CN115636884A - 一种透明质酸钠衍生物制备方法及交联透明质酸钠和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医用高分子材料技术领域，具体涉及一种透明质酸钠衍生物制备方法及交联透明质酸钠和用途。所述透明质酸钠衍生物，结构式如下，其中，R基为碱基，HA为透明质酸钠；当所述衍生物为嘧啶修饰的透明质酸钠时，R基为嘧啶碱基；当所述衍生物为嘌呤修饰的透明质酸钠时，R基为嘌呤碱基。本发明具有安全性高、抗酶解性能好的优点。

Description

一种透明质酸钠衍生物制备方法及交联透明质酸钠和用途

技术领域

本发明涉及生物医用高分子材料技术领域，具体涉及一种透明质酸钠衍生物制备方法及交联透明质酸钠和用途。

背景技术

透明质酸钠，又称玻尿酸钠，是细胞基质和多种组织的重要组成成分，具有多种重要的生理学功能，例如：调节细胞增殖、迁移和分化，天然的保湿作用，润滑关节保护软骨，调节蛋白质合成，调节炎症反应，调节免疫功能，促进伤口愈合等。透明质酸钠独特的黏弹性、生物相容性和可降解性使其在生物医学领域有广泛的应用，包括作为眼科手术助剂、外科手术后防粘连剂、皮肤创伤愈合再生助剂、药物载体、组织工程支架等。

然而，透明质酸钠在体内易被降解吸收，滞留时间较短，这大大限制了其在生物医学领域的应用。例如，注射入皮肤或关节后，其半衰期不超过24h。因此需要对透明质酸钠进行化学改性，赋予其更为优良的机械强度、流变学特性及抗酶解能力等，扩大其在生物医学领域的应用范围。

通过对透明质酸钠分子进行结构改性，可以在保留透明质酸钠原有生物相容性的同时，改变透明质酸钠的某些理化属性，并拓宽其临床应用效果。结构改性的方法主要有：修饰和交联。交联透明质酸钠的原理是使用一种或多种组合的化学交联剂，利用交联剂自身存在的基团与透明质酸钠上相关的一个或多个基团(羧基、羟基和乙酰基)发生反应，使透明质酸钠分子之间交联在一起，而形成三维网络结构。交联透明质酸钠具有水溶性低、稳定性好和粘弹性优良等优点。

目前已经知道有多种制备交联透明质酸（钠）方法。例如，美国专利4,582,865公开了利用二乙烯基砜作为交联剂制备透明质酸凝胶的方法；美国专利5,356,883公开了利用碳二亚胺与透明质酸或其盐的羧基发生交联反应的方法；美国专利5,827,937公开了通过两步交联反应得到交联多糖凝胶的方法；中国专利CN1342171A描述了多重交联的透明质酸衍生物的生产方法；中国专利CN1590444A描述了透明质酸经脱蛋白质处理后，用缩水甘油醚交联制得透明质酸凝胶的过程。但是，上述专利只叙述了交联透明质酸凝胶块的制备过程，对凝胶中的杂质即未反应的交联剂的去除等方面未进行描述，存在一定的安全隐患。

中国专利CN103848995A公开了一种制备透明质酸纳米微球材料的方法，提供了一种基于碱基配对作用交联透明质酸纳米微球的手段。采用反相乳液交联技术，通过碱基配对作用，实现了透明质酸纳米微球的交联，得到了结构稳定的透明质酸纳米微球。该发明避免使用了有毒化学交联剂，能保留被包埋药物的生物活性，可显著改善纳米微球材料的使用安全性，但是其抗酶解性能有待进一步提高。

因此，开发一种能解决上述技术问题的透明质酸钠衍生物的制备方法以及交联透明质酸钠是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种安全性高、抗酶解性能好的透明质酸钠衍生物的制备方法以及交联透明质酸钠。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种透明质酸钠衍生物，其结构式如下：

