기 활성화는 양방향으로 이루어진다는 사실을 확인하였다.
<실시예 2> 펩티드 및 αGalCer가 함께 적재된 B 세포에 의한 펩티드 특이적인 CD8+ T 세포의 활성화 촉진
본 발명자들은 알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)와 MHC I 펩티드를 B 세포에 함께 적재함으로서 펩티드 특이적인 CD8+ T 세포를 자극하여 OVA 특이적인 세포독성을 일으킬 수 있는지 알아보았다.
이를 위하여, 먼저 CFSE로 표지된 OVA 특이적인 CD8 T 세포(OT-I)를 C57BL/6 마우스에 꼬리정맥으로 이식(adoptive transfer)하고, 하루 후에 비히클을 포함한 배지에서 배양한 B 세포(B세포), αGalCer을 적재한 B세포(B/aGarCer), OVA257-264펩티드를 적재한 B세포(B/pep) 그리고 αGalCer와 OVA257-264펩티드를 적재한 B세포(B/aGarCer/pep)를 정맥주사하였다. 48시간 후에 비장으로부터 단일 세포를 얻은 다음에 OT-I 세포의 분열을 관찰하였다. 별도로 1 μM의 OVA257-264 펩타이드와 1μL/mL의 GolgiPlug으로 4 시간 동안 배양한 다음, IL-2와 IFN-γ를 생성하는 OT-I 세포를 Cytoperm/Cytofix kit(BD Pharmingen)를 이용하여 세포내 사이토카인 염색법으로 시험하였다.
그 결과, B 세포 단독 또는 B/αGalCer를 투여한 군에서는, OVA 특이적인 CD8+ T 세포 즉, OT-I 세포의 분열이 거의 유도되지 않았다. 특히, B/αGalCer를 투여한 군에서는 약하게나마 OT-I 세포의 분열을 보였는데(도 3a, 1.2± 0.5% vs. 5.4± 1.8%), 이는 항원 비특이적인 변화라고 여겨진다. 한편, B/pep을 투여한 군에서는 상당히 많은 OT-I 세포의 분열을 유도하였다. 그러나 생체 밖에서 동일한 펩티드로 재자극하면, 이러한 세포의 극소수만이 IL-2를 생성하며(<4%) 상대적으로 적은 IFN-γ를 생성하였다(38%). 이와는 대조적으로 B/αGalCer/pep를 투여한 군에서는 OT-I 세포의 현저한 분열이 나타났고, 분열한 세포의 40% 이상이 IL-2를 생성하며, 90% 이상이 IFN-γ를 생성하고, 그 레벨이 B/pep군에 비하여 월등히 높았다(도 2a).
상기 결과는, B/pep와 알파-갈락토실세라마이드를 함께 적재함으로서 CD8+ T 세포를 훨씬 높은 레벨로 활성화시킬 수 있음을 보여주고 있다.
<실시예 3> B/αGalCer/pep에 의한 지속성을 지닌 세포 독성 T 세포 반응의 유도 및 면역관용의 극복
<1-1> B/αGalCer/peptide에 의한 지속적 세포독성 T 세포 반응의 유도
본 발명자들은 C57BL/6 마우스에 B 세포 단독, B/αGalCer, B/pep 또는 B/αGalCer/pep를 각각 정맥 투여한 후 생체내의 세포독성 T 림프구 활성을 측정하여, B 세포 백신이 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 알아보았다. 또한, B 세포 백신에 의하여 유도된 세포 독성 면역반응이 지속적으로 유지되는지를 알아보았다. 구체적으로, C57BL/6 마우스를 각각 B단독, B/αGalCer, B/pep 및 B/αGalCer/pep로 면역화 한 다음에, 1주일, 3주일, 5주일 후에 생체내 세포독성시험(in vivo CTL assay)을 실시하였다. 먼저 동종의 면역화되지 않은 마우스의 비장 단일 세포를 두 그룹으로 나눈 후, 한 그룹은 OVA257-264 펩티드를 적재한 다음 20 μM의 CFSE로 표지하였고(CFSEhigh) 다른 그룹은 펩티드 적재 없이 2 μM의 CFSE로 표지하여 대조세포로 하였다(CFSElow). 상기 두 그룹의 세포를 동량씩 혼합하여 면역화한 마우스에 주사한 다음, 하루 후에 비장 단일 세포를 적출하여 CFSEhigh와 CFSElow 세포집단을 유세포분석기를 통하여 측정하였다. 이때, CFSEhigh의 비율이 낮을수록 세포독성면역반응이 큰 것을 의미한다.
그 결과, 오직 B/αGalCer/pep를 투여한 군에서만 펩티드가 적재된 표적을 완전하게 파괴하였고, 특이적으로 한 번의 백신 접종 이후 5주까지 완벽하게 세포 독성을 나타내었다. 한편, B/αGalCer 또는 B/pep를 투여한 마우스군 모두 펩티드 특이적인 세포독성 T 세포 반응이 전혀 유도되지 않았고, 단지 B/αGalCer/pep를 투여한 군에서만 펩티드에 대한 IFN-γ를 생성하는 CD8 T 세포가 현저하게 증가함을 관찰하였다(도 2c, 왼쪽).
