CN111139212B - 一种用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,包括:将牛血清白蛋白与CB缓冲液混合得到混合液,调节混合液的pH值为7~9,加入甲基丙烯酸酐进行反应,再经后处理得到BSA‑MA;将BSA‑MA溶于PBS缓冲液中,得到溶液A;将光引发剂溶于乙醇溶液中,得到溶液B,将溶液A与溶液B混合得到水凝胶前体溶液,最后经浇铸、紫外光交联固化得到。本发明首次以牛血清白蛋白为原料合成了光固化牛血清白蛋白甲基丙烯酰水凝胶,即保证了制备过程中白蛋白不会发生变性,又保证了白蛋白中酰基的高取代,制备得到的白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶具有优异的机械性能、吸水性、可降解性及生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及一种水凝胶材料领域,具体涉及一种用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法。
背景技术
水凝胶由于其高含水量和特殊的溶胀性质等,越来越多地被用于药物传递和组织工程应用。水凝胶按照来源可分为合成水凝胶和天然水凝胶,并且都可被用来制造生物相容性良好的水膨胀聚合物网络,模拟体内微环境。合成的聚合物水凝胶可以低成本大规模批量制造,并且具有易于控制的机械性能,但其缺乏细胞识别位点。而天然聚合物水凝胶具有较好的生物相容性和生物降解性能,此外还有特定细胞相互作用位点,这对水凝胶在实际应用中和生物体的结合至关重要。但是天然水凝胶通常具有较差的机械性能,即使这些性能可以通过化学交联策略加以改善。
聚合物链的交联即在聚合物分子间形成共价键的形成,该过程可以通过以添加交联剂、烘烤、高压、盐浴为代表的化学交联方法实现,或者通过电子束、紫外线照射等物理方法实现。然而考虑到实际交联过程中的时空精度,复杂结构的交联可能性和交联效率以及交联过程中的易调节性,光引发的自由基聚合已被优先用于生物医学应用的水凝胶的制备。为了制造可以应用于生物组织工程的支架,已经用可光固化的部分(例如丙烯酰基或甲基丙烯酰基)对聚合物进行了功能化,所述光固化部分在存在光引发剂的情况下在紫外线(UV)或可见光下彼此形成共价键,从而形成交联聚合物网络凝胶。许多研究表明,天然聚合物如胶原蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠、右旋糖酐、硫酸软骨素、丝素和原弹性蛋白的甲基丙烯酰化是制备用于各种生物医学应用的水凝胶结构的一种有前景的策略。
白蛋白是人体血浆中最丰富的蛋白质之一,在调节血浆内皮素的压力方面起着至关重要的作用,它是金属离子和各种内源性和外源性分子在血液中的载体,具有抗氧化作用。此外,白蛋白一级序列和心形折叠三级结构有助于白蛋白应用的设计。因此,人血清白蛋白(HSA)已成功地作为药物载体应用于FDA批准的几种治疗糖尿病和各种癌症的药物中。此外,在过去的15年中,白蛋白也被用于各种组织工程应用。牛血清白蛋白(BSA)因其高利用率、低成本和分子结构与HSA相似而被选为人类血清白蛋白(HSA)的有效替代品。可见,将白蛋白水凝胶材料应用于生物医学上具有很大的应用价值。
但白蛋白很容易受pH和温度的影响而变性,给白蛋白水凝胶的制备带来极大地阻碍。因此,目前尚无以白蛋白制备水凝胶的报道。
发明内容
基于现有技术中存在的上述缺陷,本发明公开了一种用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,首次以牛血清白蛋白为原料合成了牛血清白蛋白甲基丙烯酰水凝胶,即保证了制备过程中白蛋白不会发生变性,又保证了白蛋白中酰基的高取代,制备得到的白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶具有优异的机械性能、吸水性、可降解性以及生物相容性,有望应用于生物医学领域,包括细胞培养,组织工程和3D生物打印,为其在再生医学中的广泛应用奠定了基础。
具体技术方案如下:
一种用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,包括:
(1)将牛血清白蛋白(BSA)与CB缓冲液混合得到混合液,调节混合液的pH值为7~9,再加入甲基丙烯酸酐(MAA)进行反应,最后经后处理得到中间产物,记为BSA-MA;
反应过程中维持反应液的pH值为7.5~9;
(2)将步骤(1)制备的BSA-MA溶于PBS缓冲液中,得到溶液A;将光引发剂溶于乙醇溶液中,得到溶液B,将溶液A与溶液B混合得到水凝胶前体溶液;
(3)将步骤(2)制备的水凝胶前体溶液浇铸到模具中,经紫外光交联固化后得到所述用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶。
本发明首先以牛血清白蛋白与甲基丙烯酸酐单体为原料,经反应后将牛血清白蛋白上的氨基转化为酰胺键,并将C=C引入牛血清白蛋白中,再经过紫外线光固化,制备得到白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶。本制备工艺中,甲基丙烯酸酐单体的选择尤为关键,经试验发现,若将甲基丙烯酸酐单体替换为本领域其它的常见的可引发光固化的单体,如丙烯酸酐单体、丙烯酸酯类单体,均会由于产生有毒的中间产物或副产物而毒化牛血清白蛋白,导致其发生变性。
步骤(1)中:
