CN112543791B - 基于双官能改性的生物聚合物的聚合物和能够由这种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物获得的水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，其包含至少一个聚合物链，所述至少一个聚合物链包含n个第一官能团和m个第二官能团。第一官能团包含能够依照自由基链增长聚合来自由基交联的基团。第二官能团包含能够进行硫醇‑烯交联的基团。优选的基于双官能改性的生物聚合物的聚合物包含双官能改性的明胶和双官能改性的胶原。本发明进一步涉及一种制备这种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物的方法，并且涉及一种由这种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物制备水凝胶的方法。此外，本发明涉及能够由这种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物获得的水凝胶，并且涉及这种水凝胶的用途。

Description

基于双官能改性的生物聚合物的聚合物和能够由这种基于双 官能改性的生物聚合物的聚合物获得的水凝胶
技术领域
本发明涉及基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，特别是双官能改性的生物聚合物例如双官能改性的明胶和双官能改性的胶原，并且涉及制备这种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物的方法。本发明进一步涉及一种能够由这种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物开始获得的水凝胶，并且涉及一种制备这种水凝胶的方法。此外，本发明涉及这种水凝胶在生物医学应用例如在组织工程学中的用途。
背景技术
明胶是一种天然来源的生物聚合物材料，其具有优异的细胞相互作用性能和形成水凝胶的潜力。它基于其宽广的可用性和成本效率，已经广泛应用于食品和药品工业。结果，该材料已经变成了组织工程学和生物制造领域中的基准之一。但是，由于明胶的特征在于低于生理温度(±30℃)的上限临界溶液温度，所以基于明胶的水凝胶不适于生物医学应用例如组织工程学。为了适于生物医学应用，必需增加明胶在生理条件下的稳定性和机械性能。所以，已经出现了多种策略来使明胶共价交联。使用光交联策略是特别令人关注的，因为这些方法通常的特征在于相对温和的条件，其允许细胞包封在水凝胶中。此外，某些(高解析度)增材制造技术，包括立体光刻法(stereolithography)和双光子聚合(2PP)，需要光交联来结构化该材料。
已知的光交联策略通常可以根据交联机理分为两种主要类别：链增长聚合和逐步增长聚合。历史上，光致明胶交联策略的主要部分使用链增长聚合(自由基调节的链增长光聚合)来进行。在这方面，一种经常报道的明胶衍生物是明胶-甲基丙烯酰胺(Gel-MOD或Gel-MA)，其中明胶的伯胺基团已经使用甲基丙烯酸酐进行了官能化，这产生了交联性甲基丙烯酰胺。在最近十年内，逐步增长硫醇-烯水凝胶例如硫醇-烯(光-)链接(click)水凝胶已经获得了日益增加的关注。它们通常的特征在于更高的反应性和由于它们的正交性而形成的更均匀的网络。因此，它们表现出对于细胞包封的优异的相容性，因为反应的特征在于较低的自由基浓度，并且与链增长水凝胶相反，该反应可以在氧的存在下有效地进行。为了进行硫醇-烯化学，降冰片烯官能度特别令人关注。一方面，它们不易受到竞争性均聚的影响。另一方面，减轻与硫醇反应过程中的环应变，与快速的随后的质子转移相组合，进一步增加了它的硫醇-烯反应性。
明胶甲基丙烯酰胺凝胶(Gel-MOD或Gel-MA)由于交联的性质，通常比硫醇烯水凝胶(Gel-NB)更硬。硫醇-烯水凝胶例如明胶降冰片烯水凝胶(Gel-NB)具有能够控制交联的官能度的量的优点，并且表现出对于基于光的增材制造技术来说改进的加工能力。
此外，通常硫醇-烯水凝胶(Gel-NB)的特征在于由于更疏水的降冰片烯官能度的存在，与甲基丙烯酰胺明胶(Gel-MOD)相比降低的溶胀行为。
此外，由于通过改变硫醇-烯比率来控制硫醇-烯水凝胶(Gel-NB)中的反应的官能度的数目，在交联后可以获得未反应的降冰片烯官能度，其可以用于硫醇化组分的随后的光接枝(例如细胞相互作用次序，活性药物组分，抗氧化剂，……)。但是，通过降低硫醇-烯比率，水凝胶材料的特征在于甚至更差的机械性能，和与之组合的更高的吸水能力。结果，该材料会失去一些高解析度增材制造的益处，因为生产后溶胀一方面将增加构造的尺寸，同时该构造内部的溶胀引起的应力也会导致变形。此外，由于较差的机械性能，该材料当产生具有较小的特征尺寸的构造时会不再能够支撑它的自重。
使用硫醇-烯水凝胶(Gel-NB)的另一缺点是在加工过程中它们在升高的温度有限的存储稳定性，其对于基于挤出/沉积的增材制造具有或不具有细胞包封来说会是必需的，这是由于在硫醇化交联剂中形成二硫化物。结果，该材料会表现出过早的交联，或者硫醇-烯比率不再受控。