<1-2> B/αGalCer/pep에 의한 면역관용의 극복 확인
일반적으로 항원만을 투여한 경우에는 면역관용이 유도되므로 본 발명자들은 αGalCer를 펩타이드와 같이 B 세포에 적재하였을 때, 항원만을 투여하여 유도되는 면역관용을 극복할 수 있는지 알아보았다. 구체적으로, 상기 실시예 3의 <1-1>과 같이 C57BL/6 마우스를 면역화하고 일주일 후에 비장 단일 세포를 적출한 후, OVA가 적재된 비장 단일 세포로 일주일간 자극하였다. 자극된 비장 단일 세포들에 대하여 IFN-γ를 생성하는 CD8+ T 세포들을 상기의 세포내 사이토카인 염색법으로 시험하였다.
그 결과, B 세포 단독 또는 B/αGalCer를 투여한 마우스의 경우에는 정상적으로 면역 반응이 유도되어 펩티드 특이적인 IFN-γ를 생산하는 CD8 T+ 세포를 유도한 반면(도 2c, 오른쪽), B/pep를 투여한 마우스는 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포의 증가가 나타나지 않았으며, 이는 마우스가 펩티드에 대하여 ‘면역 관용’을 나타내는 것으로 여겨진다.
이와는 대조적으로 B/αGalCer/pep을 투여한 마우스는 B 세포 단독 또는 B/αGalCer를 투여한 군에 비해 펩티드에 반응하는 CD8+ T 세포를 월등하게 많이 형성하였다. 여기서, B 단독 또는 B/αGalCer를 투여한 마우스의 경우에는 항원이 투여된 적이 없기 때문에 항원 특이적인 면역반응이 유도되지 않은 마우스로, OVA가 적재된 비장 단일세포의 시험관내 재자극이 최초 면역반응이다. 반면에, B/αGalCer/pep를 투여한 마우스의 경우에는 마우스에 이미 항원이 투여되었기 때문에 OVA가 적재된 비장 단일세포의 시험관내 재자극은 재반응(recall response)이 된 다. 결론적으로, B/αGalCer/pep는 면역관용을 극복하여 면역원성을 나타내며, 강력한 재반응을 나타냄을 확인하였다.
<실시예 4> 수지상 세포백신과 유사한 효능의 B세포 백신의 세포 독성 T 림프구의 생성을 유도 확인
본 발명자들은 B 세포를 매개로 하는 백신의 세포 독성 효과를 수지상 세포 백신의 세포 독성 효과와 비교하였다.
이를 위하여, 생체 내 세포 독성 T 림프구 분석을 이용하여, 완전하게 표적을 용해하는 데 필요한 최소한의 세포수를 측정해보았다. 구체적으로 B 세포 또는 수지상 세포를 각각 αGalCer 또는 비히클과 함께 16 내지 18 시간 동안 배양한 다음, OVA257-264 펩티드 1μg/ml로 1 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 순차적으로 희석하여 동종의 마우스에 정맥 주사한 다음 일주일 후에, 생체 내 세포독성 T 림프구 분석을 실시하였다. 즉 상기 실시 예에서와 같이, 펩티드가 적용된 표적 세포는 CFSEhigh로 표지하고, 펩티드가 적용되지 않은 대조 세포는 CFSElow로 표지하여 마우스에 동량 주입한 다음, 일정 시간이 지나서 마우스의 비장 세포를 유세포 분석기로 분석하여 CFSElow: CFSEhigh 비율을 산출하여 항원 특이적인 표적 세포의 용해를 측정하였다.
그 결과, DC/αGalCer/pep 투여군은 16000개의 세포만으로도 완전하게 표적 세포의 용해를 일으켰고 B/αGalCer/pep 투여군에서는 80000개의 세포로 완전하게 펩티드 특이적인 용해가 일어났으며, 상기의 DC/αGalCer/pep와 같은 수(16000개)의 B/αGalCer/pep를 투여하면 체내에서 중간 정도의 세포 독성을 일으키는 것을 관찰하였다(도 3a). 그러나 수지상 세포의 표면적이 B 세포에 비해 훨씬 크다는 점을 고려하면, B/αGalCer/pep은 DC/αGalCer/pep만큼 효과적으로 체내에서 세포 독성을 일으킨다고 할 수 있다. 또한, DC/pep은 OVA 특이적으로 효율적인 세포독성을 일으킨 반면에, B/pep을 투여하면 세포의 숫자와는 무관하게 세포독성을 유도하지 않았다(도 3b). 특히, 중요한 것은 체내 세포 독성의 경향성이 DC/pep와 DC/αGalCer/pep 투여군이 상당히 유사했다는 것인데, 이는 αGalCer를 수지상 세포에 적재하는 것이 펩티드를 적재한 수지상 세포의 백신 효율을 증가시키지 않는다는 것을 의미한다.
