CN104619831A - 通过可移动纳米基质多克隆刺激t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多克隆刺激T细胞的方法，所述方法包括将T细胞群与纳米基质接触，所述纳米基质包含a)可移动聚合物链基质，和b)一种或多种为T细胞提供激活信号的连接到所述可移动聚合物链基质上的刺激剂，从而激活并诱导T细胞增殖；其中所述纳米基质的尺寸是1-500nm。至少一种第一刺激剂和一种第二刺激剂连接至同一或分别的可移动基质。如果刺激剂连接至分别的纳米基质，可以微调刺激T细胞的纳米基质。封闭细胞培养系统也受益于该方法。

Description

通过可移动纳米基质多克隆刺激T细胞的方法
发明领域
本发明总体涉及免疫学领域，尤其涉及通过纳米基质多克隆刺激T细胞的方法。
发明背景
抗CD3的抗体在很多T细胞增殖方案中是核心要素。固定于表面的抗CD3通过将T细胞受体络合物交联到T细胞表面来递送激活和增殖诱导信号。通过固定抗CD3和抗CD28来同时递送信号和共刺激信号，可以增加增殖(Baroja等(1989),Cellular Immunology,120:205-217)。在WO09429436A1中，固相表面如培养皿和珠子用于固定抗CD3和抗CD28抗体。通常，在珠子上的固定在直径大小为4.5μm的M-450上进行。
EP01257632B1描述了通过同时的T细胞集中和细胞表面部分连接刺激T细胞群的方法，包括提供其中至少其一部分包含T细胞的细胞群，将所述细胞群与表面接触，其中所述表面连接有一种或多种连接至少一部分T细胞的细胞表面部分并刺激至少那部分T细胞或其亚群的试剂，并施加主要驱动T细胞集中和T细胞表面部分连接的力，从而诱导T细胞刺激。如本文所使用，术语力是指用于驱动细胞的力，可以包括功能相似的各种力，且包括大于重力、液压力、通过跨膜压产生的渗透力、离心力、或磁力。EP1257632B1描述了颗粒与细胞的比例可以变化，然而某些优选值包括至少1:4至6:1，其中一种优选的比例是每个T细胞至少2:1珠子。通常，在珠子/T细胞比例为3:1的实验中使用与抗CD3和抗CD28抗体偶联的直径大小为4.5μm的M-450。再一次，这些方法用固相表面来共固定T细胞刺激剂如抗CD3和抗CD28抗体。这些表面是细胞大小且与T细胞本身相当。
US2008/0317724A1公开了信号分子的空间表现可以极大影响T细胞对这些信号分子的响应。例如，当抗CD3和抗CD28抗体被置于基质的不同预定区，不仅取决于这些信号分子的类型，也取决于这些信号分子的间隔，在所述基质上培养的T细胞分泌不同量的白细胞介素-2和/或表现出钙峰(spikes in calcium)。例如，用抗CD3和抗CD28抗体产生一种模式，其中抗CD3抗体占据由与中心抗CD3特征相隔约1-2微米的抗CD28抗体的卫星特征包围的中心特征。与当抗CD3和抗CD28抗体被以“共定位”特征一起呈现给T细胞相比，当抗CD28抗体特征相隔约1-2微米时，白细胞介素-2(IL-2)的T细胞分泌增强。
Erin R Steenblock和Tarek M Fahmy的出版物(Molecular Therapyvol.16no.4,765–772April 2008)使用固体-表面的纳米颗粒(130nm)并显示这些纳米颗粒对T细胞的刺激弱于微粒(8μm)。作者声明，这些发现由之前报道的那些(Mescher,MF(1992).J Immunol 149:2402–2405.)所支持，表明与T细胞大小接近的微米尺寸的颗粒提供最佳T细胞刺激。Mesher的研究表明大的、连续的表面接触面积对有效的CTL激活极为重要。使用固定于乳胶微球的I类同种异型抗原，发现4-5微米的颗粒尺寸提供最佳刺激。低于4微米，响应随着颗粒尺寸的降低快速降低，大量小颗粒不能弥补欠佳的尺寸。
US8,012,750B2公开了激活T细胞的生物可降解设备。首先将所述生物可降解支架制备成一种形状，例如微球。随后，用能与第二种材料结合的提供反应性表面的第一种材料包被所述生物可降解支架。所述第二种材料具有反应性表面，其允许结合细胞上的表面结构。可将所述生物可降解支架制备成各种形状。微球是优选的剂型，因为制备简单，且球形允许与细胞受体相互作用的表面积增加。根据US8,012,750B2，纳米球没有提供足够的激活初始T细胞的交联，因此只能与之前被激活的T细胞一起使用。再一次，实验数据用由抗CD3和抗CD28抗体共固定的尺寸为4-24微米(其中平均尺寸为7微米)的球体产生。
US2012/121649A1公开了扩增抗原特异性抗肿瘤生成T细胞的方法，包括向受试者或细胞体外施用足够量的刺激抗原特异性抗肿瘤生成T细胞扩增的抗原/MHC/共刺激分子/纳米颗粒络合物。所述纳米颗粒为大约1nm至10nm。比较pMHC和pMHC/抗CD28mAb-偶联的纳米颗粒刺激并激活同源初始CD8+T细胞的能力。所述纳米颗粒可以进一步包含一种或多种由葡聚糖和其他分子形成的生物可降解包被。例如，可以结合铁(III)氧化物和PLGA以形成纳米颗粒，导致固体表面颗粒。US2012/121649A1没有公开例如用固定在纳米颗粒上的抗CD3和抗CD28mAb多克隆刺激T细胞。
US2010/284965A1公开了通过向细胞施用连接有抗CD28抗体的聚合纳米颗粒或微米颗粒激活T细胞的方法。所述微米颗粒在0.5至1000微米的范围内，和纳米颗粒在50nm至小于0.5nm的范围内。所述颗粒由PLGA组成，因此代表球形固体表面颗粒。此外，US2010/284965A1没有公开用纳米颗粒的多克隆刺激。
总而言之，在现有技术中使用的用于通过固定的T细胞刺激抗体的多克隆T细胞活化的珠子或微球通常是细胞大小的(大多数尺寸为1-10μm)均匀圆形颗粒。这个尺寸的珠子在其与T细胞相互作用的潜力以及其生产、操作和在临床T细胞治疗程序的安全性上具有若干缺点。
1.由于珠子的固体表面，在珠子和细胞之间的相互作用面积尺寸是有限的。
2.与可溶抗体相比，它们的制备复杂且昂贵，且以cGMP质量制备它们时尤其不便。例如由于它们的尺寸，不可能无菌过滤。沉淀使操作复杂化，即在填充和抗体装载过程中恒定的颗粒数/体积。
3.它们对于体外方法使用以产生用于体内用途的T细胞疗法不便，
–因为它们必须以确定的细胞/珠子比例以确定的每表面积细胞/珠子密度加入细胞，
–刺激强度的适应性只在某种程度上是可能的，因为T细胞刺激强度主要由细胞表面上的抗体密度确定，而不是由珠子数/细胞确定，
–由于沉淀，等分是不准确的，
–不可能无菌过滤，
–由于其尺寸，它们可能影响细胞活性和功能，且它们不能简单地通过离心从细胞中去除。因此开发了“去除珠子”的特定方案或生物可降解颗粒。然而，两种方法均具有去除过程之后的残留珠子的实际数量的不准确性的缺点，如果将T细胞刺激珠子注入患者，则留下毒性作用的某些风险。这个问题尤其与颗粒的尺寸相关，因为每个单个颗粒本身仍然可能保留体内激活T细胞的能力。
因此，需要改进的多克隆T细胞刺激的体内方法。
发明概述
