CN109432496A - 一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶及其药物载体的制备方法和应用 - Google Patents

一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶及其药物载体的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于组织工程支架领域，公开了一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶及其药物载体的制备方法和应用，该巯基化多糖基水凝胶是由3％～6％(w/v)的巯基化多糖、10％～29％(w/v)的β‑甘油磷酸钠所形成的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶，其中巯基化多糖可包覆载药脂质体、载药巯基化埃洛石或多肽中的一种或多种，形成可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体。该可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶及其药物载体在人体生理温度条件下即可实现凝胶化，具有温敏性、可注射性、吸水性。

Description

一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶及其药物载体的 制备方法和应用
技术领域
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶及其药物载体的制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体的重要组成部分，直接与外界接触，很容易受到各种外伤，如烧伤、刮伤感染、肿瘤切除及糖尿病引起的皮肤溃疡等。骨肿瘤的切除复发会使病人增加二次手术的痛苦，通过凝胶包载抗肿瘤药物，具有填充缺损部位和预防肿瘤复发，通过药物的包载可以控制药物的释放，降低肿瘤药物的副作用，具有一定的应用前景。
天然多糖材料如海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖等多糖是自然界中生物复合体中主要的有机成分，来源广泛，价格低廉，且这些材料由于具有良好的生物相容性和生物可降解性等在组织工程研究中受到众多研究者的青睐，因此以天然多糖材料为原料进行组织工程研究是模拟天然组织的有效方法。
水凝胶作为一种越来越受关注的软物质，通常是指在水溶液中溶胀的高分子相互交联而形成的三维网络结构。可注射水凝胶具有流动性和完美塑形性，能够填充形状复杂的缺损部位，其所具有的类细胞外基质的结构、包裹细胞和生物分子的能力、易于给药、物理性能易调控、可微创植入并原位成型、对组织损伤小、操作简单易行等优点，在生物医学领域的药物缓释和组织工程支架等方面得到了深入的研究。
目前使用得较多的可注射水凝胶制备方法主要为紫外光引发交联或引入化学交联剂，但是紫外光交联(光引发剂)或引入化学交联剂，都会对细胞有一定的潜在毒性影响，而物理交联的可注射水凝胶回复性差，且力学强度差，不适于手术操作。专利申请号200710058737.9和200710058738.3均公开巯基化壳聚糖水凝胶及其制备方法，但不加入任何交联剂和催化剂，仅利用空气的氧化作用使巯基之间反应形成的二硫键交联而成水凝胶，所需的时间长。公开号为CN102241837A的专利，公开了巯基化壳聚糖基温敏原位水凝胶及其制备方法和应用，通过加入不同质量含量的巯基化壳聚糖，不同构型和含量的甘油磷酸钠或甲基丙烯酸酯基聚合物形成的二元或三元温敏原位水凝胶，其具体实施实例为巯基乙酸改性的巯基化壳聚糖。
因此，开发一种毒性小、力学强度高、凝胶时间短、可控药物释放和生物相容性好的可原位注射成型水凝胶药物载体亟待提上日程。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶。本发明的水凝胶来源丰富、操作简便、凝胶时间短，反应条件温和、凝胶性能可控，可在人体生理条件下进行且无需其他化学交联剂即可实现凝胶化。且本发明水凝胶还可含有细胞、多肽、脂质体、埃洛石或药物等。
本发明另一目的在于提供一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述巯基化天然多糖基可注射用水凝胶药物载体在组织工程材料中的应用，特别是在皮肤缺损修复和骨肿瘤切除治疗中的应用。本发明以改性天然多糖为原料，通过静电的相互作用将巯基化多糖包覆在带负电或带正电的载药脂质体表面和加入载药的巯基化埃洛石，通过巯基之间的反应，利用不同的凝胶前驱液浓度、β-甘油磷酸钠浓度、载药脂质体浓度和载药埃洛石质量比等，控制凝胶的溶胀率、强度、降解速率、载药量和药物释放速率等，制备得到凝胶性能可控的水凝胶。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将天然多糖加入到水中，加入催化剂后再加入HCl溶液调节pH＝5.5后并避光搅拌均匀，搅拌均匀后加入巯基化试剂，加入NaOH溶液调节体系pH为4.75～5，避光搅拌反应5～24h，依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液作为透析液避光各透析1天，经冷冻干燥后得到巯基化天然多糖，其中，按摩尔比计，天然多糖：巯基化剂＝3:1～1:3，所述的天然多糖为透明质酸或海藻酸钠；
