CN111440340B - 一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丝素蛋白‑透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法。利用蚕丝丝素蛋白中酪氨酸残基含量较高的特点，用酪氨酸酶催化丝素蛋白大分子间发生交联反应,生成丝素蛋白第一网络；用碳化二亚胺介导透明质酸钠大分子间的交联，生成透明质酸钠第二网络；将第一网络和第二网络混合后，依靠碳化二亚胺的介导，生成第一网络与第二网络之间的交联键，从而制成丝素蛋白‑透明质酸钠交联双网络凝胶。本发明提供的凝胶具有三维网络结构稳定，不易崩塌和解体，抗生物降解能力强，生物相容性好的特点，可广泛用于组织填充、引导组织再生、组织工程支架及药物载体等。

Description

一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用高分子凝胶材料领域，尤其涉及丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法，可用于组织填充、引导组织再生、细胞培养载体、组织工程支架及药物控制释放载体等。
背景技术
高分子水凝胶作为一类具备亲水性三维网络结构的高吸水、高保水材料，被广泛用于美容整形领域的组织填充，矫形外科的缺损组织引导再生、组织工程支架，以及药物控制释放载体等。
透明质酸钠是构成天然细胞外基质的主要成分之一，广泛存在于脊椎动物的结缔组织、关节润滑液和软骨中。透明质酸钠是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖通过β1-3键及β1-4键交替组成双糖单位，再由双糖单位重复组成的线性多糖。透明质酸钠凝胶的吸水性强，吸水后产生的膨胀压力使其可以支撑周围组织。但是天然透明质酸钠在体内很易被降解，半衰期短，且对骨髓间充质干细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等细胞的粘附能力相对不足。通过用1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜等试剂交联，虽然可以延缓透明质酸钠凝胶的生物降解，但在体内的停留时间仍然很短。
蚕丝丝素蛋白材料具有良好的生物相容性，对各种人类细胞的粘附能力强，在体内的生物降解速度较慢。用蚕丝丝素蛋白与透明质酸钠共混制备复合凝胶，既能具备透明质酸钠凝胶的高吸水性，又能具备蚕丝丝素蛋白凝胶的抗生物降解性能以及对细胞的较强粘附能力。
在本发明作出之前，文献报道了一种丝素蛋白-透明质酸钠复合凝胶的制备方法及性能（Biomaterials,2020,233:119729），所制备的凝胶是由辣根过氧化物酶和双氧水交联而成。中国发明专利CN106492279A公开了一种丝素蛋白-透明质酸复合凝胶的快速制备方法，采用碳化二亚胺盐、N-羟基琥珀酰亚胺、醛、二缩水甘油醚或二乙烯砜中的一种或一种以上交联剂制备而成。中国发明专利CN110527116A公开了一种酶法制备丝素/透明质酸复合外敷材料的方法，以漆酶催化丝素蛋白和改性后的透明质酸发生交联，制得复合水凝胶敷料。上述方法通过用丝素蛋白与透明质酸钠复合、交联制备凝胶，在一定程度上利用了丝素蛋白和透明质酸钠各自的生物学性能优点。但是，由于凝胶内部的网络是由丝素蛋白与透明质酸钠混合交联而成，当透明质酸钠组份先被降解后易造成凝胶整体三维网络的崩塌和解体，使凝胶失去效用。
发明内容
本发明针对现有技术中丝素蛋白-透明质酸钠凝胶结构及制备方法存在的不足，提供一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络结构凝胶及其制备方法，所制备的凝胶具有三维网络结构牢固，不易崩塌和解体，抗生物降解能力强，生物相容性好的特点。
实现本发明目的的技术方案是提供一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法，蚕丝经脱胶、溶解、透析处理后，得到丝素蛋白水溶液，用纯化水调整丝素蛋白水溶液的浓度，再进行如下步骤的加工：
（1）将酪氨酸酶溶液和双氧水分别滴加到温度为15～50℃的丝素蛋白水溶液中，边滴加边缓慢搅拌，在温度为15～50℃的条件下，搅拌反应60～180分钟，得到第一组分；
（2）将透明质酸钠溶解于50 mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中，再在溶液中滴加N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，得到的透明质酸钠溶液中N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为5～20 mmol/L和10～40 mmol/L，在温度为15～50℃的条件下，搅拌反应30～120分钟，得到第二组分；
（3）将第一组分与第二组分充分混合，真空脱泡，在温度为15～50℃的条件下反应6～24小时，得到丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块；