<실시예 5> B/αGalCer/pep의 세포 독성 T 림프구 형성시 필요조건 확인
본 발명자들은 세포 독성 T 림프구 반응을 유도하는데 관여하는 면역 세포의 종류를 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스에 B/αGalCer/pep를 투여하기 4일 전 또는 4일 후에 각각의 면역 세포를 제거하기 위한 항체(항 CD4 제거 항체: GK1.5, 항 CD8 제거 항체: 2.43, 항 NK1.1 제거 항체: PK136)를 주사한 후, 체내 세포 독성 T 림프구 분석을 실시하였다.
그 결과, 면역 세포 제거의 시기와는 무관하게(B/αGalCer/pep 투여 전, 후 모두) CD4+ T 세포 또는 NK1.1 세포 제거가 세포 독성 T 림프구 반응 유도를 저해하지 않았다(도 4a). 반면에, CD8+ T 세포를 제거하면 표적 세포의 파괴가 일어나 지 않았다. 상기 결과와 유사하게 MHC II-/-(CD4+T 세포 결여) 마우스는 정상적으로 세포 독성 T 림프구 반응이 유도된 반면에, Jα281-/-(자연 살해 T 세포 결여) 마우스는 유도되지 않음을 확인하였다(도 4b).
<실시예 6> B 세포의 항원 제시 및 세포 독성 T 림프구의 유도 확인
본 발명자들은 펩티드를 적재한 B 세포가 항원제시 세포로서 기능하는 것인지, 아니면 펩티드의 운반체로만 작용하는 것인지 즉, B 세포가 운반한 펩티드를 수지상 세포가 회수하여 세포 독성 T 림프구 반응을 유도하는 것인지 알아보았다. 이를 위하여, OVA 펩티드를 MHC I에 적재할 수 있으나, H-2K 영역의 돌연변이로 인하여 CD8+ T 세포가 MHC I-펩티드 복합체를 인식하지 못하는 bm-1 마우스를 이용하였다(Norbury, C. C. et al., Science 304, 1318-1321, 2004). 이러한 bm-1으로부터 수득한 B 세포는 정상적으로 CD1d를 발현하고 있으며, αGalCer와 반응하여 자연 살해 T 세포의 활성화를 자극한다는 점에서, bm-1의 B 세포와 자연 살해 T 세포와의 상호작용에 있어서는 아무런 문제가 없음을 알 수 있다.
다시 한번, 야생형의 B 세포로부터 준비된 B/αGalCer/pep를 야생형 마우스에 주사하면, 체내에서 OVA 특이적인 세포 독성이 완벽하게 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 달리, bm-1 마우스의 B 세포로부터 준비된 B/αGalCer/pep를 야생형 마우스에 주사하면, 야생형의 마우스는 OVA 특이적인 세포 독성 활성을 생성하지 못함을 알 수 있었다. 이러한 결과는, 수용 마우스의 수지상 세포 또는 다른 전문적인 항원 제시 세포가 세포 독성 T 림프구를 형성하는데 기여하지 않음을 나 타낸다(도 5a).
이어, 본 발명자들은 αGalCer와 펩티드를 개별적으로 투여한 경우와 함께 투여한 경우에 세포 독성 T 림프구를 형성할 수 있는지 조사하였다. C57BL/6 마우스에 B/αGalCer+B/pep또는 B/αGalCer/pep 단독으로 정맥 주사한 후, 체내 세포 독성 T 림프구 분석을 실시하였다.
그 결과, B/αGalCer+B/pep를 투여한 마우스에서는 체내 세포 독성이 전혀 유도되지 않음을 확인하였다(도 5b). 이러한 결과는, 펩티드와 αGalCer가 동일한 B 세포에 적재되는 것이 OVA 특이적인 세포 독성을 생성하는데 있어서 필수적임을 시사하고 있다.
<실시예 7> B/αGalCer/pep의 항암효과 확인
<7-1> OVA 모델을 이용한 생체내 실험
본 발명자들은 B/αGalCer/pep의 백신 투여가 항암면역을 유도하는지 조사하였다. 우선, 예방적 항암면역 활성을 시험하기 위하여 B 세포 단독, B/αGalCer, B/pep, B/αGalCer/pep, DC/pep, 또는 DC/αGalCer/pep 백신을 1회 투여한 후, OVA를 형질도입한 B16 흑색종(MO-5)(Dr. Kenneth Rock, University of Massachusetts : Falo, L. D., et al., Nat. Med. 1: 649, 1995)을 피하로 이식하였다. 그 결과, B/αGalCer를 투여한 마우스에서는 암의 성장이 약간 지연되는 경향성을 보였지만, 최종적으로는 암을 형성한 반면(도 6a), B/αGalCer/pep, DC/pep, 또는 DC/αGalCer/pep를 투여한 마우스에서는 암이 성장하지 않았다.