令人惊讶地，发现与纳米基质连接的多克隆T细胞刺激剂如抗体，例如抗CD3和CD28，可以用于体外刺激初始和记忆T细胞，所述纳米基质的特征在于可移动聚合物基质骨架(非固体表面)，在所述基质中可包埋附加的功能化合物如磁性纳米晶体，尽管它们的直径小于1μm，优选小于500nm，更优选小于200nm。与此相反，已经发现具有与本文所用的纳米基质相同尺寸的固体表面的珠子完全不能刺激T细胞，或刺激T细胞至纳米基质的相似水平，这与本领域技术人员广为接受的观点一致。由于其小尺寸，不连接抗体时，纳米基质本身不改变细胞的结构、功能、活动状态或活性，即，它们不会在细胞中造成干扰且不会干扰刺激细胞随后的分析、实验和治疗应用。此外，优选地，所述纳米基质是生物可降解且对活细胞无毒的，即，所述纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性实体。因此，在本发明的方法中使用的纳米基质通过保存细胞活性而改进了T细胞的体外刺激。此外，小的纳米基质的无菌过滤是可能的，这对于在符合严格的GMP标准的条件下的长期T细胞体外扩增是一个重要特征，且对于体外扩增的T细胞的临床应用是有价值的选择。并且，这些纳米基质非常适合用于无菌且封闭的细胞培养系统，如WO2009/072003(Prodigy,Miltenyi Biotec GmbH,Germany)所述。
此外，令人惊讶地，发现与纳米基质连接的T细胞刺激剂如抗体，例如抗CD3和CD28，可以偶联至分别的纳米基质(而不是偶联至同一纳米基质)，其随后可以混合用于优化用途。通常，纳米基质与细胞的比例大于100:1，优选大于500:1，更优选大于1000:1。这导致用于刺激靶标T细胞的纳米基质的微调(fine-tuning)的可能性，例如，它促进了单个纳米基质的生产过程和质量控制并改进了试剂的灵活性，例如通过滴定各种CD3和CD28浓度和比例促进特定T细胞亚组激活条件的优化。
在第一个方面，本发明提供如本文所述的纳米基质用于多克隆体外刺激T细胞的用途。
在进一步的方面，本发明提供多克隆刺激T细胞的方法，所述方法包括将T细胞群与纳米基质接触，其中所述纳米基质包含可移动聚合物链的基质，且已连接一种或多种为T细胞提供激活信号的试剂，从而激活并诱导T细胞增殖；并且其中，所述纳米基质的尺寸是1-500nm，优选10-200nm。优选地，所述纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性的。此外优选地，所述纳米基质是生物可降解的。
用本发明实现的刺激的且可选地扩增的T细胞可以用于随后的治疗或非治疗应用，且由于所述纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性的性质而无需消除或去除所述的纳米基质。
或者，由于其是可溶的或胶质的，所述纳米基质在T细胞激活过程后容易通过重复的洗涤步骤稀释至低于T细胞激活阈值的有效浓度。
所述纳米基质的尺寸是1-500nm，优选10-200nm。所述纳米基质是由聚合材料组成的可移动基质，但与珠子或微球相反，其不含有固相表面。允许多克隆刺激T细胞的试剂如抗CD3和/或抗CD28抗体与基质的可移动聚合物链相连接。可在所述基质内包埋其他物质，例如磁性纳米晶体、荧光染料等，为所述纳米基质增加其他功能而不改变其基本的可移动结构、表面特征、或纳米基质的细胞相互作用参数。
这种移动性，例如在水性溶液中聚合物基质的灵活性(即使当与固体表面连接)在本领域是公知的。例如，Bertholon等Langmuir2006,45485-5490页给出了用于生物或医学应用的葡聚糖和其他聚合物的灵活性或移动性的定量评估。
通过所用聚合物引入刺激基质的移动性在多糖和嵌入式超顺磁性纳米晶体(其在临床环境的体内成像技术中经常使用)的多种出版物中有详细描述。这些试剂与本文给出的几个实施例中所用的试剂类型非常相似。众所周知，除了术语“颗粒”，这些试剂实际上与球形固体表面颗粒不可相比：
“用于医疗目的的大多数胶质(所谓的)纳米颗粒被聚合物或聚电解质包被，且它们不能真的被认为是刚性球体(Di Marco等Int J.Nanomed.2007,p618,line 5ff.)”。
直接举例说明：多糖包埋的超顺磁性纳米晶体的这一典型特征最好通过用于尺寸测定的不同方法所获得的尺寸值差异来描述。通常，透射电子显微镜采用干燥样品，因此主要测定包埋的纳米晶体的尺寸，通常是在10nm的范围内。然而，相反，也考虑水性溶液中周围基质尺寸的动态激光光散射测定大得多的直径(例如，对于由葡聚糖基质和包埋的氧化铁晶体组成的临床对比剂AMI-25为5-10nm对80-150nm)。这表明水性溶液中络合物总体积的>99％由可移动基质组成(Wang等Eur.Radiol.2001:page 2323)。对于如实施例1中所用的基质，尺寸测量显示30nm(TEM)和65nm(DLS)，因此水性溶液中大约80-90％络合物由可移动基质组成。因此，在这些类型的可移动基质中，可移动聚合物决定与细胞而不是可能额外被用于连接的聚合物薄层包被的刚性颗粒或覆盖的固体表面相互作用过程中的生物物理性能。因此，在所述基质中，众所周知的聚合物链的灵活性或移动性(运动性)对于传统地用于刺激的微球上的固体表面连接的抗体而言是决定性特征和关键性差异。
总之，这些实施例表明了目前水性溶液中可移动、灵活的聚合物基质性能的常识(是所有细胞培养应用的前提条件)，并强调了聚合物包被的胶体，例如在本研究中所用的包含氧化铁的多糖基质(但不限于那些)的生物物理性能也独立于包埋物质，主要由聚合物材料的特征决定这一事实。
因此，本发明提供多克隆刺激T细胞的体外方法，所述方法包括将T细胞群与纳米基质接触，所述纳米基质包含
a)可移动聚合物链基质，和
b)一种或多种为T细胞提供激活信号的连接到所述可移动聚合物链基质上的刺激剂，从而激活并诱导T细胞增殖，其中所述纳米基质的尺寸是1-500nm，优选10-200nm，且其中水性溶液中所述纳米基质总体积的大多数(例如大于50％)、优选大于80％、更优选大于90％、最优选大于99％由可移动聚合物链组成。
如果在基质中包埋其他物质，例如磁性纳米晶体、荧光染料等，所得络合物主要由可移动聚合物链组成，占大于50％、优选大于80％、更优选大于90％、和最优选大于99％的水性溶液体积。
附图说明
图1：用于扩增初始T细胞的CD3/CD28。
用所示浓度(有效的CD3浓度)的CD3/CD28偶联的纳米基质在IL-2存在下刺激分类的人初始CD4和CD8T细胞7天。比较用各种所示比例的CD3和CD28偶联的纳米基质。使用CD3/CD28偶联的MACSiBeads作为高对照。给出第7天在培养物中的绝对活细胞数。
图2A-C：用于刺激T细胞的纳米尺寸的固体颗粒与纳米基质。用CD3/CD28(1:1)偶联纳米尺寸的固体颗粒(AdemtechBeads,直径＝200nm)，并用于以所示的CD3浓度刺激初始CD4和CD8T细胞。作为激活参数，用流式细胞仪分析CD3的下调(图2A，第3天)或早期激活标志物CD25的诱导(图2B的第3天，图2C的第5天)。将该值归一化到经由CD3/CD28纳米基质(100ng/ml CD3)激活的相同细胞的值。给出来自4个不同供体的值。
图3：扩增分类的人T细胞群：将人T细胞分类为不同的亚群(总T细胞、总初始T细胞、初始CD4+T细胞、初始CD8+T细胞)，并用所示浓度(有效的CD3浓度)和CD3/CD28比例为1:1的CD3/CD28偶联的纳米基质在IL-2存在下刺激7天。使用CD3/CD28偶联的MACSiBeads作为高对照。给出第7天在培养物中的绝对活细胞数。
图4：扩增人Treg：通过磁性CD25选择从PBMC中分离CD25+Treg，并用CD3/CD28纳米基质(200ng/ml CD3)和高剂量IL-2在存在或不存在100nM雷帕霉素的情况下扩增14天。在第7天，通过添加新鲜纳米基质+IL-2再刺激细胞。在第14天测定活Treg数。用细胞内免疫荧光测定Foxp3表达细胞的频率。每个点代表单个健康供体。
