CN104231285A - 透明质酸衍生物凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备透明质酸衍生物凝胶的方法，特别涉及通过在低温下使用零段交联剂制备交联高浓度透明质酸凝胶的方法。通过阶段低温反应避免了零段交联剂与辅助交联剂在较高温度下发生副反应而导致凝胶的抗降解力、凝胶品质的降低，还能提高交联程度。所制备的凝胶粘弹性提高，避免了凝胶由于硬度较大导致填充的困难以及病人体内的不适应，降低了红肿发炎等症状。在本发明中，采用复合搅拌方式更能充分地搅拌较高浓度的反应液，既避免了剪切搅拌器破坏交联物的网状结构，又解决了其他类型的搅拌器难以搅动高浓度反应液的问题，从而使产物的粘弹性增大，交联程度提高，所制备的凝胶交联程度高、网络结构稳定、粘弹性好。

Description

透明质酸衍生物凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及制备透明质酸衍生物凝胶的方法，特别涉及通过在低温下使用零段交联剂制备交联高浓度透明质酸凝胶的方法。 

背景技术

可注射的凝胶在体内与修复组织之间嵌合性好，实现原位注射达到微创目的，成为软组织修复、重建、填充的热点。因此，可注射的凝胶材料的应用具有显著的优势。可注射的填充和修复材料是一种智能高分子材料，是近十年来发展起来的一个较新的研究领域，是智能高分子材料的一个非常热门的研究课题。 

在已有的可注射填充物及其制备方法的技术中，常采用的注射填充物是交联的透明质酸及其盐的凝胶。玻尿酸(又名透明质酸、HA)是一种广泛存在于生物和组织类型的多聚糖，是由(1-4)-β-D葡萄糖醛酸2-乙酰氨基-β-D葡萄糖结合而成的双糖组织。由于其不具有种属与脏器的特异性，并展现良好的生物相容性，从而被广泛应用于美容、医疗等方面。但是纯透明质酸由于其易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等物理和生物特性，使用受到限制，因此需要使用化学交联修饰，以增大其分子量、延长降解时间和提高稳定性。 

CN1774450A和CN1970094A公开了使用1，4-丁二醇二环氧甘油醚(BDDE)作为交联剂制备透明质酸交联产物。但是由于BDDE的毒性很难从凝胶中去除，短期无法彻底去除其残留，会对生物体造成红肿、发炎、不适等状况，因此必须通过长时间的透析、纯化以减少BDDE的残留。 

CN1893989A公开了使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)作为交联剂制备透明质酸交联产物。EDC与其他交联剂相比，具有仅作交联反应的催化剂，而不引入最终产物中的优点。通过EDC制备的凝胶弹性高，并且交联形成的透明质酸凝胶水分比用其他交联剂低。此外所制备的 透明质酸凝胶还具有抗降解性，能满足一些特殊性能的生物医学材料的要求。但是，该专利中的交联透明质酸的浓度较低，造成透明质酸凝胶产量低，该透明质酸的分子链自由度高导致凝胶较为柔软，难以得到优异粘弹性的透明质酸衍生物凝胶。 

CN1694903A也公开了使用零段交联剂EDC与辅助交联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联制备透明质酸与脱乙酰糖类的复合凝胶，但是该方法无法得到较纯的透明质酸凝胶，并且该复合凝胶也不能用于美容行业。 

发明内容

本发明提供了一种透明质酸衍生物凝胶的制备方法，包括以下步骤： 

(1)将透明质酸或其盐溶于水中，使所得透明质酸水溶液中透明质酸的浓度为约10mg/ml～约200mg/ml，并将pH值调节为约1～约7；和 

(2)在约-80℃～约20℃的反应温度下，在零段交联剂存在下使所述透明质酸水溶液进行交联。 

在一个本发明的实施方案中，所述零段交联剂是碳二亚胺类交联剂，其选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1-乙基-3-(3-三甲基氨基丙基)碳二亚胺(ETC)、1，1’-二硫-p-亚苯基双(碳二亚胺)、叔丁基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺中的一种或多种。 

