CN114231478A - 一种普适性细胞背包聚合物系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种普适性细胞背包聚合物系统及其制备方法，属于聚合物纳米生物材料领域，该细胞背包聚合物系统包括：细胞和反应性聚合物纳米粒子；反应性聚合物纳米粒子包括反应性酰胺聚合物；其中，反应性聚合物纳米粒子位于细胞的细胞表面上。本发明的细胞背包聚合物系统，具有良好的细胞相容性，与细胞的结合机制主要为聚合物与细胞表面分子间的氢键和/或共价键，而不依赖于特异性受体，因此能在细胞表面驻留较长时间；并且制备方法具有灵活普适性，背包功能可由功能蛋白与细胞种类而定制。

Description

一种普适性细胞背包聚合物系统及其制备方法
技术领域
本发明涉及聚合物纳米生物材料领域，特别是涉及一种普适性细胞背包聚合物系统及其制备方法。
背景技术
细胞的表面成分决定了它与环境的相互作用、与其他细胞沟通的能力以及向组织的迁移。利用基因调控的方式可以使细胞实现特定功能，但这些方式仅限于利用细胞具备的天然功能来调控。近年来，利用合成材料与生物系统协同作用，可以突破常规的生物学途径，从而使细胞功能更加丰富。现有的利用高分子材料修饰细胞及调控细胞功能的方法包括两大类：一类是对细胞膜进行均匀完全包封；一类是用纳米材料修饰活细胞表面的一小部分，此类纳米材料又被称为细胞背包。在细胞背包中加入活性组分，如药物、细胞因子、影像剂等等，即可对细胞进行功能化调控。相比之下，细胞背包既可以扩展细胞功能，又不会干扰细胞与周围环境的交流能力，因此优势更加明显。然而大多数情况下，由于细胞天然具有吞噬各种物质的特性，因此纳米材料更容易被递送至细胞内，而很难在细胞表面停留较长时间。因此将纳米粒子递送至胞内的研究丰富且成熟，而细胞背包的制备和应用研究，即：利用纳米粒子修饰细胞表面的研究和应用非常少。现存细胞背包的研究中，大多是在纳米材料上修饰特异性抗体，然后与细胞表面受体进行结合而实现背包功能。此种方法对抗体-受体的选择非常关键，例如：Irvine等人的研究显示，对T细胞修饰细胞背包，仅当纳米粒子靶向细胞的CD45时，可以使粒子稳定的停留在细胞表面至48h，而靶向CD2，CD8，CD11a，CD90等，粒子均很快的被细胞摄取至胞内(Nature Nanotechnology 2018,36(8):707)。此外，如开发其他细胞种类的背包，则抗体和受体种类需要重新筛选。而开发其他细胞背包的功能，也需重新设计背包的结构和制备方法。这些严重影响了细胞背包的制备效率和经济成本。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种普适性细胞背包聚合物系统及其制备方法，该系统可由反应性酰胺聚合物、功能蛋白质和细胞三种元素构成，首先通过自组装法制备反应性酰胺聚合物纳米粒子或聚合物-蛋白质杂化纳米粒子，然后将上述粒子与细胞共培养，即可得到细胞背包聚合物系统。由上述配方和制备方法获得的细胞背包聚合物系统，具有良好的细胞相容性，与细胞的结合机制主要为聚合物与细胞表面分子间的氢键和/或共价键，而不依赖于特异性受体，因此能在细胞表面驻留较长时间(至少24h)。并且制备方法具有灵活普适性，背包功能可由功能蛋白与细胞种类而定制。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种普适性细胞背包聚合物系统，包括：细胞和反应性聚合物纳米粒子；所述反应性聚合物纳米粒子包括反应性酰胺聚合物；其中，所述反应性聚合物纳米粒子位于所述细胞的细胞表面上。
进一步地，所述普适性细胞背包聚合物系统还包括功能蛋白；所述功能蛋白含有氨基或巯基中的一种或多种；其中，所述功能蛋白与所述反应性聚合物纳米粒子共组装成聚合物-蛋白质杂化纳米粒子，所述聚合物-蛋白质杂化纳米粒子位于所述细胞的细胞表面上。
在本发明中，细胞背包聚合物系统的组成：反应性酰胺聚合物、功能蛋白及细胞，其中反应性酰胺聚合物和细胞为必要组分，功能蛋白质为可选组分。
功能蛋白为含有氨基、巯基的一种或多种，蛋白质种类根据功能进行选择。
细胞种类具有普适性，根据功能进行选择。
进一步地，所述反应性酰胺聚合物的侧链结构包括：丙烯酰胺单体、和能在温和条件下与蛋白质发生化学反应的反应性单体；其中，所述丙烯酰胺单体和反应性单体的摩尔比为1:1～20:1。
进一步地，所述丙烯酰胺单体为含有一个或多个丙烯酰胺结构的烯基单体(AmM)；所述反应性单体为含有琥珀酰亚胺(NHSM)、二硫吡啶基团(PDSM)和/或五氟苯基酯(PFPM)结构的烯基单体。
进一步地，所述丙烯酰胺单体包括但不限于丙烯酰胺(AAm)，N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)等。AmM通用结构及结构举例(包括但不局限于下述结构)：
Figure BDA0003427079720000021
进一步地，所述反应性单体包括但不限于N-丙烯氧基琥珀酰亚胺(NAS)，N-甲基丙烯氧基琥珀酰亚胺(MAS)，二硫吡啶基乙基丙烯酰胺(PDSAm)，二硫吡啶基乙基甲基丙烯酰胺(PDSMAm)，五氟苯基丙烯酸酯(PFPA)等。反应性单体的通用结构及结构举例(包括但不局限于下述结构)：
Figure BDA0003427079720000031
进一步地，所述反应性酰胺聚合物的构筑结构为线性和支化结构中的一种或两种；
所述反应性酰胺聚合物的分子量分布为1.1～3.0，重均分子量为1～20万。
进一步地，所述反应性酰胺聚合物的制备方法，包括以下步骤：
