JP6216793B2 - 可動性ナノマトリックスによるｔ細胞のポリクローナル刺激方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般的に、免疫学の分野に関し、特にナノマトリックスによるＴ細胞のポリクローナル刺激プロセスに関する。

ＣＤ３に対する抗体は、多くのＴ細胞増殖プロトコールにおける中心的な要素である。抗ＣＤ３は、表面上に固定されると、Ｔ細胞表面でＴ細胞受容体複合体と架橋を形成することにより活性化および増殖誘導シグナルを送達する。抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８とを固定して、シグナルと共刺激シグナルとを同時に送達することにより、増殖を増加させることができる（Ｂａｒｏｊａら（１９８９）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２０：２０５〜２１７）。ＷＯ０９４２９４３６Ａ１では、培養皿およびビーズなどの固相表面を使用して、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体が固定される。通常、ビーズへの固定は、直径４．５μｍの大きさを有しているＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０において行われる。

ＥＰ０１２５７６３２Ｂ１は、Ｔ細胞の濃縮と細胞表面部分のライゲーションとを同時に行うことによるＴ細胞集団を刺激する方法であって、少なくとも一部がＴ細胞を含む細胞集団を用意すること、その細胞集団を表面（ここで表面には、Ｔ細胞の少なくとも一部の細胞表面部分とライゲートしてＴ細胞の少なくとも一部またはそれらの部分集団を刺激する１種または複数の物質が付着している）と接触させること、およびＴ細胞の濃縮とＴ細胞表面部分のライゲーションとを優勢に駆動させることによりＴ細胞の刺激を誘導する力を適用することを含む方法を説明している。力という用語は、本明細書で使用される場合、細胞を駆動させるのに使用される力を指し、同じように機能する様々な力を包含していてもよく、重力を超える力、液圧の力、膜内外の圧力により生じる濾過の力、遠心力、または磁力を包含する。ＥＰ１２５７６３２Ｂ１は、粒子と細胞との比率は様々であってもよいが、所定の好ましい値は少なくとも１：４から６：１の値を包含し、好ましい比率の１つはビーズ対Ｔ細胞が少なくとも２：１であることを説明している。通常、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体にカップリングされた直径４．５μｍの大きさを有しているＤｙｎａＢｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０が、ビーズ／Ｔ細胞の比率を３：１にして実験に使用された。これらの方法においても、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体などのＴ細胞の刺激物質を共に固定するために固相表面を使用している。これらの表面は、細胞の大きさに合わされており、Ｔ細胞自身と同程度である。

ＵＳ２００８／０３１７７２４Ａ１は、シグナル分子の空間的な提示がそのようなシグナル分子に対するＴ細胞の応答に劇的に影響を与える可能性があることを開示している。例えば、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体とが基質の予め規定された別々の領域に配置されると、基質上でインキュベートされたＴ細胞は、これらのシグナル分子のタイプだけでなく空間的配置にも応じて異なる量のインターロイキン−２を分泌するか、および／またはカルシウムの急上昇を示す。例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の場合、抗ＣＤ３抗体が、中央の抗ＣＤ３のフィーチャから約１〜２マイクロメートル間隔で配置された抗ＣＤ２８抗体の付随のフィーチャで取り囲まれた中央のフィーチャを有するパターンが生じた。抗ＣＤ２８抗体のフィーチャが約１〜２マイクロメートル離れた間隔で配置される場合、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体が「共局在」フィーチャで一緒にＴ細胞に提示される場合と比較してインターロイキン−２（ＩＬ−２）のＴ細胞分泌を強化した。

Ｅｒｉｎ Ｒ ＳｔｅｅｎｂｌｏｃｋおよびＴａｒｅｋ Ｍ Ｆａｈｍｙの出版物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１６巻４号、７６５〜７７２、２００８年４月）によれば、固体表面ナノ粒子（１３０ｎｍ）が使用されており、これらのナノ粒子はマイクロ粒子（８μｍ）よりも弱くＴ細胞を刺激することが示される。著者によれば、これらの発見は、Ｔ細胞の大きさに近いマイクロメートルサイズの粒子が最適なＴ細胞の刺激を提供することを実証する以前の報告（Ｍｅｓｃｈｅｒ、ＭＦ（１９９２）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：２４０２〜２４０５．）の発見によって裏付けられると述べている。Ｍｅｓｈｅｒの研究では、有効なＣＴＬ活性化のために、大きい連続表面の接触域が極めて重要であることが実証された。粒度４〜５マイクロメートルのラテックスマイクロスフェアに固定されたクラスＩ同種抗原を使用すれば最適な刺激が提供されることを見出した。４マイクロメートル未満だと、粒度が減少するにつれて応答が急速に減少し、小さい粒子が多数あったとしても、最適な大きさに及ばないことを補償できない。

ＵＳ８，０１２，７５０Ｂ２は、Ｔ細胞を活性化するための生分解性デバイスを開示している。まず生分解性の支持体を、例えばマイクロスフェアなどの形状に成形する。次いで、生分解性の支持体を第１の材料でコーティングして、第２の材料に結合できる反応性表面を提供する。第２の材料は、細胞上の表面構造への結合を可能にする反応性表面を有する。生分解性の支持体は、様々な形状に成形できる。マイクロスフェアは製造が簡単なため好ましい調合物であり、その球状の形状は細胞受容体との相互作用のための表面積を増加させる。ＵＳ８，０１２，７５０Ｂ２によれば、ナノスフェアは、ナイーブＴ細胞を活性化するのに十分な架橋を提供しないため、予め活性化されたＴ細胞にしか使用できない。この場合でも、実験データは、大きさの範囲が４から２４マイクロメートルで平均７マイクロメートルの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体が共に固定されたスフェアを用いて作製された。

ＵＳ２０１２／１２１６４９Ａ１は、対象または細胞に、インビトロで抗原／ＭＨＣ／共刺激分子／ナノ粒子複合体を、抗原特異的な抗腫瘍形成性Ｔ細胞の増殖を刺激するのに十分な量で投与することを含む、抗原特異的な抗腫瘍形成性Ｔ細胞の増殖方法を開示している。ナノ粒子は、約１ｎｍから１０ｎｍである。ｐＭＨＣおよびｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８ｍＡｂがコンジュゲートしたナノ粒子の、同源のナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して活性化する能力を比較した。ナノ粒子はさらに、デキストランおよび他の分子から形成された１種または複数の生分解性コーティングを含んでいてもよい。例えば酸化鉄（ＩＩＩ）とＰＬＧＡとを組み合わせてナノ粒子を形成することにより、固体の表面粒子を得ることができる。ＵＳ２０１２／１２１６４９Ａ１は、ナノ粒子上に固定された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂを用いたＴ細胞のポリクローナル刺激を開示していない。

ＵＳ２０１０／２８４９６５Ａ１は、抗ＣＤ２８抗体が付着した高分子ナノ粒子またはマイクロ粒子をＴ細胞に投与することによってＴ細胞を活性化する方法を開示している。マイクロ粒子は、０．５から１０００マイクロメートルの範囲であり、ナノ粒子は、５０ｎｍから０．５ｎｍ未満の範囲である。この粒子はＰＬＧＡからなるため、球形の固体表面を有する粒子といえる。加えて、ＵＳ２０１０／２８４９６５Ａ１は、ナノ粒子でのポリクローナル刺激を開示していない。

総合すると、固定されたＴ細胞刺激抗体を介してポリクローナルＴ細胞の活性化に使用される最先端のビーズまたはマイクロスフェアは通常、細胞の大きさを有する（大部分が１〜１０μｍの大きさを有する）均一な丸い形の粒子である。この大きさのビーズは、Ｔ細胞と相互作用するそれらの能力、加えてそれらの生産、取り扱い、および臨床的なＴ細胞治療法における安全性に関して数々の不利益がある。

１．ビーズの固体表面に起因して、ビーズと細胞との相互作用領域の大きさが制限される。

２．ビーズの製造は、可溶性抗体と比較して複雑で高価であり、ｃＧＭＰの品質でそれらを作製することが特に不便であり、例えばそれらの大きさのために、濾過滅菌が不可能であり、沈殿により、取り扱い、すなわち充填および抗体の付加中に一定の粒子数／体積にすることが困難である。

３．ビーズは、インビボで使用するためのＴ細胞治療剤を生成するためインビトロのプロセスで使用するには不便であり、それはなぜなら、
− ビーズは、規定の細胞／ビーズ比で、規定の表面積あたりの細胞／ビーズの密度で細胞に添加しなければならず、
− Ｔ細胞の刺激強度は、ほとんど細胞表面上における抗体の密度によって決定され、ビーズ／細胞の数によっては決定されないため、刺激強度はある程度しか適合させることができず、
− 沈殿のために等分化が不正確であり、
− 濾過滅菌が不可能であり、
− ビーズの大きさのために、ビーズは細胞生存率および機能に影響を与える可能性があり、遠心分離ではそれらを細胞から簡単に除去できないためである。それゆえに「ビーズ除去」のための特殊なプロトコールまたは生分解性粒子のいずれかが開発された。しかしながら、どちらの方法も除去プロセス後に残留したビーズの実際の数に関して正確さを欠くという問題があり、Ｔ細胞刺激性ビーズが患者に注射される場合に所定の毒作用の危険が残る。それぞれの単一の粒子そのものはインビボでＴ細胞を活性化する能力をなお保持する可能性があることから、この問題は特に粒子の大きさに関連する。