所述CB缓冲液为碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液,由碳酸盐与碳酸氢盐溶于水中获得。
优选地,所述CB缓冲液的浓度为0.25mol/L,由碳酸氢钠与十水合碳酸钠溶于水中获得,所述碳酸氢钠与十水合碳酸钠的摩尔比为2.32:1。
本发明中,牛血清白蛋白上的氨基与甲基丙烯酸酐单体的反应受反应体系pH值的影响,因此,反应过程中,可以通过控制反应体系pH值的变化来控制反应的进行与终止。优选地,可以采用氢氧化钠调节反应体系的pH值。反应过程中,还需通过不断补加氢氧化钠的方式来维持反应液的pH值为7.5~9,以保证该反应的不断进行。反应最后,还可以通过加入盐酸或氢氧化钠的方式将反应体系的pH值调节至7~7.4使反应完全终止,以保证反应体系的稳定性。
进一步优选,调节步骤(1)中混合液的pH值为9,并在反应过程中维持反应液的pH值为7.5~9。经试验发现,当初始pH值限定为9时,氨基与甲基丙烯酸酐的反应效率最高,制备得到的BSA-MA的产率最高。
优选地,控制步骤(1)中反应的温度为37℃。
优选地,所述混合液中,牛血清白蛋白的浓度为5~15g/100mL;进一步优选,牛血清白蛋白的浓度为10g/100mL。经试验发现,在BSA的浓度为10g/100mL左右时,MAA单体的分散性能最佳,而当BSA的浓度过高时会充当表面活性剂不利于MAA单体的分散。
优选地,所述甲基丙烯酸酐与牛血清白蛋白的摩尔比为0.55~4.4;进一步优选为0.55~2.2:1,经试验发现,当采用较高的甲基丙烯酰酐与赖氨酸基团的摩尔比(摩尔比高于4.4:1)时,甲基丙烯酰酐还可能与羟基(来自羟脯氨酸,苏氨酸,丝氨酸,酪氨酸和羟基赖氨酸残基)反应,导致甲基丙烯酸酯等副产物的生成。再优选,所述甲基丙烯酸酐与牛血清白蛋白的摩尔比为1.1~2.2:1,经试验发现,该摩尔比下获得的BSA-MA具有更高的产率。
步骤(1)中,BSA-MA是通过甲基丙烯酸酐(MAA)与牛血清白蛋白(BSA)分子中的游离赖氨酸氨基之间的直接反应合成。将BSA溶解在CB缓冲液中,并将溶液的pH值保持在BSA等电点(BSA IEP=4.7)以上,从而减少不会与MAA反应的质子化游离氨基的数量。通过改变MAA与赖氨酸基团的摩尔比,合成具有不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA。
所述后处理包括透析、过滤和冷冻干燥,冻干后的BSA-MA保存在-20℃下待用。
步骤(2)中:
所述PBS缓冲液即为磷酸盐缓冲溶液,选自pH=7.4的市售产品。
优选地,所述溶液A中,BSA-MA的浓度为5~30g/100mL;浓度范围为5~30g/100mL的BSA-MA均可以形成凝胶,含量为5~15g/100mL的BSA-MA可以形成适合药物输送应用的软水凝胶,而含量为15~30g/100mL的BSA-MA可以形成适合组织工程应用的相对坚硬的水凝胶。可根据具体的应用领域选择合适的浓度。溶液中加入光引发剂可以通过光照产生自由基并在紫外光下诱发聚合。优选地,所述光引发剂选自2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙酚、2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸苯基锂、2,2′-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]、2-(2,4,5,7-四溴-6-氧化-3-氧代-3氧杂蒽酮-9-基)苯甲酸酯中的至少一种。
所述溶液B以乙醇作为溶剂,优选为70%(v/v)的乙醇-水溶液;优选地,所述溶液B中,光引发剂的浓度为5~30g/100mL。
优选地,所述水凝胶前体溶液中,光引发剂的浓度为0.05~1g/100mL;该范围内,引发剂对细胞的毒性较小,适用于细胞封装。当浓度为0.05~0.3g/100mL,适合可进行长时间光交联作用,对光引发剂浓度敏感性低的水凝胶;当浓度为0.3~1g/100mL,适合可进行较短时间光交联作用,对光引发剂浓度敏感性高的水凝胶。
进一步优选为0.1~0.5g/100mL,该浓度下需要的光交联时间适中,引发剂浓度适中对细胞和组织工程的作用较小。
步骤(3)中:
所述模具为将硅管、聚四氟乙烯管粘合到载玻片上制备。
所述紫外光交联固化的时间为5~15min。
进一步优选:
步骤(1)中:
所述混合液中,牛血清白蛋白的浓度为10g/100mL;
所述混合液的pH值为9;
所述甲基丙烯酸酐与牛血清白蛋白中游离氨基的摩尔比为1.1~2.2:1;
步骤(2)中:
所述溶液A中,BSA-MA的浓度为10~20g/100mL;
所述光引发剂选自2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙酚或2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸苯基锂;
所述水凝胶前体溶液中,光引发剂的浓度为0.1~0.5g/100mL。
上述优选工艺下制备的BSA-MA具有高取代、高产率的优点;再以不同甲基丙烯酰化度的BSA-MA为单体进一步制备的白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶,具有生物活性的牛血清白蛋白可以保持良好的生物相容性,其交联度又可以进行大幅调控(约为50~90%),得到不同机械性能、吸水性以及降解性能的水凝胶材料,可以适用于基于细胞培养和组织工程的不同应用。