(2)将步骤(1)制备得到的巯基化天然多糖加入到水中，搅拌至充分溶解，再加入β-甘油磷酸钠搅拌使其充分溶解，调节体系pH＝7，得到凝胶前驱液，最后将凝胶前驱液在37℃恒温水浴孵育0.2～24h，得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶，其中，巯基化天然多糖在体系中的浓度为3％～6％(w/v),β-甘油磷酸钠的浓度为10％～29％(w/v)。
优选的，步骤(1)中天然多糖在水中的加入量为10～20mg/ml；
优选的，步骤(1)所述调节pH所用的HCl溶液的浓度为1mol/L，所述调节pH所用的NaOH溶液的浓度为1mol/L；
优选的，步骤(1)所述的催化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；
优选的，步骤(1)所述巯基化剂为巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐中的一种；
优选的，按质量比计，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺盐酸盐与天然多糖的比值为0.9586:1，所述N-羟基琥珀酰亚胺与天然多糖的比值为0.5754:1。
一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将天然多糖加入到的醋酸溶液中，加入催化剂并避光搅拌均匀，搅拌均匀后加入巯基化试剂，加入NaOH溶液调节体系pH为4.75～5，避光搅拌反应5～24h，依次以pH＝5.0HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0HCl溶液和pH＝5.0HCl溶液作为透析液避光各透析1天，经冷冻干燥后得到巯基化天然多糖，其中，按摩尔比计，天然多糖：巯基化剂＝3:1～1:3，所述天然多糖为壳聚糖；
(2)将步骤(1)制备得到的巯基化天然多糖加入到pH＝8的水中，搅拌至充分溶解后在-20℃冷冻30min，再加入β-甘油磷酸钠搅拌使其充分溶解，调节体系pH＝7，再次-20℃冷冻30min得到凝胶前驱液，最后将凝胶前驱液在37℃恒温水浴孵育0.2～24h，得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶，其中，巯基化天然多糖在体系中的浓度为3％～6％(w/v),β-甘油磷酸钠的浓度为10％～29％(w/v)。
优选的，步骤(1)中天然多糖在醋酸溶液中的加入量为10～20mg/ml，所述醋酸溶液的浓度为0.5％(v/v)。
优选的，步骤(1)所述调节pH所用的NaOH溶液的浓度为1mol/L。
优选的，步骤(1)所述的催化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
优选的，步骤(1)所述的巯基化剂为巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐中的一种。
优选的，按质量比计，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺盐酸盐与天然多糖的比值为0.9586:1，所述N-羟基琥珀酰亚胺与天然多糖的比值为0.5754:1。
一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体的制备方法，包含以下步骤：
将权利要求1步骤(2)制备得到的凝胶前驱液与载药脂质体、载药巯基化埃洛石和多肽中的一种或多种混合，得到载药凝胶前驱液，将载药凝胶前驱液在37℃恒温水浴孵育0.2～24h，得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体；或者将权利要求4步骤(2)制备得到的凝胶前驱液与载药脂质体、载药巯基化埃洛石和多肽中的一种或多种混合，得到载药凝胶前驱液，将载药凝胶前驱液在37℃恒温水浴孵育0.2～24h，得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体。
优选的，所述载药脂质体和载药巯基化埃洛石所负载的药物为阿霉素、姜黄素和紫杉醇中的一种或多种。
上述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体的制备方法制备得到的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体。
上述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体在皮肤创伤修复和骨肿瘤切除治疗中的应用。
本发明制备方法以巯基化改性天然多糖材料，通过静电的相互作用将巯基化多糖包覆在带负电或带正电的载药脂质体表面和加入载药的巯基化埃洛石，通过巯基之间的反应，利用不同的官能团含量、溶液浓度、β-甘油磷酸钠浓度、载药脂质体浓度和载药埃洛石质量比等，控制凝胶的溶胀率、强度、降解速率、载药量和药物释放速率等，制备得到凝胶性能可控的载药水凝胶。可以用带正电的巯基化壳聚糖包覆带负电的载药脂质体通过巯基之间的交联形成脂质体凝胶，也可以加入带负电的巯基化载药埃洛石，通过静电作用和巯基之间的反应形成凝胶；可以用带负电的巯基化透明质酸和巯基化海藻酸钠包覆带正电的载药脂质体，通过巯基之间的交联形成脂质体凝胶，也可以加入巯基化载药埃洛石，通过巯基之间的反应形成载药凝胶。