それゆえに、インビトロにおけるポリクローナルＴ細胞の刺激方法を改善する必要がある。

驚くべきことに、可動性ポリマーマトリックス主鎖（非固体表面）を特徴とし、マトリックス内に例えば磁性ナノ結晶などの追加の機能性化合物を埋め込むことができるナノマトリックスに付着させた、例えばＣＤ３およびＣＤ２８に対するポリクローナルＴ細胞刺激性物質（例えば抗体など）は、それらの直径が１μｍ未満であり、優先的には５００ｎｍ未満であり、より優先的には２００ｎｍ未満であるにもかかわらず、インビトロでナイーブおよびメモリーＴ細胞を刺激するのに使用できることが見出された。それとは逆に、本明細書で使用されるナノマトリックスと同じ大きさの固体表面を有するビーズでは、十分に確立された当業者の見解に従って、Ｔ細胞を全く刺激できないか、またはナノマトリックスと類似のレベルまで刺激できないことが見出された。ナノマトリックスの大きさは小さいため、ナノマトリックスそのものは、抗体が付着していないと細胞の構造、機能、活性状態または生存率を変更せず、すなわちそれらは細胞中で混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｃｅ）を引き起こさず、それに続く刺激された細胞の分析、実験、および治療用途に干渉しない。加えて優先的には、ナノマトリックスは、生細胞にとって生分解性かつ非毒性であり、すなわちナノマトリックスは、細胞の機能の変更に関して生物学的に不活性な物体である。それゆえに、本発明の方法で使用されるナノマトリックスは、細胞の生存を保護することによりインビトロでのＴ細胞の刺激を改善する。加えて、小さいナノマトリックスの濾過滅菌は可能であり、これは厳格なＧＭＰ規格に準拠する条件下で長期にわたりインビトロでＴ細胞を増殖させるための重要な特性であり、インビトロで増殖したＴ細胞の臨床応用のための有用な選択肢である。さらにこれらのナノマトリックスは、例えばＷＯ２００９／０７２００３（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で説明されているような密閉された無菌細胞培養システムでの使用によく適している。加えて、驚くべきことに、ナノマトリックスに付着させた、例えばＣＤ３およびＣＤ２８に対するＴ細胞刺激性物質（例えば抗体など）を、（同じナノマトリックスにコンジュゲートさせる代わりに）別々のナノマトリックスにコンジュゲートさせてもよく、これをその後、最適な使用のために混合してもよいことが見出された。一般的に、ナノマトリックスと細胞との比率は、１００：１を超える、優先的には５００：１を超える、最も優先的には１０００：１を超える。これにより、標的Ｔ細胞の刺激に使用されるナノマトリックスの精密な調整が可能となり、例えば単一のナノマトリックスの生産プロセスおよび品質管理が容易となり、試薬の柔軟性が改善され、例えば様々なＣＤ３およびＣＤ２８の濃度および比率の適正値を決定することによって、特殊化したＴ細胞のサブセットごとの活性化状態の最適化が容易となる。

第１の態様において、本発明は、インビトロにおけるＴ細胞のポリクローナル刺激のための、本明細書で開示されたナノマトリックスの使用を提供する。

さらなる態様において、本発明は、Ｔ細胞のポリクローナル刺激方法であって、Ｔ細胞集団をナノマトリックスと接触させることを含み、ナノマトリックスは、可動性ポリマー鎖のマトリックスを含み、この可動性ポリマー鎖のマトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナルを供給することによりＴ細胞を活性化して増殖を誘導する１種または複数の物質を付着させており；１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍの大きさである、上記方法を提供する。優先的には、ナノマトリックスは、細胞の機能の変更に関して生物学的に不活性である。加えて優先的には、ナノマトリックスは、生分解性である。

本発明により得られた刺激され場合により増殖させたＴ細胞は、ナノマトリックスがＴ細胞の機能の変更に関して生物学的に不活性であるという特性のために、ナノマトリックスを排除または除去する必要なくその後の治療用途または治療以外の用途に使用できる。

あるいは、ナノマトリックスは可溶性またはコロイド状であるために、Ｔ細胞の刺激プロセス後、繰り返しの洗浄工程により、Ｔ細胞活性化の閾値未満の有効な濃度に容易に希釈できる。

ナノマトリックスは、１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍの大きさである。ナノマトリックスは、高分子材料からなる可動性マトリックスであるが、ビーズまたはマイクロスフェアとは対照的に固相表面を有さない。Ｔ細胞のポリクローナル刺激を可能にする例えば抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体などの物質は、マトリックスの可動性ポリマー鎖に付着される。例えば磁性ナノ結晶、蛍光色素などの追加の物質をマトリックス内に埋め込むことにより、その基本的な可動性構造、表面の特性、またはナノマトリックスと細胞との相互作用のパラメーターを変更することなくナノマトリックスに追加の機能を付加することもできる。

このように、固体表面に付着しているとしても、水溶液中でポリマーマトリックスが可動性、すなわち柔軟性を有することは当分野において周知である。例えば、生物学的用途または医療用途に使用されるデキストランおよび他のポリマーの柔軟性または可動性の定量的な推定は、Ｂｅｒｔｈｏｌｏｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００６、４５４８５〜５４９０頁で示されている。

使用されるポリマーによって刺激マトリックスに導入される可動性は、臨床的状況におけるインビボでのイメージング技術に頻繁に使用される多糖類および埋め込まれた超常磁性ナノ結晶に関して複数の出版物でよく説明されている。これらの試薬は、本明細書に記載された実施例のうちいくつかで使用された試薬のタイプに極めて類似している。「粒子」という用語が用いられるが、これらの試薬は実際には球状の固体表面粒子とは限らないことが周知である：「医療目的に使用されるコロイド状の（いわゆる）ナノ粒子の多くはポリマーまたは高分子電解質でコーティングされており、実際にこれらは、固定されたスフェアとみなすことはできない（Ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ （ｓｏ ｃａｌｌｅｄ） ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｕｒｐｏｓｅ ａｒｅ ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｍｅｒ ｏｒ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｙ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｒｅａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ｒｉｇｉｄ ｓｐｈｅｒｅｓ）（Ｄｉ Ｍａｒｃｏら．Ｉｎｔ Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．２００７年、６１８頁、５行以降）」。

直接的な例証として、多糖類が埋め込まれた超常磁性ナノ結晶のこの典型的な特性は、大きさの測定に使用される異なる方法によって得られた大きさの値が一致しないことによって最もよく説明される。透過型電子顕微鏡法では、典型的には乾燥サンプルを使用するため、主として常に１０ｎｍの範囲の埋め込まれたナノ結晶（ｎａｎｏｃｙｒｓｔａｌｓ）の大きさを有すると測定される。しかしながら、それに対してダイナミックレーザー散乱は水溶液中の周囲のマトリックスの大きさも考慮に入れるため、それよりもかなり大きい直径を有すると測定される（例えば、デキストランマトリックスと埋め込まれた酸化鉄結晶とからなる臨床用コントラスト試薬であるＡＭＩ−２５の場合、５〜１０ｎｍに対して８０〜１５０ｎｍである。これは、水溶液中の複合体の総体積の９９％超が可動性マトリックスで占められることを意味する（Ｗａｎｇら．Ｅｕｒ．Ｒａｄｉｏｌ．２００１：２３２３頁）。例えば、実施例１で使用されたマトリックスについては、大きさの測定から３０ｎｍ（ＴＥＭ）および６５ｎｍ（ＤＬＳ）であることが解明され、したがって水溶液中の複合体の約８０〜９０％が可動性マトリックスからなる。それゆえに、これらのタイプの可動性マトリックスにおいて、可動性ポリマーは、被覆された硬質粒子または固体表面（これはさらに、付着に使用されるポリマーの薄層でコーティングされている可能性もある）というよりも、細胞と相互作用する間の生物物理学的な挙動を決定するものである。したがって、説明されたマトリックス中のポリマー鎖の周知の柔軟性または可動性（運動性）は、決定に関わる特性であり、刺激のために伝統的に使用されてきたマイクロスフェア上の固体表面に付着した抗体との重要な差である。

まとめると、これらの例は、（全ての細胞培養用途に必要な）水溶液中の可動性の柔軟な高分子マトリックスの挙動に関する現在共通の知見を示し、さらに、これらに限定されないが、この研究で使用される酸化鉄含有多糖類マトリックスなどのポリマーでコーティングされたコロイドの生物物理的特性が埋め込まれた物質とは無関係に主としてポリマー材料の特性によって決定されるということも強調する。

それゆえに、本発明は、インビトロでのＴ細胞のポリクローナル刺激方法であって、Ｔ細胞集団をナノマトリックスと接触させることを含み、ナノマトリックスは、
ａ）可動性ポリマー鎖のマトリックスを含み；
ｂ）前記可動性ポリマー鎖のマトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナルを供給することによりＴ細胞を活性化して増殖を誘導する１種または複数の刺激性物質を付着させており；
ナノマトリックスは１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍの大きさであり、水溶液中のナノマトリックスの総体積の大部分（すなわち５０％超）、優先的には８０％超、より優先的には超、最も優先的には９９％超が可動性ポリマー鎖からなる、上記方法を提供する。

例えば磁性ナノ結晶、蛍光色素などの追加の物質をマトリックスに埋め込む場合、その結果得られた複合体は、主として可動性ポリマー鎖からなり、水溶液中の体積の５０％超、優先的には８０％超、より優先的には９０％超、最も優先的には９９％超を占める。