；

其中，R基为碱基；HA为透明质酸钠；

当所述衍生物为嘧啶修饰的透明质酸钠时，R基为嘧啶碱基；

当所述衍生物为嘌呤修饰的透明质酸钠时，R基为嘌呤碱基。

优选地，所述嘧啶碱基为胸腺嘧啶碱基、胞嘧啶碱基或尿嘧啶碱基；所述嘌呤碱基为腺嘌呤碱基或鸟嘌呤碱基。

更优选地，所述衍生物的结构具体如下：

。

优选地，所述衍生物的修饰度（即碱基取代度）为1-10%。

本发明还涉及上述的衍生物的制备方法，当R基为嘧啶碱基或腺嘌呤碱基时，制备方法包括如下步骤：

（1）将嘧啶或腺嘌呤溶解于有机溶剂中，加入乙醇钠和丙烯酸乙酯，干燥，得到白色固体1；

（2）将水合肼加入到白色固体1的乙醇溶液中，加热回流，冷却干燥，得到白色固体2；

（3）将透明质酸钠溶于水中，加入白色固体2，调节pH为酸性，加入EDCI，透析、冷冻干燥，即得。

优选地，步骤（1）中所述有机溶剂为乙醇和甲苯的混合溶剂，两者体积比为7-9:1。

优选地，步骤（1）中在冰水浴条件下加入乙醇钠和丙烯酸乙酯回流。

优选地，步骤（1）中干燥方式为：减压蒸干溶剂，用冷乙醇打浆残渣，过滤，减压干燥，得到白色固体1。

优选地，步骤（2）中加热回流24小时，冷却至室温。

优选地，步骤（2）中冷却后减压蒸干溶剂，残渣用冷乙醇打浆，过滤并减压干燥，得到白色固体2。

优选地，步骤（3）中所述透明质酸钠的分子量为100KDa~2.5MDa。

优选地，步骤（3）中用盐酸调节pH为4-5，加入EDCI在25-35℃下反应，所得液体在透析袋中透析2-4天，所得透析液冷冻干燥，即得。

本发明还涉及上述的衍生物的制备方法，当R基为鸟嘌呤碱基时，制备方法包括如下步骤：

（1）将鸟嘌呤溶解于有机溶剂和乙酸酐的混合溶剂中，升温回流，降温过滤，收集沉淀物，干燥得到白色固体G-1；

（2）将白色固体G-1溶解到DMF中，加入乙醇钠的乙醇溶液，滴入丙烯酸乙酯反应，干燥、纯化，得到白色固体G-2；

（3）将水合肼加入到白色固体G-2的乙醇溶液中，加热回流，冷却干燥，得到无色固体肼G-3；

（4）将透明质酸钠溶于水中，加入无色固体肼G-3，调节pH为酸性，加入EDCI，透析、冷冻干燥，即得。

优选地，步骤（1）中所述有机溶剂为DMA，DMA和乙酸酐的体积比为1-2:1。

优选地，步骤（1）中沉淀物用乙醇和/或水回流打浆，过滤后用冷乙醇淋洗，减压干燥，得到白色固体G-1。

优选地，步骤（2）中滴入丙烯酸乙酯后在150-170℃封管反应（保证密闭条件）0.5-1.5h，减压除去溶剂，残留物溶解在二氯甲烷中，水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，柱层析纯化，得到白色固体G-2。