（4）将丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒，装入截留分子量为3～12 kDa的透析袋中，用纯化水、注射用水或生理盐水透析2～4天，再经筛网过滤后，得到颗粒状丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶。
本发明技术方案所述的丝素蛋白为桑蚕丝素蛋白或柞蚕丝素蛋白。
本发明所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法，步骤（1）中丝素蛋白水溶液的浓度为2～40 mg/mL；步骤（1）中，酪氨酸酶溶液的浓度为500 U/mL；每100 mL丝素蛋白水溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为1～30 mL，双氧水的滴加量为10～500μL。步骤（2）中，透明质酸钠的平均分子量为400～2000 kDa；透明质酸钠的2-吗啉乙磺酸溶液浓度为1～20 mg/mL。
本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶，由经酶交联形成的丝素蛋白第一网络和交联透明质酸钠第二网络组成，第一网络和第二网络之间相互交联。
本发明的原理是：利用丝素蛋白中酪氨酸残基含量较高的特点，用酪氨酸酶催化丝素蛋白大分子间发生交联反应, 生成丝素蛋白第一网络内部交联键，并经酶交联形成的丝素蛋白第一网络；用碳化二亚胺介导透明质酸钠大分子间的交联，生成透明质酸钠第二网络内部交联键，并形成透明质酸钠第二网络；同时依靠碳化二亚胺的介导，生成第一网络与第二网络之间的交联键，从而制成丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶。
与现有技术相比，本发明的显著优点在于：
1．本发明提供的凝胶由经交联形成的丝素蛋白第一网络和交联透明质酸钠第二网络组成，且第一网络和第二网络之间也经共价键交联，网络结构牢固，当部分透明质酸钠组份先被降解后，凝胶整体的三维网络结构不易崩塌和解体，凝胶的抗生物降解能力强。
2．本发明提供的凝胶既具备高吸水性能，又具备对细胞的较强粘附能力。
3．本发明提供的制备方法，丝素蛋白第一网络和交联透明质酸钠第二网络各自利用不同的可反应基团、采用不同的反应原理进行交联后形成，能够确保各自网络结构的稳定。
4．本发明以天然高分子为原料，采用低毒性的试剂完成交联反应，且经过纯化工艺除去未反应物，可保持凝胶优良的生物相容性。
附图说明
图1为本发明提供的丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的结构示意图；
图2为本发明实施例提供的第一组分丝素蛋白网络的热水溶失率及酪氨酸含量的柱状图；
图3为本发明实施例提供的丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶与对照样的降解率对比的柱状图。
图中，1.丝素蛋白网络（第一网络）；2.透明质酸钠网络（第二网络）；3.丝素蛋白网络（第一网络）内部交联键；4. 透明质酸钠网络（第二网络）内部交联键；5. 丝素蛋白网络（第一网络）与透明质酸钠网络（第二网络）之间交联键。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。
实施例1
将桑蚕茧壳经清洗、脱胶、溶解、透析后，用纯化水稀释调整浓度，得到浓度为20mg/mL的桑蚕丝素蛋白水溶液。
将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和双氧水分别缓慢滴加到温度为30℃的桑蚕丝素蛋白水溶液中，边滴加边缓慢搅拌，每100 mL桑蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为15 mL，双氧水的滴加量为100 μL。温度维持在30℃，搅拌反应60分钟，得到第一组分。
在室温条件下，将平均分子量为1000 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的2-吗啉乙磺酸（MES）溶液中，边溶解边缓慢搅拌，使溶液中透明质酸钠的浓度为8 mg/mL，再在溶液中滴加N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液，使溶液中NHS和EDC的浓度分别为10 mmol/L和20 mmol/L。温度维持在30℃，搅拌反应90分钟，得到第二组分。
将第一组分与第二组分按体积比10∶20充分混合，温度维持在30℃，反应12小时，得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。
将桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后，装入截留分子量为9kDa的透析袋中，用纯化水透析4天。最后经筛网过滤，得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒，其粒径为300～700 μm。
参见附图1，为本发明提供的丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的结构示意图；丝素蛋白中酪氨酸残基含量较高，用酪氨酸酶催化丝素蛋白大分子间发生交联反应,生成丝素蛋白网络（第一网络）内部交联键3，并经酶交联形成的丝素蛋白网络（第一网络）1；以碳化二亚胺介导透明质酸钠大分子间的交联，生成透明质酸钠网络（第二网络）内部交联键4，并形成透明质酸钠网络（第二网络）2；同时依靠碳化二亚胺的介导，生成丝素蛋白网络（第一网络）与透明质酸钠网络（第二网络）之间交联键5，从而制成丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶。
