CN115073924B - 基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物材料技术领域,具体涉及一种基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球及其制备方法,复合凝胶球的内核为通过物理交联形成的一个或几个不规则形状的非球形的丝素蛋白凝胶颗粒,复合凝胶球的外壳为通过化学交联形成的透明质酸钠凝胶,内核的丝素蛋白凝胶质量大于外壳的透明质酸钠凝胶的质量,复合凝胶球的粒径小于等于1000μm;本发明制得的凝胶球克服单相凝胶力学性能不佳、透明质酸凝胶降解速率快、生物相容性差的问题,更加适用于医学注射。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,具体涉及一种基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球及其制备方法。
背景技术
对于组织缺陷或欠美观的治疗手段从组织来源上可分为自体组织移植和人工填充材料两种;从植入手段上可分为开口式植入和注射填充两种。自体组织移植来源受限且对患者造成二次创伤,而近些年随着可降解生物材料的研究深入,人工填充材料的应用则前景广阔。另一方面,相比于开口式植入,注射填充法由于其创面小、操作简单、患者痛苦小等优势广泛应用于软组织创伤或手术切除后的填充和美容整形领域。
人工填充材料从来源上可分为合成高分子材料和天然高分子材料。合成高分子材料可塑性较强,但其合成过程中使用大量有机溶剂,且其降解产物的生物毒性有待考证。天然高分子如胶原蛋白和透明质酸是动物体的主要细胞外结构蛋白,已被广泛应用于组织工程修复和医美整形填充,尤其是由透明质酸分子经化学交联形成的水凝胶产品,已在眼科、骨科、皮肤科等处获得广泛应用,可提供填充、修复、润滑等多种功能。然而,透明质酸水凝胶的临床应用尚存在待解决的问题。最突出的问题在于其化学交联。低交联度和非交联透明质酸在注射后数星期内即完全降解,需要频繁重新注射,且凝胶的力学性能较差,无法起到机体内稳定支撑和填充的目的。高交联度透明质酸虽然具有较高的力学性能和较长的降解时间,但较高浓度的化学交联剂使用和残留也给机体组织带来较大的毒副作用。
现有技术的缺点包括:(1)纯透明质酸凝胶交联度低,力学性能差,体内降解速率快(数星期之内),无法起到稳定支撑和填充效果,因此需频繁重新注射。另外,频繁使用时的交联剂残留会给机体组织带来较大的毒副作用。(2)经物理交联的纯丝蛋白凝胶高β-折叠结晶体含量(接近50%)使得其硬脆,弹性差,且表面粗糙,医美注射填充受限;经化学交联的纯丝蛋白凝胶的反应条件剧烈(高浓度溴化锂、高交联剂使用),尽管交联度高,但仍需通过添加透明质酸增强润滑提高注射性,无论是方法的制备还是生物安全性方面均有待考证。(3)丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶制备方法复杂,需使用多种交联剂(酪氨酸酶,碳化二亚胺等),且体内注射填充时存在安全隐患;降低化学交联剂使用浓度或不佳的反应条件会对凝胶的力学性能及降解时间造成影响;此外,简单地将少量丝素蛋白颗粒混悬包埋在透明质酸凝胶中(中国专利CN102836465A)一方面并不能解决降解速率过快的问题,另一方面也不能减少交联剂的使用,且直接研磨粉碎的不规则形状丝素蛋白颗粒的引入会影响凝胶的注射性和润滑性。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明所要解决的问题旨在提供一种基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球及其制备方法,以解决目前凝胶球制备方法复杂,单相凝胶力学性能不佳,透明质酸凝胶降解速率快、生物相容性差的问题。
为了解决上述问题,本发明采用了如下的技术方案:
第一方面,本发明提供一种基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球,所述复合凝胶球的内核为通过物理交联形成的一个或几个不规则形状的非球形的丝素蛋白凝胶颗粒,所述复合凝胶球的外壳为通过化学交联形成的透明质酸钠凝胶。
作为一种可实施方式,所述化学交联的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二环氧甘油醚、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚、双酚A二缩水甘油醚衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、3,4-羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚和新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。
