CN101148520B - 一种温度敏感的壳聚糖水凝胶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种温度敏感的壳聚糖水凝胶，其组成为壳聚糖0.2-20％(重量)、甘油1-60％(重量)或甘露醇0.5-40％(重量)和硼砂0.5-20％(重量)。本发明还公开了其制备方法，将壳聚糖溶解于酸性溶液中，加入甘油或甘露醇溶液；搅拌条件下逐滴加入硼砂溶液，继续搅拌使其混合均匀；将所得混合溶液加热到胶凝温度后恒温直至溶液胶凝完全。本发明的温度敏感型水凝胶，低温下为液体，人体温度下可形成凝胶，即可作为注射植入材料，也可用于非注射涂抹材料。其制备条件温和，符合环保要求。本发明凝胶对温度敏感性高，机械强度好，有望用于药物载体，生物组织工程等领域，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种温度敏感的壳聚糖水凝胶及其制备方法，适合用于药物传递、组织工程和细胞培养等领域。
背景技术
在现代药剂学的研究中，材料学的重要作用日趋明显，一个优秀的药物传递系统的成功，是现有材料的巧妙应用和新的功能性材料发现的结果。智能材料是近年来在世界上兴起并迅速发展起来的新型材料，这一类材料可以响应外界环境的变化，产生新的功能。智能材料在材料学领域和工程学领域里的研究热度日趋增大，在日常生活的各个领域里都有着广泛的应用前景。
温敏性凝胶是一类温度响应型的智能凝胶材料，可以感知温度的变化而产生功能性的效应。温敏性凝胶材料自1975年MIT的田中丰一发现聚丙烯酸响应温度的变化产生溶胀和收缩功能开始，已经有了30多年的历史。但是，对于此类功能性材料的研究，发展最快的是最近的十几年。将温敏性材料应用于生物医学，也是近年来的研究热点，温敏性凝胶材料由于具备原位凝胶的特性，被应用于药物传递、组织工程，细胞生物学等领域。
壳聚糖是天然界存在的唯一的带阳电荷碱性多糖，具有来源广泛、无毒、无味、抗血栓、抗静电、耐碱、成膜性、生物黏附性、生物相容性和生物降解性等特征，而且其降解产物无毒、无免疫原性、无致癌性。这些特征使壳聚糖成为应用前景广泛的生物医药载体。壳聚糖在酸性条件下溶解，碱性条件则产生白色沉淀。甘油是一种价廉易得的药用辅料，也是人体生理活动所必须的物质。甘露醇与甘油结构相似，在本发明中它可以替代甘油。硼砂是种弱碱盐，易溶于水和甘油。
然而目前所研究制备的智能水凝胶存在着的许多缺点限制了它们在临床上的应用。其一：目前所制备的智能水凝胶很多缺乏生物相容性，不易在生物体内降解。当药物释放完毕后，必须通过手术从生物体内取出。如聚丙烯酰胺类聚合物不能生物降解，且其单体对人体存在一定的毒性。其二：目前制备的水凝胶大多不具备可注射性，通常凝胶在体外形成，再通过手术植入体内，这不仅增加病人的经济负担和肉体上的痛苦，而且也导致临床应用不方便。另外目前研究的温敏水凝胶强度不够，进入体内易被体液稀释而加速降解。这些原因都限制了这些类水凝胶的临床应用。
发明内容
本发明提供一种温度敏感的壳聚糖水凝胶。该水凝胶可以包含药物、蛋白质、多肽、细胞、酶、抗体等，以溶液形式注射入体内，或涂抹于腔道等部位，在体温下形成水凝胶，从而实现所包含物质的智能控释，也可以作为组织工程支架，用于细胞生物学领域。
本发明提供制备上述水凝胶的方法，制备的壳聚糖水凝胶在温度低于28-35℃，pH 6.0-8.0之间为溶液，在温度28-60℃，pH 6.0-8.0之间为水凝胶。
本发明所提供的水凝胶的组成为：0.2％-20％(重量)壳聚糖、1％-60％(重量)甘油或0.5％-40％(重量)甘露醇和0.5-20wt％硼砂。
壳聚糖分子量范围为5-800万，脱乙酰度为50％-100％。
一种温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)壳聚糖0.2-20％(重量)溶解于pH为2-6的酸性溶液中得到壳聚糖溶液；酸性溶液的酸包括盐酸、醋酸、乳酸、柠檬酸、抗坏血酸或蚁酸。
(2)加入甘油1-60％(重量)或甘露醇0.5-40％(重量)，搅拌混合均匀；
(3)称取硼砂0.5-20％(重量)，加入水，加热使溶解；
(4)搅拌条件下，在步骤(2)所得溶液中缓慢滴加硼砂溶液，至壳聚糖水凝胶体系pH为6.0-8.0，优选范围是6.7-7.0。
(5)在步骤(4)中加入药物，包括化学药、中药提取物和生物药(如多肽，蛋白，抗体等)，也可以是药物载体(如纳米粒、脂质体、微球、乳剂、包合物等)，还可以是细胞。添加物可以是溶解形式的，也可以是非溶解形式的。
将步骤(4)中制备的混合体系倒入容器、模型，涂抹于或注射入动物或人组织、器官、身体空腔内，升高温度到胶凝温度，并恒温保持，制得模型形状的凝胶。胶凝温度范围为28-60℃，优选范围为32-40℃。
本发明采用壳聚糖、甘油与硼砂制备温度敏感的凝胶。该凝胶在温度低于28-35℃，pH 6.0-8.0之间为溶液，在温度28-60℃，pH 6.0-8.0之间为水凝胶，因而可通过环境温度的变化实现溶液-凝胶转变，且这种凝胶制备条件温和，工艺安全，简单有效，可避免有机化学试剂及其它有害的物质，符合环保要求。本发明制备的壳聚糖水凝胶也可作为可注射型医用材料，用作关节软骨的修复和组织工程支架材料，用于细胞的培养，还可作为药物载体，用于敏感类药物的的缓释，在生物医学领域有着广泛的应用前景。