对得到的第一组分样品，其酪氨酸含量及热水溶失率进行测试：取一定数量的第一组分样品，经冷冻干燥后得到第一组分样品的固体。取其中部分固体，用氨基酸分析仪测定其酪氨酸的含量（mol%）。同时，另取其中部分固体，称得其质量W0（g），加入锥形瓶中按浴比为1:100加入去离子水，于37 ℃，在水浴恒温振荡器中振荡24小时，过滤，将残留的第一组分样品再经冷冻干燥后称得其质量W1（g），按公式（1）计算得到第一组分样品的热水溶失率（%）。对未经交联反应的丝素蛋白溶液经冷冻干燥后作为交联前的样品，进行相同步骤的测试。
Figure 421856DEST_PATH_IMAGE002
参见附图2，它是本实施例提供的第一组分的热水溶失率及酪氨酸含量的柱状图；由图2可见，本实施例提供的经酪氨酸酶溶液和双氧水交联加工后，第一组分样品中酪氨酸的含量明显减少，热水溶失率显著降低，几乎不溶于水，说明酪氨酸酶和双氧水有效催化了丝素蛋白中酪氨酸间的交联反应，形成第一网络丝素蛋白网络。
桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠混合网络凝胶（对照样凝胶）的制备：将MES溶解于20mg/mL的桑蚕丝素蛋白水溶液中，使其浓度达到50 mmol/L。再在溶液中滴加NHS和EDC溶液，使溶液中NHS和EDC的浓度分别为10 mmol/L和20 mmol/L，得到对照样第一组分。第二组分的制备方法与本实施例中第二组分相同。将制备的对照样第一组分立即与第二组分按照体积比10∶20充分混合，按照本实施例中所述相同的方法制备凝胶块，并经破碎造粒、透析、筛网过滤后，得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联混合网络凝胶颗粒，作为对照样凝胶。
凝胶的抗降解性能测试：取冷冻干燥后的蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒约0.5 g，准确称得其质量M0（g），加300 U/mL的透明质酸酶溶液2mL，37℃保温降解65小时，过滤，将残留的凝胶冷冻干燥后称得其质量M1（g），按公式（2）计算得到凝胶的降解率（%）。桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶（双网络凝胶）和对照样凝胶进行相同的测试。
Figure 604576DEST_PATH_IMAGE004
参见附图3，为本实施例提供的丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶与对照样的降解率对比的柱状图；由图3可见，桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的降解率显著小于对照样，抗降解能力显著强于对照样。
实施例2
将桑蚕生丝经脱胶、溶解、透析后，用纯化水稀释调整浓度，得到浓度为2 mg/mL的桑蚕丝素蛋白水溶液。
在室温条件下，将酪氨酸酶溶解于纯化水中，边溶解边缓慢搅拌，制备浓度为500U/mL的酪氨酸酶溶液。
将酪氨酸酶溶液和双氧水分别滴加到温度为15℃的桑蚕丝素蛋白水溶液中，边滴加边缓慢搅拌，每100 mL桑蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为25 mL，双氧水的滴加量为450 μL。温度维持在15℃，搅拌反应180分钟。得到第一组分。
在室温条件下，将平均分子量为2000 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶液中，边溶解边缓慢搅拌，使溶液中透明质酸钠的浓度为5 mg/mL，再在溶液中滴加NHS和EDC溶液，使溶液中NHS和EDC的浓度分别为5 mmol/L和10 mmol/L。温度维持在15℃，搅拌反应30分钟。得到第二组分。
将第一组分与第二组分按照体积比10∶15充分混合，温度维持在15℃，反应24小时，得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。
将桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块粉碎造粒后，装入截留分子量为12 kDa的透析袋中，用注射用水透析3天，最后再经筛网过滤后得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒。
实施例3
将桑蚕生丝经脱胶、溶解、透析后，用纯化水稀释调整浓度，得到浓度为38 mg/mL的桑蚕丝素蛋白水溶液。
将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和双氧水分别缓慢滴加到温度为50℃的桑蚕丝素蛋白水溶液中，边滴加边缓慢搅拌，每100 mL桑蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为2 mL，双氧水的滴加量为15 μL。温度维持在50℃，搅拌反应120分钟。得到第一组分。