作为一种优选实施方式,所述化学交联的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
进一步,所述内核的丝素蛋白凝胶质量大于所述外壳的透明质酸钠凝胶的质量。
作为一种可实施方式,所述复合凝胶球的粒径小于等于1000μm,所述复合凝胶球的内核粒径小于等于250μm。
作为一种优选实施方式,所述复合凝胶球的粒径小于等于54μm,所述复合凝胶球的内核粒径为0.1-50μm。
第二方面,本发明提供所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,包括:
(1)、将丝素蛋白溶液与弱酸溶液混合,进行温育、成胶,成胶后加入非极性溶剂,磁力搅拌获得丝素蛋白凝胶颗粒混合液;
(2)、将所述步骤(1)的产物与非极性溶剂混合形成共混溶液,在向共混溶液中加入透明质酸钠溶液,搅拌混匀后,再向其加入交联剂,进行交联,制得复合凝胶球悬浮液。
作为一种可实施方式,向所述步骤(2)制得的所述复合凝胶球悬浮液加入乙酸乙酯溶液进行悬浮均质,再去除乙酸乙酯,洗涤去除多余的非极性溶剂、弱酸、透明质酸钠和交联剂,得复合凝胶球颗粒,将所述复合凝胶球颗粒烘干后过筛得复合凝胶球。
作为一种可实施方式,所述步骤(1)中,若丝素蛋白溶液与弱酸溶液混合,进行温育大于等于12小时、成胶,变成丝素蛋白凝胶块,则将所述丝素蛋白凝胶块粉碎成丝素蛋白凝胶颗粒,再进行所述步骤(2)。
作为一种可实施方式,所述复合凝胶球的粒径小于等于1000μm,所述复合凝胶球的内核粒径小于等于250μm。
更优的,所述复合凝胶球的粒径小于等于54μm,所述复合凝胶球的内核粒径为0.1-50μm。
作为一种可实施方式,所述步骤(1)中弱酸的质量体积浓度为0.02-50w/v%。
更优的,所述步骤(1)中弱酸的质量体积浓度为0.2-25w/v%。
作为一种可实施方式,所述步骤(1)中丝素蛋白溶液的质量体积浓度为0.1-40w/v%。
更优的,所述步骤(1)中丝素蛋白溶液的质量体积浓度为5-20w/v%。
作为一种可实施方式,所述非极性溶剂加入的体积,均大于等于加入前的物质的体积。
作为一种可实施方式,所述步骤(2)中所述共混溶液的pH为1-3。
更优的,所述步骤(2)中所述共混溶液的pH为1.5。
作为一种可实施方式,所述步骤(2)中透明质酸钠溶液的质量体积浓度为0.1-10w/v%。
更优的,所述步骤(2)中透明质酸钠溶液的质量体积浓度为2-8w/v%。
作为一种可实施方式,所述步骤(2)交联剂的体积浓度为0.01-2v/v%。
更优的,所述步骤(2)交联剂的体积浓度为0.1-0.5v/v% 。
作为一种可实施方式,所述步骤(2)中丝素蛋白、透明质酸钠、交联剂三者的体积比为16-320:20:1。
更优的,所述步骤(2)中丝素蛋白、透明质酸钠、交联剂三者的体积比为30:20:1。
作为一种可实施方式,所述步骤(1)中弱酸为柠檬酸、草酸、醋酸、苹果酸、乳酸、水杨酸、奎宁酸、抗坏血酸或酒石酸。
作为一种可实施方式,所述步骤(1)中所述温育还包括超声处理,所述超声处理的方式为:超声振幅为75%;超声50s、间歇10s,循环5次。
作为一种可实施方式,所述步骤(1)中温育的温度为60℃。
作为一种可实施方式,所述步骤(1)中磁力搅拌的时间为0.1-2小时,转速为1000r/min,温度为60℃。
作为一种可实施方式,所述非极性溶剂为石蜡溶液、矿物油或植物油。
更优的,所述植物油为含有1%(v/v)Span80的大豆油。
作为一种可实施方式,所述步骤(2)中所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二环氧甘油醚、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚、双酚A二缩水甘油醚衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、3,4-羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚和新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。
更优的,所述步骤(2)中所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
作为一种可实施方式,所述步骤(2)中进行交联的条件为:在60℃水浴锅中搅拌2-24小时。
更优的,所述步骤(2)中进行交联的条件为:在60℃水浴锅中搅拌4-8小时。
第三方面,本发明还提供一种包含所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的填充注射液。