Jasper Van Hoorick等人的“Cross-Linkable Gelatins with SuperiorMechanical Properties Through Carboxylic Acid Modification:Increasing theTwo-Photon Polymerization Potential”，Biomacromolecules，第18卷第10期，2017年8月29日，第3260-3272页描述了一种具体的经由羧酸与甲基丙烯酸2-氨基乙酯的反应形成的双官能改性的生物聚合物，被称作GEL-MOD-AEMA，其包含作为第一官能团的甲基丙烯酰胺和作为第二官能团的甲基丙烯酸酯。该双官能改性的生物聚合物表现出与本领域已知更常规的Gel-MOD链增长基生物聚合物相比的交联动力。
发明内容
本发明的一个目标是提供一种基于改性的生物聚合物的聚合物例如改性的明胶，其避免了现有技术的缺点。
本发明的另一目标是提供一种基于改性的生物聚合物的聚合物，其组合了两种官能度：第一官能度，其能够进行常规的自由基链增长聚合，和第二官能度，其易于发生逐步增长硫醇-烯链接反应例如硫醇-烯光偶合反应。
本发明的另一目标是提供一种基于改性的生物聚合物的聚合物，其允许在自由基聚合之后进行受控的后交联接枝。
本发明的又一目标是提供一种改性的明胶，其将对于明胶甲基丙烯酰胺(Gel-MOD)的材料操控和(机械)稳定性的益处与明胶-降冰片烯(Gel-NB)的正交链接化学相组合。
本发明的另一目标是提供一种适于制备水凝胶的基于改性的生物聚合物的聚合物，其允许依靠硫醇-烯光接枝来局部地和受控地引入某些官能度。
本发明的另一目标是提供一种水凝胶，其具有令人感兴趣的机械性能例如强度和硬度。具体地，目标是提供一种水凝胶，其具有与明胶-降冰片烯相比改进的机械性能，而不管硫醇-烯比率如何，同时仍然表现出硫醇-烯接枝潜力。
本发明的又一目标是提供一种水凝胶，其具有可控的溶胀和/或吸水性。
此外，本发明的一个目标是提供一种水凝胶，其具有改进的存储稳定性，特别是在高温时。
根据本发明的第一方面，提供了一种基于双官能改性的生物聚合物的聚合物。该双官能化明胶包含至少一个聚合物链。该至少一个聚合物链包含至少两种类型的官能团：n个第一官能团和m个第二官能团，并且n或m都不是零。第一官能团包括能够依照自由基链增长聚合进行自由基交联的基团。第二官能团包括硫醇-烯交联性基团，其在第一官能团的自由基链增长聚合过程中保持未反应。
优选地，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物的第一官能团的取代度是1％-95％，更优选5％-75％，例如15％-75％，或15％-50％。
基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶或双官能改性的胶原，包含至少一个第一官能团/聚合物链，优选多于一个第一官能团/聚合物链。该基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶，包含至少一个第一官能团/聚合物链，和包含优选多于一个第一官能团，例如5，10，20，30，50，60，70，80，90或100个第一官能团/聚合物链。优选地，该基于双官能改性的生物聚合物的聚合物的第二官能团的取代度是5％-95％，更优选5％-75％，例如15％-75％，或15％-50％。
基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶或双官能改性的胶原，包含至少一个第二官能团/聚合物链，更优选多于一个第二官能团/聚合物链。该基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶，包含至少一个第二官能团，和包含优选多于一个第二官能团，例如5，10，20，30，50，60，70，80，90或100个第二官能团/聚合物链。
根据本发明的基于双官能改性的生物聚合物的聚合物具有将两种官能度相组合的优点：第一官能度，其能够进行常规的自由基聚合，和第二官能度，其易于发生硫醇-烯链接反应，例如硫醇烯光链接(photoclick)反应。第二官能团在自由基聚合过程中保持未反应，并且允许获得交联后接枝。第二官能团允许引入某些硫醇化的官能度。第二官能团允许例如加工后接枝，例如生物活性分子的加工后接枝，来基于特定需要进一步调节基于生物聚合物的聚合物。
根据本发明的基于双官能化生物聚合物的聚合物可以包含任何类型的生物聚合物或聚合型生物分子，其能够用第一和第二官能团来官能化。生物聚合物和聚合型生物聚合物包括天然来源的聚合物。出于本发明的目的，术语“生物聚合物”和“聚合型生物分子”可互换使用。出于本发明的目的，术语“基于生物聚合物的聚合物”指的是生物聚合物，生物聚合物的衍生物，生物聚合物的重组体类似物，聚合型生物聚合物的合成类似物的全部类型。生物聚合物的化学衍生物包括但不限于具有官能化侧链的生物聚合物以及生物聚合物的水解产物。生物聚合物的重组体类似物包括这样的生物聚合物，其经由在生物聚合物合成中形成的生物体中或者具有规定的氨基酸序列的蛋白质中的规定的合成DNA序列的编码来获得。生物聚合物的合成类似物包括这样的聚合物，其通过将不同单体彼此连接来合成产生，这获得了在它的侧链上含有不同官能度的聚合物。这种合成的例子包括固相肽合成。基于生物聚合物的聚合物的例子包括多糖、核酸、明胶、胶原、藻酸盐、右旋糖酐、琼脂糖、糖胺聚糖(例如透明质酸)、壳聚糖和角叉菜胶以及多糖、核酸、明胶、胶原、藻酸盐、右旋糖酐、琼脂糖、糖胺聚糖(例如透明质酸)、壳聚糖和角叉菜胶的衍生物、重组体类似物和合成类似物。出于本发明的目的，生物相容性聚合物也被认为是基于生物聚合物的聚合物。特别优选的基于生物聚合物的聚合物包括明胶和胶原、重组体明胶和重组体胶原。
