CN102241837A

CN102241837A - 巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102241837A
Application number: CN2011101513152A
Authority: CN
Inventors: 邓联东; 董岸杰; 陈晨
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2011-06-08
Publication date: 2011-11-16

Abstract

本发明公开了一种巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶及其制备方法和应用。该巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶是由质量含量为0.5～10％的巯基化壳聚糖、质量含量为1～30％的甘油磷酸钠、用量为巯基化壳聚糖中巯基摩尔量的0～0.5倍的(甲基)丙烯酸酯基聚合物及其余为水所形成的三元或二元温敏原位水凝胶；其制备方法是将巯基化壳聚糖、甘油磷酸钠、(甲基)丙烯酸酯基聚合物配制水溶液，搅拌均匀，在10～50℃原位形成水凝胶；该巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶具有吸水性、通透性、良好生物相容性、可生物降解性和较高机械强度，操作简单方便，具有广泛的生物医学和其它方面的用途。

Description

巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶及其制备方法和应用。属于高分子水凝胶技术领域。

背景技术

水凝胶是一种能够在水中溶胀，吸收并保持大量水分而又不溶解于水的亲水性的网状高分子溶胀体。水凝胶表面光滑，具有优良的生物相容性。与疏水聚合物相比，亲水性的水凝胶同被固定的酶或细胞的相互作用极弱，固定在水凝胶中的生物分子的活性能够长时间保持。由于水凝胶能够提供类细胞间质的水性环境，因此被认为是较适宜的细胞支架材料。原位凝胶是指以溶液状态给药后立即在用药部位发生相转变，形成的非化学交联的半固体制剂。只需将细胞、各种生长因子等与聚合物水溶液混合，注射到受损伤部位，原位形成凝胶，即可实现细胞的种植、生长因子的控制释放和提供细胞分化生长的三维空间支架。可注射型温敏原位凝胶类的医用植入材料研究适应了微创伤外科技术发展的要求，具有微创伤修复组织缺损或畸形、组织损伤小、不破坏修复区血供、操作简便易行等优点，在药物缓释和组织工程领域日益引人注目。

壳聚糖(chitosan，CS)是自然界唯一大量存在的碱性多糖，是甲壳素的脱乙酰化产物。其价格低廉，具有良好的生物相容性，无免疫原性和生物可降解性等性能，在环境工程、食品、农业、生物技术、化妆品和医药等诸多行业得以广泛的应用。但在一般情况下，壳聚糖只溶于酸性水溶液中，中性或碱性溶液中可形成类似凝胶的沉淀，该过程与温度关系不大。但近年来研究发现，通过加入碱性盐、含羟基聚合物或对壳聚糖进行衍生化和接枝反应，可得到具有温度敏感性的壳聚糖基可注射原位凝胶。

巯基化壳聚糖不仅提高了壳聚糖的水溶性、壳聚糖凝胶的生物黏附性和药物对细胞膜的透过性，还可以提供进一步的化学交联，使壳聚糖水凝胶的力学性能达到较高的水平，克服了通过物理交联作用形成水凝胶的机械强度弱、凝胶形态保持时间短等问题。中国专利申请号200710058737.9和200710058738.3均公开了巯基化壳聚糖水凝胶及其制备方法。该方法制备的水凝胶，不加入任何交联剂和催化剂，仅利用空气的氧化作用使经巯基化修饰的壳聚糖因分子内和分子间二硫键的生成而形成水凝胶。但是在以上水凝胶的形成中，凝胶的相转变时间有几十分钟到数小时，凝胶时间较长，限制了其在某些领域的应用。Sakloetsakun D等通过在巯基化壳聚糖水溶液中加入氧化剂，使得凝胶转变时间缩短到几分钟(Duangkamon Sakloetsakun，et al.Biomaterial，2009，30(31)，6151-6157)，但是由于氧化剂(例如(NH₄)₂S₂O₈)形成自由基和其强氧化性的特点，会引入一定的细胞毒性，因此它的应用性会受到限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶及其制备方法和应用。所述的巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶具有良好生物的相容性、可降解性及较高机械强度性；其制备过程简单；用于载药、固定酶、细胞培养及组织工程等。

