CN109897179B - 一种多臂聚乙二醇-聚(l-谷氨酸酯)嵌段共聚物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种多臂聚乙二醇-聚(l-谷氨酸酯)嵌段共聚物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种多臂聚乙二醇‑聚(L‑谷氨酸酯)嵌段共聚物及其制备方法和应用，其中，所述共聚物包含具有式(I)结构的第一嵌段和/或式(II)结构的第二嵌段与具有式(III)结构的第三嵌段，使得本发明提供的多臂嵌段共聚物可以随温度变化发生可逆的溶胶‑凝胶‑沉淀(脱水)转变。此外，本申请通过选择特定的第一嵌段和/或第二嵌段、第三嵌段以及第三嵌段的长度可以实现聚合物相转变温度的调节和高的透明度，使得本发明提供的多臂嵌段共聚物可以很好的应用于生物医学方面，尤其是作为三维细胞培养材料和药物载体的使用。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料领域，尤其涉及一种多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物及其制备方法和应用。
背景技术
2016年美国塔夫茨大学药物发展研究中心发布的一项关于药物研发成功率的统计数据显示，平均仅有9.6％(n＝9,985)进入临床试验的药物能成功获得FDA批准，考虑到折现率，每种创新药物最终获FDA批准的平均费用高达25.58亿美元，对于肿瘤类药物的平均通过率仅有5.1％。这种药物研发的低通过率主要是药物进入临床试验后会缺乏药效、有不良反应及药代动力学不能满足要求。产生这些现象的根源在于实验室阶段用于药物及疾病研究的二维细胞培养基与体内环境存在很大差异，因此，二维培养材料已经不能满足生物医学研究的要求，开发更接近体内环境的三维细胞培养材料已经成为生物医学研究的必要课题。
三维细胞培养材料与二维培养材料相比，有如下几个方面的优势：a.二维培养的细胞形态学上为单层片状的扁平拉伸细胞，而三维培养形成球体等自然形状；b.二维培养的细胞增殖速度更快，而三维的则相对较慢，且取决于细胞类型和三维模型；c.由于二维培养为单层细胞，他们同等暴露于培养液与药物中，因此多处于细胞周期的同一阶段，但三维培养中，营养物质和药物无法到达球形体的中心，且细胞可处于增殖，静止，缺氧和坏死细胞的各个阶段；d.二维培养的细胞为了适应外界环境，通常会有基因及蛋白的差异表达，而三维培养更接近体内；e.二维培养的细胞经常屈服于治疗，似乎更有效，或产生抗药性，但三维培养的细胞则对药物更具抗性，可以实现对体内药物反应的更好预测。
目前，常用的三维细胞培养材料可分为需要支架和无需支架两大类，不需要支架的三维细胞培养仍使用液体培养基，虽然能形成球形体，但是无法模拟体内的组织强度、细胞-ECM相互作用，因此与体内真实环境还存在一定差别。需要支架的细胞培养如多孔材料、纳米纤维、微孔板和微流控技术等分别因为孔隙过大、强度不够和造价昂贵无法大量使用的原因受到了限制。而水凝胶材料可以允许营养物质及细胞因子等分布，很好的模拟了细胞-细胞相互作用及细胞-ECM相互作用，且凝胶强度可以调节，从而得到了广泛的应用。目前常用的细胞培养水凝胶多为Martigel、胶原水凝胶和纤维凝胶，这类生物来源的水凝胶虽然能使细胞保持接近体内状态的形貌，实现可控的增殖与分化，但是由于生物来源材料的批次差异，造成了实验重现性差，影响了药理学规律的探究。化学交联法合成的PEG水凝胶，虽然可以用于培养材料，但需要使用酶来收集材料，因此对细胞有一定的伤害。
可回复水凝胶(Macromolecules 2001，34：3710～3715)，实现了温度调节的溶胶-凝胶转变，有利于细胞收集，从而得到了很多应用，但聚(N-异丙基丙烯酰)除了无法降解，使用的单体有毒性外，用于细胞培养时的聚合物浓度达到10％。此外，这种材料限制了成纤维细胞的生长，使得成纤维细胞不能像体内环境一样对肿瘤生长产生促进或抑制的作用，偏离了体内真实情况。近几年来，有一些热可逆的水凝胶陆续出现，但他们几乎全部是基于聚(N-异丙基丙烯酰)材料的温敏性设计的，如Yunfeng Li等人设计的聚(N-异丙基丙烯酰胺)接枝的纤维素纳米晶体水凝胶(Angewandte Chemie-International Edition 2016，56：6083-6087)虽然降低了材料的成胶浓度，但其在体温下仍然不透明，无法使用明场显微镜和荧光显微镜直接观察细胞，且由于材料的不可降解性限制了体内应用。本课题组制备了一种聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶(CN201610016424.6)，同样具有热可逆行为，有利于细胞收集，同时聚氨基酸可降解，降解不产生酸性环境，生物相容性好，单体无毒性，但是，该材料在透明度上仍然存在一定缺陷，不利于细胞观察。因此，开发更优异的三维细胞培养材料迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物及其制备方法和应用，本发明提供的聚合物形成的水凝胶具有良好的热可逆性能和可调节的透明度，有利于热可逆水凝胶用于三维细胞的培养、观察、收集与体内注射。
本发明提供了一种多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，包含具有式(I)结构的第一嵌段和/或式(II)结构的第二嵌段与具有式(III)结构的第三嵌段：
其中，m为聚合度，3≤m≤56；
n为聚合度，26≤n≤55；
q为聚合度，1≤q≤41；
所述第三嵌段占所述多臂嵌段共聚物总数均分子量的40％～90％。
优选的，所述m为6≤m≤50。
优选的，所述q为2≤q≤35。
本发明还提供了一种多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇和/或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇中的一种与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐发生聚合反应，得到权利要求1所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物；