ナイーブＴ細胞の増殖のためのＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックスを示すグラフである。ソートされたヒトナイーブＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、ＩＬ−２の存在下で７日間、ＣＤ３／ＣＤ２８がコンジュゲートしたナノマトリックスを指示された濃度（有効なＣＤ３濃度）で用いて刺激した。様々な指示された比率でＣＤ３およびＣＤ２８とコンジュゲートしたナノマトリックスを比較した。高度な対照として、ＣＤ３／ＣＤ２８をコンジュゲートしたＭＡＣＳｉＢｅａｄを使用した。７日目における培養物中の生存細胞の絶対数を示す。 Ｔ細胞の刺激に関するナノサイズの固体粒子とナノマトリックスとの比較を示すグラフである。ナノサイズの固体粒子（ＡｄｅｍｔｅｃｈＢｅａｄ、直径＝２００ｎｍ）をＣＤ３／ＣＤ２８とコンジュゲート（１：１）し、指示されたＣＤ３濃度でナイーブＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の刺激に使用した。活性化パラメーターとして、ＣＤ３のダウンレギュレーション（図２Ａ、３日目）または初期の活性化マーカーＣＤ２５の誘導（図２Ｂは３日目、図２Ｃは５日目）のいずれかをフローサイトメトリーによって分析した。これらの値を、ＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックス（１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ３）で刺激した同じ細胞の値に標準化した。４人の異なるドナーからの値を示す。 ソートされたヒトＴ細胞集団の増殖を示すグラフである。ヒトＴ細胞を様々な部分集団（総Ｔ細胞、総ナイーブＴ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞）にソートし、ＩＬ−２の存在下で７日間、ＣＤ３／ＣＤ２８がコンジュゲートしたナノマトリックスを指示された濃度（有効なＣＤ３濃度）および１：１のＣＤ３／ＣＤ２８比率で用いて刺激した。高度な対照として、ＣＤ３／ＣＤ２８をコンジュゲートしたＭＡＣＳｉＢｅａｄを使用した。７日目における培養物中の生存細胞の絶対数を示す。 ヒトＴｒｅｇの増殖を示すグラフである。ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを磁気によるＣＤ２５選択によってＰＢＭＣから単離し、１００ｎＭラパマイシンの存在または非存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックス（２００ｎｇ／ｍｌのＣＤ３）および高用量のＩＬ−２を使用して１４日間増殖させた。７日目に、新しく調製したナノマトリックス＋ＩＬ−２を添加することによって細胞を再び刺激した。１４日目に、生存するＴｒｅｇの数を決定した。Ｆｏｘｐ３発現細胞の割合を、細胞内免疫蛍光法によって決定した。各ドットは、個々の健康なドナーを表す。 異なるナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ３およびＣＤ２８と、同じナノマトリックスにコンジュゲートしたそれらとの比較を示すグラフである。ソートされたヒトナイーブＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、ＩＬ−２の存在下で７日間、ＣＤ３／ＣＤ２８がコンジュゲートしたナノマトリックスまたは様々なナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ３およびＣＤ２８のいずれかを指示された濃度（有効なＣＤ３濃度）で用いて刺激した。高度な対照として、ＣＤ３／ＣＤ２８がコンジュゲートしたＭＡＣＳｉＢｅａｄを使用した。７日目における培養物中の生存細胞の絶対数を（Ａ）に示す。２人のドナーからの結果を表示する。加えて、細胞をＣＦＳＥで標識し、活性化後５日目に増殖活性を測定した（１人の代表的なドナー）（Ｂ）。 可溶性ＣＤ３またはＣＤ２８抗体と、ナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ３またはＣＤ２８抗体との比較を示すグラフである。ナイーブＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を単離し、インビトロでＩＬ−２の存在下で、ＣＤ２８なしで（Ａ）、または可溶性ＣＤ２８（２００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で（Ｂ）、可溶性ＣＤ３（０〜１００００ｎｇ／ｍＬ）を使用して刺激し、ナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ２８（２００ｎｇ／ｍｌ）と比較し、５日目に初期の活性化マーカーＣＤ２５／ＣＤ６９に関して、または７日目に増殖に関して分析した（Ｃ）。２人のドナーを二連で分析した。 様々な刺激物質で刺激された単離されたＴ細胞サブセットの形質導入効率を示すグラフである。Ｔ細胞サブセット、ナイーブ（Ｔ_Ｎ、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−）、およびエフェクター（ＴＥＭ、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックス、プレートに結合したＣＤ３＋可溶性ＣＤ２８またはＣＤ３／ＣＤ２８をコンジュゲートしたＭＡＣＳｉＢｅａｄを使用して活性化し、ＭＡＲＴ−１に特異的なＴＣＲを発現するレトロウイルスベクターを使用してそれらを形質導入した。標準として、可溶性ＣＤ３／ＣＤ２８を使用して総ＰＢＭＣを活性化した。蛍光標識されたＭＡＲＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２四量体を使用して、ＭＡＲＴ−１ＴＣＲを発現する形質導入された細胞の割合を決定した。 濃縮されたＴ細胞サブセットは、少なくともＰＢＭＣと同様に、またはそれより優れて増殖することを示すグラフである。黒色腫患者から新たに単離されたＰＢＭＣからのＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットを単離し、ＩＬ２の存在下で、コーティングされたＣＤ３プラス可溶性ＣＤ２８（グラフ中、ＣＤ３＋ＣＤ２８）で、またはＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２でコーティングされたＭＡＣＳｉＢｅａｄ（グラフ中、ＭＡＣＳｉＢｅａｄ）で、またはＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックスで刺激した。刺激から２日後、細胞は形質導入されてＭＡＲＴ−１ＴＣＲを発現した。グラフに、刺激後１３〜１５日目の各培養物の増殖の倍率を報告する。増殖の倍率の値は、５７．６１±１７．７５の増殖の倍率を示す可溶性ＣＤ３で刺激されたＰＢＭＣに対する相対値である。 ＭＡＣＳｉＢｅａｄまたはＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックスで刺激されたナイーブおよびセントラルメモリー細胞は、最終分化未満の表現型を示す。黒色腫患者の白血球分離物によりＰＢＭＣを新たに単離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを濃縮し、次いで、ＩＬ２の存在下で、ＣＤ３＋ＣＤ２８またはＭＡＣＳｉＢｅａｄまたはＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックスで刺激した。その代わり、ＰＢＭＣを可溶性ＣＤ３およびＩＬ２で刺激した。刺激の４８時間後、細胞は形質導入されてＭＡＲＴ−１ＴＣＲを発現した。本図に記載のデータは、刺激後１３〜１５日に各培養物で得られた。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の、Ａ）ＭＡＲＴ−１四量体^＋ＣＤ６２Ｌ^＋、およびＢ）ＭＡＲＴ−１四量体^＋ＣＣＲ７^＋細胞の割合を示す。ＩＬ２使用中止後、細胞を、ＣＤ２７、ＣＤ５７マーカーで染色するか、またはＣＤ１０７ａ抗体およびモネンジンの存在下で、ＭＡＲＴ−１^＋ＨＬＡ−Ａ２^＋黒色腫細胞系で５時間刺激した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の、Ｃ）ＭＡＲＴ−１四量体^＋ＣＤ２７^＋；Ｄ）ＭＡＲＴ−１四量体^＋ＣＤ５７^＋、およびＥ）ＣＤ１０７ａ^＋細胞の統計的分析を示す。 ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセット中のＭＡＲＴ−１再刺激の際のサイトカイン分泌を示すグラフである。黒色腫患者から新たに単離されたＰＢＭＣからのＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットを単離し、ＩＬ２の存在下で、ＣＤ３＋ＣＤ２８のＭＡＣＳｉＢｅａｄで、またはＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックスで刺激した。同じ黒色腫患者からのＰＢＭＣを可溶性ＣＤ３およびＩＬ２で刺激した。刺激の２日後、細胞は形質導入されて、ＭＡＲＴ−１ ＴＣＲを発現し、合計１３〜１５日間培養された。その後、ＩＬ２から細胞を洗浄して除去し、さらに２日間休ませ、次いでＭＡＲＴ−１^＋ＨＬＡ−Ａ２^＋黒色腫細胞系で６時間再び刺激した。サイトカイン生産を細胞内染色によって決定した。グラフは、Ａ）ＩＦＮγ^＋；Ｂ）ＩＬ２^＋、およびＣ）ＴＮＦα^＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。

１μｍ未満の粒子はＴ細胞を活性化するのに十分な架橋を提供しないため、このような小さい粒子はＴ細胞を効果的に刺激するには不便であるということが、科学団体における十分に確立された評価であった。それゆえに、一般的に、ポリクローナル的にＴ細胞を刺激するのに使用される固相表面を有するビーズまたはマイクロスフェアの大きさは最新技術では常に１μｍを超え、通常は細胞の大きさである。

ここで意外なことに、本発明者らは、ナノマトリックスが１μｍ未満であり、優先的には５００ｎｍ未満であり、より優先的には２００ｎｍ未満であること、可動性マトリックスを有すること、さらにこの可動性マトリックスにはポリクローナル刺激性物質（複数可）が付着していることが、Ｔ細胞を刺激するのに便利であることを見出した。本発明にとって、５００ｎｍ未満であるナノマトリックスは、同じ大きさのビーズまたはマイクロスフェア（実施例３を参照）とは対照的に、固相表面を有さない（その結果として柔軟な移動相が生じる）ことが必須である。ナノマトリックスは、可動性高分子材料、優先的にはデキストランからなるメッシュまたはネット状である。ナノマトリックスはまさに、標的細胞、すなわち活性化しようとうするＴ細胞の細胞表面の膜にぴったりとくっつく能力をもたらすプラスチックである。それゆえに、マトリックスの柔軟性により結合パートナーとの最適な相互作用が可能なため、ナノマトリックスは、可動性マトリックスに付着したその物質と共に細胞表面上のそれぞれの受容体（抗原）に結合する。ナノマトリックスの形状は標的細胞表面にある程度合わせられるので、ナノマトリックスと標的細胞との接触表面が広くなる。ナノマトリックスの大きさが１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍであるために、ナノマトリックスは、細胞中の混乱を引き起こすには小さすぎ、すなわちナノマトリックスは、細胞の機能の変更に関して生物学的に不活性である。このような直接の細胞／ビーズの接触によって発生する混乱は、大きさが１μｍまたはそれより大きいビーズまたはマイクロスフェアが使用される場合に問題となる。加えて優先的には、ナノマトリックスは、例えばデキストランのポリマーなどの生分解性高分子材料からなる組成物のために、細胞にとって生分解性かつ非毒性である。結果的に、ナノマトリックスは、細胞の機能の変更に関して完全に生物学的に不活性な物体であるが、生分解性である。それゆえに、刺激および増殖のためにナノマトリックスをＴ細胞と接触させた後に、ナノマトリックスを除去する必要がない。それに続くこれらの細胞の分析、実験、および／または臨床的な用途において、活性化されたＴ細胞組成物中のナノマトリックスの存在に起因する撹乱作用は起こらない。

加えて、未結合のナノマトリックスは可溶性またはコロイド状であるために、Ｔ細胞の刺激プロセス後、繰り返しの洗浄工程により、Ｔ細胞活性化の閾値未満の有効な濃度に容易に希釈できる。

ナノマトリックスの可動性マトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナル（複数可）を提供することによってＴ細胞を活性化して増殖を誘導する１種または複数の刺激性物質が付着している。刺激性物質とは、細胞表面構造に結合でき、Ｔ細胞のポリクローナル刺激を誘導する分子である。ナノマトリックスの可動性マトリックスに付着した物質の一例は、例えば抗ＣＤ２８ｍＡｂなどの共刺激タンパク質と組み合わせた抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。他の例は、単独での、または抗ＣＤ３との様々な組み合わせのいずれかの、抗ＣＤ２、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３４、Ｎｏｔｃｈ−リガンド、例えばＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １／４、Ｊａｇｇｅｄ １／２である。刺激しようとするＴ細胞は、例えばナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、ＣＤ４ Ｔｒｅｇ、およびＣＤ８ Ｔｒｅｇ細胞である。優先的には、ナノマトリックスの可動性マトリックスに付着した刺激性物質は、共刺激タンパク質である抗ＣＤ２８ｍＡｂと組み合わせた抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。

それゆえに、一態様において、本発明は、Ｔ細胞のポリクローナル刺激方法であって、Ｔ細胞集団をナノマトリックスと接触させることを含み、ナノマトリックスは、
ａ）可動性ポリマー鎖のマトリックスを含み；
ｂ）前記ポリマー鎖のマトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナルを供給することによりＴ細胞を活性化して増殖を誘導する１種または複数の刺激性物質を付着させており；
ナノマトリックスは１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍの大きさである、上記方法を提供する。ナノマトリックスは、細胞の機能の変更に関して生物学的に不活性であってもよい。それに加えて、またはその代わりに、ナノマトリックスは、生分解性であってもよい。

ナノマトリックスは、臨床的な用途の場合はｃＧＭＰの品質を有していてもよい。無菌性は、例えば好適な孔径（２００ｎｍ）を有するフィルターを使用した濾過滅菌によって達成してもよいし、または当業者周知の他の方法によって達成してもよい。細胞生成物のＧＭＰプロセシングは、密閉された細胞培養システムで頻繁に行われる。ＧＭＰ培養システムにおけるナノマトリックスの使用の利点は：
− 滅菌フィルターを通過するナノマトリックスの特性
− Ｔ細胞と比較してそれより速いマトリックスの沈殿を回避する、低い粒子密度またはコロイド様の挙動
− Ｔ細胞数ではなく培養物の体積に基づくナノマトリックスの供給
に起因する。