이어, 이러한 마우스들이 장기간 항암 활성을 유지할 수 있는지를 확인하기 위하여, 최초로 암을 이식한 지 70일이 되는 시점에서 생존한 마우스에 MO-5 암세포를 다시 피하에 이식하였다. 그 결과, 이러한 마우스에서는 암의 성장이 나타나지 않았으며(도 6b), 이는 B/αGalCer/pep 백신 투여로 상기 암에 대한 기억 면역 반응을 확립하였음을 시사한다. OVA를 형질 도입한 흉선종(EG-7)을 이용하여 수행한 경우에도 상기와 일치하는 결과를 얻을 수 있었다(도 15).
다음으로는, B/αGalCer/pep 백신을 투여함으로써 이미 존재하고 있는 암을 제거할 수 있는지 알아보았다. 이를 위하여 본 발명자들은 하기와 같은 두 가지 치료 모델을 제시하였다. 즉, 마우스에 암을 피하이식한지 i) 1일 후 또는 ii) 9일 후 암이 촉진되는 시기에 백신을 투여하였다.
그 결과, 1일 모델에서는 DC/pep 또는 DC/αGalCer/pep 백신을 투여한 경우에 거의 완벽하게 암의 성장을 억제하였으며, 특히 B/αGalCer/pep 백신을 투여한 마우스 역시 완벽하게 암의 성장을 감소시키는 것을 관찰하였다(도 6c). 9일 모델에서는 어떠한 백신 투여군에서도 성장하는 암을 완벽하게 감소시키지 못했다. 이러한 결과는 아마도 B16 흑색종이 매우 활발한 성장 특성을 지녔기 때문인 것으로 판단된다. 이와 달리, B/αGalCer/pep 백신을 투여한 마우스의 경우에는 B 세포 단독 투여군 및 B/αGalCer, B/pep투여군에 비하여 암의 성장이 감소되는 것으로 나타났고, DC/pep 또는 DC/αGalCer/pep 백신 투여군과 유사하게 나타남을 확인하였다(도 6d).
<7-2> Her-2/
neu
모델을 이용한 생체내 실험
본 발명자들은 B 세포를 매개로 하는 백신 투여가 실제로 암 항원에 적용될 수 있는지 알아보기 위하여, 특성이 잘 규명되어 있고 세포 독성 T 림프구 항원결정기(epitope)가 알려져 있는 Her-2/neu를 발현하는 암세포인 TAUF(Penichet ML et al., Lab Anim Sci., 49: 179-88, 1999)로 상기 실시예 <7-1>과 같은 실험을 실시하였다. 그 결과, 본 발명자들은 다시 한번, αGalCer 및 Her-2/neu 63-71 펩티드를 제시하는 B 세포를 투여한 마우스군에서 체내 Her-2/neu에 대한 세포 독성이 의미있는 수준으로 나타남을 확인하였다(도 7a).
또한, 상기 모델에서의 항암 활성을 분석하기 위하여 Her-2/neu를 발현하는 암세포(TAUF)를 BALB/c 마우스에 정맥 또는 피하로 주사한 후, αGalCer와 Her-2/neu 63-71를 적재한 B 세포 백신을 투여한 결과, 정맥으로 암을 주입하고 B/αGalCer 또는 B/pep 백신 투여한 경우에는 B 세포 단독 투여군과 비교하여 생존기간이 약간 연장되는 것을 확인하였다(도 7b). 이와는 대조적으로, B/αGalCer/pep를 투여한 모든 마우스는 전체 실험기간 동안 생존하는 것을 관찰하였고, 이렇게 생존한 마우스에 Her-2/neu를 발현하는 암세포(TAUF)를 다시 주입해도 억제효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 피하 암 성장 모델에서도 유사한 결과를 관찰할 수 있었다(도 7c).
따라서, 본 발명의 B 세포를 매개로 하는 백신 투여는 항암 면역의 예방효과 및 치료 효과에 있어서 수지상 세포를 기반으로 하는 백신만큼 효율적임을 입증하 였다.
<실시예 8> 항원을 발현하는 바이러스 벡터를 이용한 단백질 도입
펩티드를 적재한 세포 백신은 임상적으로 이용할 경우, 개인의 주조직 적합성 복합체(major histocompatibilty complex, MHC)의 일배체형에 제한적으로 펩티드가 사용되기 때문에 보편적으로 사용할 수 없으며, 단일 항원결정기(epitope)만을 제시하는 단점을 가지고 있다. 반면, 바이러스를 매개로 하여 전체 항원을 도입하게 되면 주조직 적합성 복합체의 일배체형에 국한되지 않고 모든 사람에 적용 가능하며, 여러 항원결정기에 특이적인 면역 반응 즉, 특히 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 동시에 유도할 수 있다. 이를 근거로 하여, B 세포에 바이러스로 전체 항원을 형질 도입한 후 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있는지 확인해 보았다. 우선, 종양 관련 항원인 Her-2/neu의 세포외 영역 및 세포막 영역(Her-2/ne extracellular domain + transmembrane domain : HM )을 발현하는 유전자를 가진 아데노바이러스(AdHM)를 제작하여 마우스 암 모델에 적용하였다.