优选地，步骤（3）中干燥方式为：减压蒸干溶剂，残渣用冷乙醇打浆，过滤，减压干燥，得到无色固体肼G-3。

优选地，步骤（4）中所述透明质酸钠的分子量为100KDa~2.5MDa。

优选地，步骤（4）中用盐酸调节pH为4-5，加入EDCI在25-35℃下反应，所得液体在透析袋中透析2-4天，所得透析液冷冻干燥，即得。

本发明还涉及一种交联透明质酸钠，由嘧啶修饰的透明质酸钠和嘌呤修饰的透明质酸钠两种原料交联后制得；

所述嘧啶修饰的透明质酸钠为上述嘧啶修饰的透明质酸钠或由上述的制备方法制备得到；

所述嘌呤修饰的透明质酸钠为上述嘌呤修饰的透明质酸钠或由上述的制备方法制备得到。

优选地，所述嘧啶修饰的透明质酸钠和嘌呤修饰的透明质酸钠的质量比为1~5:1~5。

优选地，两种原料根据修饰透明质酸钠的嘧啶和嘌呤类型进行配对，具体为胸腺嘧啶碱基和腺嘌呤碱基修饰的透明质酸钠配对，尿嘧啶碱基和腺嘌呤碱基修饰的透明质酸钠配对，胞嘧啶碱基和鸟嘌呤碱基修饰的透明质酸钠配对。

本发明还涉及上述的交联透明质酸钠的制备方法，包括如下步骤：

将嘧啶修饰的透明质酸钠和嘌呤修饰的透明质酸钠分别溶解在生理盐水中，调节pH为7.0~7.8，静置交联，即得。

优选地，静置交联后用剪刀将凝胶剪成小块，挤压凝胶过80目标准筛，即得。

本发明还涉及上述交联透明质酸钠或上述的制备方法制备得到的交联透明质酸钠在医学美容、皮肤填充、除皱塑形或肌肤修复中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明的透明质酸钠衍生物采用特定碱基进行修饰，安全性高，没有细胞毒性。并且，本发明采用透明质酸钠衍生物交联制备的交联透明质酸钠，除了没有细胞毒性，还具有优异的抗酶解性能。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1.1HA-A的合成

将腺嘌呤A（16.7 g，0.123 mol）溶解在乙醇：甲苯混合液中（v/v=8:1；540 mL），冰水浴中加入乙醇钠（520 mg），然后滴入丙烯酸乙酯（50 mL，0.47ml），回流过夜。减压蒸干溶剂，用冷乙醇打浆残渣，过滤，减压干燥，得白色固体A-1。

在室温下，将80%水合肼（9.58 g，191 mmol）逐滴加到A-1的乙醇溶液中（300 mL乙醇溶解15.0 g A-1，63.7 mmol）。加热回流24小时。冷却至室温后减压蒸干溶剂。残渣用冷乙醇打浆，过滤并减压干燥，得到白色固体A-2。

透明质酸钠（分子量具体见表1）1g室温溶解于20ml蒸馏水，得到澄清透明溶液或凝胶。在上述体系中加入A-2（修饰基使用量见表1），搅拌。用0.1mol / L盐酸调节溶液的pH=4.75，加入EDCI，30℃下使溶液的 pH 值保持在4.75±0.2反应过夜。将所得液体置于30000的透析袋中透析3天，每6小时更换一次纯化水，所得透析液冻干得腺嘌呤修饰透明质酸钠HA-A。

1.2HA-T的合成

将胸腺嘧啶T（2.0g，16mmol）溶解在乙醇：甲苯混合液中（v/v=8:1；63mL），冰水浴中加入乙醇钠（100 mg），然后滴入丙烯酸乙酯（2.2ml，16mmol），回流过夜。减压蒸干溶剂，用冷乙醇打浆残渣，过滤，减压干燥，得白色固体T-1。

在室温下，将80%水合肼（2.3ml，46.2mmol）逐滴添加到T-1的乙醇溶液中（77mL乙醇溶解3.10g T-1，15.4 mmol）。加热回流24小时。将反应液冷却至室温，减压蒸干溶剂。残渣用冷乙醇打浆，过滤并减压干燥，得到白色固体T-2。

透明质酸钠（分子量具体见表1）1g室温溶解于20ml蒸馏水，得到澄清透明溶液或凝胶。在上述体系中加入T-2（修饰基使用量见表1），搅拌。用0.1mol / L盐酸调节溶液的pH=4.75，加入EDCI，30℃下使溶液的 pH 值保持在4.75±0.2反应过夜。将所得液体置于30000的透析袋中透析3天，每6小时更换一次纯化水，所得透析液冻干得胸腺嘧啶修饰透明质酸钠HA-T。