滅菌フィルターを通過できるナノマトリックスの特性は、滅菌フィルター、例えば細胞培養バッグ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂａｘｔｅｒ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｃｓ）、Ｇ−Ｒｅｘデバイス（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）、ＷＡＶＥバイオリアクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｑｕａｎｔｕｍ細胞拡張システム（Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ）、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｐｅｌら．２０１３、Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒ Ｔｅｃｈｎｉｋ ８５：１０３〜１１０を参照）を備えた、または備えることができる密閉された細胞培養システムへ添加することを可能にする。ナノマトリックスをフィルターに通すための注射器、またはナノマトリックスを（通気口が付けられたバイアルのアダプターに連結された）バッグまたはバイアルからフィルターを通して押し出すためのポンプを使用して、ナノマトリックスを密閉された細胞培養システムに添加してもよい。

Ｔ細胞の増殖を誘導するのに使用される他の物質（細胞大の磁気ビーズ、細胞系）は、滅菌フィルターを通過できない。これらの試薬を使用するならば、滅菌チューブ溶接機（例えばＴｅｒｕｍｏ、ＧＥ，Ｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して密閉された細胞培養システムに物質を連結させることが必要になるであろう。このようなチューブ溶接機が全て、ＧＭＰクリーンルーム内での操作のために設計されているわけではない。したがって、物質を滅菌フィルターを通過させて密閉された細胞培養システムに添加することは、著しい有利性をもたらす。

Ｔ細胞の増殖を誘導するのに使用される固定された細胞大の磁気粒子は、Ｔ細胞を包含するリンパ球の密度（１．０７ｇ／ｌ）を超える高い密度を有するため、ナノマトリックスよりも速く沈殿する。例えばＷＡＶＥバイオリアクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの撹拌型細胞培養システムは、培養に使用されるコンテナーの運動によって細胞の完全な沈殿を回避する。コンテナーの運動は、異なる大きさおよび密度を有する細胞／粒子に異なる力を与え、その結果として相対的な運動が起こる。細胞培養フラスコ中での静置培養と比較して、ＷＡＶＥバイオリアクター内での増殖の誘導は低減される。

固定された細胞大の磁気粒子を利用するＣＤ３ＣＤ２８のＭＡＣＳｉＢｅａｄ（「ＥｘｐＡｃｔ Ｔ ｒｅｇキット」、「Ｔ細胞拡張キット」、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の使用は、所定のビーズ対細胞比（例えば１：２）で使用するのに最適化されており、その際、培養コンテナー内のＴ細胞の数と、規定の細胞密度、すなわち最適化された表面積あたりの細胞およびビーズの数との測定を必要とし、それによりビーズと細胞との最適な相互作用が可能になり、両方とも数分以内に培養容器の底部に沈殿するようになる。増殖したＴ細胞の臨床的な用途の場合、それにより追加のサンプリング工程が生じるため、生成物の無菌状態が影響を受ける可能性がある。試薬は媒体中で自由に拡散でき沈殿しないために、本発明のナノマトリックスの使用は、培養物の体積に基づいたＴ細胞の増殖誘導物質の供給を可能にする。Ｔ細胞を含有する細胞懸濁液の体積は、無菌バリアに影響を与えることなく、秤またはカメラシステムによって測定できる。体積測定に基づく物質の供給は、細胞生成物の完全自動化製造プロセス（例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙシステムを使用）を可能にし、手作業で細胞を数える工程を行わなくてもよい。

接触は、例えば、インビトロで、細胞を保持することが可能なあらゆるコンテナー中、好ましくは無菌環境中で行ってもよい。このようなコンテナーは、例えば培養フラスコ、培養バッグ、バイオリアクター、または細胞を増殖させるのに使用できるあらゆるデバイス（例えばＷＯ２００９０７２００３に記載のサンプル処理システム、すなわちＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙシステム）であってもよい。

それゆえに、一態様において、本発明は、密閉された細胞培養システムでのＴ細胞のポリクローナル刺激方法であって、前記密閉された細胞培養システム内のＴ細胞集団を含む細胞培養物を使用量の（a dosage of）ナノマトリックスと接触させることを含み、ナノマトリックスは、
ａ）可動性ポリマー鎖のマトリックスを含み；
ｂ）前記可動性ポリマー鎖のマトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナルを供給する１種または複数の刺激性物質を付着させており；
ナノマトリックスは１〜５００ｎｍの大きさであり、
前記使用量のナノマトリックスは前記密閉された細胞培養システムに無菌で適用され（ａｐｐｌｉｅｄ ｓｔｅｒｉｌｅ）、
前記使用量は前記密閉された細胞培養システム中の細胞培養物の体積に依存する、上記方法を提供する。

前記細胞培養の体積は、無菌バリアに影響を与えることなく、秤またはカメラシステムによって測定できる。

前記使用量の測定および適用は自動的に行ってもよい。

本発明で使用されるナノマトリックスは、少なくとも１種の第１の物質と１種の第２の物質とが、同じ可動性マトリックスに付着しているナノマトリックスであってもよい。この種のナノマトリックスをＴ細胞と接触させることにより、Ｔ細胞が活性化されて増殖が誘導される。同じ柔軟なマトリックスに付着した第１の物質と第２の物質との比率は、１００：１から１：１００、優先的には１０：１から１：１０の間、最も優先的には２：１から１：２の間の比率の範囲であってもよい。

加えて、驚くべきことに、本発明のナノマトリックスは、少なくとも１種の第１の物質と１種の第２の物質とが、別々の可動性マトリックスに付着しているナノマトリックスであってもよいことが見出された。これらのナノマトリックスの混合物をＴ細胞と接触させることにより、Ｔ細胞が活性化されて増殖が誘導される（実施例６を参照）。使用されるＴ細胞および／または使用される物質の種類に応じて、第１の物質が付着した可動性マトリックスと第２の物質が付着した可動性マトリックスとの比率および／または濃度を変更することによって、最適な刺激の結果を得ることができる。それにより、第１の物質が付着した可動性マトリックスおよび第２の物質が付着した可動性マトリックスの様々な濃度および比率の適正値を決定することによって特殊化したＴ細胞サブセットの活性化状態の最適化が容易になる。ナノマトリックスと細胞との比率は、一般的には１００：１を超える、優先的には５００：１を超える、最も優先的には１０００：１を超えることが有利である。このように細胞１つあたりのナノマトリックスが大量であるために、細胞大のビーズを使用したＴ細胞の刺激に一般的に使用されるそれよりも低い１：１０〜１０：１の比率では不可能と思われる別々の標識ナノマトリックスの精密な調整を可能にする。

本発明で使用されるナノマトリックスは、可動性マトリックスが優先的には生分解性であり細胞にとって非毒性の高分子材料からなるナノマトリックスである。優先的には、本発明で使用されるナノマトリックスは、可動性マトリックスがデキストランのポリマーからなるナノマトリックスである。マトリックスを生成するために例えばデキストランなどの高分子材料を使用することにより、可動性の柔軟なマトリックスが生じる。マトリックスの可動性（柔軟性または可塑性）は、同じ大きさの（固相表面を有する）より固定された粒子またはビーズ、すなわち細胞を増殖させるためのナノ構造と比較して優れている。

本発明で使用されるナノマトリックスは、物質が付着しているかどうかに関わらず、可動性マトリックスがナノマトリックスの唯一の構成要素または少なくとも主要な構成要素であるナノマトリックスであってもよい。

しかしながら、本発明で使用されるナノマトリックスは、ナノマトリックスが、柔軟なマトリックスに埋め込まれた、優先的にはデキストランのポリマーに埋め込まれた磁性、常磁性、超常磁性ナノ結晶、または蛍光色素を有するナノマトリックスであってもよい。

本発明で使用されるナノマトリックスは、このナノマトリックスを用いてＴ細胞を刺激する方法で使用してもよく、ナノマトリックスは、それに続く刺激されたＴ細胞の適用で除去されない。

あるいは、本発明で使用されるナノマトリックスはまた、このナノマトリックスを用いてＴ細胞を刺激する方法で使用してもよく、ナノマトリックスは、それに続く刺激されたＴ細胞の適用の前に除去される。

他の態様において、本発明はまた、
ｉ）ナノマトリックスであって、
ａ）可動性ポリマー鎖のマトリックスを含み、
ｂ）前記ポリマー鎖のマトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナルを供給することによりＴ細胞を活性化して増殖を誘導する１種または複数の物質を付着させており；
１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍの大きさである、ナノマトリックス、
ｉｉ）前記ナノマトリックスと細胞との接触により発生される活性化され増殖が誘導されたＴ細胞集団
を含む組成物も提供する。

ナノマトリックスは、細胞の機能の変更に関して生物学的に不活性であってもよい。

ナノマトリックスは、生分解性であってもよい。

物質は、同じまたは別々のナノマトリックスに、ナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇを超える、優先的にはナノマトリックス１ｍｇあたり５０μｇを超える高密度で付着している。

この組成物は、インビボで使用するためのＴ細胞治療剤（医薬組成物）を製造するのに便利な可能性がある。また本組成物は、それに続く他の分析および実験にも使用できる。

他の態様において、本発明はまた、本発明の方法に従って生産された、刺激された（場合により増殖させた）Ｔ細胞集団を含む組成物または医薬組成物も提供する。本医薬組成物は、本発明の方法によって生産された、刺激されたＴ細胞集団を含んでいてもよく、本方法は例えばＷＯ２００９０７２００３に記載のサンプル処理システムなどの密閉された細胞培養システムで行われる。

ナノマトリックスは、溶剤蒸発、相分離、噴霧乾燥、または低温での溶媒抽出などの当技術分野において公知の様々な方法によって調製できる。選択されるプロセスは、簡単で、再現可能で、且つ拡張可能であると予想される。得られたナノマトリックスは、シリンジで扱える均一な懸濁液を生産するために自由流動性を有し、且つ凝集しないと予想される。さらにナノマトリックスは、無菌であるべきである。これは、例えば濾過、最終的な滅菌工程によって、および／または無菌処理を介して確実に行うことができる。ナノマトリックスの調製は、実施例１で説明される。

定義
用語「可動性ポリマー鎖のマトリックス」および「可動性マトリックス」は、本明細書で使用される場合、どちらも同じ意味を有する。用語「可動性」は、ナノ粒子上の例えばデキストランなどの有機バイオポリマーの、一般的で十分説明がなされている特性を指す（Ｂｅｒｔｈｏｌｏｎら．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００６、４５４８５〜５４９０頁を参照）。これらのポリマーは、可動性の（運動性の）、優先的には高度に可動性の（運動性の）鎖からなり、したがってそのマトリックスは、例えば抗体などの刺激物質のための付着点としての固体表面がないことを特徴としており、これは、現在使用されているビーズまたはマイクロスフェアが一般的には柔軟性のない硬質表面を有することとは極めて対照的である。結果として、可動性ポリマー鎖のマトリックスを含むナノマトリックスは、柔軟であり、細胞表面の形態に合わせて順応することが可能である。結果として、ナノマトリックスはさらに、水溶液中のナノマトリックスの総体積の大部分（すなわち５０％超）、優先的には８０％超、より優先的には９０％超、最も優先的には９９％超が可動性ポリマー鎖からなるナノマトリックスである。