在室温条件下，将平均分子量为400 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶液中，边溶解边缓慢搅拌，使溶液中透明质酸钠的浓度为20 mg/mL，再在溶液中滴加NHS和EDC溶液，使溶液中NHS和EDC的浓度分别为20 mmol/L和40 mmol/L。温度维持在50℃，搅拌反应120分钟。得到第二组分。
将第一组分与第二组分按照体积比10∶10充分混合，温度维持在50℃，反应6小时后，得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。
将桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后，装入截留分子量为3kDa的透析袋中，用生理盐水透析2天。最后经筛网过滤，得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒。
实施例4
将柞蚕生丝经脱胶、溶解、透析后，用纯化水稀释调整浓度，得到浓度为2 mg/mL的柞蚕丝素蛋白水溶液。
将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和双氧水分别缓慢滴加到温度为20℃的柞蚕丝素蛋白水溶液中，边滴加边缓慢搅拌，每100 mL柞蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为28 mL，双氧水的滴加量为480 μL。温度维持在20℃，搅拌反应150分钟。得到第一组分。
在室温条件下，将平均分子量为1800 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶液中，边溶解边缓慢搅拌，使溶液中透明质酸钠的浓度为3 mg/mL，再在溶液中滴加NHS和EDC溶液，使溶液中NHS和EDC的浓度分别为10 mmol/L和20 mmol/L。温度维持在20℃，搅拌反应60分钟。得到第二组分。
将第一组分与第二组分按照体积比10∶30充分混合，温度维持在20℃，反应20小时后，得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。
将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后，装入截留分子量为5kDa的透析袋中，用生理盐水透析3天。最后经筛网过滤，得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒。
实施例5
将柞蚕茧壳经清洗、脱胶、溶解、透析后，用纯化水稀释调整浓度，得到浓度为25mg/mL的柞蚕丝素蛋白水溶液。
将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和双氧水分别缓慢滴加到温度为25℃的柞蚕丝素蛋白水溶液中，边滴加边缓慢搅拌，每100 mL柞蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为15 mL，双氧水的滴加量为80 μL。温度维持在25℃，搅拌反应90分钟。得到第一组分。
在室温条件下，将平均分子量为800 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶液中，边溶解边缓慢搅拌，使溶液中透明质酸钠的浓度为10 mg/mL，再在溶液中滴加NHS和EDC溶液，使溶液中NHS和EDC的浓度分别为15 mmol/L和30 mmol/L。温度维持在25℃，搅拌反应110分钟。得到第二组分。
将第一组分与第二组分按照体积比10∶20充分混合，温度维持在25℃，反应18小时后，得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。
将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后，装入截留分子量为9kDa的透析袋中，用纯化水透析4天。最后经筛网过滤，得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒。
将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块粉碎、造粒后，得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒半成品。
将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒半成品装入截留分子量为9～12 kDa的透析袋中，用纯化水透析4天。其后，经过滤，得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒。
实施例6
将柞蚕生丝经脱胶、溶解、透析后，用纯化水稀释调整浓度，得到浓度为15 mg/mL的柞蚕丝素蛋白水溶液。
将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和和双氧水分别缓慢滴加到温度为37℃的柞蚕丝素蛋白水溶液中，边滴加边缓慢搅拌，每100 mL柞蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为5 mL，双氧水的滴加量为25 μL。温度维持在37℃，搅拌反应60分钟。得到第一组分。