1.3HA-C的合成

将胞嘧啶C（11.11 g，0.10 mol）溶解在乙醇：甲苯混合液中（v/v=8:1；450 mL），冰水浴中加入乙醇钠（500 mg），然后滴入丙烯酸乙酯（10.0g，0.1mol），回流过夜。减压蒸干溶剂，用冷乙醇打浆残渣，过滤，减压干燥，得白色固体C-1。

在室温下，将80%水合肼（9.4 g，0.15mol）逐滴添加到C-1的乙醇溶液中（300mL乙醇溶解10.56g C-1，50 mmol）。加热回流混合物24小时。将反应液冷却至室温，减压蒸干溶剂。残渣用冷乙醇打浆，过滤并减压干燥，得到白色固体C-2。

透明质酸钠（分子量具体见表1）1g室温溶解于20ml蒸馏水，得到澄清透明溶液或凝胶。在上述体系中加入C-2（修饰基使用量见表1），搅拌。用0.1mol / L盐酸调节溶液的pH=4.75，加入EDCI，30℃下使溶液的 pH 值保持在4.75±0.2反应过夜。将所得液体置于30000的透析袋中透析3天，每6小时更换一次纯化水，所得透析液冻干得胞嘧啶修饰透明质酸钠HA-C。

1.4HA-G的合成

将鸟嘌呤G（10.0 g，66.22mmol）溶解在30ml DMA及16.5ml乙酸酐的混合溶剂中升温回流过夜。降温到室温后过滤，收集沉淀物，用15ml纯化水+15ml乙醇混合液回流打浆3小时，过滤用冷50%乙醇淋洗，减压干燥，得白色固体G-1。

将G-1（10.0g，51.8mmol）溶解到50 ml DMF中。加入乙醇钠乙醇溶液（1.76g NaOEt溶解到5ml无水乙醇中，25.9 mmol），搅拌30min。滴入丙烯酸乙酯（3.8ml ，34.96 mmol），并在160℃下封管反应1小时。减压蒸出溶剂，将残留物溶解在二氯甲烷中，水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，柱层析纯化，得到白色固体G-2。

在室温下，将80%水合肼（1.28g，20.46mmol）逐滴添加到乙醇（100 mL）中的搅拌溶液G-2（2.00g，6.82mmol）。然后回流加热混合物24小时。将溶液冷却至室温，并在减压下除去溶剂。残渣用冷乙醇打浆，过滤并减压干燥，得到无色固体肼G-3。

透明质酸钠（分子量具体见表1）1g室温溶解于20ml蒸馏水，得到澄清透明溶液或凝胶。在上述体系中加入G-3（修饰基使用量见表1），搅拌。用0.1mol / L盐酸调节溶液的pH=4.75，加入EDCI，30℃下使溶液的 pH 值保持在4.75±0.2反应过夜。将所得液体置于30000的透析袋中透析3天，每6小时更换一次纯化水，所得透析液冻干得鸟嘌呤修饰透明质酸钠HA-G。

1.5HA-U的合成

将尿嘧啶U（11.21 g，0.10 mol）溶解在乙醇：甲苯混合液中（v/v=8:1；450 mL），冰水浴中加入乙醇钠（450 mg），然后滴入丙烯酸乙酯（10.0g，0.1mol），回流过夜。减压蒸干溶剂，用冷乙醇打浆残渣，过滤，减压干燥，得白色固体U-1。

在室温下，将80%水合肼（9.4 g，0.15mol）逐滴添加到乙醇（300 mL）中的搅拌溶液A-1（10.61g，0.05mol）。然后回流加热混合物24小时。将溶液冷却至室温，并在减压下除去溶剂。残渣用冷乙醇打浆，过滤并减压干燥，得到无色固体肼U-2。