ナノマトリックスが、動かない、硬質の、または固定された表面を有さないために、ナノマトリックスは細胞にぴったりとくっつくことができることから、１種または複数の刺激性物質がカップリングされたナノマトリックスと刺激しようとする細胞との接触が有利になる。マトリックスは、優先的には生分解性または生体適合性の、細胞にとって非毒性の高分子不活性材料からなる。マトリックスは、優先的には親水性ポリマー鎖で構成されることから、親水性ポリマー鎖の水和によって水溶液中で最大の可動性が達成される。物質が付着しているかどうかに関わらず、可動性マトリックスがナノマトリックスの唯一の構成要素であるか、または少なくとも主要な構成要素である。

可動性マトリックスは、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、または細胞外マトリックス組成物で作製されていてもよい。多糖類としては、例えば、セルロースエーテル、スターチ、アラビアゴム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアールガムまたはアルギネートなどが挙げられる。他のポリマーとしては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクオタニウムポリマー、ポリフォスファーゼン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマー、またはポリウレタンなどが挙げられる。優先的には、可動性マトリックスは、デキストランのポリマーである。

可動性マトリックスは、高い可塑性を有する、すなわち柔軟であるというナノマトリックスの特性を規定し、このような特性により、標的細胞、すなわち活性化され増殖すると予想されるＴ細胞の細胞表面の膜にぴったりとくっつく能力がもたらされる。このようにマトリックスが可動性を有するために、付着したリガンドまたは抗体がそれらの細胞表面受容体または抗原に最適に接近できることから、ナノマトリックスは、可動性マトリックスに付着したその物質と共に細胞に強く結合する。この特性のために、構造の大きさが小さいこと、すなわち１μｍ未満であり、優先的には５００ｎｍ未満であり、より優先的には２００ｎｍ未満の大きさであることに関係なく、ナノマトリックスはＴ細胞を活性化するのに十分な架橋を提供する能力を有する。可動性の柔軟なナノ構造に起因するナノマトリックスの適応性は、細胞表面の膜とナノマトリックスとの接触領域を大きくし、結果的に細胞表面分子と可動性マトリックスに付着した物質とをより効率的に結合させる。

いくつかの実施形態において、可動性マトリックスに、基本的な可動性構造および／または表面の特性、すなわち標的細胞との相互作用を変更することなく、磁性、常磁性もしくは超常磁性ナノ結晶、または例えば蛍光色素などの追加の機能特性を付加する他の物質を埋め込んでもよい。

ナノマトリックスの可動性マトリックスに付着した「刺激性物質」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞表面構造に結合でき、Ｔ細胞のポリクローナル刺激に寄与する分子を指す。用語「刺激性物質」および「ポリクローナル刺激性物質」は、本明細書で使用される場合、どちらも同じ意味を有する。本発明で使用するのに好適な物質の例としては、例えば合成化合物、核酸、およびタンパク質などの物質、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、およびそれらのフラグメントまたは誘導体、ならびに例えば融合タンパク質などのバイオ工学的に作製されたタンパク質などが挙げられる。一例において、このような物質は、分裂誘起タンパク質である。分裂誘起タンパク質は、Ｔ細胞の活性化を引き起こすためにＴ細胞に必要最小限の２種のシグナルを送達できる２種以上のタンパク質である。分裂誘起タンパク質の例は、例えば以下のＴ細胞表面分子：ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＯＸ４０、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、およびＬＩＧＨＴのうち１種または複数に特異的なタンパク質、加えてこれらの表面構造に対応するリガンド、またはそれらのフラグメントなどの共刺激タンパク質と組み合わせた、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。他の好適な物質としては、例えばＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ；ＩＦＮ−γＲ、ＴＮＦ−αＲ、ＩＬ−４Ｒ、およびＩＬ−１０Ｒなどのサイトカイン受容体を介してＴ細胞にシグナルを送達できる物質、例えばこれらの受容体に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、これらの受容体に特異的な反応性末端を有する融合タンパク質、およびこれらの受容体に対応するリガンドまたはそれらの一部が挙げられる。他の好適な物質としては、Ｔ細胞上で細胞接着分子に結合できるあらゆる物質、例えば以下のカテゴリー：カドヘリン、ＩＣＡＭ、インテグリン、およびセレクチンに属する接着分子に対するｍＡｂ、融合タンパク質および対応するリガンドまたはそれらの一部などが挙げられる。Ｔ細胞上の接着分子の例は、ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＤ１８／ＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２９、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、およびＣＤ２９／ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）である。他の好適な物質としては、ケモカイン受容体に結合できるあらゆる物質、例えばＣ−ＣおよびＣ−Ｘ−Ｃカテゴリーに属するものなどが挙げられる。Ｔ細胞の機能に関連するケモカイン受容体の例としては、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ３が挙げられる。

当技術分野において公知で利用可能な様々な方法で、物質を可動性マトリックスに付着またはカップリングさせることができる。付着は、共有結合または非共有結合による付着、静電気的な付着、または疎水性の付着であってもよく、付着は、例えば、物質による細胞の刺激を可能にするような化学的、機械的、酵素的、または他の手段などの様々な付着手段で達成してもよい。例えば、まず細胞表面構造に対する抗体をマトリックスに付着させてもよいし、またはビオチン化物質に結合させるためにアビジンもしくはストレプトアビジンをマトリックスに付着させてもよい。細胞表面構造に対する抗体をマトリックスに直接付着させてもよいし、または例えば抗アイソタイプ抗体を介して間接的に付着させてもよい。他の例としては、抗体と結合させるためにマトリックスに付着したプロテインＡもしくはプロテインＧ、または他の非特異的な抗体結合分子を使用することが挙げられる。あるいは、例えばマトリックスへの架橋などの化学的手段でマトリックスに物質を付着させてもよい。

用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、ハプテン、ならびに抗原上のエピトープに特異的に結合するという点で抗体の等価体である抗体フラグメントおよび分子を包含することが意図される。用語「抗体」は、あらゆるアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）のポリクローナルおよびモノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合部位を包含し、このようなものとしては、これらに限定されないが、Ｆ（ａｂ）およびＦｖフラグメント、例えばｓｃＦｖ、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。

用語「生物学的に不活性な」は、本明細書で使用される場合、生細胞にとって非毒性であり、且つその大きさが小さいために細胞表面との物理的な相互作用を介して細胞の機能（ただし付着したリガンドまたは抗体の特異的なリガンド／受容体によって誘発される機能を除く）の強い変更を誘導しないナノマトリックスの特性を指す。加えて、ナノマトリックスは生分解性であってもよく、例えば酵素活性によって分解されてもよいし、または食細胞によって排除されてもよい。生分解性材料は、例えば細胞培養培地および血液などの生体液中で分解する天然または合成材料から誘導できる。このような分解は、酵素的手段を使用して起こしてもよいし、または酵素的手段を用いずに起こしてもよい。生分解性材料は、数日、数週間または数か月以内に分解する、これは生分解性材料が晒される環境の状態によって左右される場合がある。生分解性材料は、生細胞にとって、およびヒト中で非毒性であり非抗原性であると予想される。分解産物からは非毒性の副産物が生産されるはずである。生物学的に不活性という状況における重要な観点は、ナノマトリックスは、標識された細胞の構造、機能、活性状態または生存率の強い変更を誘導しない、すなわち細胞の混乱を引き起こさず、その後の刺激された細胞の実験および治療用途を妨害しないということである。極めて小さい、すなわちナノスケールの範囲であり、さらに細胞表面の形状を変更したり、または細胞に強い剪断力を働かせて例えば結果的に膜を破裂させたりするのではなく、細胞表面にぴったりとくっつく可動性マトリックスを有するというナノマトリックスの特性のために、細胞の機械的または化学的な刺激が低減される。

用語「ＰＢＭＣ」は、本明細書で使用される場合、例えば密度勾配（例えばフィコール、ＰａｎＣｏｌｌ）の使用によりヒト末梢血液製剤から単離された末梢血単核細胞を指す。「ＰＢＭＣ」は、リンパ球および単球からなる。

用語「精製したＴ細胞」は、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞含量を増加させた細胞集団を指す。Ｔ細胞は、ＦＡＣＳ（登録商標）ソーティング、磁気ビーズ（例えばＣＤ４およびＣＤ８マイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）による濃縮、磁気ビーズによる非Ｔ細胞の枯渇、フィコールベースの方法（例えばＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または全血単離法（ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、加えて抗体でコーティングした表面上でのパニングなどの様々な方法で精製できる。

実施形態
本発明の一実施形態において、大きさが１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍの第１のナノマトリックスは、デキストランのポリマーの可動性マトリックスからなり、この可動性マトリックスに１種の物質、例えば抗ＣＤ３ｍＡｂが付着している。大きさが１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍの第２のナノマトリックスは、デキストランのポリマーの可動性マトリックスからなり、この可動性マトリックスに別の物質、例えば抗ＣＤ２８ｍＡｂが付着している。この場合、本発明のナノマトリックスは、少なくとも１種の第１の物質と１種の第２の物質とが別々の可動性マトリックスに付着しているナノマトリックスである。

これらのナノマトリックスの混合物をＴ細胞と接触させることにより、Ｔ細胞が活性化されて増殖が誘導される。

Ｔ細胞を刺激するためのナノマトリックスの精密な調整は、ナノマトリックスと細胞との比率が高い（通常、５００：１を超える）ために容易に行われる。

本発明の他の実施形態において、大きさが１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍのナノマトリックスは、デキストランのポリマーの可動性マトリックスからなり、この可動性マトリックスに１種の物質、例えば抗ＣＤ３ｍＡｂが付着している。この場合、本発明のナノマトリックスは、少なくとも１種の第１の物質が可動性マトリックスに付着しているナノマトリックスである。このナノマトリックスをＴ細胞と接触させることにより、Ｔ細胞が活性化されて増殖が誘導される。

第１の物質が付着したナノマトリックスにより誘導された活性化を最適化または維持するための可溶性物質として、第２の、またはそれより多く（複数）の共刺激物質、例えば抗ＣＤ２８ｍＡｂを添加してもよい。

本発明の他の実施形態において、大きさが１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍのナノマトリックスは、デキストランのポリマーの可動性マトリックスからなり、この可動性マトリックスに、細胞に活性化シグナルを供給する２種の物質、例えば抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂが付着している。この場合、本発明のナノマトリックスは、少なくとも１種の第１の物質と１種の第２の物質とが同じ柔軟なマトリックスに付着しているナノマトリックスである。

