CN113041392A

CN113041392A - 一种负载胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶生物活性复合水凝胶的制备方法

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Publication number: CN113041392A
Application number: CN202110354945.3A
Authority: CN
Inventors: 王秉; 邓明; 姚舒婷; 彭志勤; 万军民
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Zhejiang Sci Tech University ZSTU; Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date: 2021-04-01
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2021-06-29

Abstract

本发明涉及生物医用材料领域，公开了一种负载胰岛素微粒的丝素蛋白‑明胶生物活性复合水凝胶的制备方法，本发明先对蚕茧进行脱胶，用FA/CaCl₂二元体系对丝素蛋白进行第一步溶出，再用溴化锂溶液进行第二步溶出得到丝素蛋白溶液；将胰岛素溶于盐酸中，与用甘油混合的丝素蛋白溶液进行同轴电喷涂，冻干得到载有胰岛素的SF微粒；在SF溶液中加入明胶粉，制备丝素‑明胶共混物，加入载有胰岛素的SF微粒和酪氨酸酶，得到载有胰岛素的复合水凝胶。该方法制备的水凝胶具有良好的控释性能，可以持续释放胰岛素治疗难以愈合的慢性伤口。该水凝胶具有良好的生物相容性和优异的机械性能，利用胰岛素来治疗创伤，促进伤口愈合。

Description

一种负载胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶生物活性复合水凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种负载胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶生物活性复合水凝胶的制备方法。

背景技术

慢性皮肤创伤的特征是数周后还没有愈合，这通常被认为是糖尿病和血管损伤的结果。经典的治疗方法是对伤口进行清创，然后用无菌纱布压迫伤口。当这种方法对某些慢性创面效果不佳时，常用以生物材料为基础的敷料促进愈合。然而，目前的治疗侧重于防止微生物渗入，保持平衡的水分和气体交换环境的敷料。为了治疗一些慢性伤口，经常需要生物活性敷料。因此，需要具有生物活性药物持续释放的功能化创面敷料来提供促进组织修复的刺激功能，从而促进创面愈合，缩短恢复期。胰岛素通过刺激角质形成细胞的迁移和增殖，加速临时组织的上皮再生。此外，胰岛素可刺激内皮细胞的迁移和管的形成，有助于促进伤口愈合过程中的血管生成。

而水凝胶是溶胀的立体三维网状结构高分子聚合物，具有杰出吸取水能力却不溶于水；具有环境敏感性，良好的生物相容性，生物可降解和对多种刺激有响应等特性；具有类细胞外基质的聚合物网状结构，可以允许生物活性分子的负载。载药水凝胶除了兼具水凝胶的优点外，还具有针对性药物控释、增加药物生物利用度、对环境高敏感等优点。性能优良的水凝胶敷料具有创造创面低氧环境，保持作用部位湿润，清除坏死组织和毒素等作用。这些性能使它可以负载一种具有生物活性的胰岛素，从而得到具有持续释放胰岛素能力的慢性创口修复材料。

在制备水凝胶的材料中，天然蛋白质由于独特的结构和生物学性能而占有重要的地位。丝素蛋白作为从蚕丝中提取的天然蛋白质，已被广泛用于生物医用材料的制作；明胶是一种通过胶原蛋白水解的天然蛋白质产物，其含有的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（RGD）使明胶基的生物医用材料表现出良好的生物性能，能促进细胞的粘附和生长。丝素蛋白大分子形成的纯水凝胶机械性能较差，存在物理性能上的缺陷，且在成型过程中性能和结构易受到加工条件的影响，使得其实用性降低。在这种情况下，本发明通过温和的加工条件使明胶和丝素蛋白共同构成复合水凝胶，可以弥补丝素蛋白水凝胶的缺陷，并引入其不具备的新特性，以满足不同的应用需求，有望解决应用单一的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种负载胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶生物活性复合水凝胶的制备方法，本发明先用碳酸钠溶液对蚕茧进行脱胶，用FA/CaCl₂二元体系对丝素蛋白进行第一步溶出，再用溴化锂溶液进行第二步溶出得到丝素蛋白溶液；将胰岛素溶于盐酸中，与用甘油混合的丝素蛋白溶液进行同轴电喷涂，冻干得到载有胰岛素的SF微粒；在SF溶液中加入明胶粉，搅拌，制备丝素-明胶共混物，加入载有胰岛素的SF微粒和酪氨酸酶，超声，得到载有胰岛素的复合水凝胶。同时该水凝胶具有良好的控释性能，可以持续释放胰岛素治疗难以愈合的慢性伤口。该方法制备的水凝胶具有良好的生物相容性和优异的机械性能，利用胰岛素来治疗创伤，促进伤口愈合；同时该方法操作过程简单、无毒无害、绿色环保。