本发明提供的温度敏感的壳聚糖水凝胶及其制备方法还具备以下特点：
(1)本发明提供的壳聚糖水凝胶，温度响应性高。未胶凝的壳聚糖水凝胶一旦升温到胶凝温度，凝胶可迅速形成。
(2)本发明提供的壳聚糖水凝胶具有致密的网状结构，较高的机械强度，作为药物、多肽、蛋白质、酶、细胞、抗体的载体，可望在体内外释放更长时间，也有望用于组织工程中作为支架材料。
附图说明
图1本发明制备的壳聚糖水凝胶在37℃下胶凝的照片。
A为壳聚糖、甘油、硼砂混合溶液，B为37℃下加热胶凝后形成的壳聚糖水凝胶。
图2本发明制备的壳聚糖水凝胶控制美洛昔康体外释放图。
具体实施方案
本发明包括温度敏感的壳聚糖水凝胶及其制备方法。壳聚糖/甘油/硼砂水凝胶制备的具体方法和步骤说明如下：
(1)壳聚糖水凝胶的制备
壳聚糖溶解于酸性溶液中，并加入一定量的甘油或甘露醇溶液；搅拌条件下逐滴加入适量一定浓度的硼砂溶液，继续搅拌一段时间使其混合均匀；将所得混合溶液加热到胶凝温度，并恒温一段时间直至溶液胶凝完全。(2)载药壳聚糖水凝胶的制备
壳聚糖溶解于酸性溶液中，加入一定量的甘油或甘露醇溶液，并加入所需包含的药物、蛋白质、多肽、细胞、酶和抗体等；搅拌条件下逐滴加入适量一定浓度的硼砂溶液，继续搅拌一段时间使其混合均匀；将所得混合溶液加热到胶凝温度，并恒温一段时间直至溶液胶凝完全。
上述方法将通过下面的实例进一步描述，但是提供的实施例不能作为对此方法的限制。
实施例1
将壳聚糖0.1g溶解于5mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解。加入1.5g甘油。搅拌条件下逐滴加入15％(w/v)硼砂溶液3.4mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液的pH值为7.0。将该混合溶液加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分。该体系在4℃可稳定保存。壳聚糖、甘油、硼砂混合溶液，及37℃下胶凝形成的壳聚糖水凝胶的照片附图1所示。
实施例2
将壳聚糖0.1g溶解5mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解。将甘露醇0.7g溶解于3.7mL的蒸馏水中。搅拌条件下逐滴加入10％(w/v)硼砂溶液2.9mL，充分搅拌使其混合均匀，所得溶液的pH值为7.0。将该混合溶液加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分。该体系在4℃可稳定保存。
实施例3
将壳聚糖0.1g溶解于5mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解。加入1.5g甘油。搅拌条件下逐滴加入15％(w/v)硼砂溶液3.4mL，充分搅拌使其混合均匀。向混合溶液种加入20％的牛血清白蛋白(BSA，模型药物)溶解，并混合均匀。将含有牛血清白蛋白的混合溶液加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分。该体系在4℃可稳定保存。
实施例4
取大豆磷脂0.1g，大豆油1.0g，70℃下溶解，加入美洛昔康2.0mg，搅拌过夜，再加入2％的甘油溶液10.0g，探头超声使形成乳剂。
将壳聚糖0.1g溶解于5mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解。加入1.5g甘油和1.0g上述含药乳剂。搅拌条件下逐滴加入10％(w/v)硼砂溶液6.3mL，混合均匀，所得溶液的pH值为7.0。将该混合溶液加热到37℃并恒温20min即得胶凝充分的凝胶。
实施例5
将壳聚糖0.4g溶解于20mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解。加入6.0g甘油，美洛昔康10.0mg，，搅拌12h使混合均匀。搅拌条件下逐滴加入15％(w/v)硼砂溶液17.4mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液的pH值为7.0。取含美洛昔康的壳聚糖未凝样品约10g放入50mL的圆底离心管中，加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分，胶凝后在凝胶上部加15mL pH＝7.4的PBS作为释放介质。将装凝胶的离心管放入37℃，100rpm/min的摇床中，分别于1，3，5，7，10，24，48，96，144，192，240，288，336，408，480h取5mL释放样品，补加5mL空白释放介质，用高效液相分析释放样品。壳聚糖水凝胶控制美洛昔康的体外释放图如图2所示。
对照试验1：比较两种凝胶的强度。
(本制剂)将实施例1中所制的未凝壳聚糖、甘油和硼砂混合溶液倒入一个10mL的量桶中。该量桶高13cm，直径1.5cm，10mL标记处离量桶顶部的高度为4.8cm。将混合溶液加到10mL刻度处，将该混合溶液加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分(胶凝后体系的体积不变)。将一个直径为4mm的球形小钢珠从该量桶顶部中央处自由落下。小钢珠在量桶中经历了加速-恒速-减速至零的过程，记录小钢珠停止处的位置，重复实验三次。小钢珠停止的位置在8.7±0.1mL处。