第一官能团可以包含任何类型这样的官能团，其能够或易于依照自由基链增长聚合进行自由基交联。第一官能团优选的例子包括甲基丙烯酰胺官能团、丙烯酰胺官能团、甲基丙烯酸酯官能团和/或丙烯酸酯官能团。特别优选的第一官能团包括甲基丙烯酰胺官能团和/或丙烯酰胺官能团。在具体的实施方案中，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶，包含仅一种类型的第一官能团，例如甲基丙烯酰胺官能团或丙烯酰胺官能团或甲基丙烯酸酯官能团或丙烯酸酯官能团。在其他实施方案中，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶，包含不同的第一官能团的组合，例如甲基丙烯酰胺官能团和丙烯酰胺官能团的组合。
第二官能团可以包括任何类型的这样的官能团，其能够或易于进行硫醇-烯交联。优选地，第二官能团包含这样的官能团，其能够或易于进行硫醇-烯交联，而不能经历竞争性均聚。第二官能团包括例如降冰片烯官能团、乙烯基醚官能团、乙烯基酯官能团、烯丙基醚官能团、丙烯基醚官能团和/或烯烃官能团和/或N-乙烯基酰胺官能团。特别优选的第二官能团包括降冰片烯官能团和/或乙烯基醚官能团。在具体的实施方案中，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶，包含仅一种类型的第二官能团，例如降冰片烯官能团或乙烯基醚官能团或乙烯基酯官能团或烯烃官能团或N-乙烯基酰胺官能团。在其他实施方案中，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶，包含不同的第二官能团的组合，例如降冰片烯官能团和乙烯基酯官能团的组合。
在优选的实施方案中，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物包含甲基丙烯酰胺作为第一官能团和降冰片烯官能团作为第二官能团。
在其他实施方案中，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物包含甲基丙烯酰胺作为第一官能团和乙烯基酯官能团作为第二官能团。
在另一实施方案中，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物包含丙烯酰胺作为第一官能团和降冰片烯官能团作为第二官能团。
在又一实施方案中，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物包含丙烯酰胺作为第一官能团和乙烯基酯官能团作为第二官能团。
根据本发明的双官能改性的明胶优选的第一官能团和第二官能团的总取代度高于2％。第一官能和第二官能团的总取代度表示第一官能团的取代度和第二官能团的取代度之和。总取代度是2％-100％，例如5％-100％，或5％-95％，例如20％，40％，50％，60％，70％，或80％。
基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶，包含至少一个第一官能团/聚合物链，优选多于一个第一官能团/聚合物链，和包含至少一个第二官能团/聚合物链和优选多于一个第二官能团/聚合物链。基于双官能改性的生物聚合物的聚合物包含例如5，10，20，30，50，60，70，80，90，或100个第一官能团，和5，10，20，30，50，60，70，80，90，或100个第二官能团/聚合物链。
根据本发明的基于双官能改性的生物聚合物的聚合物可以包含单一聚合物链，或者可以包含许多聚合物链。在任何情况中，一个聚合物链包含第一官能团和第二官能团二者。通过将第一官能团和第二官能团引入一个聚合物链中，基于生物聚合物的聚合物不会遭受相分离。
根据本发明的基于双官能改性的生物聚合物的聚合物对于制备水凝胶来说特别重要。基于生物聚合物的聚合物的双官能团使它们对于大量应用具有吸引力。
基于双官能改性的生物聚合物的聚合物允许例如局部地和受控地引入某些官能度，例如来获得对于天然的细胞外基质更好的模拟。
基于双官能改性的生物聚合物的聚合物还允许通过利用另外的硫醇-烯交联来引入局部和受控的强度和/或硬度的区域。
此外，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物允许直接的材料处置和与之组合的直接的生产后官能化。
此外，基于双官能改性的生物聚合物的聚合物允许通过亲水性或疏水性官能度的交联后接枝，来控制最终的材料吸水性和溶剂相容性。
根据本发明的第二方面，提供了一种制备基于双官能改性的生物聚合物的聚合物的方法。该方法包括步骤：
a)提供基于生物聚合物的生物聚合物，其包含至少一种聚合物链，所述聚合物链含有伯官能团；
b)使所述伯官能团的第一部分官能化来引入n个第一官能团，其中n不是零，所述第一官能团能够依照自由基链增长聚合来进行自由基交联；
c)使所述伯官能团的第二部分官能化来引入m个第二官能团，其中m不是零，所述第二官能团包含硫醇烯交联性基团。