本发明是通过以下技术方案加以实现的，一种巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶，其特征在于，是由质量含量为0.5～10％的巯基化壳聚糖(A)、质量含量为1～30％的甘油磷酸钠(B)、用量为巯基化壳聚糖中巯基摩尔量的0～0.5倍的(甲基)丙烯酸酯基聚合物(C)及其余为水所形成的巯基化壳聚糖-甘油磷酸钠-(甲基)丙烯酸酯基聚合物(A-B-C)三元温敏原位水凝胶，或形成的巯基化壳聚糖-甘油磷酸钠(A-B)二元温敏原位水凝胶。

上述的巯基化壳聚糖(A)选自于壳聚糖的数均相对分子质量为20～1000kDa和巯基化度为25～1100μmol/g的巯基乙酸改性壳聚糖、半胱氨酸改性壳聚糖、N-乙酰半胱氨酸改性壳聚糖、2，3-二巯基丁二酸改性壳聚糖、硫代乙酸醇改性壳聚糖、2-亚氨基硫杂环戊烷改性壳聚糖和，3′-二硫代二丙酸改性壳聚糖。

上述的甘油磷酸钠(B)选自于α-甘油磷酸钠、β-甘油磷酸钠及α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠的混合物。

上述的(甲基)丙烯酸酯基聚合物(C)选自于数均相对分子质量为0.258～6.0kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，或选自于数均相对分子质量为2.20～14.60kDa的泊洛沙姆二丙烯酸酯和泊洛沙姆二甲基丙烯酸酯。

上述的巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下过程：按水溶液中巯基化壳聚糖(A)质量含量为0.5～10％、甘油磷酸钠(B)质量含量为1～30％以及(甲基)丙烯酸酯基聚合物(C)摩尔量为巯基化壳聚中的巯基摩尔量的0～0.5倍计，首先将甘油磷酸钠加入去离子水中，然后再加入巯基化壳聚糖和(甲基)丙烯酸酯基聚合物，搅拌均匀后，在温度10～50℃形成巯基化壳聚糖-甘油磷酸钠-(甲基)丙烯酸酯基聚合物(A-B-C)三元温敏原位水凝胶，或形成巯基化壳聚糖-甘油磷酸钠(A-B)二元温敏原位水凝胶。

上述的巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶，或上述方法制备的巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶的应用，以该水凝胶与药物、蛋白质、多肽、多糖、酶或细胞组合形成液体状态组合物，通过温度变化形成凝胶，用于控制药物释放，控制酶、细胞的固定和培养。

本发明的优点在于，所提出的温敏原位水凝胶能够在体内生物降解，降解产物无毒无害，该水凝胶具有吸水性、通透性和生物相容性，是一类新型的天然高分子温敏水凝胶材料，操作简单方便，具有广泛的生物医学和其它方面的用途，或为药物的注射定位给药制剂和药物的控制释放提供适宜的给药系统和给药方法，也或为酶固定、细胞培养、组织工程等提供凝胶基质和有效手段，以及为食品、保健品等领域的各种水溶液或水状液体系的凝胶化提供适宜的材料和技术。

附图说明

图1是实施例2所制得的A-B-C的水溶液试样的照片。

图2是实施例2所制得的A-B-C温敏性原位水凝胶试样的照片。

图3是图2中A-B-C温敏性原位水凝胶试样移出试管后的照片。

图4是实施例2制得的A-B-C温敏性原位水凝胶的SEM照片。

图5是以实施例2制得的A-B-C温敏性原位水凝胶分别载有质量含量为0.5％、1％、2％的牛血清白蛋白后，在不同时间内释放牛血清白蛋白曲线图。

图6是以实施例5制得的A-B温敏性原位水凝胶分别载有质量含量为0.5％、1％、2％的牛血清白蛋白后，在不同时间内释放牛血清白蛋白曲线图。

具体实施方式

下面再以实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：

将1.08g β-甘油磷酸钠粉末(B)溶于10mL双蒸水中，配制成10.8％β-甘油磷酸钠水溶液，将40mg壳聚糖数均相对分子质量为50kDa且巯基化度为250μmol/g的巯基乙酸改性壳聚糖(A)和5μmol数均相对分子质量为0.258kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯(C)溶于960mg的β-甘油磷酸钠水溶液中，制成巯基化壳聚糖浓度为4％(w/w)的A-B-C三元水溶液，在34～36℃时，该水溶液形成A-B-C三元温敏原位水凝胶，标记为“胶1”。