其中，m为聚合度，3≤m≤56；
n为聚合度，26≤n≤55。
优选的，所述端氨基化的四臂聚乙二醇或端氨基化的八臂聚乙二醇与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的摩尔比为1∶(4～164)；
所述端氨基化的四臂聚乙二醇和端氨基化的八臂聚乙二醇的总摩尔数与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的摩尔数之比为1∶(4～164)。
优选的，所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐按照以下方法制备：
1)将L-谷氨酸和二乙二醇乙醚混合反应，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯；
2)将所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯混合反应，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。
本发明还提供了一种水凝胶，包含本发明所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物和溶剂。
优选的，所述水凝胶中多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的含量为2wt％～30wt％。
本发明还提供了一种三维细胞培养材料，包括本发明所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明还提供了一种本发明所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物在制备药物载体中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，包含具有式(I)结构的第一嵌段和/或式(II)结构的第二嵌段与具有式(III)结构的第三嵌段，通过实验发现，低温下，多臂嵌段共聚物亲水性较强，在溶剂中为分散的胶束，温度升高时，多臂嵌段共聚物发生疏水堆积形成凝胶网络，温度继续升高，凝胶转变成为沉淀状态或发生脱水，即本发明提供的多臂嵌段共聚物可以随温度变化发生可逆的溶胶-凝胶-沉淀(脱水)转变。此外，本申请通过选择特定的第一嵌段和/或第二嵌段、第三嵌段以及第三嵌段的长度可以实现聚合物相转变温度的调节和高的透明度，使得本发明提供的多臂嵌段共聚物可以很好的应用于生物医学方面，尤其是作为三维细胞培养材料和药物载体的使用。
附图说明
图1为本发明实施例3制备的多臂嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例8制备的多臂嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例14制备的多臂嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图4为本发明实施例17制备的多臂嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图5为本发明实施例9得到的不同浓度的多臂嵌段共聚物溶液随温度变化的相图；
图6为本发明实施例13得到的不同浓度的多臂嵌段共聚物溶液随温度变化的相图；
图7为本发明实施例8得到的多臂嵌段共聚物溶液在不同温度下的形态变化照片；
图8为本发明实施例4得到的多臂嵌段共聚物溶液在不同温度下的形态变化照片；
图9为本发明实施例8得到的多臂嵌段共聚物水凝胶与本课题组制备的聚乙二醇-聚氨基酸双嵌段共聚物水凝胶(CN201610016424.6)在37℃下的凝胶照片。
具体实施方式
本发明提供了一种多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，包含具有式(I)结构的第一嵌段和/或式(II)结构的第二嵌段与具有式(III)结构的第三嵌段：
其中，m为聚合度，3≤m≤56；
n为聚合度，26≤n≤55；
q为聚合度，1≤q≤41；
所述第三嵌段占所述多臂嵌段共聚物总数均分子量的40％～90％。
本发明中，所述m优选为6≤m≤50，更优选为10≤m≤40，最优选为15≤m≤27；所述q优选为2≤q≤35，更优选为5≤q≤30，最优选为8≤q≤21；所述n优选为30≤n≤50，更优选为35≤n≤45，40≤n≤42；本发明所述的聚合物中，通过同时含有第一嵌段和/或第二嵌段与第三嵌段，并通过调节第三嵌段的长度可以实现水凝胶的相转变温度的调节，同时使得到的共聚物的透明度较好，本申请中，所述第三嵌段的数均分子量占嵌段共聚物总数均分子量的优选为40-90％，更优选为45-80％，最优选为50～70％。
本发明还提供了一种本发明所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇和/或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇中的一种与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐发生聚合反应，得到本发明所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物；
其中，m为聚合度，3≤m≤56；
n为聚合度，26≤n≤55。
本发明中，为了使嵌段聚合物中所述聚乙二醇中的一种与所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐反应充分，所述多臂嵌段共聚物的制备过程具体为：
将具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇和/或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇中的一种溶于第一有机溶剂，得到第一溶液；
将γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶于第二有机溶剂，得到第二溶液；
将所述第一溶液与第二溶液混合后发生聚合反应，得到多臂嵌段共聚物。
在上述过程中，具体的，将所述具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇和/或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇中的一种与无水甲苯共沸除水后继续除去甲苯，然后将其溶于第一有机溶剂，得到第一溶液，本发明对所述第一溶液的浓度没有特殊限制。所述具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇的质量与第一有机溶剂的体积的比例优选为1g∶(10～20mL)。所述第一有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或三氯甲烷，更优选为N，N-二甲基甲酰胺。
所述具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇的质量与无水甲苯的体积的比例优选为1g∶(25mL～35mL)，所述共沸的温度优选为125℃～135℃，所述共沸的时间优选为2小时～3小时。
将所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶于第二有机溶剂，得到第二溶液，本发明对所述第二溶液的浓度没有特殊限制。所述第二有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或三氯甲烷，更优选为N，N-二甲基甲酰胺。
得到第一溶液和第二溶液后，在氮气气氛下，将所述第一溶液与第二溶液混合并不断搅拌，在得到的混合溶液中，所述具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐发生聚合反应，得到嵌段共聚物。所述具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的摩尔比优选为1∶(4～164)，更优选为1∶(8～82)；所述端氨基化的四臂聚乙二醇和端氨基化的八臂聚乙二醇的总摩尔数与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的摩尔数之比为1∶(4～164)，更优选为1∶(8～82)。所述聚合反应温度优选为35℃～45℃，所述聚合反应时间优选为72h～96h。
聚合反应结束后，将得到的产物进行提纯，具体过程为：反应溶液用乙醚沉降，对得到的沉降物进行抽滤、洗涤、真空干燥，得到嵌段共聚物。
在制备嵌段共聚物的过程中，本申请通过调节聚合过程中反应物的质量，通过控制γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐在反应中的用量，而得到含有不同长度第三嵌段的嵌段共聚物。
本发明中，所述具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇优选按照以下方法制备：
将四臂聚乙二醇或八臂聚乙二醇与三乙胺、甲基磺酰氯发生酯化反应，得到甲基磺酸四臂聚乙二醇酯或甲基磺酸八臂聚乙二醇酯；
将所述甲基磺酸四臂聚乙二醇酯或甲基磺酸八臂聚乙二醇酯中的一种与氨水进行氨解反应，得到对应的具有(IV、)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇。
在上述过程中，首先将四臂聚乙二醇或八臂聚乙二醇中的一种和甲苯共沸除水后继续除去甲苯，再向其中加入有机溶剂，得到四臂聚乙二醇或八臂聚乙二醇溶液。此过程中所述四臂聚乙二醇或八臂聚乙二醇的数均分子量优选为2000-20000，所述有机溶剂优选为二氯甲烷，所述四臂聚乙二醇或八臂聚乙二醇中的一种的质量与有机溶剂的体积的比例优选为1g∶(5～15)mL。然后向得到的四臂聚乙二醇或八臂聚乙二醇溶液中的一种加入三乙胺和甲基磺酰氯进行酯化反应，得到对应的甲基磺酸四臂聚乙二醇酯或甲基磺酸八臂聚乙二醇酯。此过程中，所述三乙胺与四臂聚乙二醇的摩尔比优选为(16～28)∶1，所述三乙胺与八臂聚乙二醇的摩尔比优选为(32～56)∶1，所述三乙胺与甲基磺酰氯的摩尔比优选为(4～7)∶(15～24)。上述过程中优选在-5℃～5℃、无水条件下，加入三乙胺，同时滴加甲基磺酰氯进行酯化反应，得到甲基磺酸四臂聚乙二醇酯或甲基磺酸八臂聚乙二醇酯。在上述温度下优选反应1.5h～2.5h，然后优选升温至15℃～28℃，在上述温度下优选反应48h～72h。
酯化反应完毕后将产物进行提纯，具体为：将得到的反应液过滤，滤去沉淀物，滤液浓缩后，优选用乙醚沉降，再进行过滤、洗涤，优选在20℃～30℃温度下进行真空干燥，所述干燥时间优选为22h～28h，得到甲基磺酸四臂聚乙二醇酯或甲基磺酸八臂聚乙二醇酯。
然后将得到的甲基磺酸四臂聚乙二醇酯或甲基磺酸八臂聚乙二醇酯和氯化铵溶于氨水中进行氨解反应，得到具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇。其中所述甲基磺酸四臂聚乙二醇酯或甲基磺酸八臂聚乙二醇酯的质量、氯化铵的质量与氨水的体积的比例优选为1g∶(1～1.8)g∶(40～50)mL。所述氨解反应的温度优选为20℃～30℃，所述氨解反应时间优选为60h～75h。
在氨解反应完成后，则优选进行提纯，具体为：将得到的反应液优选采用二氯甲烷萃取、然后采用氯化钠水溶液洗涤、无水硫酸钠干燥，将得到的滤液浓缩，然后用乙醚沉降，将得到的沉降物过滤、洗涤，优选在20℃～30℃温度下进行真空干燥，所述干燥时间优选为20h～28h，干燥后得到具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇或具有(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇。
本发明中，所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐优选按照以下方法制备：