この種のナノマトリックスをＴ細胞と接触させることにより、Ｔ細胞が活性化されて増殖が誘導される。

本発明の他の実施形態において、大きさが１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍのナノマトリックスは、デキストランのポリマーの可動性マトリックスからなり、この可動性マトリックスに、例えば抗ＣＤ３ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８ｍＡｂ、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１３７または他の公知の共刺激分子などの細胞に活性化シグナルを供給する複数種の物質が付着している。この場合、本発明のナノマトリックスは、少なくとも１種の第１の物質と複数種の他の物質とが同じ可動性マトリックスに付着しているナノマトリックスである。

この種のナノマトリックスをＴ細胞と接触させることにより、Ｔ細胞が活性化されて増殖が誘導される。

本発明の他の実施形態において、大きさが１〜５００ｎｍ、優先的には１０〜２００ｎｍのナノマトリックスは、デキストランポリマーの可動性マトリックスからなり、この可動性マトリックスに、例えば抗ＣＤ３ｍＡｂおよび／または抗ＣＤ２８ｍＡｂなどの細胞に活性化シグナルを供給する１種または複数の物質が付着している。加えて、ナノマトリックスは、ポリマーに埋め込まれた磁性、常磁性または超常磁性ナノ結晶を有する。

ナノマトリックスをＴ細胞と接触させることにより、Ｔ細胞が活性化されて増殖が誘導される。場合により、Ｔ細胞を刺激した後、未結合の磁性、常磁性または超常磁性ナノマトリックスを磁場勾配を適用することにより除去してもよい。あるいは、磁性ナノマトリックスで標識したＴ細胞を磁場勾配、特に高勾配磁場を適用することにより分離して、続いて精製Ｔ細胞を増殖させてもよい。

ナノマトリックスは細胞の機能の変更に関して生物学的に不活性であるという特性を有するために、Ｔ細胞集団を活性化および増殖した後に必ずしもナノマトリックスを除去する必要はないが、場合により、細胞または細胞培養物からナノマトリックスを洗い落とすのに十分な程度の穏やかな洗浄条件でナノマトリックスを除去してもよい。ナノマトリックスは、繰り返しの洗浄工程により、Ｔ細胞活性化の閾値未満の有効な濃度に容易に希釈できる。この任意の除去工程は、ナノマトリックスの大きさが小さいために、最先端技術において周知のビーズまたはマイクロスフェアを用いる場合よりもナノマトリックスを用いることでかなり簡単に行われる。ナノマトリックスが、ポリマーに埋め込まれた磁性、常磁性または超常磁性ナノ結晶を有する場合、場合により、除去工程は、細胞／ナノマトリックス混合物に磁場勾配を適用することによって行ってもよい。

本発明の方法は、感染症または癌の処置に使用するために選択されたＴ細胞集団を増殖させるのに使用できる。結果得られたＴ細胞集団は、遺伝学的に形質導入して免疫療法に使用してもよいし、または例えばＨＩＶなどの感染因子のインビトロでの分析に使用してもよい。例えばＨＩＶに感染した個体または患者から得られたＣＤ４＋細胞集団の増殖を達成し、細胞を例えばＨＩＶ感染に対して耐性を付与することもできる。Ｔ細胞集団を十分な数に増殖させた後、増殖したＴ細胞を個体または患者に再注入する。同様に、腫瘍浸潤リンパ球の集団を癌に罹患した個体から得て、Ｔ細胞を刺激して十分な数まで増殖させて、個体を回復させることもできる。加えて、本発明の方法に従って増殖させたＴ細胞の培養上清はサイトカイン豊富な源であり、インビボまたはエクスビボでＴ細胞を維持するのに使用できる。

本発明の他の実施形態において、前述したいずれかの実施形態で説明されているようなナノマトリックスは、密閉された細胞培養システムで、例えばＷＯ２００９０７２００３に記載のサンプル処理システムまたは細胞培養バッグ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂａｘｔｅｒ、ＣｅｌｌＧｅｎｉｃｓ）、Ｇ−Ｒｅｘデバイス（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）、ＷＡＶＥバイオリアクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｑｕａｎｔｕｍ細胞拡張システム（Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ）で使用できる。ナノマトリックスは、このような密閉された細胞培養システムに対して最適な連結性を有し、容易に滅菌濾過されて、密閉された細胞培養システムに統合することが可能である。本明細書で説明されているように刺激（および増殖）プロセス後にナノマトリックスを除去する必要がないために、ナノマトリックスは、密閉された細胞培養システムのプロセス、すなわちＴ細胞または他の標的細胞の刺激）を容易にする。ナノマトリックスは、Ｔ細胞数ではなく培養物の体積に基づき添加できる。培養物の体積は、秤またはカメラシステムによって（例えばＷＯ２００９０７２００３に記載のサンプル処理システムで）査定できる。例えばＷＯ２００９０７２００３に記載のサンプル処理システムなどの密閉された細胞培養システム内で本発明の方法を使用すれば、（操作員によるより安全でより迅速な操作のために）例えば他の真核細胞、細菌またはウイルスなどの汚染物質の危険が低下するので、刺激されたＴ細胞の医薬組成物を生産する安全で簡単な方法がもたらされる。

本発明の他の実施形態において、ナノマトリックスの使用によるＴ細胞の培養は、磁場内で行われる。この実施形態において、ナノマトリックスは、可動性マトリックスに埋め込まれた超常磁性のコアからなる。磁場を適用すると、ナノマトリックス中で磁力が誘導されることから、リガンドによって誘発される活性化Ｔ細胞受容体を増殖誘導の改善のために濃縮できる。磁場内でのＴ細胞の培養は、（例えばＷＯ２００９０７２００３に記載の）強磁性マトリックスからなるカラム中で、または強い永続磁石と近接させたバッグ、フラスコもしくはチャンバー中で行うことができる。

本発明は、刺激される可能性がある細胞表面部分を有するあらゆる細胞型に広く適用できる。これに関して、多くの細胞シグナル伝達事象を本発明の方法で強化できる。このような方法論をエクスビボの設定で治療的に使用して、患者に注入するための細胞を活性化して刺激してもよいし、またはインビボで使用して、標的細胞集団で細胞シグナル伝達イベントを誘導してもよい。本方法の標的細胞は、優先的にはＴ細胞であるが、これに限定されることは全くない。

本発明によってＴ細胞を刺激する前に、Ｔ細胞を、直接同定および／もしくは分離してもよいし、または血液、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、体内組織、もしくは組織液からの細胞から単離してもよい。細胞は、通常、例えばヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物から、ただし特にヒトから、好ましくは検査対象および／または患者からの細胞サンプルから同定および／または分離される。分離は、当技術分野において周知のソーティング方法で行われる。このような方法としては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、または当技術分野において公知の他のあらゆる抗体依存性の分離技術が挙げられる。当技術分野において公知のあらゆるリガンド依存性の分離技術が、細胞の物理的特性に頼るポジティブおよびネガティブ分離技術の両方と共に使用できる。特に有力なソーティング技術は、磁気細胞ソーティングである。細胞を磁気的に分離する方法は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｅｌｌｐｒｏ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから市販されている。Ｔ細胞と、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、または例えば血液もしくは白血球分離物などの血液学的細胞サンプルの一部である他の細胞などの他の細胞との混合物に加えて、高度に精製したＴ細胞集団を本発明による接触に使用してもよく、このようなＴ細胞集団としては、例えば、Ｔ細胞の部分集団、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、γ／δＴ細胞、α／βＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋および／またはＣＤ６２Ｌ＋）またはセントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５Ｒ０＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５Ｒ０＋ＣＣＲ７−）またはターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）などが挙げられる。ナノマトリックスは、Ｔ細胞受容体に十分な架橋形成活性を付与するため、例えば単球または樹状細胞などのＦｃ−受容体発現細胞を介した追加の架橋形成は、活性化に必要ではない。

例えば本発明の開示により得られたＴ細胞集団などの標的細胞集団は、単独で投与してもよいし、または希釈剤、および／もしくは例えばＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与してもよい。簡単に言えば、本発明の開示の医薬組成物は、本明細書で説明されるような標的細胞集団を、１種または複数の薬学的または生理学的に許容されるキャリアー、希釈剤または添加剤と組み合わせて含んでいてもよい。医薬組成物は、ａ）Ｔ細胞集団であって、前記Ｔ細胞が本発明に従って治療的に有効な量に増殖されている、Ｔ細胞集団；およびｂ）１種または複数の薬学的または生理学的に許容されるキャリアー、希釈剤または添加剤を含んでいてもよい。このような組成物は、少量のナノマトリックスを含有していてもよく、このようなナノマトリックスは、細胞の機能の変更に関して生物学的に不活性であるが生分解性であってもよく、さらにヒトに対して非毒性および非抗原性である。本発明の開示の組成物は、好ましくは静脈内投与用に製剤化される。

本発明の開示の医薬組成物は、処置（または予防）しようとする疾患に適した方式で投与できる。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度のような要素によって決定されると予想されるが、適切な使用量は、臨床試験によって決定してもよい。

実施例１：ナノマトリックスの調製
ＭｏｌｄａｙおよびＭａｃＫｅｎｚｉｅの手順を改変することによって磁性ナノマトリックスを生産した。１０グラムのデキストランＴ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、１．５ｇのＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、および０．６４ｇのＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏを２０ｍｌのＨ_２Ｏに溶解させ、４０℃に加熱する。かきまぜながら、１０ｍｌの４Ｎ ＮａＯＨをゆっくり添加し、この溶液を７０℃で５分加熱する。粒子懸濁液を酢酸で中和する。凝集物を除去するために、懸濁液を２，０００ｇで１０分間遠心分離し、孔サイズが０．２２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）で濾過する。未結合のデキストランを高勾配磁場（ＨＧＭＦ）で洗浄することによって除去する。以下で説明したように作製され、約０．６テスラ（ＭＡＣＳ永続磁石、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の磁場に置かれたスチールウールカラムで、磁性ナノマトリックスのＨＧＭＦ洗浄を行う。１０ミリリットルのナノマトリックス懸濁液を、２ｇのスチールウールの１５×４０ｍｍのカラムに適用する。ローディングしたカラムを３０ｍｌの０．０５Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄する。外部の磁場からカラムを取り出した後、磁性ナノマトリックスを０．０５Ｍ酢酸ナトリウムで溶出させる。ナノマトリックスは茶色の懸濁液を形成する。相対的な粒子濃度は、４５０ｎｍでの光学密度として示される。ナノマトリックスの大きさを電子顕微鏡法および動的光散乱法によって測定したところ、３０±２０ｎｍ（電磁場）および６５±２０ｎｍ（ＤＬＳ）であった。コロイド状溶液中のマトリックスのデキストラン含量および磁鉄鉱含量を決定したところ、それぞれ約３．５ｍｇ／ｍｌおよび４．８ｍｇ／ｍｌの範囲であり、これらはおよそ４０：６０（ｗ／ｗ）の比率であった。ピクノメータによって決定された乾燥ナノマトリックスの密度が２．５ｇ／ｍＬであったことと、デキストランおよび磁鉄鉱の公知の密度がそれぞれ１．６ｇ／ｍｌおよび５．２ｇ／ｍｌであることに基づいてデキストラン体積を計算したところ、乾燥ナノマトリックスについて、約７０％であることが計算できる。磁化率の測定によって決定されるように、ナノマトリックスは超常磁性の挙動を示す。捕獲されたフェライトの微結晶の大きさを磁気測定により決定したところ、およそ１０ｎｍであった。

ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３）およびＣＤ２８抗体（クローン１５Ｅ８）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準的なバイオコンジュゲーション化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、２００８年にＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．により公開）によって同じまたは別々のナノマトリックスにコンジュゲートした。

実施例２：ＣＤ３／ＣＤ２８ＭＡＣＳｉＢｅａｄと比較した、様々なＣＤ３／ＣＤ２８濃度および比率でナノマトリックスを使用したＴ細胞の増殖
高度に精製したＴ細胞を活性化するための現状で最先端の試薬は、細胞培養皿の表面または大きい細胞大の（４〜５μｍ）粒子のいずれかの上に固定されたＣＤ３／ＣＤ２８に対する抗体を活性化することを含む。どちらの技術も間違いを起こしやすく、特にＧＭＰに適合する生産条件下で理解し標準化することが技術的に難しい。それに対してナノマトリックスは、容易に調製でき、ＧＭＰ条件下での細胞培養にうまく使用できる。それゆえに本発明者らは、様々なＣＤ３／ＣＤ２８の濃度および比率でＣＤ３／ＣＤ２８がコーティングされたナノマトリックスの増殖能を、市販の細胞刺激ビーズ（ＭＡＣＳｉＢｅａｄ、直径４．５μｍ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）と共に分析することによりＴ細胞活性化能を比較した。図１で示されるように、架橋形成をもたらすアクセサリー細胞の存在下で可溶性ＣＤ３／ＣＤ２８にも典型的に使用される極めて低いＣＤ３濃度（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）でさえも、ナノマトリックスはＴ細胞を効率的に増殖させる。抗体濃度以外にＣＤ３／ＣＤ２８の比率も細胞活性化に影響を与えることができ、Ｔ細胞培養を最適化する追加の手段を提供する。最適な使用量（２０〜３００ｎｇ／ｍｌ）での増殖は、標準的な試薬（ＭＡＣＳｉＢｅａｄ）と同等かまたはそれよりも優れていた。より高い使用量では、高すぎる程度のＴＣＲ刺激で起こる公知の現象であるＴ細胞の過剰刺激（活性化により誘導された細胞死）のために、増殖が低下した。総合すると、これらの結果から、ＣＤ３／ＣＤ２８がコーティングされたナノマトリックスは、極めて低い抗体濃度で、且つ追加の架橋形成を必要としなくても効率的にＴ細胞を活性化し増殖させ得ることが示される。

実施例３：ナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ３／ＣＤ２８と、２００ｎｍおよび３００ｎｍの固体粒子との比較
上記の概略のように、Ｔ細胞の活性化に現在利用可能な試薬は２つのグループに分けることができる。例えばＣＤ３およびＣＤ２８に対する可溶性抗体での刺激は、細胞培養皿表面上に固定するか、またはアクセサリー細胞の受容体、例えば免疫グロブリンＦｃ−受容体を介して固定するかのいずれかを必要とする。Ｔ細胞活性化に使用するための、例えばアクセサリー細胞の非存在下で高度に精製したＴ細胞を刺激するための余分な架橋形成工程に依存しない試薬は、刺激性のＣＤ３およびＣＤ２８抗体でコーティングされた細胞大の粒子（直径４〜５μｍ）をベースとする。約１μｍの臨界直径未満の固体粒子は、Ｔ細胞を適切に増殖させるのに好適ではないことが知られている。ＣＤ３／ＣＤ２８がコーティングされたナノマトリックス（直径５０〜２００ｎｍ）の独特な活性化能力を示すために、本発明者らは、それらの活性化能力を、類似の大きさを有する固体粒子（２００ｎｍ、および３００ｎｍ）および細胞大の粒子（直径４．５μｍ）と比較した。通常小さい固体粒子はＴ細胞の増殖を起こさないため、本発明者らは、Ｔ細胞活性化の高感度のふるいを付与するために、初期のＴ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５のアップレギュレーション、およびＣＤ３発現の損失）を分析した。ＣＤ２５は、Ｔ細胞の刺激後の最初の２４〜４８時間以内にアップレギュレートされる。ＴＣＲによって誘導されたＣＤ２５のアップレギュレーションはさらにＩＬ−２によって維持されるため、本発明者らは培養条件にＩＬ−２も添加してアッセイ感度を最大にした。それとは別のＴＣＲ刺激による直接の結果はＴ細胞受容体のダウンレギュレーションであり、これは、細胞表面でのＣＤ３発現の損失により分析できる。ＣＤ３／ＣＤ２８がコーティングされたナノマトリックス（１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ３）、またはいずれもＣＤ３およびＣＤ２８抗体が共有結合でコーティングされた直径４．５μｍを有する固体粒子（ＭＡＣＳｉＢｅａｄ）もしくは直径２００ｎｍを有する固体粒子（Ａｄｅｍｔｅｃｈビーズ）と共に高度に精製したＴ細胞を培養した。ＭＡＣＳｉＢｅａｄを最適な１：１の比率で使用し、それに対して２００ｎｍの粒子の適正量を決定して、ＣＤ３が２５〜３０００ｎｇ／ｍｌの範囲のＣＤ３およびＣＤ２８の活性な用量を達成した。３日目と５日目にＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合を測定し、３日目にＣＤ３の発現強度を測定した。

図２Ａ、Ｂ、およびＣで示されるように、細胞大のＭＡＣＳｉＢｅａｄの場合と類似のレベルで生じたＣＤ２５のアップレギュレーション［図２Ｂ（３日目）、図２Ｃ（５日目）］およびＣＤ３のダウンレギュレーション（図２Ａ）で示されたように、ナノマトリックスは最適な用量（１００ｎｇ／ｍｌ）で強い活性化を引き起こした。それとは極めて対照的に、２００ｎｍの固体粒子では、それより３０倍高いＣＤ３／ＣＤ２８濃度でもＣＤ２５のアップレギュレーションは観察されず、ＣＤ３のダウンレギュレーションもほとんど観察されなかった。５日目でも、２００ｎｍの固体粒子は、ナノマトリックスと同等のレベルまでＣＤ２５発現を誘導できなかった。（ナノマトリックスの場合よりも５〜３０倍高い）高濃度でのみ、わずかなアップレギュレーションがみられ、ナノマトリックスのレベルの約５０〜７０％に達したことが観察された。

これらのデータから、可動性ナノマトリックスは実際に、大きさが小さいにもかかわらず、固体表面を有する同じような大きさの粒子と比較した場合に独特なＴ細胞の活性化能を有することが示される。また適正量決定実験からも、ＣＤ３／ＣＤ２８がコーティングされた大きさが２００〜３００ｎｍの固体粒子による活性化の欠如は、より高い用量の粒子を用いることだけでは補えないが、明らかにナノマトリックスにより誘導された活性化シグナルの質が異なっていることが示される。

実施例４：精製されたＴ細胞サブセットの増殖
上記で示したように、様々なＴ細胞サブセットは、異なる活性化要件を有する可能性がある。特にナイーブＴ細胞は、アクセサリー細胞の非存在下で活性化することが難しい。さらにＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、単独で活性化されるかまたは追加の細胞型の存在下で活性化される場合、異なる要件を有する可能性がある。ナノマトリックスによって全てのＴ細胞サブセットが同等によく増殖できることを示すために、本発明者らは、指定された用量および組成でのナノマトリックスまたはＭＡＣＳｉＢｅａｄのいずれかを用いて精製されたＣＤ４およびＣＤ８ナイーブＴ細胞、総ナイーブＴ細胞または総Ｔ細胞を活性化し、それらの増殖を比較した。図３で示されるように、ナノマトリックスによって、且つ標準的なＭＡＣＳｉＢｅａｄ培養物に匹敵するレベルで全てのサブセットが効率的に増殖できる。

実施例５：ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖
Ｔｒｅｇは、移植、自己免疫、および慢性炎症の治療用途に関して特に注目されているものであるが、Ｔｒｅｇは、インビトロで調節活性、すなわちＦｏｘｐ３発現を損なうことなく増殖することが難しい。それゆえに本発明者らは、ナノマトリックスを使用して、様々なドナーからＣＤ２５によって選択されたＴｒｅｇ細胞（Ｆｏｘｐ３純度は典型的には６０〜９０％）が増殖できるかどうかも分析した。従来のＴ細胞と比較したＴｒｅｇの増殖を維持するために、十分説明されている従来のＴ細胞増殖阻害薬物であるラパマイシン１００ｎＭの存在下で増殖を行った。図４で示されるように、１４日間培養した後、１０〜２０時間（ラパマイシンなし）または５〜１０時間（ラパマイシンあり）でＴｒｅｇを増殖させることができる。前に説明したように、ラパマイシンなしでは、Ｆｏｘｐ３純度は高度に変動したが（１０〜７５％）、それに対してラパマイシンの存在下では純度は常に＞５０％であった。

総合すると、これらの結果から、ナノマトリックスは、培養物中でＴｒｅｇを活性化し増殖させることにも使用できることが示される。

実施例６：同じナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ３／ＣＤ２８によるＴ細胞活性化と、別々のナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ３およびＣＤ２８によるＴ細胞活性化の比較
ＣＤ３およびＣＤ２８ベースのＴ細胞活性化試薬の様々な適用において、最適な活性化のためには、両方の抗体が同じ表面上に固定されるべきであることを説明する。それゆえに本発明者らは、このことがナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ３およびＣＤ２８にも必要であるかどうかも検査した。本発明者らは、ＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックスによって活性化された精製ナイーブＴ細胞の増殖と、異なる比率／濃度で混合されたＣＤ３ナノマトリックス＋ＣＤ２８ナノマトリックスによって活性化された精製ナイーブＴ細胞の増殖とを比較した。増殖（５日目）および細胞分裂（７日目）をＶｉｏｌｅｔｙｅ希釈で測定することにより分析した。図５Ａ、Ｂで示されるように、ＣＤ３ナノマトリックス単独での刺激は有意な増殖を誘導せず、ほんのわずかな細胞分裂しか観察できなかったが、これは共刺激シグナル依存性のナイーブＴ細胞に関して予想された通りである。しかしながら、ＣＤ２８ナノマトリックスの添加は、１０〜５０ｎｇ／ｍｌですでに完全な細胞分裂活性を誘導し、さらにはＴ細胞数の拡張も誘導し、これはＣＤ３／ＣＤ２８対照ナノマトリックスまたは標準的なＭＡＣＳｉＢｅａｄと類似していた。これらのデータから明らかに、両方の抗体を別々のナノマトリックスにコンジュゲートして、それ以降に最適化された使用のために混合してもよいことが示される。それにより、単一のナノマトリックスの生産プロセスおよび品質管理が容易になり、試薬の柔軟性が改善され、例えば、様々なＣＤ３およびＣＤ２８の濃度および比率の適正値を決定すること（精密な調整）によって特殊化したＴ細胞サブセットの活性化状態の最適化が容易になる。