实施例2：

装置与操作同实施例1，将0.216g β-甘油磷酸钠粉末溶于10mL双蒸水中，配制成2％β-甘油磷酸钠水溶液，将40mg壳聚糖数均相对分子质量为50kDa且巯基化度为250μmol/g的巯基乙酸改性壳聚糖和2.5μmol数均相对分子质量为0.7kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯溶于960mg的β-甘油磷酸钠水溶液中，制成巯基化壳聚糖浓度为4％(w/w)的A-B-C水溶液，在35～37℃时，该水溶液形成A-B-C三元温敏原位水凝胶，标记为“胶2”。

实施例3：

装置与操作同实施例1，将1.08g β-甘油磷酸钠粉末溶于10mL双蒸水中，配制成10％β-甘油磷酸钠水溶液，将40mg壳聚糖数均相对分子质量为50kDa且巯基化度为250μmol/g的巯基乙酸改性壳聚糖和2.5μmol数均相对分子质量为2.0kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯溶于960mg的β-甘油磷酸钠水溶液中，制成巯基化壳聚糖浓度为4％(w/w)的A-B-C水溶液，在23～24℃时，该水溶液形成A-B-C三元温敏原位水凝胶，标记为“胶3”。

实施例4：

装置与操作同实施例1，将0.108g α-甘油磷酸钠粉末溶于10mL双蒸水中，配制成1％α-甘油磷酸钠水溶液，将100mg壳聚糖数均相对分子质量为20kDa且巯基化度为1100μmol/g的巯基乙酸改性壳聚糖和1.1μmol数均相对分子质量为6.0kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯溶于900mg的α-甘油磷酸钠水溶液中，制成巯基化壳聚糖浓度为10％(w/w)的A-B-C水溶液，在24～26℃时，该水溶液形成A-B-C三元温敏原位水凝胶，标记为“胶4”。

A-B-C三元温敏原位水凝胶中的A、B、C组分可以有多种不同组成，如表1所示。

表1A-B-C三元温敏原位水凝胶的组成

改变A-B-C三元温敏原位水凝胶中的壳聚糖的数均相对分子质量、壳聚糖的巯基化度以及水凝胶中A的质量含量、B的质量含量、C的相对分子质量和用量，其他操作同实例1，可得到一系列A-B-C三元温敏原位水凝胶，如表2所示。

表2A-B-C三元温敏原位水凝胶

M_CS代表壳聚糖的数均相对分子质量；n_SH代表巯基化壳聚糖的巯基化度；W_A代表凝胶中巯基化壳聚糖的质量含量；W_B代表甘油磷酸钠的质量含量；M_C代表(甲基)丙烯酸酯基聚合物的数均相对分子质量；N_C代表(甲基)丙烯酸酯基聚合物的用量，即C的用量为A中巯基摩尔量的0～0.5倍；T代表原位凝胶化温度。

实施例5：

装置与操作同实施例1，将1.08g β-甘油磷酸钠粉末溶于10mL双蒸水中，配制成10％β-甘油磷酸钠水溶液，将40mg壳聚糖数均相对分子质量为50kDa且巯基化度为218μmol/g的巯基乙酸改性壳聚糖溶于960mg的β-甘油磷酸钠水溶液中，制成巯基化壳聚糖浓度为3％(w/w)的A-B水溶液，在29～30℃时，该水溶液形成A-B二元温敏原位水凝胶，标记为“胶10”。

实施例6：

装置与操作同实施例1，将0.648g β-甘油磷酸钠粉末溶于10mL双蒸水中，配制成6％β-甘油磷酸钠水溶液；将40mg壳聚糖数均相对分子质量为50kDa且巯基化度为218μmol/g的巯基乙酸改性壳聚糖溶于960mg的β-甘油磷酸钠水溶液中，制成巯基化壳聚糖浓度为4％(w/w)的A-B水溶液，在30～31℃时，该水溶液形成A-B二元温敏原位水凝胶，标记为“胶11”。

实施例7：

在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中研究实施例5中的“胶10”水凝胶的体外降解行为，温度为37℃，降解时间大于一个月。

实施例8：

在加入0.5mg/mL溶菌酶的pH 7.4的磷酸盐缓冲液中研究实施例5中的“胶10”水凝胶的体外降解行为，温度为37℃，降解速度加快，但仍然大于一个月。

实施例9：

在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中研究实施例2中的“胶2”水凝胶的体外降解行为，温度为37℃，此水凝胶的溶胀率较大，降解时间大于一个月，与实施例5中的水凝胶相比，降解速率较快。