本发明的水凝胶来源丰富、操作简便、凝胶时间短，反应条件温和、凝胶性能可控，可在人体生理条件下进行且无需其他化学交联剂即可实现凝胶化。且该水凝胶具有促进上皮细胞生长，可有效保护手术创面，减少手术创面出血，具有消炎抗菌作用，促进伤口愈合，可应用作为组织工程材料，特别适用于皮肤缺损的修复和骨肿瘤切除治疗中的应用，具有可注射性，且反应迅速、可在5～8min内凝胶化，原位成型、手术操作性强、手术过程中自动粘合，无需缝合固定，对任何形状、位置的创面都可有效的保护。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明制备反应体系条件温和、容易操作和控制。
(2)本发明原料来源丰富，成本低，无需添加化学交联剂。
(3)本发明利用不同的官能团含量、溶液浓度、β-甘油磷酸钠浓度、载药脂质体浓度和载药埃洛石质量比等，控制凝胶的溶胀率、强度、降解速率、载药量和药物释放速率等，制备得到凝胶性能可控的水凝胶。
(4)本发明的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体可利用该凝胶在肿瘤的微酸环境二硫键的破坏和肿瘤细胞内的谷胱甘肽断裂二硫键而使凝胶降解，可以控制凝胶的降解速率和药物释放速率等，具有骨肿瘤部位切除的填充和术后治疗的应用前景。
(5)本发明制备得到的巯基化壳聚糖载药凝胶，具有促进上皮细胞生长且具有消炎抗菌作用，促进皮肤伤口愈合。
(6)本发明制备水凝胶的过程迅速，具有温敏性和可原位成型性，手术操作性强，手术过程中可以自动粘合，无需缝合固定，对任何形状、位置的创面都可有效的保护。
附图说明
图1为实施例2制备的CSSH Gel于37℃凝胶过程中的流变学分析图。
图2为实施例2步骤(3)制得的凝胶冷冻干燥后的断面微观扫描电镜图。
图3为实施例5制得的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶循环压缩图。
图4为在实施例10的包载不同浓度姜黄素的巯基化壳聚糖水凝胶的体外释放曲线图，其中(b)是(a)中0～3h范围内的体外释放曲线，100μM，150μM和200μM表示姜黄素浓度。
图5为实施例11制得的凝胶海绵和实施例2步骤(3)制得的CSSH Gel在-80℃冷冻干燥24小时后得到的冻干凝胶海绵对大鼠皮肤缺损的修复效果图，其中，A图为实物拍摄图，B为修复率条形图。
图6为实施例2步骤(3)制得的CSSH Gel原位注射成型对大鼠皮肤缺损的修复效果图，其中，A图为大鼠皮肤缺损处的修复图片，B图为对应的修复率。
图7为实施例12制得的DOX@CSSH Gel、DOX@CSSH/HNTs Gel和DOX@CSSH/HNTs-SHGel的照片图。
图8为实施例12制得的CSSH/HNTs Gel和CSSH/HNTs-SH Gel的不同放大倍数下的扫面电镜图，其中，a～b对应CSSH/HNTs Gel，c～d对应CSSH/HNTs-SH Gel。
图9为实施例12制得的DOX@CSSH Gel、DOX@CSSH/HNTs Gel和DOX@CSSH/HNTs-SHGel在不同pH下的体外释放曲线，其中7.4和5.5代表pH。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例所述的室温为25℃。实施例所用雄性大鼠购于广州医科大学动物实验中心，年龄为4～6周，体重为300～350g，所用药品均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
实施例1
(1)称取1g壳聚糖溶于100mL 0.5％(v/v)的醋酸水溶液中，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(壳聚糖：半胱氨酸的摩尔比为3:1)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/LNaOH溶液调节体系PH＝5，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液作为透析液避光各透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化壳聚糖(CSSH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制备的巯基化壳聚糖加入pH＝8的去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后放入-20℃冰箱冷冻保存30min，然后取出加入β-甘油磷酸钠调节其pH＝7，在室温下磁力搅拌下使之溶解均匀，最终的巯基化壳聚糖浓度为5％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，再次-20℃冷冻30min得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶(记作CSSH Gel)。