구체적으로, BALB/c 마우스의 비장세포로부터 분리한 B 세포를 Her-2/neu의 세포외 영역 및 세포막 영역을 발현하는 아데노바이러스(AdHM, 바이로메드) 100 MOI로 혈청을 첨가하지 않은 배지에서 90분 동안 37℃ 배양기에서 감염시킨 후 혈청을 보충하여 총 8시간, 24시간, 및 48시간 동안 각각 배양한 다음, PE로 표지된 항-Her-2/neu 항체(BD biosciences #340552)로 염색하여 유세포 분석을 실시한 후 Her-2/neu가 표면에 발현되는 정도(B 세포에 대한 아데노바이러스 형질 도입 효율, 전체 B세포 중의 PE+ 세포의 비율)를 측정하였다.
그 결과 8시간, 24시간 및 48시간 동안 B 세포를 아데노바이러스와 함께 배양했을 때, 모든 배양 조건에서 약 20% 이상의 효율을 나타내는 것을 확인하였다(도 8a). 즉, B 세포를 AdHM와 8시간 이상 배양하면, 충분하게 AdHM에 의해 형질 도입된 B 세포 표면에 Her-2/neu를 발현할 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한, B 세포에서의 Her-2/neu 발현은 바이러스로 형질 도입된 후 알파-갈락토실세라마이드와 함께 배양해도 변하지 않았으며, B 세포가 알파-갈락토실세라마이드를 제시하는데 있어서도 별다른 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(도 8b). 이러한 결과는 상기에서 언급한 바와 같이, B 세포의 CD1d 분자에 의해 DN32.D3 세포에 알파-갈락토실세라마이드가 제시되면 활성화된 DN32.D3 세포는 IL-2를 분비하게 되며, 배양액에 포함된 이러한 IL-2 농도를 측정함으로써 B 세포가 알파-갈락토실세라마이드를 제시할 수 있음을 간접적으로 확인하였다.
<실시예 9> 아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포에 의해 유도되는 세포 독성 T 세포 반응 확인
BALB/c 마우스의 비장세포에서 분리된 B 세포를 Her-2/neu의 세포외 영역과 세포막 영역을 발현하는 아데노바이러스(AdHM) 100 M.O.I.로 혈청을 첨가하지 않은 배지에서 60분 동안 37°C 배양기에서 감염시켰고, 이후 혈청이 보충된 배지를 첨가하여 총 24시간 배양하여 B/AdHM 세포를 제작하였다. 또한, AdHM으로 형질 전환된 B세포를 1~2 μg/ml의 αGalCer를 첨가한 혈청이 보충된 배지에서 23시간동안 배양하여 αGalCer를 적재한 B세포(B/AdHM/αGalCer)를 제작하였다. 제작이 완료된 B세포는 RPMI 배지로 3회 이상 세척하여 자유형의 아데노바이러스 및 αGalCer를 제거하고 실험에 이용하였다.
본 발명자들은 상기 Her-2/neu의 세포외 영역과 세포막 영역을 발현하는 아데노바이러스(AdHM)로 형질도입된 B 세포가 마우스에서 세포 독성 면역 반응을 유도할 수 있는지 조사하기 위해 마우스에 정맥 주사로 B세포 백신을 투여하였다. B 세포 단독(B) 및 알파-갈락토실세라마이드만 적재한 B 세포(B/αGalCer)를 투여한 마우스를 음성 대조군으로 이용하였고, AdHM으로 형질 도입된 B세포 (B/AdHM) 및 AdHM으로 형질 도입하고 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 B세포 (B/AdHM/αGalCer)가 유도하는 Her-2/neu 특이적인 세포 독성 T 세포 반응을 측정하였다. 면역화한 후, 세포 독성 T 세포의 항원결정기 펩티드(Her-2/neu 63-71, 애니젠)를 적재한 표적 세포를 주입하여 체내에서 일어나는 표적 세포의 분해를 확인하였다.