对于用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶材料来说,并不是交联程度越高越好。较高数量的可交联基团导致较高的交联密度,降低了代表水-蛋白质相互作用主要部位的自由极性氨基的数量,从而降低了BSA分子的水结合能力。而且BSA-MA水凝胶的机械性能和生物降解性能也随蛋白质浓度和甲基丙烯酰化程度的改变而变化。
本发明制备的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶材料,甲基丙烯酰化程度可以通过改变MAA与赖氨酸基团的摩尔比合成不同甲基丙烯酰化程度(通过TNBS测定法,采用甲基丙烯酰化度(DM)加以标征)。而甲基丙烯酰化程度对于聚合至关重要,它直接影响制备得到的水凝胶材料的交联程度,并与交联的程度成比例。因此,我们以精确的方式量化BSA-MA的DM。此外,最终制备的水凝胶的交联度还可通过调节BSA-MA的浓度进行调控。通过对上述两个参数的调控,可以制备得到不同机械性能、吸水性以及降解性能的水凝胶材料。
尤其以降解性能为例,通过对上述两个参数的调控可以调节水凝胶材料的降解时间,实现组织工程中使用的支架(即水凝胶)的降解与细胞重塑周围环境的时间相匹配,有利于实现可控降解的BSA-MA水凝胶制造多种再生医学应用的构建体。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
(1)本发明首次实现了用于组织工程应用的光固化牛血清白蛋白甲基丙烯酰水凝胶的合成及其性能检测,获得了不同机械性能、吸水性、降解性能以及生物相容性的水凝胶材料,有望在生物医学应用,包括细胞培养,组织工程和3D生物打印等领域取得巨大的经济和社会价值。
(2)本发明公开的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶材料的制备工艺,以牛血清白蛋白与甲基丙烯酸酐单体为原料,通过简单地控制反应参数和MAA与赖氨酸基团的进料摩尔比,可以精确地合成具有不同甲基丙烯酰化度的BSA-MA;且该制备过程可以实现甲基丙烯酰化度的高取代,最高可达100%,且该步反应的产率也极高,均在87%以上,最高可达94%。再通过改变BSA-MA单体的浓度配合不同甲基丙烯酰化度的BSA-MA,从而改变交联程度,轻松地调节光致交联的BSA-MA水凝胶的溶胀,机械性能和降解性能。
附图说明
图1为本发明中牛血清白蛋白与甲基丙烯酸酐反应的示意图;
图2为实施例1制备的BSA-MA的甲基丙烯酰化程度测定结果图,(A)合成的四个BSA-MA样品(右)的甲基丙烯酰化程度(DM)以及MAA/赖氨酸基团的进料摩尔比与合成的BSA-MA(左)的甲基丙烯酰化程度之间的关系;(B)BSA和不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA样品的1H-NMR谱;(a)和(b)甲基丙烯酰胺接枝物的丙烯酸质子(约5.4和5.7ppm);(d)甲基丙烯酰胺接枝物的甲基质子(约1.9ppm);(c)未反应赖氨酸基团的亚甲基质子(约3.0ppm);
图3为BSA和实施例1制备的不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA样品的二级结构;
图4为实施例1中制备的不同高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶压缩实验结果图;
图5为实施例1中制备的不同高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的溶胀结果图;
图6为在实施例1中制备的不同高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的环境下进行细胞增殖实验的结果图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细描述,需要指出的是,以下实施例旨在便于对本发明的理解,而对其不起任何限定作用。
实施例1
本实施例中,选取2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙酚作为光引发剂,浓度为0.5g/100mL,通过6分钟的紫外交联时间对分别以10g/100mL、15g/100mL和20g/100mL溶解在PBS缓冲液中的不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA进行交联,溶胀和机械性能受浓度和甲基丙烯酰化程度的影响。合成BSA-MA过程中,牛血清白蛋白与甲基丙烯酸酐反应的示意图如图1所示。具体制备方法如下:
1.将BSA(V900933;Sigma-Aldrich)以10g/100mL溶于200mL0.25M碳酸盐-碳酸氢盐(CB)缓冲液(14.65g碳酸氢钠和21.53g十水合碳酸钠十水合物在1L蒸馏水中)在37℃下进行磁力搅拌(500rpm)。BSA完全溶解后,使用5M氢氧化钠水溶液(NaOH;Sigma-Aldrich)将缓冲溶液的pH调节至9。然后将不同量的甲基丙烯酸酐(MAA,94%;Sigma Aldrich)(对应于表1中所示的MAA与赖氨酸基团的摩尔比)依次添加到BSA/CB缓冲溶液中,