将L-谷氨酸和二乙二醇乙醚发生酯化反应，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯；
将所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。
在上述过程中，首先将L-谷氨酸与二乙二醇乙醚混合并搅拌，并在搅拌条件下向其中滴加浓硫酸，在浓硫酸存在且搅拌的条件下，L-谷氨酸与二乙二醇乙醚进行酯化反应，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯。所述L-谷氨酸与二乙二醇乙醚的摩尔比优选为1∶(3～5)，所述L-谷氨酸与浓硫酸的摩尔比优选为1∶(1.2～2)。所述L-谷氨酸与二乙二醇乙醚混合的温度优选为3℃～15℃，所述酯化反应的温度优选为28℃～40℃，所述酯化反应时间优选为10h～30h。
所述L-谷氨酸与所述二乙二醇乙醚的酯化反应完成后，优选采用三乙胺和异丙醇的混合溶液中和得到的反应液，然后将得到的混合溶液离心、重结晶、干燥，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯。上述过程中，所述三乙胺与异丙醇的体积比优选为1∶(2～4)。
本申请然后优选在无水条件下，采用有机溶剂溶解所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯，在有机溶剂中，γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1∶(0.5～0.8)，所述有机溶剂优选为四氢呋喃，所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯混合时的温度优选为20℃～30℃，所述反应温度优选为40℃～60℃，所述缩合反应时间优选为0.2h～2h。
上述缩合反应结束后则进行提纯，具体为：将得到的反应液优选采用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，然后将得到的分离产物洗涤、干燥，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。
本发明还提供了一种水凝胶，包含本申请所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物和溶剂。其中，所述水凝胶中所述多臂嵌段共聚物的含量优选为2wt％～30wt％，更优选为3wt％～25wt％，因为在实验过程中，申请人发现当本申请所述的多臂嵌段共聚物的浓度若增大，则在低温时多臂嵌段共聚物溶液的粘度会变大，且凝胶的转变温度变低，透明度下降，由高温至低温转变时间延长。本申请对所述溶剂没有特别的限制，为本领域技术人员熟知的，作为优选方案，本申请所述溶剂优选为水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液，在实施例中，优选为缓冲溶液或生理盐水，更优选为缓冲溶液。
热可逆水凝胶是由于随着温度的可逆变化，氢键和疏水作用发生可逆转变，而导致高分子的聚集状态发生可逆转变。形成热可逆水凝胶的高分子在结构上均包含一定比例的疏水链段和亲水链段，适当的亲水链段与疏水链段的比例，可使高分子的水溶液在适当的温度和浓度范围内发生凝胶转变。本申请提供的多臂嵌段共聚物溶液通过实验结果预测其机理为嵌段共聚物在低温下自组装形成分散的胶束，呈现为流动性较好的透明水溶液；随着温度的升高，多臂嵌段共聚物由相对亲水状态转变为相对疏水状态，胶束发生聚集从而形成凝胶网络；温度继续升高，多臂嵌段共聚物更加疏水，亲疏水平衡被打破，自组装结构被破坏，凝胶又转变为流动的沉淀状态或发生脱水。当多臂嵌段共聚物再次降温到一定程度时，又可以转变为具有成胶能力的流动液体。
本发明对水凝胶的制备方法没有特殊要求，如可以按照以下方法制备得到：将所述多臂嵌段共聚物与溶剂混合后，得到多臂嵌段共聚物溶液；
将所述多臂嵌段共聚物溶液置于恒温水浴中，得到水凝胶。
在上述过程中，所述多臂嵌段共聚物溶液的质量浓度优选为2wt％～30wt％，更优选为3wt％～25wt％，所述恒温温度优选为0℃～70℃，所述放置时间优选为8min～12min。
在得到水凝胶后，本申请对含有不同侧链长度的多臂嵌段共聚物形成的水凝胶的相变行为进行测试，结果表明，水凝胶的相变温度、透明度随侧基长度的不同而改变。因此可以通过调节嵌段共聚物的侧基的长度来调节其形成的热可逆水凝胶的相变行为。
本发明采用以下方法对所述热可逆水凝胶的降解性能进行了测试：
将上述技术方案得到的多臂聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物溶解于缓冲溶液中，得到多臂聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物溶液。所述缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲溶液，所述缓冲溶液的pH优选为6.5～7.5。将得到的多臂嵌段共聚物溶液优选在恒温水浴中放置10分钟，所述恒温水浴的温度优选为35℃～40℃，得到多臂聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶。然后优选将3mL的所述缓冲溶液缓慢加入所述多臂嵌段共聚物水凝胶中，优选将所述多臂嵌段共聚物水凝胶放置于30℃～45℃的恒温振荡箱中，优选为35℃～40℃，所述放置时间优选为4周～10周，采用称重法和凝胶渗透色谱进行分析，结果表明，所述嵌段共聚物形成的温度敏感型水凝胶的降解周期为4周～10周，降解产物为聚乙二醇和L-谷氨酸。
热可逆水凝胶可以随温度的可逆变化发生可逆的相转变过程，不仅具有普通水凝胶的生物医学作用，还能满足其他方面的要求，如细胞培养与回收，拓宽了水凝胶的应用范围。
本发明还提供了一种三维细胞培养材料，包括本发明所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