作为一种可实施方式,所述填充注射液包括所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球和透明质酸钠溶液;所述明质酸钠溶液的浓度为2-8w/v%;所述复合凝胶球的质量与所述透明质酸钠溶液的体积比为0.01-0.3mg:1ml。
更优的,所述复合凝胶球的质量与所述透明质酸钠溶液的体积比为0.025-0.1:1。
本发明的有益效果在于:
(1)在酸性和超声双刺激条件下可加快丝素蛋白形成凝胶,非极性溶液的引入可制备均匀分散的凝胶球,且其中的酸性介质可为下一步丝素蛋白凝胶球表面透明质酸化学交联提供反应微环境,具有一举两得的作用,可方便地生产制备和实施过程控制。
(2)独特的双层核壳结构复合凝胶球赋予其优异的弹性、可注射性和体内降解性。内层为通过物理交联形成高β-折叠含量的丝素蛋白凝胶球(核),能显著延缓体内降解时间;外层为通过化学交联形成的高弹性的透明质酸凝胶(壳),可赋予凝胶优异的可注射性和润滑性,且双层凝胶中各组分基质含量可灵活调控,进而控制凝胶的交联度和厚度从而实现降解速率的可控性。
(3)生物安全性得到保证,双层核壳结构复合凝胶是以物理交联的丝素蛋白凝胶球为主体(> 50wt%),在确保凝胶球在临床应用中具有理想的填充和修复效果的前提下,可大幅度减少BDDE等交联剂的使用,从而减少交联剂残留对人体的毒副作用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述,其中:
图1:实施例2制备的基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球显微镜图。
图2:实施例4制备的基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球显微镜图。
图3:实施例6制备的基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球显微镜图。
图4:实施例8制备的基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球显微镜图。
图5:实施例10制备的基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球显微镜图。
图6:实施例11中粒径小于等于54μm的凝胶颗粒。
图7:实施例4中的复合凝胶球推注力随时间变化的曲线图。
图8:实施例4中的复合凝胶球应力随压缩距离的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
需要说明的是,这些实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的限制,在本发明的构思前提下本方法的简单改进,都属于本发明要求保护的范围。
本发明整体技术思路为:
(1)、将丝素蛋白溶液与弱酸溶液混合,进行温育、成胶,成胶后加入非极性溶剂,磁力搅拌获得丝素蛋白凝胶颗粒混合液;多步法经过粉碎或者机械力搅拌的内核呈不规则形状,再通过化学交联裹上透明质酸壳厚形成的凝胶球,可赋予凝胶球良好的可注射性和润滑性,且双层凝胶中的各组分基质含量可灵活调控,进而控制凝胶的交联度和厚度从而实现降解速率的可控性。
(2)、将所述步骤(1)的产物与非极性溶剂混合形成共混溶液,再向共混溶液中加入透明质酸钠溶液,搅拌混匀后,再向其加入交联剂,进行交联,制得复合凝胶球悬浮液。
若丝素蛋白溶液与弱酸溶液混合,进行温育大于等于12小时、成胶,变成丝素蛋白凝胶块,则将丝素蛋白凝胶块粉碎成丝素蛋白凝胶颗粒,再进行步骤(2)。
将丝素蛋白凝胶球与非极性溶剂混合,形成油包水的形式,使得酸性丝素蛋白液滴能均匀地分散在分散质中,且在一定温度的孵育下,丝素蛋白分子在剪切力作用下逐渐自组装形成固态网络状的凝胶球(物理交联)。在酸性条件下(pH=3.8-4.0),丝素蛋白溶液靠近其等电点附近,无同种电荷互相排斥的影响,此时丝蛋白分子最不稳定,溶解度最小,最易受内外部环境刺激而自组装聚集进而形成果冻样凝胶。因此在此过程中,酸的混入有助于诱导丝素蛋白凝胶进行化学交联。pH=3.8-4.0条件下最有利于丝蛋白溶液形成凝胶,但只是目的之一。本申请加酸的第二个目的是要凝胶处于酸性环境,为后续的透明质酸钠交联提供反应微环境,所以丝蛋白溶液的pH是要低于3.8的,经测定,共混液的pH约为1.5。
在制备复合凝胶球的过程中,酸性介质可在搅拌的过程中不断扩散到交联剂与透明质酸钠的共混液中,为诱导丝素蛋白凝胶球外层的透明质酸钠化学交联提供反应微环境。随着扩散的持续,交联的透明质酸钠层逐渐增厚,而交联层的厚度和交联度通过改变透明质酸钠浓度和反应时间进行调控。具体的,可通过增加单位体积水相中透明质酸钠的含量来增加交联层的厚度,可通过控制BDDE等交联剂的添加量和反应时间来控制交联层的交联度(也就是说在同样含量的透明质酸钠和酸性微环境条件下,在一定的范围内,透明质酸钠凝胶的交联度会随着交联剂用量的增多而提升的。)另外,一定范围内,透明质酸钠凝胶的交联度也会受反应时间影响,也可通过弱酸的含量来控制,这个控制过程酸性条件是动态变化的。