其中步骤b)和步骤c)可以同时进行，或者其中步骤b)可以在步骤c)之前或之后进行。在优选的方法中，步骤b)在步骤c)之前进行。在可选的方法中，步骤c)在步骤b)之前进行。步骤c)在步骤b)之前进行的方法具有在与第一官能团反应之前引入官能度的优点。对于在交联之前影响材料的疏水性，或者经由硫醇-烯化学引入光可逆基团，这是重要的，其可以在交联后离解来以时空受控引入机械性能更低的区域。
基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含例如胺官能团，例如伯胺官能团、羧酸官能团、羟基官能团或其组合。
在一种优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含胺官能团，和步骤b)包括这些胺官能团或这些胺官能团的一部分例如与甲基丙烯酸酐的反应。
在其他优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含羧酸官能团，和步骤b)包括这些羧酸官能团或的这些羧酸官能团的一部分的反应。
在另一优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含羟基官能团，和步骤b)包括这些羟基官能团或这些羟基官能团的一部分的反应。
显然在伯官能团包含伯官能团的组合，例如胺官能团、羧酸官能团和/或羟基官能团的组合的情况中，步骤b)可以包括反应的组合，例如胺官能团或胺官能团的一部分例如与甲基丙烯酸酐的反应，和/或羧酸官能团或羧酸官能团的一部分的反应，和/或羟基官能团或羟基官能团的一部分的反应。
在另一优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含胺官能团，和步骤c)包括这些胺官能团或这些胺官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-羧酸的反应。一种优选的胺官能团或胺官能团的一部分的反应使用了碳二酰亚胺偶合化学(例如使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基)丙基)-碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))来将5-降冰片烯-2-羧酸偶合到胺官能团。
在另一优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含胺官能团，和步骤c)包括胺官能团或胺官能团的一部分与卡巴酸酐的反应。
在又一优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含羧酸官能团，和步骤c)包括这些羧酸官能团或这些羧酸官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-甲基胺的反应。优选的羧酸官能团或羧酸官能团的一部分的反应使用了碳二酰亚胺偶合化学，来将5-降冰片烯-2-甲基胺偶合到羧酸官能团。
在又一优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含羟基，和步骤c)包括这些羟基官能团或这些羟基官能团的一部分的反应。
显然在伯官能团包含伯官能团的组合，例如胺官能团、羧酸官能团和/或羟基官能团的组合的情况中，步骤c)可以包括反应的组合，例如上述反应的组合，例如以下反应的组合：胺官能团或胺官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-羧酸的反应，例如使用碳二酰亚胺偶合化学，和/或羧酸官能团或这些羧酸官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-甲基胺的反应，例如使用碳二酰亚胺偶合化学，和/或羟基官能团或羟基官能团的一部分的反应。
在一种特别优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含胺官能团，和步骤b)包括这些胺官能团的一部分例如与甲基丙烯酸酐的反应，而步骤c)包括这些胺官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-羧酸的反应，或者步骤c)包括这些胺官能团的一部分与卡巴酸酐的反应。
在另一特别优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含羧酸官能团，和步骤b)包括这些羧酸官能团的一部分例如与2-氨基乙基甲基丙烯酸酯的反应，而步骤c)包括这些羧酸官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-甲基胺的反应。
在另一特别优选的方法中，基于生物聚合物的聚合物的伯官能团包含胺官能团和/或羧酸官能团，和步骤b)包括这些胺官能团的一部分例如与甲基丙烯酸酐的反应，和/或这些羧酸官能团的一部分例如与甲基丙烯酸2-氨基乙酯的反应，而步骤c)包括胺官能团的一部分与例如5-降冰片烯-2-羧酸的反应和羧酸官能团的一部分与例如5-降冰片烯-2-甲基胺的反应。
一种优选的方法涉及一种制备双官能改性的明胶的方法。该方法包括步骤：
a)提供包含至少一个聚合物链的明胶，所述聚合物链包含伯官能团例如胺官能团和/或羧酸官能团；
b)使所述伯官能团的第一部分官能化来引入n个第一官能团，其中n不是零，所述第一官能团能够依照自由基链增长聚合来进行自由基交联；