在室温条件下，将平均分子量为500 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶液中，边溶解边缓慢搅拌，使溶液中透明质酸钠的浓度为15 mg/mL，再在溶液中滴加NHS和EDC溶液，使溶液中NHS和EDC的浓度分别为20 mmol/L和35 mmol/L。温度维持在37℃，搅拌反应50分钟。得到第二组分。
将第一组分与第二组分按照体积比10∶15充分混合，温度维持在37℃，反应8小时后，得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。
将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后，装入截留分子量为12 kDa的透析袋中，用注射用水透析2天。最后经筛网过滤，得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒。

Claims (6)

1.一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法，将蚕丝经脱胶、溶解、透析处理后得到丝素蛋白水溶液，用纯化水调整丝素蛋白水溶液的浓度，其特征在于再进行如下步骤的加工：
（1）将酪氨酸酶溶液和双氧水分别滴加到温度为15～50℃的丝素蛋白水溶液中，边滴加边缓慢搅拌，在温度为15～50℃的条件下，搅拌反应60～180分钟，得到第一组分；
（2）将透明质酸钠溶解于50 mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中，再滴加N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，得到的透明质酸钠溶液中，N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为5～20 mmol/L和10～40 mmol/L；在温度为15～50℃的条件下，搅拌反应30～120分钟，得到第二组分；
（3）将第一组分与第二组分充分混合，真空脱泡，在温度为15～50℃的条件下反应6～24小时，得到丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块；
（4）将丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒，装入截留分子量为3～12kDa的透析袋中，用纯化水、注射用水或生理盐水透析2～4天，再经筛网过滤后，得到颗粒状丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法，其特征在于：所述丝素蛋白为桑蚕丝素蛋白或柞蚕丝素蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中丝素蛋白水溶液的浓度为2～40 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，酪氨酸酶溶液的浓度为500 U/mL；每100 mL丝素蛋白水溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为1～30 mL，双氧水的滴加量为10～500μL。
5.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，透明质酸钠的平均分子量为400～2000 kDa；透明质酸钠的2-吗啉乙磺酸（MES）溶液浓度为1～20 mg/mL。
6.按权利要求1制备方法得到的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶，由经酶交联形成的丝素蛋白第一网络和交联透明质酸钠第二网络组成，第一网络和第二网络之间相互交联。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN103421201A (zh) * 2012-05-14 2013-12-04 江南大学 一种生物酶法抗菌丝素蛋白膜制备方法
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102952275A (zh) * 2011-08-19 2013-03-06 上海建华精细生物制品有限公司 一种双相技术运用的透明质酸凝胶及其制备方法
CN103421201A (zh) * 2012-05-14 2013-12-04 江南大学 一种生物酶法抗菌丝素蛋白膜制备方法
CN104004231A (zh) * 2014-06-12 2014-08-27 东南大学 一种生物大分子互穿网络水凝胶及其制备方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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"再生丝素蛋白水凝胶的制备与改性";张轩等;《江苏丝绸》;20191215(第6期);第22-30页 *

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