CN112773905B - 一种巨噬细胞背包系统及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巨噬细胞背包系统及其制备方法与应用。本发明的巨噬细胞背包系统的制备方法包括如下步骤:构建柔性纳米微粒,引入巨噬细胞特异性识别分子,得到可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒,将其与巨噬细胞共孵育,形成巨噬细胞背包系统。本发明的巨噬细胞背包系统制备方法简单,得到的巨噬细胞背包系统易于携带药物、疫苗、纳米治疗物质或者成像物质等,可实现针对炎症相关区域或肿瘤乏氧区等病灶的靶向输送。
Description
技术领域
本发明涉及纳米生物技术领域,特别涉及一种巨噬细胞背包系统及其制备方法与应用。
背景技术
巨噬细胞是机体免疫的重要组成部分,具有趋化性迁移、吞噬、抗原递呈和免疫调控等多种生物学功能,在病原体微生物、衰老和凋亡细胞的清除以及机体发育、体内平衡、损伤组织修复和免疫调控中发挥重要作用。
目前,基于巨噬细胞的治疗策略受到越来越多的关注,例如利用巨噬细胞趋化性迁移的功能,基因工程改造离体的巨噬细胞已被用于体内增强免疫治疗肿瘤模型。目前,巨噬细胞在治疗中的应用已发展到利用巨噬细胞作为小分子,质粒DNA等治疗剂的递送载体,巨噬细胞通过信号传导分子如趋化因子、细胞因子而迅速募集到患病部位,涉及广泛的病理状况,包括癌症、动脉粥样硬化、炎性疾病等。然而,将治疗性的纳米颗粒装载在巨噬细胞内降低了药物释放速率,并增加了药物降解的风险,大大限制了其治疗效果。将纳米颗粒附在巨噬细胞表面避免内化和影响巨噬细胞的功能已成为近年来巨噬细胞改造的研究热点。形成粘附在细胞表面的背包可以包载治疗或诊断材料,如小分子药物,蛋白质,纳米颗粒,或功能性聚合物,大大提高了药物生物利用度。通过微接触印刷技术逐层组装构建圆盘状的含细胞粘附层和载药层的背包可以牢牢的粘附在巨噬细胞表面,这是构建巨噬细胞背包最通用的方法之一,但制备过程复杂。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种巨噬细胞背包系统的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的巨噬细胞背包系统。
本发明的再一目的在于提供上述巨噬细胞背包系统的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种巨噬细胞背包系统的制备方法,包括如下步骤:
(1)构建柔性纳米微粒,引入巨噬细胞特异性识别分子,得到可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒;
(2)将步骤(1)得到的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒与巨噬细胞共孵育,得到巨噬细胞背包系统。
步骤(1)中所述的柔性纳米微粒由磷脂、胆固醇以及柔性增强剂制备得到,构建方法如下:将磷脂与胆固醇溶解并混匀,蒸干,获得脂质薄膜,经过柔性增强剂的水溶液水化,超声及挤出过膜,获得柔性纳米微粒的溶液。
所述的磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油和阳离子脂质体用磷脂(DOTAP)中的一种或几种。
所述的磷脂的用量为按其与所述的胆固醇的摩尔比为6~9:4~1配比计算。
所述的柔性增强剂为吐温、胆酸、脱氧胆酸盐和司盘中的一种或几种;优选为胆酸或脱氧胆酸。
所述的脱氧胆酸盐优选为脱氧胆酸钠。
所述的柔性增强剂的用量为按其与所述的磷脂的摩尔比为1:(1~40)配比计算。
所述的溶解采用的有机溶剂为甲醇、氯仿或乙醇中的一种或几种;
所述的有机溶剂的用量为适量。
所述的蒸干优选为采用旋转蒸发仪。
所述的超声功率为100W~1000W,时间为1~10min,处理至溶液清澈透明。
所述的超声优选为探头超声。
所述的挤出过膜的孔径为80nm~500nm。
步骤(1)中所述的巨噬细胞特异性识别分子为透明质酸、整联素关联蛋白CD47、磷酰丝氨酸、甘露糖、RGD肽中的一种。
所述的透明质酸的分子量优选为50~1000kDa。
步骤(1)中所述的引入巨噬细胞特异性识别分子是通过化学偶联或物理吸附的方式引入。
所述的物理吸附是通过将所述的柔性纳米微粒的溶液与巨噬细胞特异性识别分子共孵育,使巨噬细胞特异性识别分子通过静电吸附作用、疏水相互作用粘附在柔性纳米微粒表面。
所述的物理吸附中巨噬细胞特异性识别分子在体系中的浓度为0.01~0.5mg/mL。
所述的柔性纳米微粒在体系中的浓度为1~20mM。
所述的共孵育为室温下共孵育1~30min。
所述的室温是指25~30℃。