2.反应在37℃的磁力搅拌(500rpm)下进行反应过程中通过加入5M NaOH溶液将反应体系的pH维持在7.5~9,反应1h后通过使用6M盐酸溶液(HCl;Sigma-Aldrich)或5M NaOH溶液将溶液的pH调节至7.4来终止反应。依次使用70毫米滤纸过滤溶液,然后在室温下使用配备有包含10kDa Biomax膜的Pellicon 2盒的切向流过滤(TFF)系统在蒸馏水中透析4-6小时。以除去未反应的MAA和甲基丙烯酸副产物。最后,将BSA-MA溶液冷冻干燥4-5天,并保存在-20℃下直至进一步使用。在表1所列的反应条件下,制备得到不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA,所得的产率如下表1所示。
表1
MAA:甲基丙烯酸酐;CB:碳酸钠-碳酸氢钠;T:温度。
3.将冻干的不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA 1,BSA-MA 2,BSA-MA 3和BSA-MA 4再分别以10g/100mL,15g/100mL和20g/100mL溶于磷酸盐缓冲液(PBS;pH 7.4;Gibco,Life)技术),分别得到12组数据。将以20g/100mL溶于70%v/v(L/L)的乙醇(EtOH)-水的光引发剂2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯乙酮(Irgacure 2959;Sigma Aldrich)添加到BSA-MA/PBS缓冲液中,混合得到的水凝胶前体溶液中光引发剂的最终浓度为0.5g/100mL。
4.将水凝胶前体溶液浇铸到通过将硅管(内径6mm)粘合到载玻片上制备的模具中,并通过UV光照射(365nm;150mW cm-2;Bluewave200 3.0光固化点灯;Dymax)进行光交联6分钟。
对本实施例制备的水凝胶进行以下过程检测:
(1)BSA-MA是通过MAA与BSA分子中的游离赖氨酸氨基之间的直接反应合成的(如图1)。通过2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)测定法定量测定各种BSA-MA样品的甲基丙烯酰化度(DM)。根据TNBS计算,BSA-MA 1为DM%~73.3%,BSA-MA 2为DM%~92.2%,BSA-MA3和BSA-MA 4均为DM%~100%,在表1中的反应条件下,各反应的产率均不低于87%。
这表明:本发明的制备工艺实现了不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA的高效制备。
并通过核磁共振(NMR)进行定性光谱学验证得到有关杂质(例如,甲基丙烯酸副产物)或甲基丙烯酸酯的信息。甲基丙烯酰酐可以与胺基(主要来自赖氨酸和羟基赖氨酸残基)和羟基(来自羟脯氨酸,苏氨酸,丝氨酸,酪氨酸和羟基赖氨酸残基)反应,导致分别形成甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯。只有当采用较高的甲基丙烯酰酐与赖氨酸基团的摩尔比(例如4.4:1、5:1和10:1)时,甲基丙烯酸酯官能化才会发生。
(2)使用圆二色(CD)光谱和衰减全反射傅里叶变换红外(ATR-FTIR)光谱评估BSA和不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA样品的二级结构。结果如图3所示,天然BSA的CD光谱在208和222nm处具有两个负带,这是具有α螺旋结构的蛋白质的典型特征,而不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA 1、BSA-MA 2和BSA-MA 3也具有典型的蛋白质的特征,说明经过本发明中的制备工艺获得的不同甲基丙烯酰化度的BSA-MA样品均未发生变性。此外,还进一步计算了天然BSA与不同甲基丙烯酰化度的BSA-MA样品的分子螺旋度、α-螺旋、β-转角、延伸链与分子间β折叠,列于下表2中,BSA-MA 3的分子螺旋度(49.5%)略低于天然BSA(52.7%)和功能化程度较低的BSA-MA(BSA-MA 1(54%)和BSA-MA 2(51.2%))。延伸链含量(BSA为21%;BSA-MA1,BSA-MA2和BSA-MA3分别为25.8%,24.3%和26.8,随着蛋白质甲基丙烯酰化的增加,所有甲基丙烯酰化的样品都保持类似于BSA的α-螺旋二级结构。与α-螺旋相比,β-转角和分子间β-折叠的百分比似乎受官能化过程的影响较小。
表2
(3)使用动态机械分析仪(DMA;Q800;TA Instrument)在受控力模式下研究了本实施例制备的不同高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的机械性能,具体为压缩模量,数据见图4,图4中,BSA-MA1(DM%~73%)即对应以该BSA-MA1为单体在不同浓度下制备得到的水凝胶,其余标注采用相同解释,如无特殊说明,附图中出现的类似标识均做相同解释。
观察图4可以发现,本实施例制备的不同高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的压缩模量在几千帕至60千帕之间,这取决于PBS缓冲液中BSA-MA浓度和BSA-MA的甲基丙烯酰化程度。特别地,压缩模量随着BSA-MA含量和DM的增加而增加,表明在这些条件下存在更紧密的网络,这与所观察到的膨胀成反比。BSA-MA样品显示非线性应力-应变曲线,具有基于交联天然聚合物的水凝胶典型的应变硬化行为,只需调整BSA-MA的浓度和改性程度即可调节水凝胶的机械性能。