(3)向步骤(2)制得的所述复合凝胶球悬浮液加入乙酸乙酯溶液进行悬浮均质,再去除乙酸乙酯,洗涤去除非极性溶剂、弱酸、透明质酸钠和交联剂,得复合凝胶球颗粒,将复合凝胶球颗粒烘干后过筛得复合凝胶球。
其中:
弱酸的质量体积浓度为0.02-50w/v%的柠檬酸、草酸、醋酸、苹果酸、乳酸、水杨酸、奎宁酸、抗坏血酸或酒石酸,优选为0.2-25w/v%的柠檬酸。
丝素蛋白溶液的质量体积浓度为0.1-40w/v%;优选为5-20w/v%。
透明质酸钠溶液的质量体积浓度为0.1-10w/v%,进一步为2-8w/v%。
交联剂的体积浓度为0.01-2v/v%,更优为0.1-0.5v/v%。
交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二环氧甘油醚、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚、双酚A二缩水甘油醚衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、3,4-羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚和新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种,本实施例采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
非极性溶剂的加入体积,均大于等于混合之前物质的体积。
非极性溶剂为石蜡溶液、矿物油或植物油,优选为含有1%(v/v)Span80的大豆油。
共混溶液的pH为1-3,更优为1.5。
丝素蛋白、透明质酸钠、交联剂三者的体积比为16-320:20:1,具体选用丝素蛋白、透明质酸钠、交联剂三者的体积比为30:20:1。
步骤(1)中磁力搅拌的时间为0.1-2小时,转速为1000 r/min,温度为60℃;
步骤(1)中温育还包括超声处理,超声处理的方式为:超声振幅为75%;超声50s、间歇10s,循环5次;
步骤(1)中温育的温度为60℃;
步骤(2)中进行交联的条件为:在60℃水浴锅中搅拌2-24小时,更优为4-8小时。
经本方法制备的基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的内核为通过物理交联形成的一个或多个不规则形状的丝素蛋白凝胶颗粒,复合凝胶球的外壳为通过化学交联形成的透明质酸钠凝胶,内核的丝素蛋白凝胶质量大于外壳的透明质酸钠凝胶的质量,复合凝胶球的粒径小于等于1000μm,复合凝胶球的内核粒径小于等于250μm;更优的复合凝胶球的粒径小于等于54μm,复合凝胶球的内核粒径为0.1-50μm。
基于本方法制得的复合凝胶球制备的一种填充注射液,包括:
复合凝胶球和透明质酸钠溶液;明质酸钠溶液的浓度为2-8w/v%;复合凝胶球的质量与透明质酸钠溶液的体积比为0.01-0.3g:1ml。
更优的,复合凝胶球的质量与所述透明质酸钠溶液的体积比为0.025-0.1g:1ml。
实施例1 酸性丝素蛋白凝胶颗粒的制备
1)电子天平称量40g, BL4冻干颗粒,加入200mL去离子水溶解,得到20w/v%的丝蛋白溶液;
2)向1)中加入50mL、12.6%(w/v)的柠檬酸溶液共混均匀;
3)取2)中的共混液30mL转移至50mL的空EP管中,用超声波细胞粉碎机进行超声处理,振幅75%,间歇超声(超声50s,停10s),超声共计5min;
4)将3)中超声处理后的共混液放置在60℃的烘箱温育,12h后丝蛋白可得丝素蛋白凝胶块(黄色,区别于新鲜BL4溶液制备的乳白色);
5)将得到的丝素蛋白凝胶块取出,置入80目的金属网上碾压粉碎,在金属网下方收集通过的颗粒,得丝素蛋白凝胶颗粒。
实施例2复合凝胶球的制备
1)配置1%的Span80的石蜡溶液,取1mLSpan80加入到100mL的石蜡中,充分混合均匀;
2)称量丝素蛋白凝胶颗粒10g,将其分散在50mL的中含有1%Span80的石蜡中,在匀浆机中匀浆10 min(转速10000 r/min),尽可能使聚集的凝胶颗粒在油相中分散均匀;
3)向2)中称量4w/v%的透明质酸钠,在60℃的磁力水浴锅中搅拌10min;
4)向3)中搅拌的共混液中逐滴加入0.5%v/v BDDE;继续在60℃水浴锅中继续搅拌6h;丝素蛋白、透明质酸钠、BDDE三者的体积比为16-320:20:1,体积比更优为20:20:1。
5)静置10min后,过滤去除石蜡,并进一步用吸油纸除去复合凝胶颗粒表面的石蜡,再用乙酸乙酯洗涤,最后经无水乙醇、50%乙醇、纯水分别清洗3次得到干净的复合凝胶颗粒,当三者体积比为20:20:1时,所形成的复合凝胶球以单核为主,参见图1。
实施例3 酸性丝素蛋白凝胶球的制备