所述的化学偶联是通过化学反应接枝巨噬细胞特异性识别分子。
所述的化学反应接枝为混合后震荡1~10min。
所述的巨噬细胞特异性识别分子在体系中的浓度为0.01~0.1mg/mL。
所述的柔性纳米微粒在体系中的浓度为1~10mM。
步骤(2)中所述的共孵育的条件为在DMEM培养基中共孵育1~24h;优选为共孵育6h。
所述的DMEM培养基中含有体积比1%~5%的FBS。
所述的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒在体系中的浓度为0.1~2mM;优选为1mM。
所述的巨噬细胞体系中的浓度优选为5×105~106个/mL。
所述的巨噬细胞优选为骨髓巨噬细胞、肝巨噬细胞或RAW264.7细胞;更优选为骨髓巨噬细胞。
所述的巨噬细胞背包系统形成后清洗去除未结合的微粒。
所述的清洗为采用1×PBS清洗;优选为采用1×PBS清洗三次。
一种巨噬细胞背包系统,通过上述制备方法制备得到。
上述巨噬细胞背包系统在携带治疗物质或成像物质中的应用。
所述的治疗物质优选为药物、疫苗、纳米治疗物质。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
1、本发明的巨噬细胞背包系统易于携带药物、疫苗、纳米治疗物质或者成像物质等,可实现针对炎症相关区域或肿瘤乏氧区等病灶的靶向输送。
2、本发明的巨噬细胞背包系统制备方法简单。
附图说明
图1是实施例1-3得到的柔性纳米微粒的TEM图;其中,A是实施例1的柔性纳米微粒,B是实施例2的柔性纳米微粒,C是实施例3的非柔性纳米微粒。
图2是实施例4实验组和对照组的荧光信号值统计图。
图3为实施例5实验组和对照组的胞上分布图;其中标尺为10μm。
图4为实施例6实验组和对照组巨噬细胞背包系统在非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠中的分布图;其中,A为荧光信号在小鼠中的分布照片图,B为48h时各脏器中荧光信号图。
图5为实施例7实验组和对照组巨噬细胞背包系统携带N-乙酰半胱氨酸治疗的非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠中炎症因子表达情况统计图;其中,A为炎症因子TNF-α,B为IL-1β。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1柔性纳米微粒的制备
将5μmol的磷脂酰胆碱、3μmol的DOTAP和2μmol的胆固醇混合溶解在10mL有机溶剂中;所述有机溶剂为氯仿和乙醇,体积比为氯仿:乙醇=9:1,震荡混合均匀。经旋转蒸发仪蒸干有机溶剂(40℃,20min),得到脂质薄膜。用0.5mL 0.1mM的脱氧胆酸钠溶液将脂质薄膜水化,得到柔性纳米微粒浑浊液。使用探头超声仪超声1min,150W,直至溶液清澈透明。通过挤出仪使柔性纳米微粒的粒径均一化,保持在300nm左右。将柔性纳米微粒与0.1mg/mL的透明质酸(MW 100kDa)溶液等体积混合,震荡10min,通过凝胶色谱法分离多余的透明质酸,得到引入巨噬细胞特异性识别分子的柔性纳米微粒,其TEM形貌如图1A所示,测得粒径为304.72±2.71nm,测得杨氏模量为0.57±0.15kPa。
实施例2柔性纳米微粒的制备
将5μmol的磷脂酰胆碱、3μmol的DOTAP和2μmol的胆固醇混合溶解在10mL有机溶剂中;所述有机溶剂为氯仿和乙醇,体积比为氯仿:乙醇=9:1,震荡混合均匀。经旋转蒸发仪蒸干有机溶剂(40℃,20min),得到脂质薄膜。用0.5mL含0.1mM的脱氧胆酸钠溶液将脂质薄膜水化,得到柔性纳米微粒浑浊液。使用探头超声仪超声10min,400W,直至溶液清澈透明。通过挤出仪使柔性纳米微粒的粒径均一化,保持在60nm左右。将柔性纳米微粒与0.1mg/mL的透明质酸溶液等体积混合,震荡10min,通过凝胶色谱法分离多余的透明质酸。得到的柔性纳米微粒TEM形貌如图1B所示,测得粒径为61.28±0.09nm,测得杨氏模量为1.13±0.41kPa。
实施例3非柔性纳米微粒的制备
将5μmol的磷脂酰胆碱、3μmol的DOTAP和2μmol的胆固醇混合溶解在10mL有机溶剂中;所述有机溶剂为氯仿和乙醇,体积比为氯仿:乙醇=9:1,将溶液震荡混合均匀。经旋转蒸发仪蒸干有机溶剂(40℃,20min),得到脂质薄膜。用0.5mL不含0.1mM的脱氧胆酸的生理盐水将脂质薄膜水化,使非柔性纳米微粒的最终浓度为20mM。使用探头超声仪超声1min,150W,直至溶液清澈透明。通过挤出仪使非柔性纳米微粒的粒径均一化,保持在300nm左右。将柔性纳米微粒与0.1mg/mL的透明质酸溶液等体积混合,震荡10min,通过凝胶色谱法分离多余的透明质酸。得到的非柔性纳米微粒TEM形貌如图1C所示,测得粒径为305.15±8.26nm,测得杨氏模量为124.11±10.98kPa。