实施例10：

称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％(w/v)的磷酸100mL，过滤，用蒸馏水定容到1000mL；按照实施例2的方法，在20℃下配制牛血清白蛋白的质量含量为0.5、1、2％的“胶2”水溶液，取0.5g装入试管中，37℃下形成凝胶，每支试管中加入5mL PBS缓冲液(pH 7.4)，放置在恒温振荡器中(37℃，70r/min)进行释放，间隔一定时间取2.5mL上清液，同时补充2.5mL新鲜的PBS缓冲液；采用紫外分光光度计检测释放液中牛血清白蛋白的浓度，检测波长为595nm，累积释放量按式II计算，得到如图5所示的累积释放曲线.

Y＝B*X I

线性拟合得出：B＝0.00561(R＝0.99987)。

E = \frac{V_{E} Σ_{1}^{n - 1} C_{i} + V_{0} C_{n}}{m_{0}} \times 100 % - - - II

式中：E为BSA的累积释放量，μg/mL；V_E为PBS的置换体积，2.5mL；V₀为释放液PBS体积，5mL；C_i为第i次置换取样时释放液中药的浓度，μg/mL；n为置换PBS的次数，m₀为投药量。

实施例11：

方法同实施例10，只是水凝胶由按实施例5方法制备出“胶10”水凝胶代替。结果如图6。

按照实施例10、11的方法也可以负载其它蛋白质、多肽、DNA、酶等药物，或负载载药微粉、微粒制成药物缓控释制剂，注射到体内原位形成凝胶，用于药物的缓控释给药。也可以将细胞、营养成分等与上述液态下的温敏水凝胶混合，混合体系经温度变化形成凝胶。

Claims

1.一种巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶，其特征在于，是由质量含量为0.5～10％的巯基化壳聚糖、质量含量为1～30％的甘油磷酸钠、用量为巯基化壳聚糖中巯基摩尔量的0～0.5倍的(甲基)丙烯酸酯基聚合物及其余为水所形成的巯基化壳聚糖-甘油磷酸钠-(甲基)丙烯酸酯基聚合物三元温敏原位水凝胶，或形成的巯基化壳聚糖-甘油磷酸钠二元温敏原位水凝胶。

2.按权利要求1所述的巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶，其特征在于，巯基化壳聚糖选自于壳聚糖的数均相对分子质量为20～1000kDa和巯基化度为25～1100μmol/g的巯基乙酸改性壳聚糖、半胱氨酸改性壳聚糖、N-乙酰半胱氨酸改性壳聚糖、2，3-二巯基丁二酸改性壳聚糖、硫代乙酸醇改性壳聚糖、2-亚氨基硫杂环戊烷改性壳聚糖和3，3′-二硫代二丙酸改性壳聚糖。

3.按权利要求1所述的巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶，其特征在于，甘油磷酸钠选自于α-甘油磷酸钠、β-甘油磷酸钠及α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠的混合物。

4.按权利要求1所述的巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶，其特征在于，(甲基)丙烯酸酯基聚合物选自于数均相对分子质量为0.258～6.0kDa的聚乙二醇二丙烯酸酯和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，或选自于数均相对分子质量为2.20～14.60kDa的泊洛沙姆二丙烯酸酯和泊洛沙姆二甲基丙烯酸酯。

5.一种制备权利要求1所述的巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶的方法，其特征在于包括以下过程：按水溶液中巯基化壳聚糖质量含量为0.5～10％、甘油磷酸钠质量含量为1～30％、以及(甲基)丙烯酸酯基聚合物摩尔含量为巯基化壳聚中的巯基摩尔量的0～0.5倍计，首先将甘油磷酸钠加入去离子水中，然后再加入巯基化壳聚糖和(甲基)丙烯酸酯基聚合物，搅拌均匀后，在温度10～50℃形成巯基化壳聚糖-甘油磷酸钠-(甲基)丙烯酸酯基聚合物三元温敏原位水凝胶，或形成巯基化壳聚糖-甘油磷酸钠二元温敏原位水凝胶。

6.以按权利要求1所述的巯基化壳聚糖基温敏性原位水凝胶，或以按权利要求5所制备的巯基化壳聚糖基温敏性原位水凝胶的应用，该水凝胶与药物、蛋白质、多肽、多糖、酶或细胞组合形成液体状态组合物，通过温度变化形成凝胶，用于控制药物释放，控制酶、细胞的固定和培养。