将7.5w/v%的再生丝素蛋白溶液20mL与10mL,12.6%(w/v)的柠檬酸溶液混合均匀后(其中丝素蛋白与柠檬酸的质量比为15:12.61),经超声波细胞粉碎机进行超声处理,振幅75%,间歇超声(超声50 s,停10 s),超声共计5min;再将超声处理后的共混液放置在60℃的烘箱温育,待成胶后(一般12小时后,完全成胶)加入150mL含有1%Span80(v/v)的大豆油中(60℃),并在磁力搅拌器下搅拌1h(1000r/min,60℃);可获得均匀分散的丝素蛋白凝胶颗粒,制得内核。
实施例4复合凝胶球的制备
向实施例3中继续分别加入300 mL的含有1% Span80(v/v)的大豆油和2wt%的透明质酸钠溶液,在60℃的磁力水浴锅中搅拌10min的条件下混合均匀后,继续逐滴加入0.1v/v%的BDDE,在60℃水浴锅中继续搅拌4h,调控凝胶球尺寸跟透明质酸浓度成正向增加,即浓度越高尺寸越大,油相越多体积反向,油相越多尺寸越小,其中丝素蛋白、透明质酸钠、BDDE三者的体积比为16-320:20:1,更优的三者体积比为30:20:1,最终得到核壳结构的复合凝胶颗粒既有单核,也有多核,参见图2。
实施例5 酸性丝素蛋白凝胶球的制备
将5w/v%的再生丝素蛋白溶液20mL与10mL,12.6%(w/v)的柠檬酸溶液混合均匀后(其中丝素蛋白与柠檬酸的质量比为10:12.61),经超声波细胞粉碎机进行超声处理,振幅75%,间歇超声(超声50s,停10s),超声共计5min;再将超声处理后的共混液放置在60℃的烘箱温育,待完全成胶后(约20h)加入150mL含有1%Span80(v/v)的大豆油中(60℃),并在磁力搅拌器下搅拌1h(500r/min,60℃);可获得均匀分散的丝素蛋白凝胶颗粒,制得内核。
实施例6复合凝胶球的制备
向实施例5中继续加入,4wt%的透明质酸钠溶液,在60℃的磁力水浴锅中搅拌10min的条件下混合均匀后,继续逐滴加入2v/v%的BDDE,在60℃水浴锅中继续搅拌4h,其中丝素蛋白、透明质酸钠、BDDE三者的体积比为16-20:20:1,更优体积比为20:20:1时最终得到核壳结构的复合凝胶颗粒(单核),内核粒径约为250μm,外壳粒径约1000μm,参见图3。
实施例7 酸性丝素蛋白凝胶球的制备
将10w/v%的再生丝素蛋白溶液20mL与10mL,12.6%(w/v)的柠檬酸溶液混合均匀后(其中丝素蛋白与柠檬酸的质量比为20:12.61),经超声波细胞粉碎机进行超声处理,振幅75%,间歇超声(超声50s,停10s),超声共计5min;再将超声处理后的共混液放置在60℃的烘箱温育,待完全成胶后(约10h)加入150mL含有1%Span80(v/v)的大豆油中(60℃),并在磁力搅拌器下搅拌1h(500r/min,60℃);可获得均匀分散的丝素蛋白凝胶颗粒,制得内核。
实施例8复合凝胶球的制备
向实施例7中继续加入4wt%的透明质酸钠溶液,在60℃的磁力水浴锅中搅拌10min的条件下混合均匀后,继续逐滴加入2v/v%的BDDE,在60℃水浴锅中继续搅拌4h,其中丝素蛋白、透明质酸钠、BDDE三者的体积比为40-320:20:1,更优的体积比为40:20:1,最终得到核壳结构的复合凝胶颗粒(多核),内核粒径约为250μm,外壳粒径约1000μm,参见图4。
实施例9 酸性丝素蛋白凝胶球的制备
将10w/v%的再生丝素蛋白溶液20mL与10mL,12.6%(w/v)的柠檬酸溶液混合均匀后(其中丝素蛋白与柠檬酸的质量比为20:12.61),经超声波细胞粉碎机进行超声处理,振幅75%,间歇超声(超声50s,停10s),超声共计5min;再将超声处理后的共混液放置在60℃的烘箱温育,待完全成胶后(约10h)加入150 mL含有1%Span80(v/v)的大豆油中(60℃),并在磁力搅拌器下搅拌1h(1000r/min,60℃);可获得均匀分散的丝素蛋白凝胶颗粒,制得内核。
实施例10复合凝胶球的制备
向实施例9中继续分别加入150mL的含有1% Span80(v/v)的大豆油和4wt%的透明质酸钠溶液,在60℃的磁力水浴锅中搅拌10min的条件下混合均匀后,继续逐滴加入0.5v/v%的BDDE,在60℃水浴锅中继续搅拌4h,其中丝素蛋白、透明质酸钠、BDDE三者的体积比为40-320:20:1,更优的体积比为40:20:1,最终得到核壳结构的复合凝胶颗粒(多核)。内核的粒径范围为50-100μm,外壳粒径约为500μm,参见图5。
通过实施例10(图5)和实施例6(图3)的对比发现,提高丝素蛋白凝胶的含量可增加内核的数量。
实施例11可注射核壳结构的复合凝胶颗粒