图5：比较CD3和CD28偶联不同的纳米基质与偶联相同纳米基质。用所示浓度(有效的CD3浓度)的CD3/CD28偶联的纳米基质或CD3和CD28偶联的不同的纳米基质在IL-2存在下刺激分类的人初始CD4和CD8T细胞7天。使用CD3/CD28偶联的MACSiBeads作为高对照。给出第7天在培养物中的绝对活细胞数(A)。示出了来自两个供体的结果。此外，将细胞用CFSE标记，在激活后的第5天测量增殖活性(1个代表性供体)(B)。
图6：比较可溶的CD3或CD28抗体与CD3或CD28抗体偶联的纳米基质。将初始CD4和CD8T细胞分离，在IL-2存在下用可溶的不存在CD28的CD3(0-10000ng/mL)(A)或在可溶的CD28(200ng/mL)存在下(B)刺激，并与CD28偶联的纳米基质(200ng/mL)比较，分析第5天的早期激活标志物CD25/CD69或第7天的扩增(C)。重复分析了2个供体。
图7：用各种刺激剂刺激的分离T细胞亚组的转导效率。用CD3/CD28纳米基质、板结合CD3+的可溶CD28或CD3/CD28偶联的MACSiBeads激活T细胞亚组，初始(TN,CD62L+CD45RA+)、中央记忆(TCM,CD62L+CD45RA-)和效应(TEM,CD62L-CD45RA-)T细胞，并用对MART-1特异性表达TCR的逆转录病毒载体转导它们。作为标准，用可溶的CD3/CD28激活总PBMC。用荧光标记的MART-1/HLA-A2四聚体测定表达MART-1TCR的转导细胞的频率。
图8：富集的T细胞亚组的扩增至少像PBMC或更好。
从由黑色素瘤患者新鲜分离的PBMC中分离CD8+T细胞亚组，并用包被的CD3加上可溶的CD28(图表中的CD3+CD28)或CD3/CD28/CD2包被的MACSiBeads(图表中的MACSiBeads)或CD3/CD28纳米基质在IL-2存在下刺激。刺激2天后，转导细胞以表达MART-1TCR。图表报道了在刺激后第13-15天每个培养物的扩增倍数。该扩增倍数值是相对于其扩增倍数为57.61±17.75的可溶CD3刺激的PBMC。
图9：用MACSiBeads或CD3/CD28纳米基质刺激的初始和中央记忆细胞显示较少的终端分化表型。从黑色素瘤患者的白细胞去除术中新鲜分离PBMC。富集CD8+T细胞亚组然后在IL2存在下用CD3+CD28或MACSiBeads或CD3/CD28纳米基质刺激。相反，PBMC用可溶CD3和IL2刺激。刺激后48小时转导细胞以表达MART-1TCR。刺激后第13-15天获得每个培养物的数据。示出了CD8+T细胞中A)MART-1四聚体+CD62L+和B)MART-1四聚体+CCR7+细胞的频率。收回IL2后，对细胞进行CD27、CD57标志物染色或用MART-1+HLA-A2+黑色素瘤细胞系在CD107a抗体和孟宁素存在下刺激5小时。统计分析CD8+T细胞中的C)MART-1四聚体+CD27+；D)MART-1四聚体+CD57+和E)CD107a+细胞的频率。
图10：在CD8+T细胞亚组中MART-1再刺激时细胞因子分泌。从由黑色素瘤患者新鲜分离的PBMC中分离CD8+T细胞亚组，并用CD3+CD28MACSiBeads或CD3/CD28纳米基质在IL-2存在下刺激。用可溶CD3和IL2刺激来自同一黑色素瘤患者的PBMC。刺激2天后，转导刺激细胞以表达MART-1TCR并培养总共13-15天。随后，洗涤细胞除去IL2，再静置2天，然后用MART-1+HLA-A2+黑色素瘤细胞系再刺激6小时。通过细胞内染色测定细胞因子的产生。图表示出了A)IFNγ+、B)IL2+和C)TNFα+CD8+T细胞的频率。
发明详述
小于1μm的颗粒不便有效刺激T细胞是科学界广为接受的观点，因为如此小的颗粒不能提供足够的交联以激活T细胞。因此，通常，在现有技术中用来激活多克隆T细胞的具有固相表面的珠子或微球的尺寸总是大于1μm，通常它们是细胞大小。
现在出乎意料地，本发明人发现具有可移动基质且具有与其连接的多克隆刺激剂的小于1μm、优选小于500nm、更优选小于200nm的纳米基质方便刺激T细胞。与相同尺寸的珠子或微球相反，所述小于500nm的纳米基质不具有固相表面(导致灵活的可移动相)，这对于本发明而言是必不可少的(参见实施例3)。纳米基质像网格或网，由可移动聚合物材料(优选葡聚糖)组成。纳米基质非常可塑，导致其紧靠到靶细胞(即，将被激活的T细胞)的细胞膜表面的能力。因此，纳米基质将连接在可移动基质上的试剂结合到细胞表面的各个受体(抗原)上，其中该基质的灵活性允许与结合伴侣的最佳相互作用。在某种程度上，纳米基质的形状适应于靶细胞表面，从而延伸纳米基质和靶细胞之间的接触表面。由于纳米基质的尺寸是1-500nm，优选10-200nm，它们太小以至于不能在细胞中引起干扰，即，纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性的。如果使用尺寸为1μm或更大的珠子或微球，这种由直接的细胞/珠子接触引发的干扰是有问题的。此外，优选地，由于组合物由生物可降解的聚合物材料(例如葡聚糖聚合物)组成，纳米基质是生物可降解的且对细胞无毒。其结果是，纳米基质在改变细胞功能方面是完全生物学惰性的实体但其是生物可降解的。因此，为了刺激和增殖，将其与T细胞接触后，没有必要去除纳米基质。在这些细胞随后的分析、实验和/或临床应用中没有因为激活的T细胞组合物中存在纳米基质而出现干扰效应。
此外，由于其是可溶的或胶质的，未结合的纳米基质在T细胞激活过程后容易通过重复的洗涤步骤稀释至低于T细胞激活阈值的有效浓度。
纳米基质的可移动基质连接有一种或多种为T细胞提供激活信号的刺激剂，从而激活并诱导T细胞增殖。该试剂是能够结合细胞表面结构并诱导T细胞多克隆刺激的分子。连接到纳米基质的可移动基质的试剂的一个实例是抗CD3单克隆抗体(mAb)与共刺激蛋白(如抗CD28mAb)的组合。其他实例是单独的抗CD2、抗CD137、抗CD134、Notch配体(如Delta类1/4、Jagged1/2)或其与抗CD3的各种组合。待刺激的T细胞是例如初始T细胞、记忆T细胞、CD4Treg和CD8Treg细胞。优选地，连接到纳米基质的可移动基质的刺激剂是抗CD3单克隆抗体(mAb)与共刺激蛋白抗CD28mAb的组合。
因此，在一个方面，本发明提供多克隆刺激T细胞的方法，所述方法包括将T细胞群与纳米基质接触，所述纳米基质包含
a)可移动聚合物链基质，和
b)一种或多种为T细胞提供激活信号的连接到所述聚合物链基质上的刺激剂，从而激活并诱导T细胞增殖，其中所述纳米基质的尺寸是1-500nm，优选10-200nm。
所述纳米基质在改变细胞功能方面可以是生物学惰性的。
此外，或可选择地，所述纳米基质可以是生物可降解的。
纳米基质可以是临床应用的cGMP质量。例如可以通过使用具有适宜孔径(200nm)的过滤器无菌过滤或使用本领域技术人员熟知的其他方法实现灭菌。细胞产物的GMP加工通常在封闭的细胞培养系统中进行。在GMP培养系统中使用纳米基质是有利的，因为：
–纳米基质通过无菌过滤器的特征
–与T细胞相比，低颗粒密度或胶质性能避免了基质的较快沉淀
–纳米基质的剂量与培养物的体积而不是T细胞数相关。
纳米基质能够通过无菌过滤器的特征允许其被添加到配备有或可配备无菌过滤器的封闭细胞培养系统中，例如细胞培养包(MiltenyiBiotec,Baxter,CellGenics)、G-Rex设备(Wilson Wolf manufacturing)、WAVE生物反应器(GE Healthcare)、量子细胞扩增系统(TerumoBCT)、Prodigy(Miltenyi Biotec,参见Apel等2013,Chemie Ingenieur Technik 85:103-110)。可以从袋或瓶(连接到排气瓶适配器)中用注射器推注纳米基质通过过滤器或用泵拉动纳米基质通过过滤器从而将纳米基质加入封闭的细胞培养系统。