(4)将本实施例制备的光交联的不同高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶置于PBS中直至达到平衡溶胀,经过处理计算其溶胀,结果图如图5所示,图5中标注采用与图4中相同解释,可以看出,较高数量的可交联基团导致较高的交联密度,并因此导致较不牢固的,较不吸收水分子的柔性网络。此外,较高的甲基丙烯酰化程度降低了代表水-蛋白质相互作用主要部位的自由极性氨基的数量,从而降低了BSA分子的水结合能力。
(5)将光交联后的不同高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶置于PBS中直至达到平衡溶胀,测量湿重。然后将每种BSA-MA支架(即高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶)在胰蛋白酶-EDTA(TE;Gibco,Life Technologies)溶液中孵育。在预定的时间点t,测量每个样品的干重(WDt)。通过计算质量损失百分比可以看出,DM值或BSA-MA单体的浓度越高,降解越慢,BSA-MA 1水凝胶在12小时内会完全降解,而BSA-MA 2水凝胶在15g/100mL和20g/100mL浓度下,在96小时后损失的质量不到其质量的10%,在所有BSA-MA水凝胶中,只有15g/100mL和20g/100mL的BSA-MA 3几乎完全保持其完整性一周,这表明这些凝胶紧密交联的网络可能会限制酶在构建体中的扩散,而具有更多交联桥的BSA-MA水凝胶会由于较高的DM和较高的浓度,C=C键的数量多而对酶的反应性较低。
(6)通过在二维高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶环境中培养细胞,以人类肝癌细胞(Huh-7.5;Apath)作为模型细胞,评估本实施例制备的BSA-MA水凝胶的细胞相容性。使用Infinite 200PRO微孔板读数器(Tecan)测量450nm处的吸光度,得出细胞增殖实验结果,详见图6,图中,横坐标为时间,d1即为第一天;纵坐标为第一天(d1)的细胞数为100%计的细胞增殖百分比。观察发现,当细胞在2D BSA-MA水凝胶底物上培养时,细胞增殖从第1天到第5天逐渐增加,而直到第3天才增加,然后在第5天进一步增加;当在正常组织培养板(CTRL)上培养细胞时,细胞增殖在第3天开始增加,但在第5天略有下降,这可能是由于空间有限导致的。
实施例2
本实施例中,光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙酚,浓度为0.3g/100mL,交联时间为15分钟。调节甲基丙烯酸酐和牛血清白蛋白的摩尔比分别为1、2、3、4,获得不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA,并调整不同的BSA-MA在PBS中的浓度分别为5g/100mL、23g/100mL、30g/100mL,得到不同的BSA-MA水凝胶,产率较大,溶胀和压缩的效果差异明显:
1.将BSA(V900933;Sigma-Aldrich)以10g/100mL溶于200mL0.25M碳酸盐-碳酸氢盐(CB)缓冲液(14.65g碳酸氢钠和21.53g十水合碳酸钠十水合物在1L蒸馏水中)在37℃下进行磁力搅拌(500rpm)。BSA完全溶解后,使用5M氢氧化钠溶液(NaOH;Sigma-Aldrich)将缓冲溶液的pH调节至9。然后将不同量的甲基丙烯酸酐(MAA,94%;Sigma Aldrich)依次添加到BSA/CB缓冲液溶液中。
2.反应在37℃的磁力搅拌(500rpm)下进行,反应过程中通过加入5M NaOH溶液将反应体系的pH维持在7.5~9,反应1h,然后通过使用6M盐酸溶液(HCl;Sigma-Aldrich)或5MNaOH溶液将溶液的pH调节至7.2来终止反应。依次使用70毫米滤纸过滤溶液,然后在室温下使用配备有包含10kDa Biomax膜的Pellicon 2盒的切向流过滤(TFF)系统在蒸馏水中透析4-6小时。以除去未反应的MAA和甲基丙烯酸副产物。最后,将BSA-MA溶液冷冻干燥4-5天,并保存在-20℃下直至进一步使用。
3.将冻干的BSA-MA分别以5g/100mL、23g/100mL和30g/100mL溶于磷酸盐缓冲液(PBS;pH 7.4;Gibco,Life)。将以20g/100mL溶于70%v/v的乙醇(EtOH)-水的光引发剂2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯乙酮(Irgacure 2959;Sigma Aldrich)添加到BSA-MA/PBS缓冲液中,混合得到的水凝胶前体溶液中光引发剂最终浓度为0.3g/100mL。
4.将水凝胶前体溶液浇铸到通过将硅管(内径6mm)粘合到载玻片上制备的模具中,并通过UV光照射(365nm;150mW cm-2;Bluewave200 3.0光固化点灯;Dymax)进行光交联15分钟。
对本实施例制备的水凝胶进行以下过程检测:
(1)根据TNBS计算,甲基丙烯酸酐和牛血清白蛋白的摩尔比为1制备的BSA-MA为DM%~73%,摩尔比为2制备的BSA-MA为DM%~98%,摩尔比为3制备的BSA-MA为DM%~100%,摩尔比为4制备的BSA-MA为DM%~100%。具有不同甲基丙烯酸化程度的MA,在使用的反应条件下产率较高。这同样表明了本发明的制备工艺对于不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA的高效制备。