将实施例4中得到的凝胶颗粒悬浮液室温静置2h后倒去上清液,加入50 mL的乙酸乙酯溶液充分悬浮,经高速均质机在10000rpm/min条件下均质1min,静置5min后去除乙酸乙酯,分别经纯乙醇、50%乙醇洗涤3次、再经氢氧化钠中和、最后用纯水洗涤3次,去除大豆油、柠檬酸、游离透明质酸钠、BDDE后得到干净的复合凝胶颗粒。再将其悬浮液转移至塑料圆形培养皿中,再放置60℃烘箱干燥后过300目筛得到粒径小于等于54μm的凝胶颗粒,参见图6。称量125mg过筛的复合凝胶颗粒,用注射器吸取5mL,2w/v%的透明质酸钠溶液混合均匀,再经组织研磨器研磨灌装至1mL的注射器中,使用质构仪及压力为50N的测压元件,将含有凝胶球的26G针头的注射器以10mL/min的速度垂直施加压力,使凝胶球穿过针,记录注射力随时间的变化。由图7可知,含固量为2.5wt%(干重/湿重)的核壳式凝胶球可通过26G针头直接注射出来,且整个过程的推注力均在30N以下,具有可注射性。
实施例12压缩弹性评估
将实施例4方法制备的核壳凝胶球,通过质构仪(TMS-PRO,美国)进行压缩弹性评估。加载速度为30mm/min,压缩型变量为60%。当凝胶球被压缩到原始高度的40%时停止压缩然后释放压力,当压力传感器回复到起始位置时再次压缩,重复进行压缩释放75个循环。采用Origin软件对支架60%应变内的线性区域进行拟合,所得拟合的直线斜率就是凝胶球的压缩模量,经拟合后该核壳结构凝胶器球的压缩模量为1.60kPa。另外由图8的研究发现,当形变量为60%时,相比于第1次压缩循环,75次后的应力依然达到初始应力的70%以上,且经75次循环压缩后曲线与10次的依然重叠在一起,说明核壳凝胶球具有优异的回弹性。
以上所述,仅为本申请的具体实施方式,但本申请的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此,本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (33)
1.一种基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球,其特征在于,所述复合凝胶球的内核为通过物理交联形成的一个或几个不规则形状的非球形的丝素蛋白凝胶颗粒,所述复合凝胶球的外壳为通过化学交联形成的透明质酸钠凝胶;所述复合凝胶球的粒径小于等于1000μm,所述复合凝胶球的内核粒径小于等于250μm。
2.根据权利要求1所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球,其特征在于,所述化学交联的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二环氧甘油醚、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚、双酚A二缩水甘油醚衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、3,4-羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚和新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球,其特征在于,所述化学交联的交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
4.根据权利要求1所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球,特征在于,所述内核的丝素蛋白凝胶的质量大于所述外壳的透明质酸钠凝胶的质量。
5.根据权利要求1所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球,特征在于,所述复合凝胶球的粒径小于等于54μm,所述复合凝胶球的内核粒径为0.1-50μm。
6.权利要求1所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,包括:
(1)、将丝素蛋白溶液与弱酸溶液混合,进行温育、成胶,成胶后加入非极性溶剂,磁力搅拌获得丝素蛋白凝胶颗粒混合液;
(2)、将所述步骤(1)的产物与非极性溶剂混合形成共混溶液,再向共混溶液中加入透明质酸钠溶液,搅拌混匀后,再向其加入交联剂,进行交联,制得复合凝胶球悬浮液。
7.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)后还包括:
向所述步骤(2)制得的所述复合凝胶球悬浮液加入乙酸乙酯溶液进行悬浮均质,再去除乙酸乙酯,洗涤去除多余的非极性溶剂、弱酸、透明质酸钠和交联剂,得复合凝胶球颗粒,将所述复合凝胶球颗粒烘干后过筛得复合凝胶球。
8.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,若丝素蛋白溶液与弱酸溶液混合,进行温育大于等于12小时、成胶,变成丝素蛋白凝胶块,则将所述丝素蛋白凝胶块粉碎成丝素蛋白凝胶颗粒,再进行所述步骤(2)。
9.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中弱酸的质量体积浓度为0.02-50w/v%。