本发明还提供了一种本发明所述的制备方法制备的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物在制备药物载体中的应用。
本发明提供的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，包含具有式(I)结构的第一嵌段和/或式(II)结构的第二嵌段与具有式(III)结构的第三嵌段，通过实验发现，低温下，多臂嵌段共聚物亲水性较强，在溶剂中为分散的胶束，温度升高时，多臂嵌段共聚物发生疏水堆积形成凝胶网络，温度继续升高，凝胶转变成为沉淀状态或发生脱水，即本发明提供的多臂嵌段共聚物可以随温度变化发生可逆的溶胶-凝胶-沉淀(脱水)转变；此外，通过调节第一嵌段、第二嵌段的形状、分子量及第三嵌段的长度可以调节聚合物相转变温度和透明度，使得本发明提供的多臂嵌段共聚物可以很好的应用于生物医学方面，尤其是作为三维细胞培养材料和药物载体的使用。
下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的制备方法按照实施例1提供的方法制备，其他原料按照本领域技术人员熟知的方式制备或为市售产品。
实施例1
γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的制备：
将30gL-谷氨酸与120ml二乙二醇乙醚混合并搅拌，并在搅拌条件下向其中滴加18ml浓硫酸，在浓硫酸存在且搅拌的条件下，L-谷氨酸与二乙二醇乙醚进行酯化反应，反应时间为24h。反应完成后，用83ml三乙胺和166ml异丙醇的混合溶液中和得到的反应液，然后将得到的混合溶液离心、重结晶、干燥，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯，产率为67％。
将得到的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯取10g溶于150ml四氢呋喃中，缓慢加入双(三氯甲基)碳酸酯6g，反应温度为50℃，反应时间优选为0.5h。反应结束后将反应液倒入700ml石油醚中进行沉降，将沉淀物分离，对得到的分离产物进行洗涤、干燥，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐，产率为90％。
实施例2
将2g数均分子量为1000的端氨基化的四臂聚乙二醇与60mL无水甲苯在130℃下共沸2h除水，然后减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于40mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3.00g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于30mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将所述第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为63.4％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为970，占四臂嵌段共聚物总重量的49.2％。
其中，m为聚合度，m＝4；q为聚合度，q＝1。
实施例3
将0.945g数均分子量为2000的端氨基化的四臂聚乙二醇与25mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于18mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.04g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，图1为本发明实施例3制备的四臂嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为47.6％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为1670，占四臂嵌段共聚物总重量的45.5％。
其中，m为聚合度，m＝10；q为聚合度，q＝2。
实施例4
将1.2g数均分子量为5000的端氨基化的四臂聚乙二醇与35mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于25mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将1.7g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于18mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为76.6％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为5660，占四臂嵌段共聚物总重量的53.1％。
其中，m为聚合度，m＝27；q为聚合度，q＝6。
实施例5
将1g数均分子量为10000的端氨基化的四臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将1.9g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为56.3％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为9260，占四臂嵌段共聚物总重量的48.0％。
其中，m为聚合度，m＝55；q为聚合度，q＝9。
实施例6
将1g数均分子量为2000的端氨基化的四臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于30mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为68.5％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为2940，占四臂嵌段共聚物总重量的59.5％。
其中，m为聚合度，m＝10；q为聚合度，q＝3。