在另一个本发明的实施方案中，所述透明质酸的交联在辅助交联剂的存在下进行，所述辅助交联剂选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、琥珀酸酐和高碘酸钠中的一种或多种。 

在又一个本发明的实施方案中，所述反应混合物中的所述碳二亚胺类交联剂与透明质酸的重量比为约2％～约10％。 

在又一个本发明的实施方案中，在步骤(2)中通过复合搅拌装置使反应混合物交联，所述复合搅拌方式是指采用交联反应器的自旋转与搅拌反应器采用上下捣动方式结合在一起的搅拌方式。 

在又一个本发明的实施方案中，所述制备方法还包括步骤(3)：通过凝固浴使所得透明质酸衍生物产物凝固。 

在又一个本发明的实施方案中，所述制备方法还包括步骤(4)：将所得透明质酸衍生物产物进行卷绕。 

在又一个本发明的实施方案中，所述制备方法还包括步骤(5)：将所得透明质酸凝胶产物造粒，并将所得透明质酸衍生物凝胶颗粒进行透析。 

通过本发明的方法，可以制备得到高浓度、高粘弹性和抗降解的透明质酸衍生物凝胶。 

附图说明

图1是本发明制备透明质酸衍生物凝胶的示意图。 

图2是本发明实施例3制备的透明质酸衍生物凝胶的抗降解性示意图。 

具体实施方式

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。若存在矛盾，则以本申请提供的定义为准。 

当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及优选的数值下限的形式表述某个量、浓度或其它值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另外指出，本文所列出的数值范围旨在包括范围的端点，和该范围之内的所有整数和分数。 

当术语“约”和“大约”用于描述数值或范围的端值时，所公开的内容应理解为包括具体值或所涉及的端值。 

除非另外说明，本文中所有的百分比、份数、比值等均是按重量计。 

本文的材料、方法和实施例均是示例性的，并且除非特别说明，不应理解为限制性的。 

以下详细描述本发明的透明质酸衍生物凝胶的制备方法。 

步骤(1)

1、透明质酸的来源

在本发明的透明质酸衍生物凝胶制备方法的步骤(1)中，术语“透明质酸”是指具有不同分子量的酸性多聚糖，其由D-葡萄糖醛酸以及N-乙酰基 -D-葡萄糖胺酸残基组成，其天然存在于细胞表面、脊椎动物结缔组织的碱性细胞外基质、关节滑液、眼球内液、人类脐带组织和鸡冠中。 

一般通常将术语“透明质酸”用作表示具有交替的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺酸残基和可变分子量的多糖或甚至是其降解片段。 

在此将“透明质酸”定义为非硫酸化的氨基多糖，其由通过交替的β-1，4以及β-1，3糖苷键连接的N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)以及葡萄糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单元组成。透明质酸亦称为透明质素(hyaluronan)或HA。 

本发明中使用的透明质酸来源并非关键，例如可通过商购获得。例如，公鸡冠是透明质酸主要的商用来源之一。微生物是另一主要来源。例如WO2003/054163中公开了通过芽孢杆菌属细菌进行重组而制备透明质酸或其盐，在此将其全文援引并入本文。所述芽孢杆菌宿主细胞可以是野生型的芽孢杆菌细胞或其突变型。在本发明中可使用的芽孢杆菌细胞包括但不限于：粘琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaraderhens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。在本发明中优选使用解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞制备透明质酸，特别优选枯草芽孢杆菌细胞。 

本发明中可使用透明质酸本身或可使用透明质酸盐。在本发明中优选使用透明质酸盐。在本发明中可使用的透明质酸盐包括但不限于透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙或透明质酸镁。优选使用透明质酸钠、透明质酸钾或透明质酸铵，特别优选使用透明质酸钠。 

本发明中使用的透明质酸及其盐还可以是市售的，例如购自江苏润禾生物有限公司的产品(生物发酵，医药级，分子量50000～3000000Da) 