以丙烯酰胺单体和反应性单体为原料，通过自由基聚合法、可逆加成-断裂链转移聚合法(RAFT)或原子转移自由基聚合法(ATRP)制备。
采用普通自由基聚合、RAFT、ATRP等方法均可，不影响聚合物对细胞膜的粘附。使用RAFT方法时，体系中还应包括一定比例的链转移剂；使用ATRP方法时，体系中还应包括一定比例的催化剂。
进一步地，当反应性酰胺聚合物为线性结构时，采用自由基聚合法制备步骤包括：将引发剂和单体溶于溶剂中，排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物；
当反应性酰胺聚合物为线性结构时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备步骤包括：将单体、链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物；
当反应性酰胺聚合物为线性结构时，采用原子转移自由基聚合法制备步骤包括：将单体、引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除3次氧气后，聚合，除去铜催化剂，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物；
当反应性酰胺聚合物为支化结构时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备步骤包括：将单体、支化结构的链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物；
当反应性酰胺聚合物为支化结构时，采用原子转移自由基聚合法制备步骤包括：将单体、支化结构的引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去铜催化剂，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物。
进一步地，所述单体在溶剂中的浓度为0.01～0.5g/mL，所述单体中丙烯酰胺单体和反应性单体的摩尔比为1:1～20:1；
所述引发剂的加入量为单体摩尔数的0.02～0.3％；
所述自由基聚合法中，聚合温度60～70℃，聚合时间5～48h；
所述可逆加成-断裂链转移聚合法中，聚合温度60～70℃，聚合时间6～72h；
所述原子转移自由基聚合法中，聚合温度60～90℃，聚合时间6～72h。
本发明还提供一种上述的普适性细胞背包聚合物系统，包括以下步骤：
A.将细胞和反应性聚合物纳米粒子共孵育，得到普适性细胞背包聚合物系统；或，
B.将细胞和聚合物-蛋白质杂化纳米粒子共孵育，得到普适性细胞背包聚合物系统；
其中，所述反应性聚合物纳米粒子由反应性酰胺聚合物通过自组装法构建；
所述聚合物-蛋白质杂化纳米粒子由反应性聚合物纳米粒子与功能蛋白通过共混共组装法构建。
进一步地，包括以下步骤：
(1)当背包系统仅含有反应性酰胺聚合物时，通过自组装法构建反应性聚合物纳米粒子，根据聚合物的溶解性，自组装法包括如下两种方式：
A.聚合物水溶性较差时，将反应性酰胺聚合物溶于少量溶剂(二甲基甲酰胺或二甲基亚砜溶剂)中，然后使用蒸馏水透析24h获得反应性聚合物纳米粒子；
B.聚合物水溶性随温度改变有明显变化时，先将反应性酰胺聚合物溶于热水中，然后冷却使其自组装形成反应性聚合物纳米粒子。
(2)当背包系统同时含有反应性酰胺聚合物和功能蛋白时，将(1)中获得的反应性聚合物纳米粒子水溶液与功能蛋白水溶液共混以进一步发生共组装，反应性聚合物纳米粒子和功能蛋白的质量比为1:0.5～1:10，并于室温孵育0.5～12h，然后超滤除去游离的功能蛋白，收集浓缩液，获得聚合物-蛋白质杂化纳米粒子。
(3)将步骤(1)所得的反应性聚合物纳米粒子或步骤(2)所得的聚合物-蛋白质杂化纳米粒子与目标细胞进行共培养2～48h，可获得普适性细胞背包聚合物系统。
反应性酰胺聚合物是伸展的链状，不是粒子形态，不能直接和细胞混合，否则会全包裹细胞，而不能在细胞表面形成粒子。本发明将反应性酰胺聚合物自组装形成纳米粒子，使链状聚合物分子变成分子聚集体，反应性酰胺聚合物的反应性单体具有共价反应功能，酰胺单体提供形成氢键的能力，反应性酰胺聚合物组装后仍然保留上述功能，细胞膜表面的分子含有大量的氨基、巯基，可与反应性聚合物纳米粒子发生共价键，细胞膜表面的蛋白含有的酰胺键、羟基等基团可与反应性聚合物纳米粒子形成氢键。
当体系中含有功能蛋白时，反应性聚合物纳米粒子先与功能蛋白以共价键/氢键方式结合，共组装以形成新的聚合物-蛋白杂化纳米粒子，此新的杂化纳米粒子再与细胞结合，结合作用力仍然是上述的共价键和/或氢键。
该反应性酰胺聚合物水溶性随温度发生变化，具体指的是，该反应性酰胺聚合物在水中具有低温不溶-高温溶解的可逆相转变性质，转变温度在40-90℃之间。该反应性酰胺聚合物水溶性较差，不能直接溶于水，只能溶于有机溶剂中，但经过纯水透析，可自组装形成稳定的纳米粒子，而非大颗粒的沉淀物。
本发明公开了以下技术效果：
本发明由上述方法获得的细胞背包聚合物系统，具有良好的细胞相容性，与细胞的结合机制主要为聚合物与细胞表面分子间的氢键和/或共价键，而不依赖于特异性受体，因此能在细胞表面驻留较长时间(至少24h)。并且制备方法具有灵活普适性，背包功能可由功能蛋白与细胞种类而定制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为反应性酰胺聚合物的1H NMR谱图，其中(A)为聚合物一的1H NMR谱图、(B)为聚合物二的1H NMR谱图、(C)为聚合物十二的1H NMR谱图；