测得步骤(2)制得的巯基化壳聚糖的巯基含量为133.50±7.56μmol/g，对步骤(3)制得的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行测试与分析，通过倒置小瓶的方法测得凝胶时间为8～10min。
实施例2
(1)称取1g壳聚糖溶于100mL0.5％(v/v)的醋酸水溶液中，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(壳聚糖：半胱氨酸的摩尔比为1:1)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/LNaOH溶液调节体系PH＝5，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液作为透析液避光各透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化壳聚糖(CSSH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制备的巯基化壳聚糖加入pH＝8的去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后放入-20℃冰箱冷冻保存30min，然后取出加入β-甘油磷酸钠调节其pH＝7，在室温下磁力搅拌下使之溶解，最终的巯基化壳聚糖浓度为5％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，再次-20℃冷冻30min得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶(记作CSSH Gel)。
测得步骤(2)制得的巯基化壳聚糖的巯基含量为215.84±13.57μmol/g。对步骤(3)制得的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行测试与分析，通过倒置小瓶的方法测得凝胶时间为5～8min；流变学分析结果如图1所示，可见凝胶点在112s(储存模量大于损耗模量)；对步骤(3)制得的CSSH Gel冷冻干燥后进行扫描电镜观察，结果如图2所示，由图2可见，断面可见凝胶内部为多孔结构，有利于细胞迁移、营养物质传输及代谢产物的排出。
实施例3
(1)称取1g壳聚糖溶于100mL0.5％(v/v)的醋酸水溶液中，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(壳聚糖：半胱氨酸的摩尔比为1:3)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/LNaOH溶液调节体系PH＝5，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液作为透析液避光各透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化壳聚糖(CSSH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制备的巯基化壳聚糖加入pH＝8的去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后放入-20℃冰箱冷冻保存30min，然后取出加入β-甘油磷酸钠调节其pH＝7，在室温下磁力搅拌下使之溶解，最终的巯基化壳聚糖浓度为5％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，再次-20℃冷冻30min得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶(记作CSSH Gel)。
测得步骤(2)制得的巯基化壳聚糖的巯基含量为193.32±10.86μmol/g，对步骤(3)制得的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行测试与分析，通过倒置小瓶的方法测得凝胶时间为6～8min。
实施例4
(1)称取1g透明质酸溶于100mL去离子水，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入1mol/LHCl溶液调节pH至5.50，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(透明质酸：半胱氨酸的摩尔比为3:1)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/L NaOH溶液调节PH＝4.75，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液最为透析液避光各透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化透明质酸(记作HA-SH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制备的巯基化透明质酸加入去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后，加入β-甘油磷酸钠调节pH＝7.0，在室温下磁力搅拌下使之溶解，最终得到巯基化透明质酸质量体积比为5wt％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶。