10.根据权利要求9所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中弱酸的质量体积浓度为0.2-25w/v%。
11.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中丝素蛋白溶液的质量体积浓度为0.1-40w/v%。
12.根据权利要求11所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中丝素蛋白溶液的质量体积浓度为5-20w/v%。
13.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述非极性溶剂加入的体积,均大于等于加入前的物质的体积。
14.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中所述共混溶液的pH为1-3。
15.根据权利要求14所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中所述共混溶液的pH为1.5。
16.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中透明质酸钠溶液的质量体积浓度为0.1-10w/v%。
17.根据权利要求16所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中透明质酸钠溶液的质量体积浓度为2-8w/v%。
18.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)交联剂的浓度为0.01-2v/v%。
19.根据权利要求18所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)交联剂的浓度为0.1-0.5v/v% 。
20.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中丝素蛋白、透明质酸钠、交联剂三者的体积比为16-320:20:1。
21.根据权利要求20所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中丝素蛋白、透明质酸钠、交联剂三者的体积比为30:20:1。
22.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中弱酸为柠檬酸、草酸、醋酸、苹果酸、乳酸、水杨酸、奎宁酸、抗坏血酸或酒石酸。
23.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中所述温育还包括超声处理,所述超声处理的方式为:超声振幅为75%;超声50s、间歇10s,循环5次。
24.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中温育的温度为60℃。
25.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中磁力搅拌的时间为0.1-2小时,转速为1000 r/min,温度为60℃。
26.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述非极性溶剂为石蜡溶液、矿物油或植物油。
27.根据权利要求26所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述植物油为含有1v/v%Span80的大豆油。
28.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二环氧甘油醚、1,3-二环氧甘油醚甘油、双酚A二缩水甘油醚、双酚A二缩水甘油醚衍生物、间苯二酚二缩水甘油醚、3,4-羟基苯基甲烷三缩水甘油基醚和新戊二醇二缩水甘油醚中的一种或多种。
29.根据权利要求28所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
30.根据权利要求6所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中进行交联的条件为:在60℃水浴锅中搅拌2-24小时。
31.一种包含权利要求1所述基于物理和化学交联核壳结构的复合凝胶球的填充注射液。
32.根据权利要求31所述填充注射液,其特征在于,所述填充注射液还包括透明质酸钠溶液;所述明质酸钠溶液的浓度为2-8w/v%;所述复合凝胶球的质量与所述透明质酸钠溶液的体积比为0.01-0.3:1。
33.根据权利要求32所述填充注射液,其特征在于,所述复合凝胶球的质量与所述透明质酸钠溶液的体积比为0.025-0.1:1。
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