実施例７：ナノマトリックスへの可溶性ＣＤ３またはＣＤ２８のコンジュゲーションの作用
ＣＤ３および／またはＣＤ２８がコーティングされたナノマトリックスを使用した場合と類似の結果がそれぞれの可溶性抗体の使用によって達成できるという可能性を除外するために、本発明者らは、ナノマトリックスをコーティングしたＣＤ３またはＣＤ２８の刺激作用と可溶性抗体との刺激作用を様々な濃度で比較して、マトリックスへの抗体のコンジュゲーションは、実際に優れたＴ細胞活性化を得るための重要な工程であることを実証した。全ての培養物にＩＬ−２を添加した。図６Ａで示されるように、可溶性ＣＤ３単独では、広範な濃度範囲にわたり（１０〜１００００ｎｇ／ｍｌ）ナイーブＴ細胞中の初期の活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の有意なアップレギュレーションを全く誘導しなかったが、それに対してＣＤ３がコーティングされたナノマトリックス（１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ３）は細胞の２０〜６０％においてＣＤ２５／ＣＤ６９発現を誘導した。共刺激因子として飽和量（２００ｎｇ／ｍｌ）の可溶性ＣＤ２８の存在下で（図６Ｂ）、可溶性ＣＤ３も、最大の検査用量（１００〜１００００ｎｇ／ｍｌ）で細胞の約２０〜４０％においてＣＤ２５／ＣＤ６９発現を誘導した。それに対してＣＤ３がコーティングされたナノマトリックス（１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ３）は、細胞の４０〜７０％においてＣＤ２５／ＣＤ６９発現を誘導した。

本発明者らはさらに、ナノマトリックスへのＣＤ２８抗体のコンジュゲーションの作用も検査した。共刺激の作用は、最適以下のＣＤ３刺激下で最もよく可視化されることから、本発明者らは、可溶性ＣＤ３の存在下で、可溶性ＣＤ２８またはナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ２８のいずれかのナイーブＴ細胞の培養物に対する適正量を決定した。図６Ｃで示されるように、上記で示したようにＣＤ２５／ＣＤ６９の誘導と類似する可溶性ＣＤ３単独では、ナイーブＴ細胞の増殖を全く誘導しなかった。しかしながら可溶性ＣＤ２８の存在下では２〜６倍の増殖を検出できたが、ＣＤ２８の最大の検査用量（１００００ｎｇ／ｍｌ）においてのみであった。それに対して、ナノマトリックスにコンジュゲートしたＣＤ２８は、その１０００分の１未満の濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）ですでに同程度の増殖を誘導した。これらのデータからも、可溶性抗体と比べてナノマトリックスの強い架橋形成およびＴ細胞活性化能が示され、これが、可溶性抗体とは対照的に、ＣＤ３ＣＤ２８がコンジュゲートしたナノマトリックスがインビトロのナイーブヒトＴ細胞でさえも活性化および増殖に使用できる理由の説明である。

実施例８：ナノマトリックスは、ウイルストランスダクションによるＴＣＲ遺伝子導入のためにＴ細胞を活性化するのに使用できる
Ｔ細胞、特に精製された細胞サブセットを活性化し増殖させるための１つの重要な用途は、例えば腫瘍抗原に特異性を有する所定の抗原受容体を導入するためにそれらを遺伝子操作することである。本発明者らは、ナノマトリックスを使用して精製ナイーブ（Ｔ_Ｎ、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（Ｔ_ＣＭ、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−）、およびエフェクター（Ｔ_ＥＭ、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−）Ｔ細胞を活性化し、腫瘍抗原であるＭＡＲＴ−１に特異的なＴＣＲを発現するレトロウイルスベクターを使用してそれらを形質導入した。これらのＴ細胞サブセットにおけるトランスジーン発現の相対的な割合を検査するために、本発明者らはＭＨＣペプチドクラスＩ四量体染色を行った。本発明者らが検査した刺激条件とは無関係に、全てのＴ細胞サブセットが効率的に形質導入される（＞５０％）（図７）。また本発明者らは、インビトロでの形質導入されたＴ細胞の増殖も比較した。図８で示されるように、１０日後、本発明者らは、全ての条件下で３種のサブセットの増殖に関して差がないことを観察した。単離されたＴ細胞サブセットに関する全ての活性化レジメンは、可溶性ＣＤ３での総ＰＢＭＣの「標準的な」刺激（この標準値に全ての値を標準化して、異なるドナー間のより優れた比較を可能にした）に等しいか、またはそれより優れていた。本発明者らは、Ｔ細胞サブセットがＭＡＣＳｉＢｅａｄまたはナノマトリックスで刺激される場合、コーティングされたαＣＤ３＋αＣＤ２８と比較してより優れた増殖を示す傾向（統計学的に有意ではない）を観察した。本発明者らはさらに、導入されたＭＡＲＴ−１ ＴＣＲの機能的な活性と、ＭＡＲＴ−１＋ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞系での再刺激の際に表面マーカーおよびサイトカイン生産で観察される形質導入された細胞の分化状態とを調査した。図９で示されるように、ナノマトリックスで、およびＭＡＣＳｉＢｅａｄで刺激されたＴ_ＣＭおよびＴ_Ｎ細胞は、末梢リンパ節へのＴ細胞の移動を容易にする２種の分子であるＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７のより高い発現を示すようである。この能力は、インビボにおいて移行したＴ細胞の長期の持続性および機能的な活性を促進するために有益とみなされ、治療効果を高めると考えられる。全ての刺激条件下で、ＭＡＲＴ−１反応性ＩＦＮγ^＋細胞のパーセンテージは、Ｔ_Ｎと比較してＴ_ＣＭおよびＴ_ＥＭＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットでより高い傾向があるが、これは統計学的に有意ではなかった（図１０の上のパネル）。ＩＬ−２生産に的を絞って（図１０の中央のパネル）、本発明者らは、Ｔ_Ｎ細胞がＭＡＣＳｉＢｅａｄ／ナノマトリックスで刺激されると、コーティングしたαＣＤ３＋αＣＤ２８の刺激と比較してより高いパーセンテージのＴ_Ｎ細胞がＩＬ−２を生産することを観察した。ＭＡＣＳｉＢｅａｄで刺激した場合、同じことが、Ｔ_Ｎサブセットで検出されたＴＮＦα産生細胞にも当てはまる（図１０の下のパネル）。これらの結果から、ビーズで刺激されたＴ_Ｎから誘導された細胞の細胞は、エフェクター細胞分化を減少させることが示され、すなわちこれは、最終分化にあまり進行しなかったことを示唆している。

総合すると、結果から、ＣＤ３／ＣＤ２８ナノマトリックスは、精製されたＴ細胞サブセットを活性化して形質導入し、例えば腫瘍治療のための完全な機能を有するＴ細胞の移植組織を生成するのに効率的に使用できることが示される。

Claims (14)

1. インビトロにおけるＴ細胞のポリクローナル刺激のためのナノマトリックスの使用であって、ナノマトリックスは、
   ａ）非固体表面を有する可動性ポリマー鎖のマトリックスを含み、
   ｂ）前記可動性ポリマー鎖のマトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナルを供給する１種または複数の刺激性物質を付着させており；
   ナノマトリックスは１〜５００ｎｍの大きさであり、可動性ポリマー鎖のマトリックスはセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸及びアルギネートからなる群から選ばれる多糖類である、使用。
2. インビトロでのＴ細胞のポリクローナル刺激方法であって、Ｔ細胞集団をナノマトリックスと接触させることを含み、ナノマトリックスは、
   ａ）非固体表面を有する可動性ポリマー鎖のマトリックスを含み、
   ｂ）前記可動性ポリマー鎖のマトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナルを供給することによりＴ細胞を活性化して増殖を誘導する１種または複数の刺激性物質を付着させており；
   ナノマトリックスは１〜５００ｎｍの大きさであり、可動性ポリマー鎖のマトリックスはセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸及びアルギネートからなる群から選ばれる多糖類である、方法。
3. 少なくとも１種の第１の刺激性物質と１種の第２の刺激性物質とが、同じ可動性ポリマー鎖のマトリックスに付着している、請求項２に記載の方法。
4. 少なくとも１種の第１の刺激性物質と１種の第２の刺激性物質とが、別々の可動性ポリマー鎖のマトリックスに付着している、請求項２に記載の方法。
5. ナノマトリックスと細胞との比率が５００：１を超えることにより、Ｔ細胞の刺激が精密に調整される、請求項４に記載の方法。
6. １種の刺激性物質が抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 第２の刺激性物質が抗ＣＤ２８抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 可動性ポリマー鎖のマトリックスがデキストランのポリマーからなる、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ナノマトリックスが可動性ポリマー鎖のマトリックスに埋め込まれた磁性、常磁性または超常磁性ナノ結晶を有する、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 刺激性物質がナノマトリックス１ｍｇあたり２５μｇを超える高密度で付着している、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 刺激されたＴ細胞がＴｒｅｇ細胞である、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 密閉された細胞培養システムでのＴ細胞のポリクローナル刺激方法であって、前記密閉された細胞培養システム内のＴ細胞集団を含む細胞培養物を使用量のナノマトリックスと接触させることを含み、ナノマトリックスは、
    ａ）非固体表面を有する可動性ポリマー鎖のマトリックスを含み；
    ｂ）前記可動性ポリマー鎖のマトリックスに、Ｔ細胞に活性化シグナルを供給する１種または複数の刺激性物質を付着させており；
    ナノマトリックスは１〜５００ｎｍの大きさであり、可動性ポリマー鎖のマトリックスはセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸及びアルギネートからなる群から選ばれる多糖類であり、
    前記使用量のナノマトリックスは前記密閉された細胞培養システムに無菌で適用され、
    前記使用量は前記密閉された細胞培養システム中の細胞培養物の体積に依存する、方法。
13. 前記細胞培養物の体積が無菌バリアに影響を与えることなく、秤またはカメラシステムによって測定できる、請求項１２に記載の方法。
14. 前記使用量の測定および適用が自動的に行われる、請求項１２または１３に記載の方法。