测得步骤(2)制得的巯基化透明质酸的巯基含量为107.83±7.67μmol/g，对步骤(3)制得的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行测试与分析，小瓶倒置法测得凝胶时间为15～20min。
实施例5
(1)称取1g透明质酸溶于100mL去离子水，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入1mol/LHCl溶液调节pH至5.50，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(透明质酸：半胱氨酸的摩尔比为1:1)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/L NaOH溶液调节PH＝4.75，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液最为透析液避光各透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化透明质酸(记作HA-SH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制备的巯基化透明质酸加入去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后，加入β-甘油磷酸钠调节pH＝7.0，在室温下磁力搅拌下使之溶解，最终得到巯基化透明质酸质量体积比为5wt％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶。
测得步骤(2)制得的巯基化透明质酸的巯基含量为318.37±12.58μmol/g，对步骤(3)制得的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行测试与分析，考察其凝胶化时间和力学性能，图3为凝胶的循环压缩实验，表明凝胶的力学性能良好，具有良好的弹性和可恢复性，由小瓶倒置法测得凝胶时间为10～15min。
实施例6
(1)称取1g透明质酸溶于100mL去离子水，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入1mol/LHCl溶液调节pH至5.50，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(透明质酸：半胱氨酸的摩尔比为1:3)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/L NaOH溶液调节PH＝4.75，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液最为透析液避光各透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化透明质酸(记作HA-SH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制备的巯基化透明质酸加入去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后，加入β-甘油磷酸钠调节pH＝7.0，在室温下磁力搅拌下使之溶解，最终得到巯基化透明质酸质量体积比为5wt％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶。
测得步骤(2)制得的巯基化透明质酸的巯基含量为358.64±14.62μmol/g，对步骤(3)制得的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行测试与分析，小瓶倒置法测得凝胶时间为8～10min。
实施例7
(1)称取1g海藻酸钠溶于100mL去离子水，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入1mol/LHCl溶液调节pH至5.50，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(透明质酸：半胱氨酸的摩尔比为3:1)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/L NaOH溶液调节PH至4.75，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液为透析液分别避光透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化海藻酸钠(记作SA-SH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制得的巯基化海藻酸钠加入去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后，加入β-甘油磷酸钠在室温下磁力搅拌下使之溶解，调节最终的pH＝7左右，最终得到巯基化海藻酸钠质量体积比为5wt％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶。