本发明的具体技术方案为：

一种负载胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶生物活性复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：丝素蛋白水溶液的制备：取蚕茧，在碳酸钠溶液中煮沸脱胶，然后用去离子水彻底冲洗，去除胶状丝胶蛋白，每一步都重复多次；所得脱胶蚕丝在FA/CaCl₂溶剂中室温溶解，形成SF-FA-CaCl₂薄膜；将形成的薄膜在溴化锂溶液中室温重溶，得到含丝素蛋白的混合溶液，在去离子水中透析去除盐离子，得到丝素蛋白溶液。

该制备工艺为两步溶出法，得到的丝素蛋白纯度很高，彻底脱去了具有免疫原性、对于生物组织相容性很低的丝胶蛋白，有利于后面水凝胶的形成。

步骤2：载有胰岛素的丝素蛋白微粒的制备：将胰岛素溶解于HCl中，用NaOH调节pH为6.9-7.1，得到胰岛素溶液；将丝素蛋白溶液稀释后与甘油混合，得到混合溶液，将胰岛素溶液和混合溶液分别作为芯和壳进行同轴电喷涂；同轴喷嘴具有内径0.6 mm的内毛细管和内径1.2 mm的外毛细管；两个注射器泵分别输送芯层和壳层溶液；高压电源在喷嘴与装满液氮的收集箱之间提供13kv高压，距离为12cm，收集到的包被胰岛素的丝素蛋白微粒用冷冻干燥器冻干，得到载有胰岛素的丝素蛋白微粒。

大多数制备胰岛素给药微粒的方法，如乳化法和溶剂萃取法，都需要在有机溶剂中，在极端pH值或机械压力下进行处理，潜在地挑战了胰岛素的生物活性。与其他小分子药物不同，胰岛素具有复杂的分子构象，其生物活性更容易受到盐、有机溶剂和高温的影响，可能导致生物活性的丧失。同时，外部伤口给药半衰期短，在富含多肽酶的伤口环境中生物活性易丧失。所以使用生物相容性的丝素蛋白伤口敷料来持续输送胰岛素，利用可降解微球给药制造敏感的生物制剂，胰岛素被包裹在聚合物微粒中，建立一个持续给药系统。

步骤3：载有胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶复合水凝胶的形成：另取丝素蛋白溶液，加入明胶粉，制备丝素-明胶共混物，搅拌；加入步骤2制得的载有胰岛素的丝素蛋白微粒和酪氨酸酶，继续搅拌均匀，然后超声10-30s，冷冻干燥，制得载有胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶生物活性复合水凝胶。

步骤3中利用丝素蛋白和明胶优化的混合比例，来制造具有良好生物相容性和优异机械性能的水凝胶，同时这种水凝胶还具有多孔结构，所以可以负载胰岛素微粒，形成具有持续释放胰岛素功能的创面伤口敷料；络氨酸酶用于丝素蛋白水凝胶的交联，使络氨酸残基氧化，氧化的酪氨酸残基自身缩合或与丝素蛋白的胺基进行亲核取代，最终形成水凝胶的交联网络。加入酪氨酸酶进行酶促交联避免了化学交联剂对伤口组织细胞的毒性影响。

本发明先用碳酸钠溶液对蚕茧进行脱胶，用FA/CaCl₂二元体系对丝素蛋白进行第一步溶出，再用溴化锂溶液进行第二步溶出得到丝素蛋白溶液；将胰岛素溶于盐酸中，与用甘油混合的丝素蛋白溶液进行同轴电喷涂，冻干得到载有胰岛素的SF微粒；在SF溶液中加入明胶粉，搅拌，制备丝素-明胶共混物，加入载有胰岛素的SF微粒和酪氨酸酶，超声，得到载有胰岛素的复合水凝胶。同时该水凝胶具有良好的控释性能，可以持续释放胰岛素治疗难以愈合的慢性伤口。该方法制备的水凝胶具有良好的生物相容性和优异的机械性能，利用胰岛素来治疗创伤，促进伤口愈合；同时该方法操作过程简单、无毒无害、绿色环保。

作为优选，步骤1中，用0.03-0.07wt%的碳酸钠溶液进行脱胶，脱胶时间为20-40分钟。

作为优选，步骤1中，用9.0-9.5M的溴化锂溶液溶解3-5h。

作为优选，步骤1中，透析时间为70-80h。

作为优选，步骤2中，取胰岛素90-110mg溶于10ml 0.01M盐酸中，溶解过程中始终用NaOH保持pH在6.9-7.1，得到0.8-1.2wt%的胰岛素溶液。

作为优选，步骤2中，稀释丝素蛋白溶液至1.5-2.5wt%，与甘油混合到丝素蛋白质量分数为25-35wt%.