实施例7
将1.5g数均分子量为1000的端氨基化的四臂聚乙二醇与45mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将5.05g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于50mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为74.9％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为1850，占四臂嵌段共聚物总重量的64.9％。
其中，m为聚合度，m＝4；q为聚合度，q＝2。
实施例8
将1g数均分子量为2000的端氨基化的四臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.4g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于45mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，图2为本发明实施例8制备的四臂嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为66％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为4170，占四臂嵌段共聚物总重量的67.6％。
其中，m为聚合度，m＝10；q为聚合度，q＝4。
实施例9
将1g数均分子量为5000的端氨基化的四臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3.8g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于40mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为75.7％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为8890，占四臂嵌段共聚物总重量的64.0％。
其中，m为聚合度，m＝27；q为聚合度，q＝10。
实施例10
将1.2g数均分子量为10000的端氨基化的四臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.0g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于40mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为62.1％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为18570，占四臂嵌段共聚物总重量的65.0％。
其中，m为聚合度，m＝55；q为聚合度，q＝19。
实施例11
将1g数均分子量为10000的端氨基化的八臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二-甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将3.9g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于40mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到八臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的八臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述八臂嵌段共聚物的产率为68.4％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为17460，占八臂嵌段共聚物总重量的63.6％。
其中，n为聚合度，n＝26；q为聚合度，q＝9。
实施例12
将1g数均分子量为20000的端氨基化的八臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二-甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.0g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于40mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到八臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的八臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述八臂嵌段共聚物的产率为73.6％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为36050，占八臂嵌段共聚物总重量的64.3％。
其中，n为聚合度，n＝55；q为聚合度，q＝18。
实施例13
将0.945g数均分子量为2000的端氨基化的四臂聚乙二醇与25mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于18mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将7.4g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于75mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为44.4％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为7100，占四臂嵌段共聚物总重量的78.0％。
其中，m为聚合度，m＝10；q为聚合度，q＝7。
实施例14