用于本发明的透明质酸或其盐的分子量没有特别的限制，优选其具有约50000～约3000000Da，更优选约100000～约1000000Da，并且最优选约300000～约600000Da的分子量。 

2、pH值的调节

在步骤(1)中，在将上述来源的透明质酸溶于水之后将所得透明质酸水溶液的pH值调节至约1～约7的范围。pH值调节的方法是本领域技术人员已知的。例如可通过向透明质酸水溶液中加入缓冲剂将pH值调节至所述范围。本发明中可使用的缓冲剂包括但不限于盐酸、乙酸和磷酸中的一种或多种，优选使用盐酸将透明质酸水溶液的pH值调节至约1～约7，更优选为约4～约6。 

在步骤(1)中，所使用的水优选是医用水，并且步骤(1)优选在常温常压下进行。 

步骤(2)

1、零段交联剂

本发明中透明质酸的交联反应可通过加入本领域中已知的零段交联剂交联剂或交联剂体系进行。 

在本申请发明中，零段交联剂是指通过交联后得到的产品中没有交联剂成分的交联剂。在零段交联剂与交联体(透明质酸)的反应过程中不会引入其他间隔臂，因此经交联的聚合物基质中不包含零段交联剂。 

适用于本发明的零段交联剂包括但不限于碳二亚胺类交联剂，其优选选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1-乙基-3-(3-三甲基氨基丙基)碳二亚胺(ETC)、1，1’-二硫-p-亚苯基双(碳二亚胺)、叔丁基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺中的一种或多种，进一步优选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1-乙基-3-(3-三甲基氨基丙基)碳二亚胺(ETC)和1，1’-二硫-p-亚苯基双(碳二亚胺)。 

在本发明中，零段交联剂与交联体(透明质酸)的反应优选在辅助交联剂的存在下进行。所述辅助交联剂选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、琥珀酸酐和高碘酸钠中的一种或多种。这些辅助交联剂可有助于稳定由碳二亚胺类交联剂交联产生的活性中间产物，并 由此提高碳二亚胺类交联剂与透明质酸的交联效率。 

本领域技术人员已知零段交联剂和辅助交联剂的制备方法，并且零段交联剂和辅助交联剂也是市售可得的。 

2、交联剂含量和配比

在本发明的交联反应中，透明质酸水溶液中的透明质酸浓度为约10mg/ml～约200mg/ml，优选为约40mg/ml～约100mg/ml。 

透明质酸的较高反应浓度可使产品的产量增大，经济效益提高，其水分含量较少而使后续切割加工较容易，且不需使用大量乙醇等物质使凝胶沉淀，有利于大规模的商业化生产。 

根据使用的交联剂，所述反应混合物中的所述零段交联剂与透明质酸的重量比为约0.5％～约20％，优选为约1％～约8％，更优选为约4％～约7.5％。 

所述反应混合物中的所述零段交联剂与辅助交联剂的摩尔比为约1∶3～约5∶1，优选为约3∶1～约1∶2。 

3、交联反应温度与时间

在本发明的透明质酸衍生物凝胶制备方法中，透明质酸的交联反应在约-80℃～约20℃的低温下进行。在一个实施方案中，透明质酸的交联反应在约-80℃～约20℃的二步温度梯度下进行，即先在约0℃～约20℃的条件下进行反应约30min～约48h，再在约-80℃～约0℃的条件下进行反应约12h～约6天。 

出人意料地发现，通过低温反应可避免零段交联剂与辅助交联剂在较高温度下发生副反应而导致凝胶的抗降解力、凝胶品质的降低。此外，所述低温反应还能提高交联程度。由此，所述低温反应可使凝胶的粘弹性提高，避免了凝胶由于硬度较大导致填充的困难以及病人体内的不适应，降低了红肿发炎等症状。 