图2为聚合物纳米粒子一(A)、聚合物纳米粒子二(B)和聚合物-蛋白质杂化纳米粒子二(C)的原子力显微镜照片；
图3为牛血清白蛋白和聚合物-蛋白质杂化纳米粒子二的圆二色性对比谱图；
图4为牛血清白蛋白和聚合物-蛋白质杂化纳米粒子二的蛋白质活性对比图。
图5为聚合物纳米粒子一和聚合物-蛋白质杂化纳米粒子一48h对NIH 3T3细胞的毒性结果；
图6为聚合物纳米粒子一和聚合物-蛋白质杂化纳米粒子一6h和24h在NIH 3T3细胞表面的分布；
图7为本发明普适性细胞背包聚合物系统的示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下通过具体实施例对本发明反应性酰胺聚合物的制备做进一步的说明，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
采用RAFT聚合法，首先将氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯(CMDT)(链转移剂)、2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(V-50)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.1g/mL，使CMDT:V-50:NAGA:NAS的摩尔比例为1:0.1:117:67，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物一。反应方程式：
Figure BDA0003427079720000071
将该聚合物进行凝胶渗透色谱表征得到聚合物重均分子量为20200，分子量分布为1.25。图1为该聚合物的1H NMR谱图，化学位移为6.8～8.9ppm的峰为NAGA的酰胺氮上的氢(a和c)；化学位移3.3～4.2ppm的峰为NAGA的侧链亚甲基上的氢(b)；化学位移2.9ppm的峰是NAS的琥珀酰亚胺次甲基氢(d)，上述归属表明聚合物为NAGA和NAS的共聚物，共聚物中NAGA和NAS的摩尔比例为1.7:1。
实施例2
采用RAFT聚合法，首先将2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDMAT)(链转移剂)、偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使DDMAT:AIBN:AAm:NAS的摩尔比例为1:0.2:400:80，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应20h。然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物二。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000081
将该共聚物进行凝胶渗透色谱表征得到聚合物重均分子量为35400，分子量分布为1.19。图1B化学位移为6.6～7.7ppm的峰是AAm的酰胺氮上的氢(a)；化学位移2.9ppm是NAS的琥珀酰亚胺次甲基氢(b)；化学位移10.6ppm处为NAS部分发生水解后的丙烯酸(AAc)的羧基氢。共聚物中AAm:NAS:AAc的摩尔比例为77:5:18。
实施例3
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.5g/mL，使AIBN:NAGA:NAS的摩尔比例为1:120:70。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物三。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000082
实施例4
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使AIBN:AAm:NAS的摩尔比例为1:400:80，反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物四。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000083
实施例5
使用ATRP聚合法，将2-溴-2-甲基丙酸乙酯(EBriB)(引发剂)、氯化亚铜(CuCl)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(PMDETA)(CuCl与PMDETA络合后成为催化剂体系)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，使EbriB:CuCl:PMDETA:NAGA:NAS的比例为1:1:2:120:70，单体总浓度为0.2g/mL。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物五。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000091
实施例6
使用ATRP聚合法，将2-溴-2-甲基丙酸乙酯(EbriB)(引发剂)、氯化亚铜(CuCl)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(PMDETA)(CuCl与PMDETA络合后成为催化剂体系)、丙烯酰胺(AAm)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，使EbriB:CuCl:PMDETA:AAm:NAS的比例为1:1:2:378:79，单体总浓度为0.5g/mL。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物六。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000092