c)使所述伯官能团的第二部分官能化来引入m个第二官能团，其中m不是零，所述第二官能团包含硫醇烯交联性基团。
其中步骤b)和步骤c)可以同时进行，或者其中步骤b)可以在步骤c)之前或之后进行。在优选的方法中，步骤b)在步骤c)之前进行。在可选的方法中，步骤c)在步骤b)之前进行。
明胶的伯官能团包含例如胺官能团，例如伯胺官能团、羧酸官能团、羟基官能团或其组合。
在一种优选的方法中，明胶的伯官能团包含胺官能团，和步骤b)包括这些胺官能团或这些胺官能团的一部分例如与甲基丙烯酸酐的反应。
在其他优选的方法中，明胶的伯官能团包含羧酸官能团，和步骤b)包括这些羧酸官能团或这些羧酸官能团的一部分的反应。
显然在明胶的伯官能团包含不同官能团的组合，例如胺官能团和/或羧酸官能团和/或羟基官能团的组合的情况中，步骤b)可以包括反应的组合，即胺官能团或胺官能团的一部分例如与甲基丙烯酸酐的反应，和/或羧酸官能团或羧酸官能团的一部分例如与甲基丙烯酸2-氨基乙酯的反应。如果明胶包含另外的伯官能团，则步骤b)可以进一步包括这些另外的伯官能团或这些另外的伯官能团的一部分的反应。
在另一优选的方法中，明胶的伯官能团包含胺官能团，和步骤c)包括这些胺官能团或这些胺官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-羧酸的反应。一种优选的胺官能团或胺官能团的一部分的反应使用了碳二酰亚胺偶合化学(例如使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基)丙基)-碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))来将5-降冰片烯-2-羧酸偶合到胺官能团。
在另一优选的方法中，明胶的伯官能团包含羧酸官能团，和步骤c)包括这些羧酸官能团或这些羧酸官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-甲基胺的反应。一种优选的羧酸官能团或羧酸官能团的一部分的反应使用了碳二酰亚胺偶合化学来将5-降冰片烯-2-甲基胺偶合到羧酸官能团。
在另一优选的方法中，明胶的伯官能团包含胺官能团，和步骤c)包括胺官能团或胺官能团的一部分与卡巴酸酐的反应。
显然在伯官能团包含胺官能团和羧酸官能团的组合的情况中，步骤c)可以包括反应的组合，即反应或上述反应的组合，例如以下反应的组合：胺官能团或胺官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-羧酸的反应，例如使用碳二酰亚胺偶合化学，和羧酸官能团或这些羧酸官能团的一部分例如与5-降冰片烯-2-甲基胺的反应，例如使用碳二酰亚胺偶合化学。如果明胶包含另外的伯官能团，则步骤c)可以进一步包括这些另外的伯官能团或这些另外的伯官能团的一部分的反应。
在一种特别优选的方法中，明胶的伯官能团包含胺官能团，和步骤b)包括这些胺官能团的一部分例如与甲基丙烯酸酐的反应，而步骤c)包括这些胺官能团的一部分与5-降冰片烯-2-羧酸的反应，或者步骤c)包括这些胺官能团的一部分与卡巴酸酐的反应。
在另一特别优选的方法中，明胶的伯官能团包含羧酸官能团，和步骤b)包括这些羧酸官能团的一部分的反应，而步骤c)包括这些羧酸官能团的一部分与5-降冰片烯-2-甲基胺的反应。
在另一特别优选的方法中，明胶的伯官能团包含胺官能团和羧酸官能团，和步骤b)包括这些胺官能团的一部分例如与甲基丙烯酸酐的反应和这些羧酸官能团的一部分例如与甲基丙烯酸2-氨基乙酯的反应，而步骤c)包括胺官能团的一部分与5-降冰片烯-2-羧酸的反应和羧酸官能团的一部分与5-降冰片烯-2-甲基胺的反应。
另一优选的方法涉及一种制备双官能改性的胶原的方法。为了制备双官能改性的胶原，可以考虑与制备双官能改性的明胶相同或类似的方法。
根据本发明的第三方面，提供了一种制备水凝胶的方法。该方法包括步骤：
a)提供基于双官能改性的生物聚合物的聚合物，例如双官能改性的明胶或双官能改性的胶原，如上所述；
b)通过将所述n个第一官能团的至少一部分进行自由基链增长聚合，来使所述基于双官能改性的生物聚合物的聚合物交联；
c)使所述m个第二官能团的至少一部分交联和/或官能化。
根据本发明的制备水凝胶的方法的一个优点是基于双官能改性的生物聚合物的聚合物可以如步骤b)所规定的那样来交联，同时保持步骤c)所规定的交联潜力和/或官能化潜力。
根据本发明的制备水凝胶的方法的另一优点是交联可以在不存在硫醇化交联剂时，在步骤b)中使用自由基链增长聚合来获得。相反，硫醇-烯生物聚合物或基于生物聚合物的聚合物例如硫醇-烯明胶在交联之前需要硫醇化的交联剂。由于根据本发明的交联性溶液不需要硫醇化交联剂，所以交联性溶液与硫醇-烯交联性生物聚合物相比保持更稳定，这是因为一些生物聚合物(例如明胶)需要加热到高于30℃或甚至高于40℃来保持在溶液中。在高于30℃的温度时，使用硫醇化交联剂会形成二硫化物。这被认为是硫醇-烯交联性生物聚合物的相当大的缺点，因为二硫化物的形成减少了对于交联过程中反应的官能度的数目的控制，并且产生了甚至更弱的水凝胶。
硫醇-烯交联性生物聚合物或基于生物聚合物的聚合物的另一缺点是需要精确计算交联剂的量，来对应于需要交联的烯官能度的数目。
在一种优选的方法中，步骤b)包括在活细胞存在下交联，包括例如干细胞、软骨细胞、纤维原细胞，……。为此目的，在制备的材料的溶液内细胞悬浮，随后进行UV引发的交联，由此不杀死悬浮的细胞。结果，可以获得水凝胶内均匀的细胞分布。