将1.26g数均分子量为5000的端氨基化的四臂聚乙二醇与35mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于25mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将8.4g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于85mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，图3为本发明实施例14制备的四臂嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为63.5％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为15680，占四臂嵌段共聚物总重量的75.8％。
其中，m为聚合度，m＝27；q为聚合度，q＝16。
实施例15
将1g数均分子量为10000的端氨基化的四臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将7.6gγ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于80mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为65.8％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为36210，占四臂嵌段共聚物总重量的78.3％。
其中，m为聚合度，m＝55；q为聚合度，q＝37。
实施例16
将1g数均分子量为10000的端氨基化的八臂聚乙二醇与30mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将7.2gγ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于75mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到八臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的八臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，实验结果表明，所述八臂嵌段共聚物的产率为74.2％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为35390，占八臂嵌段共聚物总重量的78％。
其中，n为聚合度，n＝26；q为聚合度，q＝18。
实施例17
将0.72g数均分子量为2000的端氨基化的四臂聚乙二醇与20mL无水甲苯在130℃下共沸除水2h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于15mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将10.0g的γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐溶解于100mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在40℃、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到四臂聚乙二醇-聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
对得到的四臂嵌段共聚物进行核磁共振分析，图4为本发明实施例17制备的四臂嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，实验结果表明，所述四臂嵌段共聚物的产率为61.7％，其中，聚(γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯)的数均分子量为16270，占四臂嵌段共聚物总重量的89.1％。
其中，m为聚合度，m＝10；q为聚合度，q＝17。
实施例18
将本发明实施例9制备的多臂嵌段共聚物配制成质量浓度为5％～10％的磷酸缓冲溶液，采用小管倒置法观察其在0℃～70℃的粘度变化，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。每个温度下平衡10min，升温速率为2℃/min。
结果参见图5，图5为本发明实施例9得到的不同浓度的多臂嵌段共聚物溶液随温度变化的相图。在图5中，曲线左下方的区域代表溶液，曲线右侧的区域代表凝胶，曲线左上方的材料代表沉淀，由图5可知，当多臂嵌段共聚物溶液浓度为5％～10％时，其由溶液形成水凝胶的温度为0℃～20℃，可用于细胞的三维培养及体内注射水凝胶使用。
实施例19
将本发明实施例13制备的多臂嵌段共聚物配制成质量浓度为5％～10％的磷酸缓冲溶液，采用小管倒置法观察其在0℃～70℃的粘度变化，以小管倒置时，30s内不发生流动为凝胶化。每个温度下平衡10min，升温速率为2℃/min。
结果参见图6，图6为本发明实施例13得到的不同浓度的多臂嵌段共聚物溶液随温度变化的相图。在图6中，曲线左下方的区域代表溶液，曲线右侧的区域代表凝胶，曲线左上方的材料代表沉淀，由图6可知，该多臂嵌段共聚物溶液可发生凝胶化，且该凝胶化过程是可逆的；该多臂嵌段共聚物溶液可用作可注射型水凝胶，作为药物载体或者支架材料应用。
实施例20
将本发明实施例8制备的多臂嵌段共聚物配制成质量浓度为6％的磷酸缓冲溶液，观察其在0℃、20℃、37℃、60℃时的状态，待其成胶后，又将温度降低至0℃，观察聚合物溶液的状态。
结果参见图7，图7为本发明在成胶前、成胶后以及可逆回复之后的状态。由图7可知，该热可逆水凝胶具有良好的可逆恢复特性，且恢复速度快，它的这一特性使得该凝胶材料在生物医学应用中具有独特的优势。
实施例21
将本发明实施例4制备的多臂嵌段共聚物配制成质量浓度为15％的磷酸缓冲溶液，观察其在2℃、37℃时的状态，待其成胶后，又将温度降低至2℃，观察聚合物溶液的状态。