透明质酸钠（分子量具体见表1）1g室温溶解于20ml蒸馏水，得到澄清透明溶液或凝胶。在上述体系中加入U-2（修饰基使用量见表1），搅拌。用0.1mol / L盐酸调节溶液的pH=4.75，加入EDCI，30℃下使溶液的 pH 值保持在4.75±0.2反应过夜。将所得液体置于30000的透析袋中透析3天，每6小时更换一次纯化水，所得透析液冻干得尿嘧啶修饰透明质酸钠HA-U。

1.6 交联透明质酸钠制备通用方法：

将嘧啶修饰的透明质酸钠和嘌呤修饰的透明质酸钠分别溶解在50倍质量的注射用生理盐水中，用磷酸缓冲盐调节PH=7.0~7.8，按照设计比例（见表1）进行混合，静置交联5小时后，用剪刀将凝胶剪成小块，挤压凝胶过80目标准筛，得到交联透明质酸钠。最后将溶液总体积配置成50ml，制成20mg/ml的交联透明质酸钠溶液。

表1

对比例1

羟基修饰碱基配对交联：参照专利CN103848995B实施例1，制备的腺嘌呤功能化透明质酸钠（透明质酸钠分子量250万Da）及胸腺嘧啶功能化透明质酸钠（透明质酸钠分子量250万Da，腺嘌呤或胸腺嘧啶与透明质酸钠的质量比为1:25）将两种功能化的透明质酸钠配置成20mg/ml的磷酸缓冲盐水溶液，调节PH=7.0~7.8，将两种溶液按照1:1混合，静置交联5小时后，用剪刀将凝胶剪成小块，挤压凝胶过80目标准筛，得到交联透明质酸钠。最后将溶液总体积配置成50ml，制成20mg/ml的交联透明质酸钠溶液。

对比例2

BDDE交联：称取分子量为1.80MDa透明质酸钠1.0g，加入到10ml的1%氧氧化钠溶液中，快速搅拌均匀后，加入0.2g BDDE，搅拌15分钟，置于50℃水浴中反应5小时。反应结束后，将凝胶浸泡于蒸馏水中，加入适量盐酸调节凝胶pH值至中性，再用磷酸盐缓冲液纯化数小时。用剪刀将凝胶剪成小块，挤压凝胶过80目标准筛，交联透明质酸钠凝胶颗粒溶液pH值介于7.0~7.8之间。最后将溶液总体积配置成50ml，制成20mg/ml的交联透明质酸钠溶液。

对比例3

BDDE交联：称取分子量为1.80MDa透明质酸钠1.0g，加入到10ml的1%氧氧化钠溶液中，快速搅拌均匀后，加入0.1g BDDE，搅拌15分钟，置于50℃水浴中反应5小时。反应结束后，将凝胶浸泡于蒸馏水中，加入适量盐酸调节凝胶pH值至中性，再用磷酸盐缓冲液纯化数小时。用剪刀将凝胶剪成小块，挤压凝胶过80目标准筛，交联透明质酸钠凝胶颗粒溶液pH值介于7.0~7.8之间。最后将溶液总体积配置成50ml，制成20mg/ml的交联透明质酸钠溶液。

测试例1

抗酶解性能测定：取交联透明质酸钠（20mg/ml）2g置于试管中，向其中加入HAase－B酶液（原酶液稀释10倍）3ml晃匀，于37℃水浴中孵育，不同酶解时间点，取样50μl稀释至3ml，在紫外232nm波长测定波长吸收，直到吸光度不再变化，即为酶解时间终点。结果如表2所示。表2中“交联试剂总用量”表示的是修饰基与未修饰前透明质酸钠的质量比，即修饰度。

表2

交联透明质酸钠型号	酶解终点时间(h)	交联试剂总用量（与HA重量比）
			1号	8	0.01
2号	7	0.01
			3号	7	0.013
4号	18	0.1
			5号	8	0.015
6号	12	0.036
			7号	11	0.025
8号	14	0.05
			9号	12	0.033
对比例1	5	0.04
			对比例2	26	0.2
对比例3	14	0.1