制备水凝胶的方法的步骤c)可以包括交联或官能化，或者可以通过使m个官能团的第一部分交联和通过使m个官能团的第二部分官能化而包含交联和官能化的组合。
一种特别优选的官能化类型包含接枝，特别是光接枝，例如使用光刻法(lithography)和/或多光子辅助光接枝(双光子聚合)。
根据本发明的水凝胶允许例如引入更高强度的局部区域和/或更高硬度的局部区域，并且这处于受控方式。这可以例如通过使交联的水凝胶在包含多官能化硫醇的溶液中溶胀，随后局部化接枝来实现。局部化接枝可以使用光掩模或多光子光刻法进行，由此引入更致密交联的区域。
此外，水凝胶允许局部引入生长因子或细胞粘附区域(例如RGD序列)。
官能化允许引入活性化合物，例如使用硫醇-烯机理通过共价固定活性化合物来进行。活性化合物包含例如药物化合物，其可以在水凝胶降解时逐步释放。
此外，通过接枝亲水基团(例如PEG)或疏水基团(例如7-巯基-4-甲基香豆素)，可以影响吸水性。
根据本发明的第四方面，提供了一种水凝胶，特别是官能化的水凝胶。
根据本发明的第五方面，提供了水凝胶，特别是官能化的水凝胶的用途。
根据本发明的(官能化)水凝胶在生物医学应用例如组织工程学中特别重要。(官能化)水凝胶例如适于作为创伤敷料。m个第二官能团或m个第二官能团的一部分可以此外提供另外的功能。
由于能获自根据本发明的双官能改性的聚合物的交联性溶液在升高的温度(高于30℃或高于40℃)也具有高稳定性，所以双官能改性的聚合物适于3D打印。这是相比于本领域已知的水凝胶例如硫醇-烯水凝胶的一个重要优点，由于硫醇-烯水凝胶的3D打印因为它们在升高的温度有限的稳定性而是困难的，这会影响该材料的材料性能。
附图说明
本发明将在下面参考附图来更详细地讨论，其中：
-图1显示了处于平衡溶胀状态的不同明胶衍生物的储能模量G’(顶部)和质量溶胀比(底部)(全部水凝胶在10w/v％浓度在2mol％(相对于光交联性基团的量)的Li-TPO-L光引发剂的存在下交联)；
-图2显示了在不同的时空能量在交联的Gel-MOD-NB粒料内部荧光7-甲基-4-巯基香豆素的多光子辅助接枝的荧光显微图像(左边)和正常光学显微图像(右边)；
-图3显示了对于不同的明胶衍生物，使用不同的明胶浓度的细胞存活率。
具体实施方式
本发明将涉及具体实施方案和参考某些附图来描述，但是本发明不限于此，而是仅受到权利要求书所限。
实施例1：制备方法和双官能化明胶(Gel-MOD-NB)
材料
使用以下化学品：
-明胶类型B，通过碱处理来从牛皮(bovine hides)中分离，由Rousselot(Ghent，比利时)提供。
-甲基丙烯酸酐，5-降冰片烯-2-羧酸，1-乙基-3-(3-二甲基氨基)丙基)-碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)，D,L-二硫苏糖醇(DTT)，来自于Sigma-Aldrich(Diegem，比利时)。
-二甲基亚砜(DMSO)(99.85％)和N-羟基琥珀酰亚胺(98％)(NHS)，购自Acros(Geel，比利时)。
-Irgacure 2959(1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙-1-酮)，来自于BASF。
-渗析膜Spectra/por(MWCO 12-14kDa)，购自polylab(Antwerp，比利时)。
制备Gel-MOD
DS(取代度)为72％的Gel-MOD依照在A.I.Van Den Bulcke，B.Bogdanov，N.DeRooze，E.H.Schacht，M.Cornelissen和H.Berghmans，“Structural and RheologicalProperties of Methacrylamide Modified Gelatin Hydrogels”，Biomacromolecules，第1卷第1期，第31-38页，2000年3月中所述的方案和根据以下反应来合成：
Figure BDA0002806139040000151
简单来说，在40℃将100g的明胶类型B溶解在1L磷酸盐缓冲液(pH 7.8)中。在溶解完成后，添加相对于(羟基-)赖氨酸和鸟氨酸侧链中存在的伯胺1当量的甲基丙烯酸酐，并将混合物强力搅拌。在1h后，使用1L双蒸馏水(DDW)稀释该混合物，并在24h内针对DDW引入渗析膜(Spectra/por MWCO 12-14kDa)。在渗析后，使用NaOH将该混合物的pH调节为7.4来更接近地模拟天然ECM，并使用冻干法(Christ冻干机Alpha 2-4LSC)来分离Gel-MOD。
制备Gel-MOD-NB
为了制备10g的Gel-MOD-NB，首先将5-降冰片烯-2-羧酸活化成它的琥珀酰亚胺基酯。为此目的，首先将相对于要添加的EDC 1.6倍过量的5-降冰片烯-2-羧酸(638mg，4.62mmol)溶解在50ml的无水DMSO(经由真空蒸馏，使用CaH2作为干燥剂来获得)中。在完全溶解后，添加0.75当量的EDC(555mg，2.9mmol)(相对于10g明胶中存在的初始伯胺，即0.38mmol/g明胶)和1.5当量的NHS(相对于EDC)，随后进行3次脱气。反应进行至少25小时来消除任何未反应的EDC官能度，其会导致下一反应步骤中的明胶交联。