实施例4柔性纳米微粒的胞内命运
实验组:计数的RAW264.7细胞至细胞培养板中,培养至细胞贴壁。用体系中总脂质浓度为1mM的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒(实施例1制备,~300nm)与RAW264.7细胞(体系中的浓度为5×105个/mL)在1%(v/v)FBS的DMEM培养基中共孵育6h,形成巨噬细胞背包系统。更换培养基后继续培养48h,通过多功能酶标仪对各孔的荧光强度在不同时间段分别进行定量。巨噬细胞背包系统用60μM的DHPE磷脂荧光素进行标记。
对照组1:选取总脂质浓度0.05mM的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒与RAW264.7细胞共孵育,其他步骤与实验组完全相同;
对照组2:选取可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒与RAW264.7细胞共孵育0.5h,其他步骤与实验组完全相同;
对照组2:选取总脂质浓度1mM的非柔性纳米微粒(实施例3制备),其他操作条件与实验组完全相同;
对照组3:选取总脂质浓度1mM的60nm粒径的柔性纳米微粒(实施例2制备),其他操作条件与实验组完全相同。
跟踪细胞上的荧光信号如图2所示,1mM总脂质浓度、粒径为300nm左右的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒与RAW264.7细胞共孵育6h能持续检测到胞内的荧光信号,长达48h;而其他条件下,可被巨噬细胞特异性识别的纳米微粒与RAW264.7细胞共孵育,胞内荧光信号随时间逐渐减弱,48h时几乎检测不到荧光信号。
实施例5柔性纳米微粒结合在巨噬细胞表面
实验组:计数的RAW264.7细胞至培养皿中,培养至细胞贴壁。用体系中总脂质浓度为1mM的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒(实施例1制备,~300nm)与RAW264.7细胞(体系中的浓度为5×105个/mL)在1%(v/v)FBS的DMEM培养基中共孵育6h,使可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒结合到巨噬细胞,形成背包系统。
对照组:选取实施例3制备的非柔性纳米微粒及实施例2制备的粒径60nm的柔性纳米微粒分别与RAW264.7细胞相互作用,操作条件与实验组完全相同。
得到的巨噬细胞背包系统48h的胞上分布图如图3所示(标尺为10μm),300nm的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒主要结合在细胞表面。清洗过后,可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒持续结合在巨噬细胞表面,保持长达48h的信号。同样的实验条件,300nm的非柔性纳米微粒和60nm的柔性纳米微粒无法持续的结合在巨噬细胞表面。
实施例6巨噬细胞背包系统在非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠的分布实验组:C57BL/J6小鼠(南方医科大学实验动物中心),分别给予2周的高脂高糖饮食(HFD),构建非酒精性脂肪性肝炎模型。通过尾静脉注射100μL浓度为106个/mL的巨噬细胞背包系统(实施例4实验组柔性纳米微粒与巨噬细胞共孵育形成的巨噬细胞背包系统),分别于注射后1h或48h进行活体成像拍照。
对照组:选取实施例4对照组2制备的巨噬细胞背包系统注射进模型小鼠,其他操作条件与实验组完全相同。
活体成像结果如图4所示,48h后柔性的背包系统明显富集到肝脏和脾脏部位,并保持持续较强的荧光信号。同样的实验条件非柔性纳米微粒的巨噬细胞背包系统荧光信号明显减弱。
实施例7巨噬细胞背包系统携带N-乙酰半胱氨酸治疗非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠的应用
实验组:C57BL/J6小鼠分别给予2周的高脂高糖饮食(HFD)构建非酒精性脂肪性肝炎模型。N-乙酰半胱氨酸与柔性纳米微粒溶液(pH=10)室温孵育2h制备携带N-乙酰半胱氨酸柔性纳米微粒,超滤离心分离多余的药物,分光光度法测得包封率约为80%,将携带N-乙酰半胱氨酸柔性纳米微粒与巨噬细胞共孵育形成巨噬细胞背包系统(方法参考实施例4)。通过尾静脉注射100μL浓度为106个/mL的巨噬细胞背包系统,并于48h后处死小鼠,收集血清,通过TNF-α和IL-1β的ELISA试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)检测炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。