(对照制剂)制备壳聚糖/甘油磷酸盐凝胶。将壳聚糖0.1g溶解于5mL1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解。加入2.0g甘油。搅拌条件下逐滴加入5％(w/v)硼砂溶液4.0mL，充分搅拌使其混合均匀。所得溶液的pH值为7.0。将制备的混合溶液倒入上述规格的10mL的量桶中，至10mL刻度处，将该混合溶液加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分(胶凝后体系的体积不变)。将上述规格的小钢珠从该量桶顶部中央处自由落体。小钢珠在在量桶中经历了加速-恒速-减速至零的过程，记录小钢珠停止处的位置，重复实验三次。小钢珠停止的位置在5.9±0.1mL处。
本试验表明：本制剂比对照制剂的强度大。
对照试验2：比较两种凝胶胶凝所需的时间。
(本制剂)取实施例1中所制的未凝壳聚糖、甘油和硼砂混合溶液2ml加入L＝10cm，D＝1.4cm的玻璃管中。将该混合溶液加热到37℃，每半分钟取出观察凝胶形成情况，以试管倒置30s内凝胶不流动为凝胶形成的标志。本发明制备的壳聚糖水凝胶在37℃下胶凝时间为1.5min。
(对照制剂)取实施例4中所制的壳聚糖、甘油磷酸盐混合溶液2ml加入L＝10cm，D＝1.4cm的玻璃管中。将该混合溶液加热到37℃，每半分钟取出观察凝胶形成情况，以试管倒置30s内凝胶不流动为凝胶形成的标志。壳聚糖/甘油磷酸盐水凝胶在37℃下胶凝时间为4.5min。
本试验表明：本制剂比对照制剂所需的胶凝时间短。
Claims (7)
1.一种温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将壳聚糖0.1g溶解于5mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解；加入1.5g甘油；搅拌条件下逐滴加入质量体积百分比为15％的硼砂溶液3.4mL，充分搅拌使其混合均匀；所得溶液的pH值为7.0；将该混合溶液加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分，即得凝胶。
2.一种温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将壳聚糖0.1g溶解于5mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解；将甘露醇0.7g溶解于3.7mL的蒸馏水中；搅拌条件下逐滴加入质量体积百分比为10％的硼砂溶液2.9mL，充分搅拌使其混合均匀，所得溶液的pH值为7.0；将该混合溶液加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分，即得凝胶。
3.一种温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将壳聚糖0.1g溶解于5mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解；加入1.5g甘油；搅拌条件下逐滴加入质量体积百分比为15％硼砂溶液3.4mL，充分搅拌使其混合均匀；向混合溶液中加入20％的牛血清白蛋白溶解，并混合均匀；将含有牛血清白蛋白的混合溶液加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分，即得凝胶。
4.一种温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：取大豆磷脂0.1g，大豆油1.0g，70℃下溶解，加入美洛昔康2.0mg，搅拌过夜，再加入2％的甘油溶液10.0g，探头超声使形成乳剂；将壳聚糖0.1g溶解于5mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解；加入1.5g甘油和1.0g上述含药乳剂；搅拌条件下逐滴加入质量体积百分比为10％硼砂溶液6.3mL，混合均匀，所得溶液的pH值为7.0；将该混合溶液加热到37℃并恒温20min即得胶凝充分的凝胶。
5.一种温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将壳聚糖0.4g溶解于20mL 1mol/L的冰醋酸溶液中，完全溶解；加入6.0g甘油，美洛昔康10.0mg，搅拌12h使混合均匀；搅拌条件下逐滴加入质量体积百分比为15％的硼砂溶液17.4mL，充分搅拌使其混合均匀；所得溶液的pH值为7.0；取含美洛昔康的壳聚糖未凝样品10g放入50mL的圆底离心管中，加热到37℃并恒温20min使该体系胶凝充分，即得凝胶。
6.如权利要求1～5中任一项所述的温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖分子量范围为5-800万，脱乙酰度范围为50-100％。
7.利用权利要求1～5任一项所述的温度敏感的壳聚糖水凝胶的制备方法制得的壳聚糖水凝胶。
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