4、复合搅拌方式

在本发明的交联反应中，所述交联反应采用在图1所示的复合搅拌 方式进行。 

在本发明中，复合搅拌方式是指采用交联反应器的自旋转与搅拌反应器采用上下捣动方式结合在一起的搅拌方式。所述复合搅拌方式更能充分地搅拌较高浓度的反应液，既避免了剪切搅拌器破坏交联物的网状结构，又解决了其他类型的搅拌器难以搅动高浓度反应液的问题，从而使产物的粘弹性增大，交联程度提高。 

在本发明的一个实施方案中，如图1所示，向配有搅拌器(2)、冷凝器(3)、真空泵(4)、控温装置(6)、加热套(7)的可旋转反应器1的进料口(5)中加入上述反应原料，并通过反应器(1)绕其纵轴方向上的自旋转和搅拌器(2)沿反应器1的纵轴方向的上下运动捣动反应器(1)中的反应混合物，以进行上述低温反应。所述自旋转转速没有特别限制，其可以为0～约2000rpm。 

步骤(3)：交联反应产物的凝固

在步骤(2)之后，可通过凝固浴步骤使所得透明质酸衍生物产物凝固为凝胶。 

本领域技术人员已知各种凝固浴的方法。本发明所述的凝固浴没有特别限制，所使用的浴液包括但不限于乙醇、氢氧化钠溶液、乙二醇、异丙醇和丁二醇中的一种或多种。 

在本发明的一个实施方案中，如图1a所示，交联后的产品从反应器(1)挤出通过双扩散凝固装置(9)而进行凝固。 

在本发明的另一个实施方案中，在反应器(1)的卸料口处设置多孔筛(8)，并以一定压力将透明质酸交联产物压出至双扩散凝固装置(9)中，并使其凝固。 

所述多孔筛(8)的目数为约10～约100，孔径为约10μm～约5mm。所述压力为约1～约20kg/cm²。 

步骤(4)：凝胶产物的分子链拉伸

在本发明的透明质酸衍生物凝胶的制备方法中，在步骤(3)之后还可通过卷绕处理步骤对所述透明质酸衍生物进行进一步分子链拉伸处理。卷绕 处理能够在一定外力作用下使处于弯曲状态的分子链转为直链状态，由此，卷绕处理可使凝胶的力学性能增强，从而提高其抗降解能力。 

本发明所述的卷绕拉伸步骤可通过如纺丝领域中常用的卷绕装置进行。在本发明的一个实施方案中，如图1a所示，将由双扩散凝固装置(9)凝固后的产物通过卷绕设备(10)进行分子链拉伸，由此制备经分子链拉伸的透明质酸衍生物凝胶。 

本发明的制备方法中适用的卷绕拉伸设备的速度为约50r/min～约300r/min。 

步骤(5)：分离和纯化

在本发明的透明质酸衍生物凝胶的制备方法中，可通过本领域技术人员已知的方法对交联后的透明质酸衍生物产物进行分离和/或纯化。分离和纯化的方法包括常压或减压蒸馏、重结晶、柱层析、离子交换层析、凝胶层析、薄层层析、溶剂萃取、透析、洗涤等。所述各分离和纯化步骤可在任一个上述制备步骤之后进行。 

在本发明的一个实施方案中，在最后一个上述制备步骤之后对透明质酸衍生物凝胶进行分离和纯化。更具体的，所述分离和纯化步骤包括先用如饱和生理盐水或PBS缓冲溶液将所得透明质酸衍生物凝胶产物浸泡、洗涤、抽提，除去未反应单体及其它杂质，然后用球形切粒机切成球形结构进行造粒。然后将所得凝胶颗粒经过生理盐水或PBS缓冲溶液透析纯化以得到纯净的透明质酸凝胶的最终产物。 

实施例

图1透明质酸衍生物凝胶的制备示意图。 

1-可旋转反应器；2-搅拌器；3-冷凝器；4-真空泵；5-进料口；6-温度控制；7-加热套；8-多孔筛；9-凝固浴；10-卷绕装置。 

图2本发明实施例3透明质酸衍生物凝胶的降解率示意图. 