测得步骤(2)制得的巯基化海藻酸钠的巯基含量为38.62±6.54μmol/g，对步骤(3)制得的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行分析，小瓶倒置法测得凝胶时间为15～20min。
实施例8
(1)称取1g海藻酸钠溶于100mL去离子水，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入1mol/LHCl溶液调节pH至5.50，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(透明质酸：半胱氨酸的摩尔比为1:1)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/L NaOH溶液调节PH至4.75，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液为透析液分别避光透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化海藻酸钠(记作SA-SH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制得的巯基化海藻酸钠加入去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后，加入β-甘油磷酸钠在室温下磁力搅拌下使之溶解，调节最终的pH＝7左右，最终得到巯基化海藻酸钠质量体积比为5wt％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶。
测得步骤(2)巯基化海藻酸钠的巯基含量为98.56±9.39μmol/g，对步骤(3)所制备的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行分析，小瓶倒置法测得凝胶时间为8～10min。
实施例9
(1)称取1g海藻酸钠溶于100mL去离子水，分别加入0.9586g的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和0.5754g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入1mol/LHCl溶液调节pH至5.50，室温、避光搅拌反应15min；
(2)将半胱氨酸(透明质酸：半胱氨酸的摩尔比为1:3)加至步骤(1)反应体系中，加入1mol/L NaOH溶液调节PH至4.75，室温、避光搅拌反应5小时；依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液为透析液分别避光透析1天，共透析3天，最后冷冻干燥得到巯基化海藻酸钠(记作SA-SH)样品，4℃保存；
(3)将步骤(2)制得的巯基化海藻酸钠加入去离子水中，在磁力搅拌下充分溶解后，加入β-甘油磷酸钠在室温下磁力搅拌下使之溶解，调节最终的pH＝7左右，最终得到巯基化海藻酸钠质量体积比为5wt％(w/v)，β-甘油磷酸钠浓度为29％(w/v)，得到凝胶前驱液，然后将等体积的凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，随后放于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶。
测得步骤(2)制得的巯基化海藻酸钠的巯基含量为146.28±6.32μmol/g，对步骤(3)所制备的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶进行分析，小瓶倒置法测得凝胶时间为6～8min。
实施例10
(1)通过薄膜水化超声法制备得到包载姜黄素的脂质体溶液(Cur-Lip)；
(2)取实施例2步骤(3)制得的凝胶前驱液，然后分别加入不同体积包载姜黄素的脂质体溶液(Cur-Lip)，得到巯基化壳聚糖包覆载姜黄素的脂质体凝胶前驱液，将脂质体凝胶前驱液储存于-20℃冰箱备用，最终得到姜黄素浓度分别为100μM，150μM，200μM的巯基化壳聚糖包覆载姜黄素的脂质体凝胶前驱液；
(3)将等体积的步骤(2)制得的不同姜黄素浓度的脂质体凝胶前驱液分别注射入24孔细胞培养板各孔中，于37℃恒温水浴箱中孵育处理24h形成包载姜黄素的脂质体水凝胶，得到可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体(记作CSSH/Cur-Lip Gel)。
考察CSSH/Cur-Lip Gel在pH＝7.4的PBS溶液的释放速率，将制备好的CSSH/Cur-Lip Gel放于15毫升的离心管中，加入10毫升PBS溶液，每隔一定的时间(0.5h,1h,1.5h,2h,2.5h,3h,15h,24h,48h,72h)将旧的PBS溶液取出，加入新的PBS溶液，用紫外分光光度计(Thermo Scientific紫外可见分光光度计Evolution 201)在425nm测试取样溶液的吸光度，计算释放速率。图4为包载不同浓度姜黄素脂质体巯基化壳聚糖水凝胶的体外释放曲线，其中图4中的(b)是图4中的(a)中0～3h范围内的体外释放曲线，由图可见，随着姜黄素浓度的增加其释放速度增加，最大的累计释放率为58.53±3.14％。
实施例11