结果参见图8，图8为本发明在成胶前、成胶后以及可逆回复之后的状态。由图8可知，该热可逆水凝胶不仅具有热可逆性质，且透明度可调节，它的这一特性使得该凝胶材料在细胞培养方面具有独特的优势。
实施例22
将本发明实施例8中制备的多臂嵌段共聚物溶液在37℃下与本课题组制备的聚乙二醇-聚氨基酸双嵌段共聚物水凝胶(CN201610016424.6)进行对比。
结果参见图9，图9为两种聚合物在相同的分子量、嵌段比例及浓度下的聚合物凝胶状态。由图9可知，本发明中的多臂聚合物水凝胶具有更高的透明度，它的这一特性使得该凝胶材料在细胞培养方面具有独特的优势。
实施例23
采用以下方法对热可逆水凝胶的降解性能进行测试：
将实施例8制备的多臂聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物溶解于pH为6.5～7.5的磷酸盐缓冲溶液中，得到多臂聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物溶液。将得到的多臂嵌段共聚物溶液在35℃～40℃的恒温水浴中放置10min，得到多臂聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物水凝胶；将3mL的所述缓冲溶液缓慢加入所述多臂嵌段共聚物水凝胶中，然后放置于30℃～45℃的恒温振荡箱中，放置4周～10周，采用称重法和凝胶渗透色谱进行分析，结果表明，所述多臂嵌段共聚物形成的热可逆水凝胶的降解周期为4周～10周，降解产物为聚乙二醇和L-谷氨酸。
由以上实施例可知，本发明提供的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物水凝胶聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物具有聚氨基酸材料的优良的生物相容性和生物可降解性，且降解产物为无毒的小分子氨基酸，不会产生酸性降解和局部炎性反应；此外，在相同分子量下，多臂聚合物具有更大的官能团密度，能形成更紧密的聚合物网络，耐热性和弹性模量较线型聚合物高，具有更好的机械性能，已经得到了越来越多的研究，而且该多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物水凝胶不仅能随温度变化产生迅速可逆的溶胶-凝胶互相转变过程，还可以通过改变聚合物结构和水凝胶浓度调节凝胶相转变温度、透明度和力学强度，使得该材料同时具有可注射、可降解、热可逆、物理性质可调节等特点，可用于药物释放、蛋白释放、肿瘤治疗等生物医学方面，尤其在细胞的三维培养、观察与收集中具有独特的优势。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，包含具有式(I)结构的第一嵌段和/或式(II)结构的第二嵌段与具有式(III)结构的第三嵌段：
其中，m为聚合度，6≤m≤50；
n为聚合度，26≤n≤55；
q为聚合度，2≤q≤35；
所述第三嵌段占所述多臂嵌段共聚物总数均分子量的40％～90％。
2.一种权利要求1所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式(IV)结构的端氨基化的四臂聚乙二醇和/或具有式(V)结构的端氨基化的八臂聚乙二醇中的一种与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐发生聚合反应，得到权利要求1所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物；
其中，m为聚合度，6≤m≤50；
n为聚合度，26≤n≤55。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述端氨基化的四臂聚乙二醇或端氨基化的八臂聚乙二醇与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的摩尔比为1:(4～164)；
所述端氨基化的四臂聚乙二醇和端氨基化的八臂聚乙二醇的总摩尔数与γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐的摩尔数之比为1:(4～164)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐按照以下方法制备：
1)将L-谷氨酸和二乙二醇乙醚混合反应，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯；
2)将所述γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯与双(三氯甲基)碳酸酯混合反应，得到γ-乙氧基二乙二醇-L-谷氨酸酯-N-羧酸内酸酐。
5.一种水凝胶，包含权利要求1所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物或权利要求2-4任意一项所述的制备方法制备的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物和溶剂。
6.根据权利要求5所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物的含量为2wt％～30wt％。
7.一种三维细胞培养材料，包括权利要求1所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物或权利要求2-4任意一项所述的制备方法制备的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物。
8.一种权利要求1所述的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物或权利要求2-4任意一项所述的制备方法制备的多臂聚乙二醇-聚(L-谷氨酸酯)嵌段共聚物在制备药物载体中的应用。
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