用来诱导T细胞增殖的其他试剂(细胞大小的磁珠、细胞系)不能通过无菌过滤器。使用那些试剂将需要用无菌管焊机(例如Terumo,GE,Genesis)将试剂连接到封闭的细胞培养系统。不是所有的管焊机都被设计用于GMP洁净室中的操作。因此，通过无菌过滤器将试剂添加至封闭的细胞培养系统提供了显著的优势。
用来诱导T细胞增殖的刚性细胞大小的磁性颗粒具有高于包括T细胞的淋巴细胞的密度(1.07g/l)，因此比纳米基质沉淀得快。搅拌的细胞培养系统，如WAVE生物反应器(GE Healthcare)通过用于培养的容器的运动避免了细胞的完全沉淀。容器的运动对不同尺寸和密度的细胞/颗粒施加不同的力，导致相对运动。与细胞培养瓶中的静置培养相比，WAVE生物反应器中的增殖诱导降低。
已经优化了利用刚性细胞大小的磁性颗粒的CD3CD28MACSiBeads(“ExpAct T reg kit”,“T细胞扩增试剂盒”,MiltenyiBiotec)的使用以用于给定比例的珠子/细胞(如1:2)，需要测定培养容器内的T细胞数和确定的细胞密度，即每表面积优化的细胞数和珠子数，使得在几分钟内沉淀到培养瓶底部的珠子和细胞能最佳地相互作用。对于扩增T细胞的临床应用，这导致了额外的取样步骤，可能影响产品的灭菌。本发明中纳米基质的使用允许根据培养物体积确定T细胞增殖诱导剂的剂量，因为该试剂可以在培养基中自由扩散且不会沉淀。可以通过不影响无菌屏障的天平或相机系统测定包含细胞悬液的T细胞体积。根据体积测定确定试剂剂量允许没有人工细胞计数步骤的完全自动化的细胞产物制备过程(例如，使用Prodigy系统)。
接触可以发生在，例如体外任何能够容纳细胞的容器中，优选在无菌环境下。这种容器可以是，例如培养瓶、培养袋、生物反应器或任何可以用于生长细胞的设备(如WO2009072003的样品加工系统，如Prodigy系统)。
因此，在一方面，本发明提供在封闭细胞培养系统中多克隆刺激T细胞的方法，所述方法包括将包含所述封闭细胞培养系统中的T细胞群的细胞培养物与一定剂量的纳米基质接触，所述纳米基质包含
a)可移动聚合物链基质，和
b)一种或多种为T细胞提供激活信号的连接到所述可移动聚合物链基质上的刺激剂；
其中所述纳米基质的尺寸是1-500nm，和
其中将所述剂量的纳米基质无菌施加到所述封闭的细胞培养系统，和
其中所述剂量取决于所述封闭的细胞培养系统中细胞培养物的体积。
所述细胞培养物的体积可以通过不影响无菌屏障的天平或相机系统测定。
测定和施加所述剂量可以自动进行。
本发明中所用的纳米基质可以是其中至少一种第一试剂和一种第二试剂连接到同一可移动基质的纳米基质。将这种类型纳米基质与T细胞接触，从而激活并诱导T细胞增殖。连接到同一灵活基质的第一和第二试剂的比例可以在100:1至1:100的比例范围内，优选为10:1至1:10、最优选为2:1至1:2。
此外出乎意料地，发现本发明的纳米基质还可以是其中至少一种第一试剂和一种第二试剂连接到分别的可移动基质的纳米基质。将这些纳米基质的混合物与T细胞接触，从而激活并诱导T细胞增殖(参见实施例6)。连接有第一试剂的可移动基质和连接有第二试剂的可移动基质的比例和/或浓度可以根据所用T细胞种类和/或所用试剂而改变以产生最佳刺激结果。通过滴定连接有第一试剂的可移动基质和连接有第二试剂的可移动基质的各种浓度和比例促进了特定T细胞亚组激活条件的优化。通常，纳米基质与细胞的比例大于100:1，优选大于500:1，最优选大于1000:1是有利的。每个细胞中大量的纳米基质允许单独的标记纳米基质的微调，这对于使用细胞尺寸珠子的T细胞刺激中常用的较低比例1:10至10:1而言是不可能的。
本发明所用的纳米基质是其中可移动基质由对细胞无毒的聚合物材料，优选生物可降解材料构成的纳米基质。优选地，本发明所用的纳米基质是其中可移动基质由葡聚糖聚合物构成的纳米基质。使用聚合物材料如葡聚糖生成基质产生可移动的、灵活的基质。基质的移动性(灵活性或可塑性)优于用于细胞增殖的相同尺寸的更加刚性的颗粒(具有固相表面)或珠子(例如纳米结构)。
不管与其连接的试剂，本发明所用的纳米基质可以是其中可移动基质是该纳米基质的唯一或至少主要成分的纳米基质。
但本发明所用的纳米基质也可以是其中纳米基质携带包埋在灵活性基质内、优选包埋在葡聚糖聚合物内的磁性、顺磁性、超顺磁性的纳米晶体或荧光染料的纳米基质。
本发明所用的纳米基质可用于使用该纳米基质刺激T细胞的方法中，其中在随后应用经刺激的T细胞中没有去除所述纳米基质。
或者，本发明所用的纳米基质可用于使用该纳米基质刺激T细胞的方法中，其中在随后应用经刺激的T细胞之前去除所述纳米基质。
在另一方面，本发明还提供包含以下的组合物：
i)纳米基质，所述纳米基质包含
a)可移动聚合物链基质，和
b)一种或多种为T细胞提供激活信号的连接到所述聚合物链基质上的试剂，从而激活并诱导T细胞增殖，
且其中所述纳米基质的尺寸是1-500nm，优选10-200nm；
ii)T细胞群，该细胞群通过所述纳米基质与细胞之间的接触而触发激活并诱导增殖。
所述纳米基质在改变细胞功能方面可以是生物学惰性的。
所述纳米基质可以是生物可降解的。
试剂以高密度连接到相同或不同的纳米基质，每mg纳米基质具有大于25μg试剂，优选每mg纳米基质具有大于50μg试剂。
所述组合物对于形成体内使用的T细胞疗法是方便的(药物组合物)。所述组合物也可以用于其他随后的分析和实验。
在另一方面，本发明还提供包含根据本发明方法产生的刺激和(可选的扩增)的T细胞群的组合物或药物组合物。所述药物组合物可以包含根据本发明方法产生的经刺激的T细胞群，其中所述方法在封闭的细胞培养系统(如WO2009072003的样品加工系统)中进行。
纳米基质可以通过本领域已知的各种方法制备，包括溶剂蒸发、相分离、喷雾干燥、或低温溶剂萃取。选择的方法应当简单、可重复且可规模化。所得纳米基质应当自由流动且不会聚集以生产均匀的可注射悬浮液。所述纳米基质还应当是无菌的。这可以通过，例如过滤、终端灭菌步骤和/或通过无菌处理来确保。纳米基质的制备如实施例1所述。
定义
如本文所用的术语“可移动聚合物链基质”和“可移动基质”具有可互换的含义。术语“可移动”是指有机生物聚合物如葡聚糖或纳米颗粒上的其他生物聚合物的常见且已经被详细描述的特征(参见Bertholon等Langmuir 2006,第45485-5490页)。这些聚合物由可移动的(能动的)，优选高度可移动的(能动的)链构成，因此该基质的特征在于不存在作为刺激剂(如抗体)连接点的固体表面，这与目前使用的通常具有不可弯曲的僵硬表面的珠子或微球形成强烈对比。因此，包含可移动聚合物链基质的纳米基质是灵活的，且可调节至细胞表面的形式。此外，作为结果，该纳米基质是其中在水溶液中纳米基质总体积的大部分(如大于50％)、优选大于80％且更优选大于90％且最优选大于99％由可移动聚合物链构成的纳米基质。
偶联有一种或多种刺激剂的纳米基质与待刺激的细胞之间的接触受益于该纳米基质没有允许该纳米基质紧靠到细胞的固定、僵硬或刚性表面这一事实。所述基质由对细胞无毒的聚合物材料、优选生物可降解或生物相容的惰性材料构成。优选地，该基质由在水溶液中由于链的水合作用而获得最大移动性的亲水性聚合物链组成。不管与其连接的试剂，可移动基质是纳米基质的唯一或至少主要成分。