结论：与对比例1相比，采用同样分子量的透明质酸钠进行修饰，本发明1号产品只使用对比例1的1/4使用量的碱基，所得交联产品的抗酶解时间更长；与对比例2和3采用BDDE的交联方式相比，本发明交联透明质酸钠的抗酶解性能整体略弱一些，但是4号产品的抗酶解性能优于对比例3，稍低于对比例2。总体，本发明的抗酶解时间与碱基的用量呈正相关。

测试例2

交联剂、碱基化试剂的细胞毒性

实验步骤：（1）培养细胞直至对数生长期末细胞趋于融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×10⁵个/ml的细胞悬液，从混匀的细胞悬浮液中吸取2 ml的悬浮液，注入6孔培养板的每孔内。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面；

（2）置含5％二氧化碳培养箱, 在37±2℃温度下培养24 h；

（3）将本发明实施例1中的修饰碱基A-2、T-2、C-2、G-3、U-2，对比例1-3中的腺嘌呤、胸腺嘧啶、BDDE，分别配置成0.1mg/ml的水溶液，作为细胞毒性试验样品。阴性对照为已经确认的不产生细胞毒性反应的材料高密度聚乙烯，阳性对照为经确认的可重现细胞毒性反应的材料天然乳胶。

（4）实验前用显微镜检查培养细胞单层的情况。弃去原培养液，每孔加入2 ml的新鲜细胞培养液。将实验样品，阴性对照样品，阳性对照样品分别轻轻放入培养板孔内，并使其沉于皿底，每组平行操作3孔；

（5）置含5％二氧化碳培养箱, 在37±2℃温度下培养48h；

（6）置倒置光学显微镜下观察，按表3细胞毒性反应分级标准进行判定。

表3

级别	反应程度	显微镜下反应观察
			0	无	细胞形态正常，贴壁生长良好，胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解
1	极轻	至多20%的细胞呈圆形，疏松贴壁，偶可见细胞溶解
			2	轻微	至多50%的细胞呈圆形，明显可见细胞溶解和细胞间空间
3	中度	至多70%的细胞呈圆形或溶解
			4	重度	细胞呈几乎完全破坏

各实验样品及对照品的实验结果如表4所示。

表4

实验	级别
		空白对照组	0
阴性对照组	1
		阳性对照组	4
A-2组	0
		T-2组	0
C-2组	0
		G-3组	0
U-2组	0
		腺嘌呤组	0
胸腺嘧啶组	0
		BDDE组	4

实验结果显示，本发明所用的交联碱基试剂、碱基均没有细胞毒性，所以本发明的交联透明质酸钠在体内降解后不会产生毒性。而目前市场上所用的交联剂BDDE具有重度细胞毒性，因此在目前市场上均推出各种除去BDDE的方法（控制限度不超过2ppm，花费大量时间和成本），但由于其严重的细胞毒，各种方法不能从本质上改变交联产品的使用风险。而本发明的方法从根本上改变了交联透明质酸钠交联剂残留的风险。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (21)

1.一种透明质酸钠衍生物，其结构式如下：

；

其中，R基为碱基，HA为透明质酸钠；

当所述衍生物为嘧啶修饰的透明质酸钠时，R基为嘧啶碱基；

当所述衍生物为嘌呤修饰的透明质酸钠时，R基为嘌呤碱基。

2.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，所述嘧啶碱基为胸腺嘧啶碱基、胞嘧啶碱基或尿嘧啶碱基；所述嘌呤碱基为腺嘌呤碱基或鸟嘌呤碱基。