对照组:选取实施例3制备的非柔性纳米微粒,其他操作条件与实验组完全相同。
另外设置空白对照组、模型组、N-乙酰半胱氨酸组。其中空白对照组和模型组通过尾静脉注射100μL的生理盐水;N-乙酰半胱氨酸组注射100μL浓度为0.8mg/mL的N-乙酰半胱氨酸。
测得血清炎症因子的表达如图5所示,携带N-乙酰半胱氨酸的柔性背包系统明显增强抑制血清炎症因子TNF-α的表达和IL-1β的表达。同样的实验条件非柔性的背包系统治疗肝炎模型小鼠效果较差。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种巨噬细胞背包系统的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)构建柔性纳米微粒,引入巨噬细胞特异性识别分子,得到可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒;
(2)将步骤(1)得到的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒与巨噬细胞共孵育,得到巨噬细胞背包系统;
步骤(1)中所述的柔性纳米微粒由磷脂、胆固醇以及柔性增强剂制备得到,构建方法如下:将磷脂与胆固醇溶解并混匀,蒸干,获得脂质薄膜,经过柔性增强剂的水溶液水化,超声及挤出过膜,获得柔性纳米微粒的溶液;
所述的磷脂的用量为按其与所述胆固醇的摩尔比为6~9:4~1配比计算;
所述的柔性增强剂为脱氧胆酸盐;
所述的柔性增强剂的用量为按其与所述的磷脂的摩尔比为1:1~40配比计算;
所述的挤出过膜的孔径为300 nm;
步骤(1)中所述的引入巨噬细胞特异性识别分子是通过化学偶联或物理吸附的方式引入;
步骤(1)中所述的巨噬细胞特异性识别分子为透明质酸;
步骤(2)中所述的共孵育的条件为在DMEM培养基中共孵育6 h;
所述的可被巨噬细胞特异性识别的柔性纳米微粒在体系中的浓度为1 mM。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞背包系统的制备方法,其特征在于,
所述的磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油和阳离子脂质体用磷脂DOTAP中的一种或几种;
所述的脱氧胆酸盐为脱氧胆酸钠;
所述的溶解采用的有机溶剂为甲醇、氯仿或乙醇中的一种或几种;
所述的超声为探头超声;
所述的超声功率为100 W~1000 W,时间为1~10 min,处理至溶液清澈透明;
所述的透明质酸的分子量为50 ~1000 kDa。
3.根据权利要求1所述的巨噬细胞背包系统的制备方法,其特征在于,
所述的物理吸附是通过将所述的柔性纳米微粒的溶液与巨噬细胞特异性识别分子共孵育,使巨噬细胞特异性识别分子通过静电吸附作用、疏水相互作用粘附在柔性纳米微粒表面;
所述的物理吸附中巨噬细胞特异性识别分子在体系中的浓度为0.01~0.5 mg/mL;
所述的柔性纳米微粒在体系中的浓度为1~20 mM;
所述的共孵育为室温下共孵育1~30 min;
所述的室温是指25~30℃。
4.根据权利要求1所述的巨噬细胞背包系统的制备方法,其特征在于,
所述的化学偶联是通过化学反应接枝巨噬细胞特异性识别分子;
所述的化学反应接枝为混合后震荡1~10 min;
所述的巨噬细胞特异性识别分子在体系中的浓度为0.01~0.1 mg/mL;
所述的柔性纳米微粒在体系中的浓度为1~10 mM。
5.根据权利要求1所述的巨噬细胞背包系统的制备方法,其特征在于,
所述的DMEM培养基中含有体积比1%~5% 的FBS;
所述的巨噬细胞在体系中的浓度为5×105~106个/mL;
所述的巨噬细胞为骨髓巨噬细胞、肝巨噬细胞或RAW264.7细胞;
所述的巨噬细胞背包系统形成后清洗去除未结合的微粒。
6.根据权利要求5所述的巨噬细胞背包系统的制备方法,其特征在于,
所述的巨噬细胞为骨髓巨噬细胞;
所述的清洗为采用1×PBS清洗。
7.一种巨噬细胞背包系统,其特征在于通过权利要求1~6任一项所述的制备方法制备得到。
8.权利要求7所述的巨噬细胞背包系统在制备携带治疗物质或成像物质的诊疗剂中的应用,其特征在于,所述的治疗物质为疫苗。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的治疗物质为纳米治疗物质。
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