그 결과, 면역화하고 1주가 지난 시점에서 B와 B/αGalCer로 면역화된 마우스 군에서는 표적 세포의 분해를 관찰할 수 없었던 반면, B/AdHM과 B/AdHM/αGalCer로 면역화된 마우스 군에서는 세포 독성 T 세포 반응을 확인할 수 있었다(도 9a). 아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포는 활성화되기 때문에 자연 살해 T 세포의 도움 없이도 체내에서 세포 독성 T 세포를 효과적으로 유도할 수 있는 항원제시세포로서 기능한다고 생각되어 진다. B/AdHM과 B/AdHM/αGalCer으로 유도된 세포 독성 T 세포 반응은 시간에 의존적으로 점차 감소하는 경향을 나타내었으나 면 역화 이후 7 주째까지 세포 독성 T 세포 반응이 상당한 수준으로 유지되었다(도 9b). 또한, 면역화 이후 1주째에 세포 독성 T 세포와 함께 CD8+ T세포에서 IFN-γ의 생성을 확인한 결과, B 세포만을 투여받은 마우스 군에 비하여 B/AdHM과 B/AdHM/αGalCer으로 면역화된 마우스 군에서 활성화된 CD8+ T 세포의 수가 증가되어 있었고, 특히 이러한 현상은 B/AdHM에 비하여 B/AdHM/αGalCer 군에서 다소 높게 나타났다(도 9c).
<실시예 10> αGalCer의 적재를 통한 자연 살해 세포의 활성화 유도 및 아데노바이러스로 형질도입된 B 세포 백신의 효과증진 확인
<10-1> αGalCer를 적재한 B세포를 통한 자연 살해 세포의 활성화 유도 확인
활성화된 자연 살해 세포 집단은 IFN-γ를 생산하는 자연 살해 세포에 근거하여 계산되었다. 간략히 설명하면, 마우스의 비장으로부터 분리된 B 세포를 1 ug/ml의 GolgiPlug 하에서 5시간 동안 배양하고, 이 세포를 고정 및 투과시킨 후에 항-마우스 IFN-γ : APC, CD3 : PE, 및 CD49b : FITC 항체(모두 Biolegend)로 각각 염색하였다. 자연 살해 세포는 CD3를 발현하지 않고, 자연 살해 세포의 표식인 CD49b를 발현하는 세포 집단으로 하였다.
알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)가 적재되고 아데노바이러스로 형질도입된 B 세포(B/AdHM/αGalCer)는 아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포(B/AdHM)에 비하여 세포 독성 T 세포 반응이 다소 높게 장기간 지속되는 경향성을 보이지만 유의할만한 수준의 차이가 나타나지 않는 것으로 보아, 세포 독성 T 세포 반응을 유도 하는데 있어서 펩티드를 적재한 B 세포 백신과는 달리, 알파-갈락토실세라마이드의 적재가 결정적인 역할을 담당하지는 않는 것으로 보여진다. 그러나 알파-갈락토실세라마이드가 적재된 B 세포 백신을 마우스에 투여하면, 형질도입만 된 B 세포 백신 투여군과는 달리 체내에서 자연 살해 T 세포를 자극하며 결과적으로 자연 살해 세포를 활성화시키는 것을 확인하였다(도 10a). 이러한 자연 살해 세포의 활성화는 세포 독성 T 세포 반응의 유도와 함께 항암 효과에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
<10-2> αGalCer의 적재를 통한 아데노바이러스로 형질도입된 B 세포 백신의 효과 증진 확인
본 발명자들은 B 세포 백신이 세포 독성 T 세포를 유도하는 효율성을 측정하기 위하여, 완전한 세포 독성 T 세포를 유도하는 수준 이하로 세포 백신을 투여하였을 때 유도되는 표적 세포의 용해 정도를 비교하였다. 이를 위하여 양성 대조군으로는 알파-갈락토실세라마이드를 적재하며 세포 독성 T 세포 항원결정기 펩티드를 적재한 B 세포(B/αGalCer/pep)를 사용하였고, 각각의 B세포 백신을 면역화한 후 1주일 후에 B/AdHM과 B/AdHM/αGalCer 투여로 유도되는 세포 독성 T 세포 유도 효율성을 측정하였다(도 10b). B/αGalCer/pep의 경우, 대부분의 B 세포가 항원을 제시할 수 있도록 펩티드가 적용되었을 것으로 추정되나, 상기에서 언급했던 바와 같이 아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포의 경우 전체의 약 20% 정도만이 항원제시세포로 기능할 것으로 생각된다. 이를 감안한다면, 항원을 아데노바이러스로 도 입된 B 세포 백신은 펩티드가 적재된 B 세포 백신에 비하여 많은 수의 B 세포 투여가 필요함에도 불구하고, 효율적으로 항원 특이적인 세포 독성 T 세포 반응을 유도할 수 있다고 판단된다. 또한 적은 수의 B 세포가 투여되었을 때, 알파-갈락토실세라마이드의 적재로 자연 살해 T 세포의 도움을 받는 경우 표적 세포를 용해하는 데 다소 유리한 것을 확인하였다.