可移动基质可以是胶原蛋白、纯化蛋白、纯化肽、多糖、葡萄糖胺聚糖、或胞外基质组合物。多糖可以包括，例如纤维素醚、淀粉、阿拉伯胶、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、果胶、黄原胶、瓜尔豆胶、海藻酸盐。其他聚合物可以包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚胺、聚乙烯亚胺、聚季铵盐聚合物、聚磷腈、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、嵌段共聚物、或聚氨酯。优选地，可移动基质是葡聚糖聚合物。
可移动基质限定了纳米基质的性质为高度可塑的，即灵活的，导致其紧靠到靶细胞(即，将被激活并增殖的T细胞)的细胞膜表面的能力。因此，纳米基质通过连接在可移动基质上的试剂与细胞紧密结合，因为基质的移动性提供了连接的配体或抗体进入它们的细胞表面受体或抗原的最佳通道。由于此性质，纳米基质具有提供激活T细胞的足够交联的能力，而不管该结构的小尺寸，即，尺寸小于1μm，优选小于500nm，更优选小于200nm。由可移动、灵活的纳米结构引起的纳米基质的适应性延伸了细胞膜表面与纳米基质之间的接触面积，导致了细胞表面分子与连接至可移动基质的试剂之间的更有效的结合。
在一些实施方案中，可移动基质可以包埋磁性、顺磁性、或超顺磁性的纳米晶体或其他增加额外功能性质的物质(例如荧光染料)，而不改变基本的可移动结构和/或表面特征，即与靶细胞的相互作用。
如本文所用的连接到纳米基质的可移动基质的术语“刺激剂”是指能够结合细胞表面结构并有助于多克隆刺激T细胞的分子。如本文所用的术语“刺激剂”和“多克隆刺激剂”具有可互换的含义。用于本发明的合适试剂的实例包括试剂如合成化合物、核酸和蛋白质，包括多克隆或单克隆抗体、和其片段或衍生物、以及生物工程化蛋白质，如融合蛋白。在一个实施例中，试剂是致有丝分裂蛋白。致有丝分裂蛋白是能够将必要的最少两个信号递送至T细胞以使T细胞变得活化的两种或更多种蛋白质。致有丝分裂蛋白的实例是抗CD3和抗CD2单克隆抗体(mAb)与共刺激蛋白的组合，所述共刺激蛋白例如且包括对一种或多种以下T细胞表面分子具有特异性的蛋白质：CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L(CD70)、4-1BBL、CD30L和LIGHT，包括与这些表面结构对应的配体、或其片段。其他合适试剂包括能够通过细胞因子受体如IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R和IL-10R将信号递送至T细胞的试剂，包括这些受体的单克隆抗体(mAb)、包含对这些受体具有特异性的反应端的融合蛋白和与这些受体对应的配体或其部分。其他合适试剂包括任何能够结合T细胞上的细胞粘附分子的试剂，如结合以下类型的粘附分子的mAb、融合蛋白和相应配体或其部分：钙粘素、ICAM、整合素和选择素。T细胞上的粘附分子的实例是：CD44、CD31、CD18/CD11a(LFA-1)、CD29、CD54(ICAM-1)、CD62L(L-选择素)、和CD29/CD49d(VLA-4)。其他合适试剂包括任何能够结合趋化因子受体(包括C-C和C-X-C类型的那些)的试剂。与T细胞功能相关的趋化因子受体的实例包括CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、和CXCR3。
可以通过本领域已知且可用的各种方法将试剂连接或偶联到可移动基质。连接可以是共价或非共价、静电或疏水的，且可以通过各种连接方法完成，包括例如，化学、机械、酶促或其他方法，其中试剂能够刺激细胞。例如，可以首先将针对细胞表面结构的抗体连接至基质，或可以将亲和素或链霉亲和素连接至基质以结合生物素化试剂。可以将针对细胞表面结构的抗体直接或间接(如通过抗同型抗体)连接至基质。另一实例包括使用连接至基质的蛋白A或蛋白G，或其他非特异性抗体结合分子以结合抗体。或者，可以通过化学方式将试剂连接至基质，如与基质交联。
如本文所用，术语“抗体”意欲包括多克隆和单克隆抗体、嵌合抗体、半抗原和抗体片段，以及作为特异性结合抗原表位的抗体等价物的分子。术语“抗体”包括任何同型的多克隆和单克隆抗体(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)、或其抗原结合部分，包含但不限于，F(ab)和Fv片段如sc Fv、单链抗体、嵌合抗体、人化抗体、和Fab表达文库。
如本文所用，术语“生物学惰性”是指纳米基质的性质，即对活细胞无毒且不会因其尺寸小而通过与细胞表面的物理相互作用诱导细胞功能的强烈改变，除了连接的配体或抗体的特异性配体/受体触发功能。此外，纳米基质可以是生物可降解的，如被酶活性降解或被吞噬细胞清除。生物可降解材料可以来源于在生物流体(例如细胞培养基和血液)中降解的天然或合成材料。降解可以使用酶促方式发生或可以在不使用酶促方式的情况下发生。生物可降解材料在几天、几周或几月内降解，这取决于其暴露的环境条件。生物可降解材料应当对活细胞和在人中无毒且非抗原性的。降解产物必须产生无毒副产物。生物学惰性情况下的一个重要方面是纳米基质不诱导标记细胞在结构、功能、活动状态或活力方面的强烈改变这一事实，即它不会引起细胞干扰且不会干扰经刺激细胞随后的实验和治疗应用。由于纳米基质非常小(即纳米级范围)且具有紧靠到细胞表面而不改变细胞表面形状或对细胞施加强大剪切力(例如，造成细胞膜破裂)的纳米基质的性质，细胞的机械或化学刺激降低了。
如本文所用，术语“PBMC”是指例如通过使用密度梯度(如Ficoll、PanColl)从人外周血制剂中分离的外周单核血细胞。“PBMC”由淋巴细胞和单核细胞构成。
如本文所用，术语“纯化的T细胞”是指具有增加的T细胞含量的细胞群。可以通过不同方法纯化T细胞，包括分类、磁珠富集(例如CD4和CD8MicroBeads、Miltenyi Biotec)、非T细胞磁珠消耗、基于Ficoll的方法(例如、干细胞技术)或全血分离方法(、Miltenyi Biotec)，以及在抗体包被的表面上洗涤(panning)。
实施方案
在本发明的一个实施方案中，尺寸为1-500nm，优选10-200nm的第一纳米基质由葡聚糖聚合物的可移动基质构成，且连接有一个一种试剂，例如抗CD3mAb。尺寸为1-500nm，优选10-200nm的第二纳米基质由葡聚糖聚合物的可移动基质构成，且连接有另一种试剂，例如抗CD28mAb。在这种情况下，本发明的纳米基质是其中至少一种第一试剂和一种第二试剂连接至分别的可移动基质的纳米基质。
将这些纳米基质的混合物与T细胞接触，从而激活并诱导T细胞增殖。
由于纳米基质与细胞的高比例(通常大于500:1)，容易进行纳米基质的微调以刺激T细胞。
在本发明的另一个实施方案中，尺寸为1-500nm，优选10-200nm的纳米基质由葡聚糖聚合物的可移动基质构成，且连接有一种试剂，如抗CD3mAb。在这种情况下，本发明的纳米基质是其中至少一种第一试剂连接至可移动基质的纳米基质。将该纳米基质与T细胞接触，从而激活并诱导T细胞增殖。
可加入作为溶剂的第二或更多种(多种)共刺激剂(例如抗CD28mAb)以优化或支持由连接有第一试剂的纳米基质诱导的激活。
在本发明的另一个实施方案中，尺寸为1-500nm，优选10-200nm的纳米基质由葡聚糖聚合物的可移动基质构成，且连接有为细胞提供激活信号的两种试剂，例如抗CD3mAb和抗CD28mAb。在这种情况下，本发明的纳米基质是其中至少一种第一试剂和一种第二试剂连接至同一灵活基质的纳米基质。