以下参照附图，以实施例的方式对本发明进行说明。 

以下实施例仅以示例的方式描述本发明，而不是将本发明限制在所述实施例所明确的实施方案中，从说明书整体和权利要求而言，本发明的范 围是清楚的。 

材料

透明质酸钠：购自山东福瑞达公司 

EDC：购自上海化学试剂 

ETC：购自上海化学试剂 

NHS：购自上海化学试剂 

磺化NHS：购自上海化学试剂 

1，1’-二硫-P-亚苯基双(碳二亚胺)：购自上海化学试剂 

琥珀酸酐：购自上海化学试剂 

实施例1

通过以下步骤制备透明质酸衍生物水凝胶： 

将原料透明质酸纳溶于去离子水配成透明质酸浓度为30mg/ml的溶液。加入0.1N的盐酸缓冲剂，调节pH值至4.75，然后将所得透明质酸水溶液加入到如图1所示的反应器(1)中，向透明质酸水溶液滴加EDC和NHS的水溶液，在避光条件下，在0℃的温度条件下，调节自旋转转速为10rpm并采用图示1所示的复合搅拌方式进行反应30min后，然后将反应器温度控制为-80℃进行反应24h。 

EDC的量为透明质酸浓度的10重量％。 

EDC与NHS的摩尔比为1∶1。 

在经过4h交联反应后，用8kg/cm²的压力使反应混合物通过卸料口处的100目多孔筛(孔径为100μm)，并推出至凝固装置中通过乙醇凝固浴进行凝固，然后通过转速为500r/min的卷绕装置对透明质酸凝胶产物进行分子链拉伸处理。 

将所得透明质酸衍生物凝胶产物浸泡在PBS缓冲液中进行透析以去除未反应的单体及其它杂质。用球形切粒机切成球形结构。然后将所得凝胶颗粒经过饱和生理盐水或PBS缓冲溶液透析纯化3～10天。其后在-80℃～-40℃的温度下将所得凝胶预冷冻，然后在-40℃～-20℃下冷冻干燥而得到纯净的最终凝胶产物。 

将所得凝胶产物在室温下用pH值为7.2的PBS缓冲液充分溶胀，配成注射液，并通过针管，以恒定速度推动匀化，得到可注射的水凝胶。凝胶与缓冲液PBS的浓度为10mg/ml。 

实施例2

通过以下步骤制备透明质酸衍生物水凝胶： 

将原料透明质酸纳溶于去离子水配成透明质酸浓度为50mg/ml的溶液。加入0.1N的盐酸缓冲剂，调节pH值至4.75，然后将所得透明质酸水溶液加入到如图1所示的反应器中，向透明质酸水溶液滴加ETC和NHS的水溶液，在避光条件下，在8℃的温度条件下，调节自旋转转速为200rpm并采用复合搅拌方式进行反应12h。 

EDC的量为透明质酸浓度的4重量％。 

EDC与NHS的摩尔比为3∶1。 

在经过48h交联反应后，用8kg/cm²的压力使反应混合物通过卸料口处的100目多孔筛(孔径为1mm)，并推出至氢氧化钠溶液的凝固浴中进行凝固，然后通过转速为500r/min的卷绕装置对透明质酸凝胶产物进行分子链拉伸处理。 

用无水乙醇将所得透明质酸衍生物凝胶产物浸泡、洗涤、抽提，除去未反应的单体及其它杂质，用球形切粒机切成球形结构。然后将所得凝胶颗粒经过饱和生理盐水或PBS缓冲溶液透析纯化3～10天。其后在-80℃～-40℃的温度下将所得凝胶预冷冻，然后在-40℃～-20℃下冷冻干燥而得到纯净的最终凝胶产物。将所得凝胶产物在室温下用pH值为7.2的PBS缓冲液充分溶胀，配成注射液，并通过针管，以恒定速度推动匀化，得到可注射的水凝胶。凝胶与缓冲液PBS的浓度为20mg/ml。 