实施例7
使用ATRP聚合法，将溴代环糊精(CD-Br，每个环糊精有17个Br，即为17个ATRP引发位点)(引发剂)、氯化亚铜(CuCl)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(PMDETA)(CuCl与PMDETA络合后成为催化剂体系)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，使Br:CuCl:PMDETA:NAGA:NAS的比例为1:1:2:120:70，单体总浓度为0.1g/mL。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到支化聚合物七。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000101
实施例8
使用ATRP聚合法，将溴代环糊精(CD-Br，每个环糊精有17个Br，即为17个ATRP引发位点)(引发剂)、氯化亚铜(CuCl)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(PMDETA)(CuCl与PMDETA络合后成为催化剂体系)、丙烯酰胺(AAm)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，使Br:CuCl:PMDETA:AAm:NAS的比例为1:1:2:378:79，单体总浓度为0.1g/mL。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到支化聚合物八。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000102
实施例9
采用RAFT聚合法，首先将氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯(CMDT)(链转移剂)、2,2’-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(V-50)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(PDSAm)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.2g/mL，使CMDT:V-50:NAGA:PDSAm的摩尔比例为1:0.2:350:88，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物九。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000103
实施例10
采用RAFT聚合法，首先将2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDMAT)(链转移剂)、偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(PDSAm)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使DDMAT:AIBN:AAm:PDSAm的摩尔比例为1:0.1:400:60，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000111
实施例11
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(PDSAm)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.5g/mL，使AIBN:NAGA:PDSAm的摩尔比例为1:120:30。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十一。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000112
实施例12
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(PDSAm)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使AIBN:AAm:PDSAm的摩尔比例为1:400:60，反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十二。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000121
图1C核磁表征结果显示，化学位移在6.6～8.5ppm之间出现了AAm的酰胺氢以及二硫吡啶环上的氢，2.9ppm和3.4ppm为PDSAm侧链亚甲基氢，表明聚合物为AAm和PDSAm的共聚物，共聚物中AAm和PDSAm的摩尔比为7.1:1。
实施例13