将这种类型的纳米基质与T细胞接触，从而激活并诱导T细胞增殖。
在本发明的另一个实施方案中，尺寸为1-500nm，优选10-200nm的纳米基质由葡聚糖聚合物的可移动基质构成，且连接有为细胞提供激活信号的多种试剂，例如抗CD3mAb和抗CD28mAb、抗ICOS、抗Cd137或其他已知的共刺激分子。在这种情况下，本发明的纳米基质是其中至少一种第一试剂和多种其他试剂连接至同一可移动基质的纳米基质。
将这种类型的纳米基质与T细胞接触，从而激活并诱导T细胞增殖。
在本发明的另一个实施方案中，尺寸为1-500nm，优选10-200nm的纳米基质由葡聚糖聚合物的可移动基质构成，且连接有为细胞提供激活信号的一种或多种试剂，例如抗CD3mAb和/或抗CD28mAb。此外，纳米基质携带包埋于聚合物中的磁性、顺磁性或超顺磁性的纳米晶体。
将该纳米基质与T细胞接触，从而激活并诱导T细胞增殖。可选地，刺激T细胞后，可以通过施加磁场梯度去除未结合的磁性、顺磁性或超顺磁性的纳米基质。或者，可以通过施加磁场梯度，尤其是高梯度磁场来分离标记有磁性纳米基质的细胞，并随后扩增纯化的T细胞。
尽管由于其在改变细胞功能方面具有生物学惰性的性质而不需要在激活和增殖T细胞群后去除纳米基质，可选地，可以用足以从细胞或细胞培养物中洗去纳米基质的温和的洗涤条件去除纳米基质。可以通过重复的洗涤步骤将纳米基质容易地稀释至低于T细胞激活阈值的有效浓度。该可选的去除步骤用纳米基质比本领域公知的珠子或微球更容易进行，因为其尺寸小。如果该纳米基质携带包埋于聚合物中的磁性、顺磁性或超顺磁性的纳米晶体，可选地，可以通过对细胞/纳米基质混合物施加磁场梯度进行去除步骤。
本发明的方法可以用于扩增选择的T细胞群，以用于治疗感染性疾病或癌症。可以将所得的T细胞群基因转导并用于免疫治疗或可以用于感染剂如HIV的体外分析。可以获得来自例如被HIV感染的个体或患者的CD4+细胞群的增殖，并使该细胞例如抗HIV感染。在将T细胞群扩增到足够数量后，将扩增的T细胞重新注入所述个体或患者。类似地，可以从患有癌症的个体获得肿瘤浸润的淋巴细胞群，并刺激T细胞增殖至足够数量，并返回至所述个体。此外，来自根据本发明的方法扩增的T细胞培养物的上清液是细胞因子的丰富来源，并可以用于在体内或体外维持T细胞。
在本发明的另一个实施方案中，任何之前实施方案所述的纳米基质可以用于封闭细胞培养系统，例如WO2009072003的样品加工系统或细胞培养袋(Miltenyi Biotec,Baxter,CellGenics)、G-Rex设备(Wilson Wolf manufacturing)、WAVE生物反应器(GE Healthcare)、量子细胞扩增系统(Terumo BCT)。纳米基质具有此类封闭细胞培养系统的最佳的连通性，可以将其容易地无菌过滤并整合到所述封闭细胞培养系统中。它们简化了封闭细胞培养系统的过程(即T细胞或其他靶细胞的刺激)，因为如本文所述，不需要在刺激(和扩增)过程后去除纳米基质。可以相对于培养物的体积而不是T细胞数添加纳米基质。可以通过天平或相机系统(例如WO2009072003的样品加工系统)评估培养体积。在封闭细胞培养系统(如WO2009072003的样品加工系统)中使用本发明的方法，由于例如污染试剂(如其他真核细胞、细菌或病毒)的风险降低从而导致安全且简单的生产经刺激的T细胞的药物组合物的方法(操作者更安全且更快的处理)。
在本发明的另一个实施方案中，通过使用纳米基质的T细胞培养在磁场中进行。在该实施方案中，纳米基质由包埋在可移动基质中的超顺磁性核构成。当应用于磁场时，在纳米基质中诱导磁力，可以集中触发激活T细胞受体的配体从而改进增殖诱导。在磁场中培养T细胞可以在由铁磁基质构成的柱(例如，WO2009072003的柱)中，或在靠近强永久磁铁的袋、瓶或室中进行。
本发明对具有可以被刺激的细胞表面部分的任何细胞类型具有广泛的适用性。在这方面，本发明的方法可以增强许多细胞信号事件。这种方法可以治疗性地用于离体装置激活和刺激细胞从而输注入患者，或可以体内使用，以在靶细胞群上诱导细胞信号事件。优选地，所述方法中的靶细胞是T细胞，但并不限于此。
在用本发明刺激T细胞之前，可以从血液、外周单核血细胞(PBMC)、机体组织或来自组织液的细胞中直接鉴定和/或分隔或分离T细胞。通常从来自哺乳动物如人、小鼠、或大鼠，但尤其来自人且优选来自测试对象和/或患者的细胞样品中鉴定和/或分离所述细胞。通过本领域熟知的分类方法进行分离。这包括例如亲和层析或本领域已知的任何其他抗体依赖性分离技术。本领域已知的任何配体依赖性分离技术可以与基于细胞的物理性质的正性和负性分离技术一起使用。特别有效的分类技术是磁性细胞分类。磁性分离细胞的方法可例如从Invitrogen、Stemcell Technologies、Cellpro、Advanced Magnetics、或Miltenyi Biotec商购。除了T细胞与其他细胞(如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞或作为血液细胞样品(如血液或白细胞去除术)一部分的其他细胞)的混合物外，高度纯化的T细胞群可以用于与本发明接触，所述T细胞群包括T细胞亚群，例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、γ/δT细胞、α/βT细胞、CD4+CD25+Foxp3+调控T细胞、初始T细胞(CD45RA+CCR7+和/或CD62L+)或中央记忆T细胞(CD45R0+CCR7+)、效应记忆T细胞(CD45R0+CCR7-)或终端效应T细胞(CD45RA+CCR7-)。纳米基质为T细胞受体提供足够的交联活性，因此不需要例如通过Fc-受体表达细胞如单核细胞或树突状细胞的额外的交联来激活。
靶细胞群，如通过本公开获得的T细胞群，可以单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他成分(如IL-2)或其他细胞因子或细胞群一起施用。简言之，本公开的药物组合物可以包含如本文所述的靶细胞群和一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可以包含a)T细胞群，其中根据本发明将所述T细胞增殖至治疗有效量；和b)一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物可以包含痕量纳米基质，该纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性的，但可以是生物可降解的且对人无毒且非抗原性的。
本公开的组合物优选配制为用于静脉内施用。
本公开的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)疾病的方式施用。施用的量和频率可以由这些因素确定：患者的病症、患者疾病的类型和严重程度，尽管合适的剂量可以通过临床试验测定。
具体实施方式
实施例1：纳米基质的制备