实施例3

通过以下步骤制备透明质酸衍生物水凝胶： 

将原料透明质酸纳溶于去离子水配成透明质酸浓度为100mg/ml的溶液。加入0.1N的盐酸缓冲剂，调节pH值至5.5，然后将所得透明质酸水溶液加入到反应釜中，向透明质酸水溶液滴加1，1’-二硫-p-亚苯基双(碳二亚胺) 和NHS的水溶液，在避光条件下，在8℃的温度条件下，调节自旋转转速为300rpm并采用复合搅拌方式进行反应。 

所述1，1’-二硫-p-亚苯基双(碳二亚胺)的量为透明质酸浓度的1％； 

所述1，1’-二硫-p-亚苯基双(碳二亚胺)与NHS的摩尔比为1∶2。 

在经过72h交联反应后，用8kg/cm²的压力使反应混合物通过卸料口处的10目多孔筛(孔径为5mm)，并推出至乙二醇凝固浴中进行凝固，然后通过转速为500r/min的卷绕装置对透明质酸凝胶产物进行分子链拉伸处理。 

用无水乙醇将所得透明质酸衍生物凝胶产物浸泡、洗涤、抽提，除去未反应的单体及其它杂质，用球形切粒机切成球形结构。然后将所得凝胶颗粒经过饱和生理盐水或PBS缓冲溶液透析纯化3～10天。其后在-80℃～-40℃的温度下将所得凝胶预冷冻，然后在-40℃～-20℃下冷冻干燥而得到纯净的最终凝胶产物。将所得凝胶产物在室温下用pH值为7.2的PBS缓冲液充分溶胀，配成注射液，并通过针管，以恒定速度推动匀化，得到可注射的水凝胶。凝胶与缓冲液PBS的浓度为30mg/ml。 

实施例4

通过以下步骤制备透明质酸衍生物凝胶膜： 

将原料透明质酸纳溶于去离子水配成透明质酸浓度为100mg/ml的溶液。加入0.1N的盐酸缓冲剂，调节pH值～5.5，然后将所得透明质酸水溶液加入到反应釜中，向透明质酸水溶液滴加EDC和琥珀酸酐的水溶液，在避光条件下，在4℃的温度条件下，调节自旋转转速为50rpm并采用复合搅拌方式进行反应。 

所述EDC的量为透明质酸浓度的1％； 

所述EDC与琥珀酸酐的摩尔比为1∶2。 

在经过120h交联反应后，用8kg/cm²的压力使反应混合物通过卸料口处的10目多孔筛(孔径为5mm)推出至异丙醇凝固浴中进行凝固，然后通过转速为500r/min的卷绕装置对透明质酸凝胶产物进行分子链拉伸处理。 

用无水乙醇将所得透明质酸衍生物凝胶产物浸泡、洗涤、抽提，除去未反应的单体及其它杂质，用球形切粒机切成球形结构。然后将所得凝胶 颗粒经过饱和生理盐水或PBS缓冲溶液透析纯化3～10天。其后在-80℃～-40℃的温度下将所得凝胶预冷冻，然后在-40℃～-20℃下冷冻干燥而得到纯净的最终凝胶产物。取10g干燥的如上制备的透明质酸衍生物凝胶，用100ml医用水将其溶解后，倒入模具中进行压膜，得到具有一定力学性能的透明质酸膜材料。 

测试方法

溶胀比：本发明中的溶胀比是指所得透明质酸凝胶产物在室温下用pH值为约7.2的PBS缓冲液充分溶胀后，经溶胀的凝胶产物重量对未溶胀的透明质酸凝胶产物重量的比值。通过本发明的制备方法得到的透明质酸凝胶产物的溶胀比为约50～约300。 

凝胶浓度：本发明中的凝胶浓度是指通过本发明的制备方法得到的透明质酸凝胶产物中透明质酸的含量，例如根据咔唑法(Bitter和Muir，1962，Anal Biochem.4：330-334)可测定透明质酸的含量。通过本发明的制备方法得到的透明质酸凝胶产物的凝胶浓度为约1mg/ml～约30mg/ml。 