采用RAFT聚合法，首先将氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯(CMDT)(链转移剂)、2,2’-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(V-50)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、五氟苯基丙烯酸酯(PFPA)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.2g/mL，使CMDT:V-50:NAGA:PFPA的摩尔比例为1:0.2:350:60，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十三。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000122
实施例14
采用RAFT聚合法，首先将2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDMAT)(链转移剂)、偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、五氟苯基丙烯酸酯(PFPA)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使DDMAT:AIBN:AAm:PDSAm的摩尔比例为1:0.1:400:40，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十四。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000131
实施例15
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、二甲基五氟苯基丙烯酸酯(PFPA)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.5g/mL，使AIBN:NAGA:PFPA的摩尔比例为1:120:15。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应10h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十五。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000132
实施例16
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、五氟苯基丙烯酸酯(PFPA)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使AIBN:AAm:PFPA的摩尔比例为1:400:40，反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应10h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十六。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000133
实施例17
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)与N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(MAS)溶解于无水DMSO中，使AIBN:NAGA:MAS的比例为1:400:40，单体总浓度为0.3g/mL。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应物沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十七。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000141
实施例18
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)与N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(MAS)溶解于无水DMSO中，使AIBN:AAm:MAS的比例为1:400:30，单体总浓度为0.5g/mL。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应物沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性聚合物十八。反应方程式为：
Figure BDA0003427079720000142
以下通过具体实施例对本发明反应性酰胺聚合物纳米粒子的制备做进一步的说明，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例19
将聚合物一以2.0mg/mL的浓度溶于热水中，然后冷却至室温，得到反应性酰胺聚合物纳米粒子一。使用原子力显微镜观察得到的纳米粒子形貌。图2A显示该粒子呈球形结构，粒径约为200-300nm。
实施例20
将聚合物二以2.0mg/mL的浓度溶于热水中，然后冷却至室温，得到反应性酰胺聚合物纳米粒子二。使用原子力显微镜观察得到的纳米粒子形貌。图2B显示该粒子呈球形结构，粒径约为100-200nm。
实施例21
将聚合物十一以10mg/mL的浓度溶于DMSO中，然后置于透析袋中，使用蒸馏水透析48h，冷冻干燥后得到反应性酰胺聚合物纳米粒子三。