通过修改Molday和MacKenzie的程序生产磁性纳米基质。将10克Dextran T40(Pharmacia Uppsala，瑞典)、1.5g FeCl3·6H2O和0.64g FeCl2·4H2O溶于20ml H2O中，并加热至40℃。搅拌的同时缓慢加入10ml 4N NaOH，并将溶液加热至70℃5分钟。用乙酸中和颗粒悬浮液。为了去除聚集体，将悬浮液于2000g离心10分钟，并通过0.22μm孔径的过滤器(Millex GV,Millipore,Molsheim,法国)过滤。通过在高梯度磁场(HGMF)中洗涤来去除未结合的葡聚糖。在按如下所述制备并置于约0.6特斯拉的磁场中的钢丝绒柱(MACS永久磁铁,Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,德国)中进行磁性纳米基质的HGMF洗涤。将10毫升纳米基质悬浮液施加于2g钢丝绒的15x 40mm柱。用30ml 0.05M醋酸钠洗涤加载柱。将柱从外部磁场中移开后，用0.05M醋酸钠洗脱磁性纳米基质。纳米基质形成褐色悬浮液。以450nm的光密度给出相对颗粒浓度。通过电子显微镜和动态光散射测定纳米基质的尺寸为30±20nm(e.m.)和65±20nm(DLS)。胶体溶液中基质的葡聚糖含量和磁铁矿含量分别测定为约3.5mg/ml和4.8mg/ml的范围，导致大约40:60w/w的比例。根据由比重瓶测定的2.5g/ml的干燥纳米基质的密度和分别为1.6g/ml和5.2g/ml的已知的葡聚糖和磁铁矿的密度，可以计算出干燥纳米基质中葡聚糖的体积为大约70％。如通过磁化率测量测定，纳米基质显示超顺磁性能。由磁性测量测定的捕获铁微晶的尺寸大约为10nm。
通过标准生物偶联化学(生物偶联技术,第2版,Greg T.Hermanson,由Academic Press,Inc.出版,2008)将CD3抗体(克隆OKT3)和CD28抗体(克隆15E8)偶联至相同或不同的纳米基质。
实施例2：使用各种CD3/CD28浓度和比例的纳米基质与CD3/CD28MACSiBeads的T细胞的扩增
目前现有技术中用于激活高度纯化T细胞的试剂包含针对固定于细胞培养皿或大细胞尺寸(4-5μm)颗粒表面的CD3/CD28的激活抗体。两种技术都容易出错，且技术上难以实现并标准化，尤其是在GMP相容的生产条件下。相反，纳米基质容易制备，且方便用于GMP条件下的细胞培养。因此，我们通过分析在各种浓度和CD3/CD28比例下的CD3/CD28包被的纳米基质与可商购的细胞刺激珠子(MACSiBeads,4,5μm,Miltenyi Biotec GmbH)的扩增潜力来比较T细胞的激活潜力。从图1可以看出，纳米基质有效地扩增了T细胞，即使在非常低的CD3浓度(20-100ng/ml)，该浓度也通常用于提供交联的辅助细胞存在下的可溶CD3/CD28。除了抗体浓度，CD3/CD28比例也可以影响细胞激活并提供其他方法以优化T细胞培养。在最佳剂量(20-300ng/ml)的扩增与标准试剂(MACSiBeads)相似或更好。在较高的剂量，扩增由于过度刺激T细胞而减少(激活诱导的细胞死亡)，已知该现象会在过高程度的TCR刺激下发生。总之，这些结果表明CD3/CD28包被的纳米基质能够在非常低的抗体浓度下有效地激活和扩增T细胞而不需要额外的交联。
实施例3：CD3/CD28偶联至纳米基质与200nm和300nm固体颗粒的比较
如上文所述，目前可用的用于激活T细胞的试剂可以分为两组。可溶抗体刺激(例如抗CD3和CD28)需要固定在细胞培养皿表面或通过辅助细胞的受体(例如免疫球蛋白Fc-受体)来固定。例如在不存在辅助细胞的情况下刺激高度纯化的T细胞的不依赖于外部交联步骤的用于T细胞激活的试剂，是基于用刺激CD3和CD28抗体包被的细胞大小的颗粒(4-5μm)。已知低于大约1μm关键直径的固体颗粒不适于适当地扩增T细胞。为了显示CD3/CD28包被的纳米基质(50-200nm)的独特激活能力，我们将它们的激活能力与相似尺寸的固体颗粒(200nm和300nm)和细胞大小的颗粒(4.5μm)进行比较。因为小的固体颗粒一般不会导致T细胞的扩增，我们分析了早期T细胞激活标志物(CD25上调和丧失CD3表达)以对T细胞激活具有灵敏的筛选。CD25在T细胞刺激后的最初24-48小时内上调。因为TCR诱导的CD25上调进一步被IL-2支持，我们也在培养条件中添加IL-2以最大化分析的灵敏度。TCR刺激的另一个直接结果是T细胞受体的下调，这可以通过细胞表面上丧失CD3表达来分析。高度纯化的T细胞用CD3/CD28包被的纳米基质(100ng/mlCD3)或用直径为4.5μm(MACSiBeads)或200nm(Ademtechbeads)且均由CD3和CD28抗体共价包被的固体颗粒来培养。以最佳的1:1比例使用MACSiBeads，但滴定200nm颗粒以获得25-3000ng/ml CD3的CD3和CD28的活性剂量。在第3天和第5天测量CD25+T细胞的频率，并在第3天测量CD3的表达密度。
从图2A、B和C中可以看出，最佳剂量(100ng/ml)的纳米基质导致强烈激活，如由CD25的上调[图2B(第3天)、图2C(第5天)]和CD3的下调(图2A)所示，这以与细胞大小的MACSiBeads相似的水平出现。与此鲜明对比，对于200nm固体颗粒，没有看到CD25上调且几乎没有看到CD3下调，甚至在30倍高的CD3/CD28浓度下。甚至在第5天，200nm固体颗粒不能够诱导CD25表达至与纳米基质相似的水平。只有在高浓度下(比纳米基质高5-30倍)观察到轻微上调，达到纳米基质水平的大约50-70％。
这些数据表明，尽管它们尺寸小，与具有固体表面的相似尺寸的颗粒相比，可移动纳米基质确实具有激活T细胞的独特潜力。滴定实验还表明，通过CD3/CD28包被的200-300nm大小的固体颗粒的激活缺乏不能简单地用颗粒的更高剂量来补偿，但明显存在不同质量的由纳米基质诱导的激活信号。
实施例4：纯化的T细胞亚组的扩增
如上所示，各种T细胞亚组可以具有不同的激活要求。特别地，初始T细胞在不存在辅助细胞的情况下难以激活。并且，当单独或在其他细胞类型存在下被激活时，CD4和CD8T细胞可能具有不同的需要。为了表明所有T细胞亚组可以被纳米基质同样很好地扩增，我们用所示剂量和组合物的纳米基质或MACSiBeads激活纯化的CD4和CD8初始T细胞、总初始T细胞或总T细胞，并比较它们的扩增。如图3所示，所有亚组均可以被纳米基质有效地且与标准MACSiBeads培养相当的水平扩增。
实施例5：CD25+Foxp3+调控T细胞(Treg)的扩增
Treg在移植、自身免疫和慢性炎症的治疗性应用是特别令人感兴趣的，且Teg在没有丧失调控活性(即Foxp3表达)的情况下难以在体外扩增。因此，我们还分析了是否可以用纳米基质扩增来自各种供体的CD25选择的Treg细胞(Foxp3纯度通常为60-90％)。为了支持Treg和传统T细胞的生长，在100nM雷帕霉素(一种抑制传统T细胞生长的详细描述的药物)存在下进行扩增。如图4所示，培养14天后，Treg可以被扩增10-20倍(不含有雷帕霉素)或5-10倍(含有雷帕霉素)。如之前所述，不存在雷帕霉素时，Foxp3的纯度高度可变(10-75％)，但存在雷帕霉素时，其纯度总是>50％。
总之，这些结果表明，纳米基质甚至可以用于在培养物中激活并扩增Treg。
实施例6：通过将CD3/CD28偶联至同一纳米基质与将CD3和CD28偶联至分别的纳米基质来激活T细胞的比较