作为优选，步骤2中，两个注射器泵分别以0.1 mL/h和0.3 mL/h的流速输送芯层和壳层溶液；冷冻干燥时间为40-50h。

作为优选，步骤3中，所用丝素蛋白溶液的浓度为10~20%w/v，加入明胶粉30~50%wt%，搅拌温度为35-45℃。

作为优选，步骤3中，加入酪氨酸酶90-110kU；超声时间为15-25s；冷冻干燥40-45h。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明利用具有良好生物相容性和优异机械性能的丝素蛋白-明胶复合水凝胶负载刺激角质形成细胞的迁移和增殖，加速临时组织的上皮再生，刺激内皮细胞的迁移和血管形成的胰岛素，得到了一种用于严重受创修复或慢性伤口愈合的水凝胶。它不仅可以在伤口表面形成一种具有防尘防感染的物理屏障，还可以对受创严重的部位或类似糖尿病引发的慢性难以愈合伤口持续释放胰岛素进行治疗，有效提高了胰岛素的生物利用度并且防止胰岛素在处理伤口过程中失活。同时该水凝胶是利用酪氨酸酶的催化和超声构建交联体系，不会在后期的实验过程中对细胞产生毒性，不影响实验结果的科学性，实验操作过程简单、无毒无害、绿色环保。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

步骤1：SF水溶液的制备：取13个蚕茧，在0.05wt % 碳酸钠溶液中煮沸30分钟，然后用去离子水彻底冲洗，提取胶状丝胶蛋白，每一步都重复两次。脱胶蚕丝在FA/CaCl2溶剂中室温溶解。该溶液形成SF-FA-CaCl2薄膜。将形成的薄膜在9.3 M溴化锂溶液中室温重溶4h，得到8%w/v的SF混合溶液。该溶液在去离子水中透析72小时以去除盐离子，最终得到丝素蛋白水溶液。

步骤2：载有胰岛素的SF微粒的制备：将100 mg胰岛素溶解于10 mL 0.01 M HCl中，用0.1 M NaOH调节pH为6.9-7.1，得到1.0wt%的胰岛素溶液。步骤1制取的SF溶液稀释至2.0 wt%，与甘油混合至SF重量分数为30wt%。将得到的胰岛素溶液(1.0wt%)和SF溶液(2.0wt%)分别作为芯和壳进行同轴电喷涂。同轴喷嘴具有内径0.6 mm的内毛细管和内径1.2 mm的外毛细管。两个注射器泵分别以0.1 mL/h和0.3 mL/h的速度输送芯层和壳层溶液。高压电源在喷嘴与装满液氮的收集箱之间提供13kv高压，距离为12cm。收集到的包被胰岛素的SF微颗粒用冷冻干燥器冻干48小时，得到载有胰岛素的SF微粒。

步骤3：载有胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶复合水凝胶的形成：在10%w/v SF溶液中加入30wt%的明胶粉，制备丝素-明胶(SF-G)共混物，在40℃下搅拌；加入步骤2制得的胰岛素微粒和90kU的酪氨酸酶，继续搅拌均匀，然后超声20s，冷冻干燥42h，制得载有胰岛素的复合水凝胶。

该方法中所用明胶量稍低，得到的复合水凝胶的机械性能稍差，拉伸强度为1.3MPa，伸长率达到118.44%；在2h内迅速吸水膨胀，5h内达到溶胀平衡。酪氨酸酶的用量稍低，体外胰岛素释放试验中在第2、5、9和14天分别释放14.8%、36.7%、61.2%和77.4%的累积胰岛素，在第28天累积胰岛素释放含量为88.1%。将该水凝胶敷料覆盖于链脲唑菌素诱导的糖尿病大鼠创面上，2周后创面闭合率达87.3%，在第3周无明显创面。

实施例2

步骤1：SF水溶液的制备：取15个蚕茧，在0.05wt % 碳酸钠溶液中煮沸30分钟，然后用去离子水彻底冲洗，提取胶状丝胶蛋白，每一步都重复两次。脱胶蚕丝在FA/CaCl2溶剂中室温溶解。该溶液形成SF-FA-CaCl2薄膜。将形成的薄膜在9.3 M溴化锂溶液中室温重溶4h，得到10%w/v的SF混合溶液。该溶液在去离子水中透析72小时以去除盐离子，最终得到丝素蛋白水溶液。