<실시예 11> 항원 특이적인 항체 반응을 유도하는 아데노바이러스로 형질도입된 B 세포 백신
아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포 백신은, 세포성 면역 반응을 유도하기 위해 펩티드를 적재한 B 세포 백신과는 달리 세포성 면역반응 및 체액성 면역 반응을 동시에 유도할 수 있다는 장점이 있다. AdHM으로 형질 도입된 B 세포 백신이 Her-2/neu 특이적인 항체를 유도할 수 있는지 알아보기 위하여 BALB/c 마우스에 B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer로 각각 면역화시킨 다음, 혈청 중의 항-Her-2/neu 항체의 역가를 측정하기 위하여 Her-2/neu를 세포 표면에 발현하는 마우스 암세포인 TAUF 세포에 결합하는 정도를 유세포 분석(flow cytometry)을 통하여 확인하였다.
항체 반응을 측정하기 위하여 B 세포 백신으로 면역화한 후 1, 3, 5, 및 7주째에 각각 안와채혈로 혈액을 추출하였다. 마우스의 혈액을 상온에서 2시간 방치한 다음 8000rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 중의 항-Her-2/neu 항체의 역가를 측정하기 위하여 1:50부터 2배씩 완충제(1% FBS, 0.09% azide를 포함하는 PBS)로 희석한 다음, Her-2/neu를 발현하는 암세포인 TAUF 세포와 4° C에서 60분간 배양하였다. 완충제로 마우스 혈청과 배양된 TAUF 세포를 세척한 다음, FITC로 표지된 마우스 항체에 결합하는 염소 항체를 2차 항체로 사용하여 TAUF 세포에 결합된 마우스 항체를 염색하였다. 이어, 유세포분석기(FACSCaliber, BD Biosciences사)를 이용하여 TAUF 세포에 결합한 마우스 항체의 양을 측정하였고, 면역화되지 않은 마우스의 혈액을 기준으로 하여 평균 형광 강도가 1.8배이상 증가하는 경우를 양성 반응으로 간주해 항체의 역가를 산출하였다.
그 결과, 세포 독성 T 세포를 유도한 것과 유사하게 B/AdHM 및 B/AdHM/αGalCer 두 집단 모두에서 면역화한 후 7주 이상 항-Her-2/neu 항체가 높은 역가로 유지됨이 관찰되었고(도 11a), B 세포(B) 및 B/αGalCer와 달리 B/AdHM과 B/AdHM/aGarCer 백신 투여 집단에서는 모두 체액성 면역 반응이 생성됨을 확인하였다(도 11b).
<실시예 12> 알파-갈락토실세라마이드를 적재하고 아데노바이러스로 형질 도입된 B 세포 백신의 면역화를 이용한 암의 예방 및 치료효과 확인
Her-2/neu 종양 모델에서 BALB/c 마우스에 꼬리 정맥으로 2 x 105개의 TAUF 세포를 투여하여 마우스에 종양이 생기도록 하였다. 이후, 종양을 지닌 마우스에 B 세포 백신으로 각각 면역화한 후 생존율을 측정하였다.
본 발명에서는, 아데노바이러스로 형질 전환된 B 세포 백신을 이용하여 유도된 세포성 면역 반응 및 체액성 면역 반응이 궁극적으로 효과적인 항암 활성을 나 타내는지 조사하였다. Her-2/neu를 발현하는 마우스 암세포(TAUF)를 정맥 주사한 후 폐암이 유도된 마우스에서 B 세포 백신의 예방 및 치료 효과를 확인하였다. 2x106 개의 B세포 백신으로 면역화하고 7일 후 암세포 2x105개를 정맥 주사한 마우스의 생존율을 측정한 결과, B세포만 투여 받은 마우스 군(B)에 비하여, 알파-갈락토실세라마이드를 적재한 B 세포를 투여 받은 마우스 군(B/aGarCer)과 암항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질 전환된 B세포(B/AdHM)로 면역화된 마우스 군에서 생존 기간이 다소 연장되는 것을 관찰할 수 있었다. 알파-갈락토실세라마이드가 적재되고 암항원을 발현하는 B세포 백신(B/AdHM/aGarCer)을 정맥 투여하면, 전 실험 기간 동안 마우스가 생존하는 것으로 관찰되어, B/aGarCer나 B/AdHM 백신에 비하여 B/AdHM/aGarCer 백신이 항암 효과가 높은 것으로 나타났다(도 12a). 따라서 B세포 백신으로 유도된 면역 반응이 효과적으로 암을 예방한다는 것을 알 수 있었다.