3.根据权利要求2所述的衍生物，其特征在于，结构具体如下：

。

4.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，修饰度为1-10%。

5.一种权利要求2或3所述的衍生物的制备方法，当R基为嘧啶碱基或腺嘌呤碱基时，制备方法包括如下步骤：

（1）将嘧啶或腺嘌呤溶解于有机溶剂中，加入乙醇钠和丙烯酸乙酯，干燥，得到白色固体1；

（2）将水合肼加入到白色固体1的乙醇溶液中，加热回流，冷却干燥，得到白色固体2；

（3）将透明质酸钠溶于水中，加入白色固体2，调节pH为酸性，加入EDCI，透析、冷冻干燥，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述有机溶剂为乙醇和甲苯的混合溶剂，两者体积比为7-9:1。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述透明质酸钠的分子量为100KDa~2.5MDa。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中在冰水浴条件下加入乙醇钠和丙烯酸乙酯回流；干燥方式为：减压蒸干溶剂，用冷乙醇打浆残渣，过滤，减压干燥，得到白色固体1；步骤（2）中的干燥方式与步骤（1）相同。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中用盐酸调节pH为4-5，加入EDCI在25-35℃下反应，所得液体在透析袋中透析2-4天，所得透析液冷冻干燥，即得。

10.一种权利要求2或3所述的衍生物的制备方法，当R基为鸟嘌呤碱基时，制备方法包括如下步骤：

（1）将鸟嘌呤溶解于有机溶剂和乙酸酐的混合溶剂中，升温回流，降温过滤，收集沉淀物，干燥得到白色固体G-1；

（2）将白色固体G-1溶解到DMF中，加入乙醇钠的乙醇溶液，滴入丙烯酸乙酯反应，干燥、纯化，得到白色固体G-2；

（3）将水合肼加入到白色固体G-2的乙醇溶液中，加热回流，冷却干燥，得到无色固体肼G-3；

（4）将透明质酸钠溶于水中，加入无色固体肼G-3，调节pH为酸性，加入EDCI，透析、冷冻干燥，即得。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述有机溶剂为DMA，DMA和乙酸酐的体积比为1-2:1。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中沉淀物用乙醇和/或水回流打浆，过滤后用冷乙醇淋洗，减压干燥，得到白色固体G-1。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中滴入丙烯酸乙酯后在150-170℃密闭条件下反应0.5-1.5h，减压除去溶剂，残留物溶解在二氯甲烷中，水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，柱层析纯化，得到白色固体G-2。

14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中干燥方式为：减压蒸干溶剂，残渣用冷乙醇打浆，过滤，减压干燥，得到无色固体肼G-3。

15.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述透明质酸钠的分子量为100KDa~2.5MDa。

16.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中用盐酸调节pH为4-5，加入EDCI在25-35℃下反应，所得液体在透析袋中透析2-4天，所得透析液冷冻干燥，即得。

17.一种交联透明质酸钠，其特征在于，由嘧啶修饰的透明质酸钠和嘌呤修饰的透明质酸钠两种原料交联后制得；

所述嘧啶修饰的透明质酸钠为权利要求1-4任一所述嘧啶修饰的透明质酸钠或由权利要求5-9任一所述的制备方法制备得到；

所述嘌呤修饰的透明质酸钠为权利要求1-4任一所述嘌呤修饰的透明质酸钠或由权利要求5-16任一所述的制备方法制备得到。

18.根据权利要求17所述的交联透明质酸钠，其特征在于，所述嘧啶修饰的透明质酸钠和嘌呤修饰的透明质酸钠的质量比为1~5:1~5。

19.根据权利要求17所述的交联透明质酸钠，其特征在于，两种原料根据修饰透明质酸钠的嘧啶和嘌呤类型进行配对，具体为胸腺嘧啶碱基和腺嘌呤碱基修饰的透明质酸钠配对，尿嘧啶碱基和腺嘌呤碱基修饰的透明质酸钠配对，胞嘧啶碱基和鸟嘌呤碱基修饰的透明质酸钠配对。

20.权利要求17-19任一所述的交联透明质酸钠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将嘧啶修饰的透明质酸钠和嘌呤修饰的透明质酸钠分别溶解在生理盐水中，调节pH为7.0~7.8，静置交联，即得。

21.权利要求17-19任一所述的交联透明质酸钠或权利要求20所述的制备方法制备得到的交联透明质酸钠在医学美容、皮肤填充、除皱塑形或肌肤修复中的应用。