在25h的反应后，在50℃在惰性气氛(Ar)和回流条件下将10g具有已知DS的Gel-MOD溶解在150ml无水DMSO(经由真空蒸馏，使用CaH2作为干燥剂来获得)中。在添加后，将设施脱气3次和置于氩气氛下。在完全溶解后，将制备的5-降冰片烯-2-琥珀酰亚胺基酯混合物添加到明胶溶液，随后脱气3次。使混合物在50℃在惰性气氛和回流条件下反应5-20h。
在反应后，将该混合物在十倍过量的丙酮中沉淀，使用Büchner过滤器在滤纸上过滤(VWR，孔尺寸：12-15μm)，溶解在DDW中并在24h内在40℃针对DDW渗析(Spectra/por 4：MWCO 12-14kDa)。在渗析后，使用NaOH将pH调节到7.4，随后冷冻和冻干(Christ冻干机Alpha 2-4LSC)。Gel-MOD-NB的制备通过反应[2]表示：
Figure BDA0002806139040000161
Gel-MOD-NB的性能
图1显示了不同明胶衍生物的储能模量G’(顶部)和质量溶胀比(底部)。储能模量G’对应于在5mM DTT的存在下另外交联30分钟并随后平衡溶胀之前和之后的Gel-MODDS72，Gel-NB DS90+DTT(硫醇/烯：1)，Gel-MOD-NB DS72，以及Gel-MOD DS95在30分钟交联(使用2mol％(相对于交联性官能度的量)的Li-TPO-L作为光引发剂)和在milliQ中培养24小时之后，处于平衡溶胀状态的10w/v％交联的明胶的储能模量。
Gel-MOD DS72，Gel-MOD DS95和Gel-MOD-NB DS72的质量溶胀比显示在图1的底部区中。
在使第一甲基丙烯酰胺官能度交联和平衡溶胀之后，Gel-MOD-NB衍生物表现出与具有类似DS的Gel-MOD相比稍高的硬度，不过仅甲基丙烯酰胺是聚合的。虽然本发明人不希望受限于任何理论，但是据估计机械性能的这种增加是存在疏水性降冰片烯官能度的结果，其导致明胶的吸水性与常规的Gel-MOD相比更低，如从图1中可推出的。此外，应当注意的是Gel-MOD-NB表现出与具有更高取代度(例如90％)的完全交联的Gel-NB相比更高的硬度。此外，Gel-MOD-NB的机械性能处于这些具有类似DS的Gel-MOD之间，但是低于完全官能化的Gel-MOD的硬度(参见图1)。此外，作为双官能性质的概念的证据，在平衡溶胀之后在DTT的存在下，在UV照射后会引入另外的刚度，由此受益于硫醇-烯光接枝(参见图1)。但是，由于形成的另外的交联的性质仍然获得了低的机械性能，这是因为硫醇-烯交联产生更均匀的网络，其特征在于与常规的链增长水凝胶相比更低的交联密度。
图2显示了在不同的时空能在根据本发明的交联的双官能改性的明胶(Gel-MOD-NB)粒料内部荧光7-甲基-4-巯基香豆素的双光子聚合辅助光接枝的结果，其利用了降冰片烯官能度。图2的左图显示了荧光显微图像。该图像表示存在香豆素，具有高度的时空控制。图2的右图显示了常规的显微图像，其中香豆素的接枝导致了局部收缩，这形成了可观察到的折射率的差异。应当注意的是除了对于全部的写入速度，在低激光功率(例如25mW)时没有观察到折射率的差异之外，荧光显微法清楚地显示了化合物的成功接枝。从图2(左图和右图)可以推出，双官能改性的明胶(Gel-MOD-NB)允许具有高度的时空控制的生产后接枝，由此证实了降冰片烯官能度不受初始交联步骤的影响。应当注意的是在高能量时，作为局部暴露过度的结果，接枝不太成功，由此除去了材料的一部分。
图3显示了在不同前体的存在下2小时之后和在不存在不同前体时在24小时回收之后，使用presto blue化验在融合的脂肪组织来源的干细胞上测量的代谢活性。为此目的，首先通过培养100μL的2百万个细胞/mL介质/96孔(well)来获得GFP标识的脂肪组织来源的干细胞的融合单层(通道17)。接着，在培养24小时之后使细胞达到融合。接着，将100μL的含有水凝胶前体的溶液依次叠置培养2小时。在24小时培养之后，使用presto blue化验测量代谢活动，其后将材料从孔盘上除去。在另外24小时培养之后，使用presto blue化验测量代谢活动，作为在最初2小时培养过程中在水凝胶前体的存在下引起的细胞损害的指示。图3显示了根据本发明的双官能改性的明胶(Gel-MOD-NB)表现出与Gel-MOD相当的细胞毒性，其可以被认为是组织工程学和再生医学领域的黄金标准之一。此外，通常获得了与Gel-NB相比更高的细胞存活率，其常规上在文献中被认为是细胞相容的。
实施例2：制备方法和双官能化胶原(col-MOD-NB)
制备col-MOD
Col-MOD采用在A.I.Van Den Bulcke，B.Bogdanov，N.De Rooze，E.H.Schacht，M.Cornelissen和H.Berghmans，“Structural and Rheological Properties ofMethacrylamide Modified Gelatin Hydrogels”，Biomacromolecules，第1卷第1期，第31-38页，2000年3月中所述的方案和根据以下反应来合成：
Figure BDA0002806139040000181