步骤3：载有胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶复合水凝胶的形成：在15%w/v SF溶液中加入40wt%的明胶粉，制备丝素-明胶(SF-G)共混物，在40℃下搅拌；加入步骤2制得的胰岛素微粒和100kU的酪氨酸酶，继续搅拌均匀，然后超声20s，冷冻干燥42h，制得载有胰岛素的复合水凝胶。

该方法中所用明胶量合适，得到的复合水凝胶的机械性能好，拉伸强度为1.4MPa,伸长率达到120.58%；在2h内迅速吸水膨胀，5h内达到溶胀平衡。酪氨酸酶的用量高，体外胰岛素释放试验中在第2、5、9和14天分别释放16.2%、39.8%、66.4%和81.8%的累积胰岛素，在第28天累积胰岛素释放含量为90.7%。将该水凝胶敷料覆盖于链脲唑菌素诱导的糖尿病大鼠创面上，愈合效果好，2周后创面闭合率达90.4%，在第3周无明显创面。

实施例3

步骤1：SF水溶液的制备：取17个蚕茧，在0.05wt % 碳酸钠溶液中煮沸30分钟，然后用去离子水彻底冲洗，提取胶状丝胶蛋白，每一步都重复两次。脱胶蚕丝在FA/CaCl2溶剂中室温溶解。该溶液形成SF-FA-CaCl2薄膜。将形成的薄膜在9.3 M溴化锂溶液中室温重溶4h，得到12%w/v的SF混合溶液。该溶液在去离子水中透析72小时以去除盐离子，最终得到丝素蛋白水溶液。

步骤3：载有胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶复合水凝胶的形成：在20%w/v SF溶液中加入50wt%的明胶粉，制备丝素-明胶(SF-G)共混物，在40℃下搅拌；加入步骤2制得的胰岛素微粒和110kU的酪氨酸酶，继续搅拌均匀，然后超声20s，冷冻干燥42h，制得载有胰岛素的复合水凝胶。

该方法中所用明胶量较多，得到的复合水凝胶的机械性能很好，拉伸强度为1.5MPa,伸长率达到126.29%；在2h内迅速吸水膨胀，5h内达到溶胀平衡。酪氨酸酶的用量较高，体外胰岛素释放试验中在第2、5、9和14天分别释放17.5%、41.5%、67.8%和82.4%的累积胰岛素，在第28天累积胰岛素释放含量为91.6%。将该水凝胶敷料覆盖于链脲唑菌素诱导的糖尿病大鼠创面上，愈合效果非常好，2周后创面闭合率达91.6%，在第3周无明显创面。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种负载胰岛素微粒的丝素蛋白-明胶生物活性复合水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：丝素蛋白水溶液的制备：取蚕茧，在碳酸钠溶液中煮沸脱胶，然后用去离子水彻底冲洗，去除胶状丝胶蛋白，每一步都重复多次；所得脱胶蚕丝在FA/CaCl₂溶剂中室温溶解，形成SF-FA-CaCl₂薄膜；将形成的薄膜在溴化锂溶液中室温重溶，得到含丝素蛋白的混合溶液，在去离子水中透析去除盐离子，得到丝素蛋白溶液；

步骤2：载有胰岛素的丝素蛋白微粒的制备：将胰岛素溶解于HCl中，用NaOH调节pH为6.9-7.1，得到胰岛素溶液；将丝素蛋白溶液稀释后与甘油混合，得到混合溶液，将胰岛素溶液和混合溶液分别作为芯和壳进行同轴电喷涂；同轴喷嘴具有内径0.6 mm的内毛细管和内径1.2 mm的外毛细管；两个注射器泵分别输送芯层和壳层溶液；高压电源在喷嘴与装满液氮的收集箱之间提供13kv高压，距离为12cm，收集到的包被胰岛素的丝素蛋白微粒用冷冻干燥器冻干，得到载有胰岛素的丝素蛋白微粒；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，用0.03-0.07wt%的碳酸钠溶液进行脱胶，脱胶时间为20-40分钟。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，用9.0-9.5M的溴化锂溶液溶解3-5h。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，透析时间为70-80h。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，取胰岛素90-110mg溶于10ml0.01M盐酸中，溶解过程中始终用NaOH保持pH在6.9-7.1，得到0.8-1.2wt%的胰岛素溶液。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，稀释丝素蛋白溶液至1.5-2.5wt%，与甘油混合到丝素蛋白质量分数为25-35wt%。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，两个注射器泵分别以0.1 mL/h和0.3 mL/h的流速输送芯层和壳层溶液；冷冻干燥时间为40-50h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，所用丝素蛋白溶液的浓度为10~20%w/v，加入明胶粉30~50%wt%，搅拌温度为35-45℃。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，加入酪氨酸酶90-110kU；超声时间为15-25s；冷冻干燥40-45h。