交联度：本发明中的透明质酸凝胶的交联度是指称取参加交联反应的不能被水所溶解的透明质酸的质量与投入的透明质酸总质量的百分比。 

粘弹性：本发明中的透明质酸凝胶的粘弹性是指通过Brookfield旋转粘度计测试得到的粘度。通过本发明的制备方法得到的透明质酸凝胶产物的粘度为约50000cPs～约200000cPs。 

试验例

取本发明实施例3的凝胶产品1g，将其溶解于含有30u的透明质酸酶的PBS溶液(pH＝7.2)中，然后在37℃的水浴中进行模拟降解实验。在48h后使用分光光度计测定在不同时间点时该降解液中糖醛酸的浓度，从而计算透明质酸的降解率，所得结果见图2。 

图2中交联后的透明质酸衍生物凝胶具有良好的抗降解性，例如其48h的降解率为12.8％。而目前市售的透明质酸凝胶产品在相同情况下的降解率为18.5％-约40％的水平(例如参见CN101244290A的表(1))，由此可见本发明的透明质酸衍生物凝胶产品明显具有更佳的抗降解能力。 

本发明通过低温反应可避免零段交联剂与辅助交联剂在较高温度下发生副反应而导致凝胶的抗降解力、凝胶品质的降低。此外，低温反应还有助于提高凝胶产物交联程度，可使凝胶的粘弹性提高，避免凝胶由于硬度较大导致填充的困难以及病人体内的不适应，降低了红肿发炎等症状。 

Claims (10)

1.透明质酸衍生物凝胶及其制备方法，其包括以下步骤：

(1)将透明质酸或其盐溶于水中，使所得透明质酸水溶液中透明质酸的浓度为10mg/ml～200mg/ml，并将pH值调节为1～7配成均匀溶液；

(2)向如图(1)所示反应器中加入上述反应溶液，在-80℃～20℃的反应温度下，在零段交联剂存在下使所述透明质酸水溶液进行交联；

(3)交联后的产品从反应器中挤出通过双扩散凝固装置通过凝固液进行凝固；

(4)在步骤(3)之后的透明质酸衍生物凝胶还可通过卷绕处理步骤对所述透明质酸衍生物进行进一步分子链拉伸处理。

所述透明质酸盐选自透明质酸的钠盐、钾盐、铵盐、钙盐和镁盐中的一种或多种；

所述的透明质酸或其盐的分子量为50000～3000000Da；

所述的零段交联剂是碳二亚胺类交联剂。

2.根据权利要求1中任一项所述的制备方法，其中通过向所述透明质酸水溶液中加入缓冲剂调节pH值，所述缓冲剂包含盐酸、乙酸和磷酸中的一种或多种。

3.根据权利要求1～2中任一项所述的制备方法，其中所述反应温度为温度梯度，即先在0℃～20℃的条件下进行反应30min～48h，然后在-80℃～0℃的条件下进行反应12h～6天。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述碳二亚胺类交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1-乙基-3-(3-三甲基氨基丙基)碳二亚胺(ETC)、1，1’-二硫-p-亚苯基双(碳二亚胺)、叔丁基碳二亚胺和二异丙基碳二亚胺中的一种或多种。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中所述透明质酸的交联在辅助交联剂的存在下进行。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中所述辅助交联剂选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、琥珀酸酐和高碘酸钠中的一种或多种。

7.根据权利要求1～6所述的制备方法，其中所述零段交联剂和所述辅助交联剂的摩尔比为5∶1～1∶5。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中所述零段交联剂与所述透明质酸的重量比为2％～10％。

9.根据权利要求1中所述的制备方法，其中在步骤(2)中通过复合搅拌方式使反应混合物交联而形成透明质酸衍生物产物，所述复合搅拌方式是指采用交联反应器的自旋转与搅拌反应器采用上下捣动方式结合在一起的搅拌方式。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述凝固浴的浴液选自乙醇、氢氧化钠溶液、乙二醇和异丙醇中的一种或多种。