(2)使用使用圆二色(CD)光谱和衰减全反射傅里叶变换红外评估BSA和BSA-MA样品的二级结构。
(3)使用动态机械分析仪(DMA;Q800;TA Instrument)在受控力模式下研究了本实施例制备的各种BSA-MA水凝胶的压缩模量。
(4)将光交联的BSA-MA水凝胶置于PBS中直至达到平衡溶胀,经过处理计算其溶胀。
(5)将光交联的BSA-MA水凝胶支架在胰蛋白酶中进行降解实验测试其降解性能。
(6)通过在二维BSA-MA水凝胶环境中培养人类肝癌细胞(Huh-7.5;Apath)作为模型细胞,评估BSA-MA水凝胶的细胞相容性。
实施例3
本实施例中,光引发剂为2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸苯基锂,浓度为0.4g/100mL,交联时间为10分钟。调节甲基丙烯酸酐和牛血清白蛋白的摩尔比分别为1,2,3,4,获得不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA,并调整不同的BSA-MA在PBS中的浓度分别为5g/100mL、23g/100mL、30g/100mL,得到不同的BSA-MA水凝胶,产率较大,溶胀和压缩的效果差异明显:
1.将BSA(V900933;Sigma-Aldrich)以10g/100mL溶于200mL0.25M碳酸盐-碳酸氢盐(CB)缓冲液(14.65g碳酸氢钠和21.53g十水合碳酸钠十水合物在1L蒸馏水中)在37℃下进行磁力搅拌(500rpm)。BSA完全溶解后,使用5M氢氧化钠溶液(NaOH;Sigma-Aldrich)将缓冲溶液的pH调节至9。然后将不同量的甲基丙烯酸酐(MAA,94%;Sigma Aldrich)依次添加到BSA/CB缓冲液中。
2.反应在37℃的磁力搅拌(500rpm)下进行,反应过程中通过加入5M NaOH溶液将反应体系的pH维持在7.5~9,反应1h,然后通过使用6M盐酸溶液(HCl;Sigma-Aldrich)或5MNaOH溶液将溶液的pH调节至7.4来终止反应。依次使用70毫米滤纸过滤溶液,然后在室温下使用配备有包含10kDa Biomax膜(Merck Millipore)的Pellicon 2盒的切向流过滤(TFF)系统在蒸馏水中透析4-6小时。以除去未反应的MAA和甲基丙烯酸副产物。最后,将制备得到的不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA溶液冷冻干燥4-5天,并保存在-20℃下直至进一步使用。
3.将冻干的不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA分别以5g/100mL,23g/100mL和30g/100mL溶于磷酸盐缓冲液(PBS;pH 7.4;Gibco,Life)。将以20g/100mL溶于70%v/v的乙醇(EtOH)-水的光引发剂2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸苯基锂(LAP)添加到BSA-MA/PBS缓冲液中,混合得到的水凝胶前体溶液中光引发剂最终浓度为0.4g/100mL。
4.将水凝胶前体溶液浇铸到通过将硅管(内径6mm)粘合到载玻片上制备的模具中,并通过UV光照射(365nm;150mW cm-2;Bluewave200 3.0光固化点灯;Dymax)进行光交联10分钟
对上述过程制备的水凝胶进行以下过程检测:
(1)根据TNBS计算,本实施例中,甲基丙烯酸酐和牛血清白蛋白的摩尔比为1制备的BSA-MA为DM%~73%,摩尔比为2制备的BSA-MA为DM%~98%,摩尔比为3制备的BSA-MA为DM%~100%,摩尔比为4制备的BSA-MA为DM%~100%。具有不同甲基丙烯酸化程度的MA,在使用的反应条件下产率较高。这同样表明了本发明的制备工艺对于不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA的高效制备。
(2)使用使用圆二色(CD)光谱和衰减全反射傅里叶变换红外评估BSA和BSA-MA样品的二级结构。
(3)使用动态机械分析仪(DMA;Q800;TA Instrument)在受控力模式下研究了本实施例制备的各种BSA-MA水凝胶的压缩模量。
(4)将光交联的BSA-MA水凝胶置于PBS中直至达到平衡溶胀,经过处理计算其溶胀。
(5)将光交联的BSA-MA水凝胶支架在胰蛋白酶中进行降解实验测试其降解性能。
(6)通过在二维BSA-MA环境中培养人类肝癌细胞(Huh-7.5;
Apath)作为模型细胞,评估BSA-MA水凝胶的细胞相容性。
实施例4
本实施例中,光引发剂为2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸苯基锂,浓度为0.4g/100mL,交联时间为12分钟。调节甲基丙烯酸酐和牛血清白蛋白的摩尔比分别为0.55,1.1,2.2,4.4获得不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA,并调整不同的BSA-MA在PBS中的浓度为10g/100mL、15g/100mL、20g/100mL,得到不同的BSA-MA水凝胶,产率较大,溶胀和压缩的效果差异明显:
1.将BSA(V900933;Sigma-Aldrich)以10g/100mL溶于200mL0.25M碳酸盐-碳酸氢盐(CB)缓冲液(14.65g碳酸氢钠和21.53g十水合碳酸钠十水合物在1L蒸馏水中)在37℃下进行磁力搅拌(500rpm)。BSA完全溶解后,使用5M氢氧化钠溶液(NaOH;Sigma-Aldrich)将缓冲溶液的pH调节至8。然后将不同量的甲基丙烯酸酐(MAA,94%;Sigma Aldrich)依次添加到BSA/CB溶液中。
2.反应在37℃的磁力搅拌(500rpm)下进行,反应过程中通过加入5M NaOH溶液将反应体系的pH维持在7.5~9,反应1h,然后通过使用6M盐酸溶液(HCl;Sigma-Aldrich)或5MNaOH溶液将溶液的pH调节至7来终止反应。依次使用70毫米滤纸过滤溶液,然后在室温下使用配备有包含10kDa Biomax膜的Pellicon 2盒的切向流过滤(TFF)系统在蒸馏水中透析4-6小时。以除去未反应的MAA和甲基丙烯酸副产物。最后,将制备得到的不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA溶液冷冻干燥4-5天,并保存在-20℃下直至进一步使用。
3.将不同甲基丙烯酰化程度的冻干的BSA-MA分别以10g/100mL,15g/100mL或20g/100mL溶于磷酸盐缓冲液(PBS;pH 7.4;Gibco,Life)。将以20g/100mL溶于70%v/v的乙醇(EtOH)-水的光引发剂2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸苯基锂(LAP)添加到BSA-MA/PBS缓冲液中,混合得到的水凝胶前体溶液中引发剂最终浓度为0.4g/100mL的溶液。
4.将水凝胶前体溶液浇铸到通过将硅管(内径6mm)粘合到载玻片上制备的模具中,并通过UV光照射(365nm;150mW cm-2;Bluewave200 3.0光固化点灯;Dymax)进行光交联12分钟
对本实施例制备的水凝胶进行以下过程检测:
(1)根据TNBS计算,本实施例中,甲基丙烯酸酐和牛血清白蛋白的摩尔比为0.55制备的BSA-MA为DM%~73.3%,摩尔比为1.1制备的BSA-MA为DM%~92.2%,摩尔比为2.2制备的BSA-MA为DM%~100%,摩尔比为4.4制备的BSA-MA为DM%~100%。具有不同甲基丙烯酸化程度的MA,在使用的反应条件下产率较高。这同样表明了本发明的制备工艺对于不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA的高效制备。
(2)使用使用圆二色(CD)光谱和衰减全反射傅里叶变换红外评估BSA和BSA-MA样品的二级结构
(3)使用动态机械分析仪(DMA;Q800;TA Instrument)在受控力模式下研究了本实施例制备的各种BSA-MA水凝胶的压缩模量。
(4)将光交联的BSA-MA水凝胶置于PBS中直至达到平衡溶胀,经过处理计算其溶胀。
(5)将光交联的BSA-MA水凝胶支架在胰蛋白酶中进行降解实验测试其降解性能。
(6)通过在二维BSA-MA环境中培养人类肝癌细胞(Huh-7.5;
Apath)作为模型细胞,评估BSA-MA水凝胶的细胞相容性。
实施例5
本实例中,光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙酚,浓度为0.1g/100mL,交联时间为15分钟。调节甲基丙烯酸酐和牛血清白蛋白的摩尔比为0.55,1.1,2.2,4.4获得不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA,并调整不同的BSA-MA在PBS中的浓度为5g/100mL,23g/100mL,30g/100mL,交联所用模具为聚四氟乙烯管,得到不同的BSA-MA水凝胶,产率较大,溶胀和压缩的效果差异明显:
1.将BSA(V900933;Sigma-Aldrich)以10g/100mL溶于200mL0.25M碳酸盐-碳酸氢盐(CB)缓冲液(14.65g碳酸氢钠和21.53g十水合碳酸钠十水合物在1L蒸馏水中)在37℃下进行磁力搅拌(500rpm)。BSA完全溶解后,使用5M氢氧化钠溶液(NaOH;Sigma-Aldrich)将缓冲溶液的pH调节至7。然后将不同量的甲基丙烯酸酐(MAA,94%;Sigma Aldrich)依次添加到BSA/CB溶液中。
2.反应在37℃的磁力搅拌(500rpm)下进行,反应过程中通过加入5M NaOH溶液将反应体系的pH维持在7.5~9,反应1h,然后通过使用6M盐酸溶液(HCl;Sigma-Aldrich)或5MNaOH溶液将溶液的pH调节至7.2来终止反应。依次使用70毫米滤纸过滤溶液,然后在室温下使用配备有包含10kDa Biomax膜的Pellicon 2盒的切向流过滤(TFF)系统在蒸馏水中透析4-6小时。以除去未反应的MAA和甲基丙烯酸副产物。最后,将BSA-MA溶液冷冻干燥4-5天,并保存在-20℃下直至进一步使用。
3.将冻干的BSA-MA分别以5g/100mL,23g/100mL和30g/100mL溶于磷酸盐缓冲液(PBS;pH 7.4;Gibco,Life)。将以20g/100mL溶于70%v/v的乙醇(EtOH)-水的光引发剂2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯乙酮(Irgacure 2959;Sigma Aldrich)添加到BSA-MA/PBS缓冲液中,混合得到的水凝胶前体溶液中光引发剂最终浓度为0.1g/100mL。