实施例22
将聚合物十二以10mg/mL的浓度溶于DMSO中，然后置于透析袋中，使用蒸馏水透析48h，冷冻干燥后得到反应性酰胺聚合物纳米粒子四。
实施例23
将2mg/mL的反应性酰胺聚合物纳米粒子一的水溶液与2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm,2min)，除去未结合的BSA，收集浓缩液得到聚合物-蛋白质杂化纳米粒子一。
实施例24
将2mg/mL的反应性酰胺聚合物纳米粒子二与10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm,2min)，除去未结合的BSA，收集浓缩液得到聚合物-蛋白质杂化纳米粒子二。使用原子力显微镜观察得到的纳米粒子形貌。图2C显示该粒子呈球形结构，粒径约为30-60nm。
实施例25
聚合物-蛋白质杂化纳米粒子中的蛋白质的二级结构检测：使用圆二色谱仪检测聚合物-蛋白质杂化纳米粒子二中的蛋白质活性，并与游离BSA进行对比，图3显示两个样品的圆二色性几乎一致，表明BSA与聚合物发生反应后仍然维持了原有的二级结构。
实施例26
聚合物-蛋白质杂化纳米粒子中的蛋白质的生物活性的测定：乙酸对硝基苯酯可在BSA的催化下，在水溶液中水解为对硝基苯酚，利用紫外分光光度计检测产物对硝基苯酚在400nm处的吸光度，可以测定BSA的生物活性。具体的，配置BSA浓度为1mg/mL的聚合物-蛋白质杂化纳米粒子二，同时以1mg/mL的游离BSA为对照组，配置4mg/mL的乙酸对硝基苯酯的乙腈溶液，将10μL的乙酸对硝基苯酯的乙腈溶液加入至1mL聚合物-蛋白质杂化纳米粒子二或游离BSA溶液中，37℃孵育4h，然后以紫外分光光度计检测上述样品在400nm处的吸光度，将游离BSA的生物活性作为100％，进而折算聚合物-蛋白质杂化纳米粒子二相对于游离BSA的活性。图4显示BSA在杂化纳米粒子中仍然能够保持95％以上的活性，表明聚合物与BSA的反应和共组装过程，几乎没有影响BSA原有的生物活性。
实施例27
将2mg/mL的反应性酰胺聚合物纳米粒子三的水溶液与2mg/mL的卵清蛋白(OVA)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm,2min)，除去未结合的BSA，收集浓缩液得到聚合物-蛋白质杂化纳米粒子三。
实施例28
将2mg/mL的反应性酰胺聚合物纳米粒子四的水溶液与2mg/mL的卵清蛋白(OVA)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm,2min)，除去未结合的BSA，收集浓缩液得到聚合物-蛋白质杂化纳米粒子四。
以下通过具体实施例对本发明反应性酰胺聚合物纳米粒子的细胞毒性情况做进一步的说明，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例29
将NIH 3T3细胞以5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，以含有10％FBS的DMEM为培养基，将培养板置于37℃，5％CO2浓度的条件下培养24h。然后将不同浓度的聚合物纳米粒子一或聚合物-蛋白质杂化纳米粒子一加入细胞，孵育48h。弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次，在每孔中加入10μL CCK-8试剂和90μL无血清培养基的混合溶液，在37℃孵育1.5h后，使用多功能酶标仪检测所有样品在450nm处的光密度(OD)，按照如下公式计算细胞存活率：细胞存活率＝(Atreated-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100％，其中Atreated为不同浓度的纳米粒子和细胞孵育后的吸光度值，Acontrol为未处理细胞的吸光度值，Ablank为没有细胞仅加CCK-8试剂的吸光度值。图5显示该聚合物纳米粒子及聚合物-蛋白质杂化纳米粒子在48h内对NIH 3T3细胞没有产生明显的细胞毒性，NIH 3T3细胞存活率在粒子浓度为100μg/mL时保持了96％以上的活力。
以下通过具体实施例对本发明细胞背包聚合物系统的制备做进一步的说明，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例30
将NIH 3T3细胞以6×104个细胞/孔的密度接种到共聚焦培养皿中，以含有10％FBS的DMEM为培养基，将培养板置于37℃，5％CO2浓度的条件下培养24h。然后将聚合物纳米粒子一或聚合物-蛋白质杂化纳米粒子一以40μg/mL的浓度加入细胞，孵育24h，制备得到细胞背包聚合物系统一和二。为便于观察，10％的聚合物以氨基荧光素进行标记，20％的BSA以罗丹明B进行标记。弃去培养基，用PBS洗涤2次。加入1mL 4％多聚甲醛于4℃避光固定细胞20min，然后用PBS洗涤2次。使用4mL浓度为0.01mg/mL的Hoechst-33342的PBS溶液染色细胞核，室温避光孵育10min，并用PBS洗涤3次。将得到的细胞背包聚合物系统于激光共聚焦显微镜下观察。图6的共聚焦照片显示，在与细胞共培养6～24h后，聚合物纳米粒子一和聚合物-蛋白质杂化纳米粒子一始终驻留于NIH 3T3细胞表面，而没有被摄取进入细胞浆中，表明获得了良好的细胞背包聚合物系统。
实施例29