已经描述了在基于CD3和CD28的T细胞激活剂的各种应用中，为了最佳激活，这两种抗体必须要固定在相同表面上。因此，我们还测试了这对于偶联至纳米基质的CD3和CD28是否也是需要的。我们比较了由CD3/CD28纳米基质与以不同比例/浓度混合的CD3纳米基质+CD28纳米基质激活的纯化初始T细胞的扩增。分析由Violetye稀释法测量的扩增(第5天)和细胞分裂(第7天)。如图5A和5B所示，单独用CD3纳米基质刺激没有诱导显著的扩增，且只观察到很少的细胞分裂，如对依赖于共刺激信号的初始T细胞所预期的。然而，以10-50ng/ml添加CD28纳米基质诱导了全部细胞分裂活性以及T细胞数的扩增，这与CD3/CD28对照纳米基质或标准MACSIBead类似。这些数据清楚地表明，两种抗体都可以偶联至分别的纳米基质，其随后可以混合用于优化使用。这促进了单一纳米基质的生产过程和质量控制，改进了试剂的灵活性，例如，通过滴定各种CD3和CD28浓度及比例促进了特定T细胞亚组激活条件的优化(微调)。
实施例7：将可溶性CD3或CD28偶联至纳米基质的效果
为了排除分别使用可溶性抗体可以获得与CD3和/或CD28包被的纳米基质类似结果的可能性，我们比较了各种浓度的CD3或CD28包被的纳米基质与可溶性抗体的刺激效果，以证实将抗体偶联至基质确实是获得良好T细胞激活的关键步骤。在所有培养物中加入IL-2。如图6A所示，单独的可溶性CD3在宽浓度范围(10-10000ng/ml)内在初始T细胞中没有诱导早期激活标志物CD25和CD69的任何明显的上调，而CD3包被的纳米基质(100ng/ml CD3)在20-60％的细胞中诱导了CD25/CD69表达。在饱和量(200ng/ml)的作为共刺激剂的可溶性CD28存在下(图6B)，可溶性CD3在最高的测试剂量(100-10000ng/ml)下还在大约20-40％的细胞中诱导了CD25/CD69表达。相反，CD3包被的纳米基质(100ng/ml CD3)在40-70％的细胞中诱导了CD25/CD69表达。
我们还测试了将CD28抗体偶联至纳米基质的效果。因为共刺激效果在次优的CD3刺激下肉眼观察最佳，我们将可溶性CD28或与纳米基质偶联的CD28在可溶性CD23存在下滴定至初始T细胞的培养物中。如图6C所示，与上述CD25/CD69的诱导相似，单独的可溶性CD3没有诱导初始T细胞的任何扩增。然而在可溶性CD28存在下，可检测到2-6倍的扩增，但只在CD28的最高测试剂量(10000ng/ml)下。与此相反，与纳米基质偶联的CD28在低1000倍的浓度(10ng/ml)下已经诱导了相似程度的扩增。
这些数据再次表明纳米基质与可溶性抗体的强烈交联和T细胞激活能力，这解释了为什么CD3CD28偶联的纳米基质，与可溶性抗体相反，甚至能够用于激活和扩增体外初始人T细胞。
实施例8：纳米基质可以用于激活T细胞以通过病毒转导引入TCR基因
激活和扩增T细胞(尤其是纯化的细胞亚组)的一个重要应用是它们的基因操纵，例如，以引入对肿瘤抗原具有特异性的某种抗原受体。我们已经使用纳米基质来激活纯化的初始(TN，CD62L+CD45RA+)、中央记忆(TCM,CD62L+CD45RA-)和效应(TEM,CD62L-CD45RA-)T细胞，并用对MART-1特异性表达TCR(肿瘤抗原)的逆转录病毒载体转导它们。我们进行了MHC-肽I类四聚体染色来检测这些T细胞亚组中转基因表达的相对频率。所有的T细胞亚组独立于我们测试的刺激条件均被有效转导(>50％)(图7)。我们还比较了转导T细胞的体外扩增。如图8所示，10天后，就三个亚组的扩增而言，我们在所有条件下均没有观察到差异。分离的T细胞亚组的所有激活方案与用可溶性CD3“标准”刺激总PBMC相等或更好(将所有值归一化至该标准以允许不同供体之间的更好比较)。与包被的αCD3+αCD28相比，当用MACSiBead或纳米基质激活T细胞亚组时，我们观察到更好扩增的趋势(非统计学显著的)。着眼于用MART-1+HLA-A2+肿瘤细胞系再刺激时表面标志物和细胞因子的产生，我们进一步调查了引入的MART-1TCR的功能活性和转导细胞的分化状况。如图9所示，用纳米基质和MACSiBead刺激的TCM和TN细胞似乎具有更高的CD62L和CCR7(促进T细胞迁移至外周淋巴结中的两个分子)的表达。该能力被认为对促进体内转移T细胞的长期坚持和功能活性有益，因此被认为能提高疗效。与TN相比，TCM和TEM CD8+T细胞亚组中MART-1反应性的IFNγ+细胞的百分比在所有刺激条件下均更高，但这不是统计学上显著的(图10，上图)。聚焦于IL-2生产(图10，中图)，我们观察到与包被的αCD3+αCD28刺激相比，当用MACSiBead/纳米基质刺激TN细胞时，更高百分比的TN细胞产生IL-2。对用MACSiBead刺激的TN亚组中检测到的产生TNFα的细胞也是这样(图10，下图)。这些结果表明用珠子刺激的来源于TN细胞的细胞显示了减少的效应细胞分化，表明向终端分化的较少进展。
总之，结果表明CD3/CD28纳米基质可以用于有效地激活和转导纯化T细胞亚组以产生全功能的T细胞移植体(例如用于肿瘤治疗)。

Claims (15)

1.纳米基质用于体外多克隆刺激T细胞的用途，所述纳米基质包含
a)可移动聚合物链基质，和
b)一种或多种为T细胞提供激活信号的连接到所述可移动聚合物链基质上的刺激剂；
其中所述纳米基质的尺寸是1-500nm。
2.体外多克隆刺激T细胞的方法，所述方法包括将T细胞群与纳米基质相接触，所述纳米基质包含
a)可移动聚合物链基质，和
b)一种或多种为T细胞提供激活信号的连接到所述可移动聚合物链基质上的刺激剂，从而激活并诱导T细胞增殖；
其中所述纳米基质的尺寸是1-500nm。
3.根据权利要求2所述的方法，其中至少一种第一刺激剂和一种第二刺激剂连接至同一可移动聚合物链基质上。
4.根据权利要求2所述的方法，其中至少一种第一刺激剂和一种第二刺激剂连接至分别的可移动聚合物链基质上。
5.根据权利要求4所述的方法，其中纳米基质与细胞的比例大于500:1，允许T细胞刺激的微调。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其中一种刺激剂是抗CD3抗体或其片段。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述第二刺激剂是抗CD28抗体。
8.根据权利要求2-7任一项所述的方法，其中所述可移动聚合物链基质由葡聚糖聚合物组成。
9.根据权利要求2-8任一项所述的方法，其中所述纳米基质携带有包埋于所述可移动聚合物链基质中的磁性、顺磁性或超顺磁性纳米晶体。
10.根据权利要求2-9任一项所述的方法，其中所述刺激剂以大于25μg/mg纳米基质的高密度连接。
11.根据权利要求2-10任一项所述的方法，其中所述被刺激的T细胞是Treg细胞。
12.在封闭细胞培养系统中多克隆刺激T细胞的方法，所述方法包括将所述封闭细胞培养系统内包含T细胞群的细胞培养物与一定剂量的纳米基质接触，所述纳米基质包含
a)可移动聚合物链基质，和
b)一种或多种为T细胞提供激活信号的连接到所述可移动聚合物链基质上的刺激剂；
其中所述纳米基质的尺寸是1-500nm，和
其中将所述剂量的纳米基质无菌施加到所述封闭细胞培养系统，和
其中所述剂量取决于所述封闭细胞培养系统中细胞培养物的体积。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞培养物的体积可以通过不影响无菌屏障的天平或相机系统测定。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中测定和施加所述剂量是自动进行的。
15.药物组合物，其包含根据权利要求12-14所述的方法产生的受刺激的T细胞群。
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