简单来说，在40℃将100g的胶原溶解在1L磷酸盐缓冲液(pH 7.8)中。在溶解完成后，添加相对于(羟基-)赖氨酸侧链中存在的伯胺1，2或5当量的甲基丙烯酸酐，并将混合物强力搅拌。在1h后，使用1L双蒸馏水(DDW)稀释该混合物，并在24h内针对DDW引入渗析膜(Spectra/por MWCO 12-14kDa)。在渗析后，使用NaOH将该混合物的pH调节为7.4来更接近地模拟天然ECM，并使用冻干法(Christ冻干机Alpha 2-4LSC)来分离col-MOD。
制备col-MOD-NB
为了制备10g的col-MOD-NB，首先将5-降冰片烯-2-羧酸活化成它的琥珀酰亚胺基酯。为此目的，首先将相对于要添加的EDC 1.6倍过量的5-降冰片烯-2-羧酸溶解在50ml的无水DMSO(经由真空蒸馏，使用CaH2作为干燥剂来获得)中。在完全溶解后，添加0.75当量的EDC(相对于10g胶原中存在的初始伯胺)和1.5当量的NHS(相对于EDC)，随后进行3次脱气。反应进行至少25小时来消除任何未反应的EDC官能度，其会导致下一反应步骤中的明胶交联。
在25h的反应后，在50℃在惰性气氛(Ar)和回流条件下将10g具有已知DS的col-MOD溶解在150ml无水DMSO(经由真空蒸馏，使用CaH2作为干燥剂来获得)中。在添加后，将设施脱气3次和置于氩气氛下。在完全溶解后，将制备的5-降冰片烯-2-琥珀酰亚胺基酯混合物添加到胶原溶液，随后脱气3次。使混合物在50℃在惰性气氛和回流条件下反应5-20h。
在反应后，将该混合物在十倍过量的丙酮中沉淀，使用Büchner过滤器在滤纸上过滤(VWR，孔尺寸：12-15μm)，溶解在DDW中并在24h内在40℃针对DDW渗析(Spectra/por 4：MWCO 12-14kDa)。在渗析后，使用NaOH将pH调节到7.4，随后冷冻和冻干(Christ冻干机Alpha 2-4LSC)。col-MOD-NB的制备通过反应[4]表示：
Figure BDA0002806139040000201
/>

Claims (15)

1.双官能改性的聚合物，所述聚合物基于生物聚合物，所述聚合物包含至少一个聚合物链，所述至少一个聚合物链包含n个第一官能团和m个第二官能团，其中n和m不是零，所述第一官能团包含能够依照自由基链增长聚合来自由基交联的基团，和所述第二官能团包含能够进行硫醇-烯交联的基团，所述第二官能团在所述第一官能团的自由基链增长聚合过程中保持未反应，其中所述第一官能团包含甲基丙烯酰胺官能团、丙烯酰胺官能团、甲基丙烯酸酯官能团和/或丙烯酸酯官能团，其中所述第二官能团包含降冰片烯官能团，其中所述生物聚合物选自多肽、蛋白质、多糖、核酸和前述生物聚合物的衍生物、重组体及合成产物。
2.根据权利要求1所述的双官能改性的聚合物，其中所述生物聚合物是选自藻酸盐、右旋糖酐、琼脂糖、糖胺聚糖、壳聚糖和角叉菜胶的多糖和前述生物聚合物的衍生物、重组体及合成产物。
3.根据权利要求1所述的双官能改性的聚合物，其中所述生物聚合物是选自明胶、胶原的蛋白质和前述生物聚合物的衍生物、重组体及合成产物。
4.根据权利要求1所述的双官能改性的聚合物，其中所述双官能改性的聚合物包含一个聚合物链。
5.制备根据权利要求1-4中任一项所述的双官能改性的聚合物的方法，所述聚合物基于生物聚合物，所述方法包括步骤：
a)提供生物聚合物，其包含至少一个含有伯官能团的聚合物链，其中所述伯官能团包含胺官能团和/或羧酸官能团和/或羟基官能团；
b)使所述伯官能团的第一部分官能化来引入n个第一官能团，其中n不是零，所述第一官能团能够依照自由基链增长聚合来进行自由基交联；
c)使所述伯官能团的第二部分官能化来引入m个第二官能团，其中m不是零，所述第二官能团包含硫醇-烯交联性的基团，所述第二官能团在所述第一官能团的自由链增长聚合过程中保持未反应；
其中步骤b)和步骤c)同时进行，或者其中步骤b)在步骤c)之前或之后进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤b)包括所述胺官能团的反应和/或所述羧酸官能团的反应和/或所述羟基官能团的反应。
7.根据权利要求5所述的方法，其中步骤c)包括所述胺官能团的反应和/或所述羧酸官能团的反应和/或所述羟基官能团的反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述胺官能团的所述反应和/或所述羧酸官能团的所述反应和/或所述羟基官能团的所述反应使用碳二酰亚胺偶合化学。
9.制备水凝胶的方法，所述方法包括步骤：
a)提供根据权利要求1-4中任一项所述的双官能改性的聚合物，
b)通过所述n个第一官能团的至少一部分的自由基链增长聚合来使所述双官能改性的聚合物交联；
c)使所述m个第二官能团的至少一部分交联和/或官能化。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤c)包括使所述m个第二官能团的至少一部分交联。
11.根据权利要求9所述的方法，其中步骤c)包括使所述m个官能团的至少一部分官能化。
12.根据权利要求9所述的方法，其中步骤c)包括所述m个官能团的第一部分交联，和使所述m个官能团的第二部分官能化。
13.水凝胶，其通过根据权利要求9-12中任一项所述的方法获得。
14.根据权利要求13所述的水凝胶的用途，其用于制造组织工程学中的材料。
15.根据权利要求13所述的水凝胶的用途，其用于制造生物制造中的材料。
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