将MCF-7细胞以6×104个细胞/孔的密度接种到共聚焦培养皿中，以含有10％FBS的DMEM为培养基，将培养板置于37℃，5％CO2浓度的条件下培养24h。然后将聚合物纳米粒子二或聚合物蛋白质杂化纳米粒子二以60μg/mL的浓度加入细胞，孵育24h，制备得到细胞背包聚合物系统三和四。其中，聚合物纳米粒子二或聚合物蛋白质杂化纳米粒子二能够驻留于MCF-7细胞表面，不会被摄取进入细胞浆中。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种普适性细胞背包聚合物系统，其特征在于，包括：细胞和反应性聚合物纳米粒子；所述反应性聚合物纳米粒子包括反应性酰胺聚合物；其中，所述反应性聚合物纳米粒子位于所述细胞的细胞表面上。
2.根据权利要求1所述的普适性细胞背包聚合物系统，其特征在于，所述普适性细胞背包聚合物系统还包括功能蛋白；所述功能蛋白含有氨基或巯基中的一种或多种；其中，所述功能蛋白与所述反应性聚合物纳米粒子共组装成聚合物-蛋白质杂化纳米粒子，所述聚合物-蛋白质杂化纳米粒子位于所述细胞的细胞表面上。
3.根据权利要求1所述的普适性细胞背包聚合物系统，其特征在于，所述反应性酰胺聚合物的侧链结构包括：丙烯酰胺单体、和能在温和条件下与蛋白质发生化学反应的反应性单体；其中，所述丙烯酰胺单体和反应性单体的摩尔比为1:1～20:1。
4.根据权利要求3所述的普适性细胞背包聚合物系统，其特征在于，所述丙烯酰胺单体为含有一个或多个丙烯酰胺结构的烯基单体；所述反应性单体为含有琥珀酰亚胺、二硫吡啶基团和/或五氟苯基酯结构的烯基单体。
5.根据权利要求3所述的普适性细胞背包聚合物系统，其特征在于，所述反应性酰胺聚合物的构筑结构为线性和支化结构中的一种或两种；
所述反应性酰胺聚合物的分子量分布为1.1～3.0，重均分子量为1～20万。
6.根据权利要求3-5任一项所述的普适性细胞背包聚合物系统，其特征在于，所述反应性酰胺聚合物的制备方法，包括以下步骤：
以丙烯酰胺单体和反应性单体为原料，通过自由基聚合法、可逆加成-断裂链转移聚合法或原子转移自由基聚合法制备。
7.根据权利要求6所述的普适性细胞背包聚合物系统，其特征在于，
当反应性酰胺聚合物为线性结构时，采用自由基聚合法制备步骤包括：将引发剂和单体溶于溶剂中，排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物；
当反应性酰胺聚合物为线性结构时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备步骤包括：将单体、链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物；
当反应性酰胺聚合物为线性结构时，采用原子转移自由基聚合法制备步骤包括：将单体、引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除氧气后，聚合，除去铜催化剂，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物；
当反应性酰胺聚合物为支化结构时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备步骤包括：将单体、支化结构的链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物；
当反应性酰胺聚合物为支化结构时，采用原子转移自由基聚合法制备步骤包括：将单体、支化结构的引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除氧气后，聚合，除去铜催化剂，除去未反应单体，干燥得到反应性酰胺聚合物。
8.根据权利要求7所述的普适性细胞背包聚合物系统，其特征在于，所述单体在溶剂中的浓度为0.01～0.5g/mL，所述单体中丙烯酰胺单体和反应性单体的摩尔比为1:1～20:1；
所述引发剂的加入量为单体摩尔数的0.02～0.3％；
所述自由基聚合法中，聚合温度60～70℃，聚合时间5～48h；
所述可逆加成-断裂链转移聚合法中，聚合温度60～70℃，聚合时间6～72h；
所述原子转移自由基聚合法中，聚合温度60～90℃，聚合时间6～72h。
9.一种权利要求1-8任一项所述的普适性细胞背包聚合物系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将细胞和反应性聚合物纳米粒子共孵育，得到普适性细胞背包聚合物系统；或，
B.将细胞和聚合物-蛋白质杂化纳米粒子共孵育，得到普适性细胞背包聚合物系统；
其中，所述反应性聚合物纳米粒子由反应性酰胺聚合物通过自组装法构建；
所述聚合物-蛋白质杂化纳米粒子由反应性聚合物纳米粒子与功能蛋白通过共混共组装法构建。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将反应性酰胺聚合物溶于溶剂中，然后使用蒸馏水透析，获得反应性聚合物纳米粒子；或，
将反应性酰胺聚合物溶于热水中，然后冷却，自组装，形成反应性聚合物纳米粒子；和/或，
(2)将步骤(1)获得的反应性聚合物纳米粒子水溶液与功能蛋白水溶液共混，反应性聚合物纳米粒子和功能蛋白的质量比为1:0.5～1:10，并于室温孵育0.5～12h，然后超滤除去游离的功能蛋白质，收集浓缩液，获得聚合物-蛋白质杂化纳米粒子；和，
(3)将步骤(1)中的反应性聚合物纳米粒子或步骤(2)中的聚合物-蛋白质杂化纳米粒子与细胞进行共培养2～48h，得到普适性细胞背包聚合物系统。
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