(1)配制组胺素1多肽溶液(Hst1)(药品的名称是：组胺素1多肽，购于上海淘普生物科技有限公司)的浓度为12.5μg/μL；
(2)取实施例2步骤(3)制得的凝胶前驱液，将步骤(1)制备的组胺素1多肽溶液加入到凝胶前驱液中，凝胶前驱液与组胺素1多肽溶液的体积比为9:1，然后搅拌混匀，得到复合组胺素1多肽巯基化壳聚糖水凝胶前驱液，将凝胶前驱液储存于-20℃冰箱备用；
(3)将步骤(2)制得的复合组胺素1多肽巯基化壳聚糖水凝胶前驱液加入到96孔板，每个孔的加入量为40μL，在37℃恒温水浴箱中孵育处理24h形成复合组胺素1多肽巯基化壳聚糖水凝胶，得到可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体(记作Hst1 Gel)；
(4)将步骤(3)制得的Hst1 Gel放于-80℃冷冻干燥24小时形成干态的凝胶海绵，用于大鼠皮肤缺损的修复。
考察实施例11步骤(4)制备得到的凝胶海绵、实施例2步骤(3)制得的CSSH Gel在-80℃冷冻干燥24小时得到的冻干凝胶海绵对大鼠皮肤缺损的修复效果，以不加凝胶样品为对照组。对大鼠皮肤进行全皮层打孔切除，伤口为5mm直径的圆柱体。结果如图5所示，其中，A图为实物拍摄图，B为修复率条形图，从图中可以看到5天后，Hst1 Gel凝胶海绵组相对于对照组、CSSH Gel组的皮肤缺损修复效果最好。
图6为实施例2步骤(3)制得的CSSH Gel原位注射成型对大鼠皮肤缺损的修复效果图。对大鼠皮肤进行全皮层打孔切除，伤口为5mm直径的圆柱体。其中，A图为大鼠皮肤缺损处的修复图片，B图为对应的修复率，不加凝胶样品的为对照组。手术时记得其原位注射成型的凝胶时间为8～10分钟，可以看到7天后，皮肤缺损修复良好，优于对照组的修复。
由以上的实验可得，可以通过冻干海绵或者原位注射成型水凝胶去修复皮肤缺损部位，可以看出本发明制备的凝胶对于大鼠皮肤缺损的修复效果良好，组胺素1多肽具有促进皮肤修复的效果。
实施例12
(1)取实施例2步骤(3)制得的凝胶前驱液，将阿霉素(DOX)、埃洛石(HNTs)、巯基化埃洛石(HNTs-SH)、载阿霉素的埃洛石(DOX@HNTs)和载阿霉素的巯基化埃洛石(DOX@HNTs-SH)分别加入到凝胶前驱液中，然后搅拌混匀得到凝胶前驱液，将凝胶前驱液储存于-20℃冰箱备用；其中埃洛石、巯基化埃洛石、载阿霉素的埃洛石和载阿霉素的巯基化埃洛石的质量体积比为1％(w/v)(埃洛石占凝胶前驱液的体积比)；载阿霉素的埃洛石和载阿霉素的巯基化埃洛石通过将埃洛石和巯基化埃洛石各100mg加入到50μg/ml阿霉素溶液中搅拌24小时，10000转每小时离心10分钟，去离子水洗涤两次，然后冷冻干燥得到；
(2)将步骤(1)制得的凝胶前驱液加入到24孔板，在37℃恒温水浴箱孵育处理24h，得到可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体，其中：载阿霉素的凝胶(记作DOX@CSSH Gel)、埃洛石复合凝胶(记作CSSH/HNTs Gel)、巯基化埃洛石交联巯基化壳聚糖凝胶(记作CSSH/HNTs-SH Gel)、载阿霉素的埃洛石复合凝胶(记作DOX@CSSH/HNTs Gel)、载阿霉素的巯基化埃洛石交联巯基化壳聚糖凝胶(记作DOX@CSSH/HNTs-SH Gel)。
如图7为制备得到的DOX@CSSH Gel、DOX@CSSH/HNTs Gel和DOX@CSSH/HNTs-SH Gel的照片图；图8为CSSH/HNTs Gel和CSSH/HNTs-SH Gel的扫面电镜图片，可以看到埃洛石均匀分布于凝胶基质中，相对于没改性埃洛石，巯基化埃洛石交联的巯基化壳聚糖凝胶的孔洞较少，表面其交联网络致密，有利于凝胶的力学强度提高。
考察DOX@CSSH Gel、DOX@CSSH/HNTs Gel和DOX@CSSH/HNTs-SH Gel在不同pH下的释放速率，将制备好的凝胶分别放于15毫升的离心管中，分别加入3毫升pH＝7.4和pH＝5.5的PBS溶液，每隔一定的时间(1h,2h,6h,12h,24h,48h,72h,96h,120h)将旧的PBS溶液取出，加入新的PBS溶液，用紫外分光光度计(Thermo Scientific紫外可见分光光度计Evolution201)在550nm测试取样溶液的吸光度，计算释放速率。图9为不同pH和不同样品的体外释放曲线，由图可以看到凝胶中的药物释放在肿瘤酸性环境(pH＝5.5)的释放速率要快于正常人体生理条件的(pH＝7.4)，表明了该凝胶具有在特定的pH环境下通过二硫键的断裂从而将药物释放出来，具有一定的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将天然多糖加入到水中，加入催化剂后再加入HCl溶液调节pH＝5.5后并避光搅拌均匀，搅拌均匀后加入巯基化试剂，加入NaOH溶液调节体系pH为4.75～5，避光搅拌反应5～24h，依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％w/v NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液作为透析液避光各透析1天，经冷冻干燥后得到巯基化天然多糖，其中，按摩尔比计，天然多糖：巯基化剂＝3:1～1:3，所述的天然多糖为透明质酸或海藻酸钠；