4.将水凝胶前体溶液浇铸到通过将聚四氟乙烯管(内径3mm)粘合到载玻片上制备的模具中,并通过UV光照射(365nm;150mW cm-2;Bluewave 200 3.0光固化点灯;Dymax)进行光交联15分钟
对本实施例制备的水凝胶进行以下过程检测:
(1)根据TNBS计算,本实施例中,甲基丙烯酸酐和牛血清白蛋白的摩尔比为0.55制备的BSA-MA为DM%~73.3%,摩尔比为1.1制备的BSA-MA为DM%~92.2%,摩尔比为2.2制备的BSA-MA为DM%~100%,摩尔比为4.4制备的BSA-MA为DM%~100%。具有不同甲基丙烯酸化程度的MA,在使用的反应条件下产率较高。这同样表明了本发明的制备工艺对于不同甲基丙烯酰化程度的BSA-MA的高效制备。
(2)使用使用圆二色(CD)光谱和衰减全反射傅里叶变换红外评估BSA和BSA-MA样品的二级结构
(3)使用动态机械分析仪(DMA;Q800;TA Instrument)在受控力模式下研究了本实施例制备的各种BSA-MA水凝胶的压缩模量。
(4)将光交联的BSA-MA水凝胶置于PBS中直至达到平衡溶胀,经过处理计算其溶胀。
(5)将光交联的BSA-MA水凝胶支架在胰蛋白酶中进行降解实验测试其降解性能。
(6)通过在二维BSA-MA环境中培养人类肝癌细胞(Huh-7.5;Apath)作为模型细胞,评估BSA-MA水凝胶的细胞相容性。
Claims (10)
1.一种用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于,包括:
(1)将牛血清白蛋白与CB缓冲液混合得到混合液,调节混合液的pH值为7~9,再加入甲基丙烯酸酐进行反应,最后经后处理得到中间产物,记为BSA-MA;
反应过程中维持反应液的pH值为7.5~9;
(2)将步骤(1)制备的BSA-MA溶于PBS缓冲液中,得到溶液A;将光引发剂溶于乙醇溶液中,得到溶液B,将溶液A与溶液B混合得到水凝胶前体溶液;
(3)将步骤(2)制备的水凝胶前体溶液浇铸到模具中,经紫外光交联固化后得到所述用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶。
2.根据权利要求1所述的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中:
所述CB缓冲液为碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液,由碳酸盐与碳酸氢盐溶于水中制备得到。
3.根据权利要求1所述的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中:
所述CB缓冲液为碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液,浓度为0.25mol/L;
所述混合液中,牛血清白蛋白的浓度为5~15g/100mL;
所述甲基丙烯酸酐与牛血清白蛋白的摩尔比为0.55~4.4。
4.根据权利要求1所述的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中:
调节反应体系混合液的pH值为9,并在反应过程中维持反应液的pH值为7.5~9。
5.根据权利要求1所述的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中:
所述后处理包括过滤、透析和冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中:
所述溶液A中,BSA-MA的浓度为5~30g/100mL;
所述溶液B中,光引发剂的浓度为5~30g/100mL;
所述水凝胶前体溶液中,光引发剂的浓度为0.05~1g/100mL。
7.根据权利要求1所述的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述光引发剂选自2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙酚、2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸苯基锂、2,2′-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]、2-(2,4,5,7-四溴-6-氧化-3-氧代-3氧杂蒽酮-9-基)苯甲酸酯中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述紫外光交联固化的时间为5~15min。
9.根据权利要求1~8任一权利要求所述的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中:
所述混合液中,牛血清白蛋白的浓度为10g/100mL;
所述甲基丙烯酸酐与牛血清白蛋白中游离氨基的摩尔比为1.1~2.2:1;
步骤(2)中:
所述溶液A中,BSA-MA的浓度为10~20g/100mL;
所述水凝胶前体溶液中,光引发剂的浓度为0.1~0.5g/100mL。
10.一种根据权利要求1~9任一权利要求所述的方法制备的用于细胞和组织培养的高取代白蛋白甲基丙烯酰基水凝胶。
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