다음으로는 B세포 백신의 치료 효과를 확인하기 위하여 BALB/c 마우스를 1x106 개의 B, B/aGarCer, B/AdHM, B/AdHM/aGarCer 로 각각 면역화한 다음, 3일 후에 5x104 개의 암세포(TAUF)를 꼬리 정맥으로 주사하여 폐암을 유도하였다. B 세포만 단독으로 투여받은 마우스 군이 가장 짧은 생존 기간을 나타내었고, B/aGarCer 백신 투여군도 이와 비슷한 경향으로 관찰되었다. B/AdHM 백신으로 면역화된 마우스 군은 B, B/aGarCer 투여군에 비하여 생존 기간이 약간 연장되는 효과가 있었다. 반면 B/AdHM/aGarCer 투여군은 예방 모델에서 관찰했던 것과 유사하게 다른 실험군에 비하여 생존 기간이 현저하게 증가되는 것으로 보아, B, B/aGarCer 또는 B/AdHM 의 면역화로 유도되는 항암 효과에 비하여 뛰어난 효과를 나타내는 것을 알 수 있다(도 12b).
<제제예> 주사액제의 제조방법
본 발명의 항암용 백신의 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
알파-갈락토실세라마이드 1~2μg/ml, B 세포 5x106 개/ml, 펩티드 1~2μg/ml, 5‘-클로로-3,2’-디하이드록시찰콘 또는 5‘-클로로-2,3’-디하이드록시찰콘?염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.
본 발명의 자연 살해 T 세포의 리간드 특히, 알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)와 항원을 적재한 B 세포는 기존의 수지상 세포백신과 비교하여 유사한 수준의 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 뿐 아니라 피하암 및 전이암의 예방 및 억제효과가 있고 암 항원을 발현하는 아데노바이러스로 형질전환된 B 세포는 항원 특이적인 면역반응을 유도하므로 상기 세포를 포함하는 백신은 암 예방 및 치료제로 이용될 수 있다. 더불어, 본 발명의 백신은 CD4+ T세포가 없는 경우에도 면역 반응을 유도하므로 CD4+T 세포의 수가 현저하게 감소되어 면역 결핍이 나타나는 HIV 환자를 면역화하는데도 이용될 수 있을 것이다.
Claims (11)
- 알파-갈락토실세라마이드, 알파-글루쿠로노실세라마이드, 포스파티딜이노시톨테트라만노사이드, 이소글로보트리헥소실세라마이드, 갱글리오사이드 GD3, 포스파티딜콜린, 베타-갈락토실세라마이드, 리포포스포글리칸, 글리코이노시톨 포스포리피드, 알파-갈락토실세라마이드의 유사체인 베타-아노머 갈락토실세라마이드 및 알파-아노머 갈락토실세라마이드, 박테리아 지질 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 자연 살해 T 세포의 리간드를 적재한 B 세포, 상기 리간드와 항원을 적재한 B 세포 또는 상기 리간드를 적재하고 항원을 발현하는 B 세포를 포함하는 면역 치료 및 예방용 백신.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 항원은 병원균(pathogenic bacteria), 바이러스 및 기생충을 포함하는 병원체(pathogen) 유래의 항원 또는 암 항원인 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제 3항에 있어서, 병원균 유래의 항원은 백일해균(Bordetella pertussis) 항원(pertussis toxin, filamentous haemagglutinin, pertactin), 파상풍균 항원(tetanus toxoid), 디프테리아균(diphtheria) 항원(diphtheria toxoid), 헬리코박터파이로리(Helicobacterpylori) 항원(capsula polysaccharides of serogrup A, B, C, Y 및 W-135), 폐렴균(pneumococcal) 항원(Streptococcus pnemoniae type 3 capsular polysaccharide), 결핵균(tuberculosis) 항원, 콜레라(cholera) 항원(cholera toxin B subunit), 포도상구균(staphylococcal) 항원(staphylococcal enterotoxin B), 적리균(shigella) 항원(shigella polysaccharides), 보렐리아(Borrelia sp.) 항원, 칸디다(Candida albicans) 항원 및 플라스모디움(Plasmodium) 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제 3항에 있어서, 바이러스 유래의 항원은 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 항원(haemagglutinin 및 neuraminidase 항원), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV) 항원(glycoprotein), 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 항원(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 항원, 간염(hepatitis)바이러스 항원(hepatitis A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원)(core antigen and surface antigen), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV) 항원, 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 항원(GP-120, GP-160, p18, Tat, Gag, Pol, Env) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제 3항에 있어서, 암항원은 인간 유두종 바이러스(HPV: human papilloma virus) E6/E7, gp100, 티로시나제(tyrosinase), 티로시나제-관련 단백질-1(TRP-1), 티로시나제-관련 단백질-2(TRP-2), 멜라노마 항원 유전자(MAGE: melanoma antigen gene), 뮤리노글로브린 1(MUC-1: murinoglobulin 1), 암 배아항원(CEA: carcinoembryonic antigen), p53, 알파-페토프로테인 및 Her-2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제 1항에 있어서, 항원은 펩티드, 지질다당류, 다당류, 당단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제 1항에 있어서, 상기 항원의 발현은 재조합 바이러스에 의해 도입되어 발현되는 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
- 제 8항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 항원을 발현하는 유전자가 도입된 아데노바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 신드비스 바이러스(Sindbis virus)인 것을 특징으로 하는 면역 치료 및 예방용 백신.
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