(2)将步骤(1)制备得到的巯基化天然多糖加入到水中，搅拌至充分溶解，再加入β-甘油磷酸钠搅拌使其充分溶解，调节体系pH＝7，得到凝胶前驱液，最后将凝胶前驱液在37℃恒温水浴孵育0.2～24h，得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶，其中，巯基化天然多糖在体系中的浓度为3％～6％w/v，β-甘油磷酸钠在体系中的浓度为10％～29％w/v。
2.根据权利要求1所述一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中天然多糖在水中的加入量为10～20mg/ml；
步骤(1)所述调节pH所用的HCl溶液的浓度为1mol/L，所述调节pH所用的NaOH溶液的浓度为1mol/L；
步骤(1)所述的催化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；
步骤(1)所述巯基化剂为巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐中的一种。
3.根据权利要求2所述一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶的制备方法，其特征在于，按质量比计，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺盐酸盐与天然多糖的比值为0.9586:1，所述N-羟基琥珀酰亚胺与天然多糖的比值为0.5754:1。
4.一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将天然多糖加入到的醋酸溶液中，加入催化剂并避光搅拌均匀，搅拌均匀后加入巯基化试剂，加入NaOH溶液调节体系pH为4.75～5，避光搅拌反应5～24h，依次以pH＝5.0的HCl溶液，含1％(w/v)NaCl的pH＝5.0的HCl溶液和pH＝5.0的HCl溶液作为透析液避光各透析1天，经冷冻干燥后得到巯基化天然多糖，其中，按摩尔比计，天然多糖：巯基化剂＝3:1～1:3，所述天然多糖为壳聚糖；
(2)将步骤(1)制备得到的巯基化天然多糖加入到pH＝8的水中，搅拌至充分溶解后在-20℃冷冻30min，再加入β-甘油磷酸钠搅拌使其充分溶解，调节体系pH＝7，再次-20℃冷冻30min得到凝胶前驱液，最后将凝胶前驱液在37℃恒温水浴孵育0.2～24h，得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶，其中，巯基化天然多糖在体系中的浓度为3％～6％w/v,β-甘油磷酸钠在体系中的浓度为10％～29％w/v。
5.根据权利要求4所述一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中天然多糖在醋酸溶液中的加入量为10～20mg/ml，所述醋酸溶液的浓度为0.5％v/v；
步骤(1)所述调节pH所用的NaOH溶液的浓度为1mol/L；
步骤(1)所述的催化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；
步骤(1)所述的巯基化剂为巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐中的一种。
6.根据权利要求5所述一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶的制备方法，其特征在于，按质量比计，所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺盐酸盐与天然多糖的比值为0.9586:1，所述N-羟基琥珀酰亚胺与天然多糖的比值为0.5754:1。
7.一种可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
将权利要求1步骤(2)制备得到的凝胶前驱液与载药脂质体、载药巯基化埃洛石和多肽中的一种或多种混合，得到载药凝胶前驱液，将载药凝胶前驱液在37℃恒温水浴孵育0.2～24h，得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体；或者将权利要求4步骤(2)制备得到的凝胶前驱液与载药脂质体、载药巯基化埃洛石和多肽中的一种或多种混合，得到载药凝胶前驱液，将载药凝胶前驱液在37℃恒温水浴孵育0.2～24h，得到所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体。
8.根据权利要求7所述可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体的制备方法，其特征在于，所述载药脂质体和载药巯基化埃洛石所负载的药物为阿霉素、姜黄素和紫杉醇中的一种或多种。
9.权利要求7或8所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体的制备方法制备得到的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体。
10.权利要求9所述的可原位注射成型的巯基化多糖基水凝胶药物载体在皮肤创伤修复和骨肿瘤切除治疗中的应用。
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