CN109988255A - 一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，在一定质量浓度的醋酸水溶液中加入一定质量的壳聚糖，在不同的催化剂作用下，缓慢滴加一定物质的量浓度的1‑巯甲基环丙基乙酸的二甲基亚砜溶液，经透析后得到一种水溶性硫醇化的壳聚糖化合物，该化合物8小时内对大肠杆菌的抗菌效果为38.55%。本发明制备的硫醇化壳聚糖具有水溶性好，合成方法简单，反应条件温和等优点，避免了常用抗菌材料在不同pH环境下水溶性弱和抗菌效果差的问题，为抑制大肠杆菌的生长和繁殖提供了新型的材料，适合规模化生产和应用，在医疗领域有较好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，涉及一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用。
背景技术
壳聚糖(Chitosan)是一种从甲壳素中提取的氨基多糖，由含有D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖基的线性氨基多糖组成，壳聚糖分子中存在大量易被修饰的羟基和氨基，可以进行如酰胺化、羧基化、醚化、烷基化、酯化等反应，壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性、及低毒性，被广泛应用于水处理、食品、化妆品、医药保健等方面(Food chemistry,2018, 254, 217, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2013,61, 6574)，然而壳聚糖结构规整、难溶于水、部分结晶、强烈的分子内氢键导致分子量大于5000的壳聚糖难溶于水，只能溶解于稀酸溶液中，极大限制了其在各个领域的应用。
壳聚糖具有广谱的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等病原微生物有明显的抑制效果(Food control, 2019, 96, 234, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2018, 172, 338)，目前，壳聚糖作为抗菌剂已经在国内外得到了广泛应用，但是主要是将壳聚糖与生物制剂或重金属螯合形成复合抗菌剂，水溶性和稳定性差，壳聚糖的结晶结构被破坏，制备成本高，过程污染大，不能满足当今绿色无毒抗菌剂的要求，而且大部分结构改性的壳聚糖比表面积较小，无规则的微观结构，很难作为药物载体应用，因此如何利用壳聚糖广谱的抗菌活性，进行功能化的修饰，制备水溶性和稳定性好的壳聚糖促进其在药物化学领域中的应用是亟待解决的问题，硫醇化壳聚糖是一种重要的阳离子硫醇聚合物，水溶性较好，是壳聚糖化学改性的一个研究热点(Journal of Controlled Release, 2014, 190)，硫醇化壳聚糖具有良好的生物学特征，可以在体内被完全降解，且毒副作用较小，这些原因使得硫醇化壳聚糖在生物医药领域有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用。
本发明提供一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，其特征在于，反应方程式如式I所示：
式I
在一定质量浓度的醋酸水溶液100 mL中加入一定质量的壳聚糖（分子量为3~5万），在不同的催化剂作用下，缓慢滴加一定质量的1-巯甲基环丙基乙酸/二甲基亚砜溶液20 mL，用物质的量浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值，在一定温度下反应一段时间，将混合液装入透析袋中透析，冷冻干燥后得到水溶性硫醇化壳聚糖。
本发明所述醋酸水溶液的质量浓度为0.3~0.5%，其中优选为0.33%：
本发明所述壳聚糖和醋酸的质量浓度为0.8 g/100 mL~1.2 g/100 mL，其中优选为1.0g/100 mL。
本发明所述催化剂的有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC•HCl)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)，其中优选EDC•HCl和NHS两种催化剂，1-巯甲基环丙基乙酸、EDC•HCl和NHS的质量比为1: 1: (0.3~0.5)，其中优选为1:1.2:0.4。
本发明所述壳聚糖和1-巯甲基环丙基乙酸的质量比为(0.8~1.2) :1，其中优选1:1，
本发明所述使用0.1 mol/L的NaOH调节pH至4.5~5.5，其中优选pH=5.0，
本发明所述所述反应温度为20-80 ℃，其中优选反应温度为20 ℃，
本发明所述所述反应时间为10-16 h，其中优选反应时间为12 h。
本发明提供一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，制备的硫醇化壳聚糖具有水溶性好，合成方法简单，反应条件温和等优点，在不同pH范围内都有良好的溶解性，而且表面结构多孔，微观结构均匀，热稳定性显著提高，可以优良的作为药物载体。
附图说明
本发明有如下4幅附图：
图1为本发明中水溶性硫醇化壳聚糖的热稳定性图，
图2为本发明中水溶性硫醇化壳聚糖的扫描电镜图，
图3为本发明中水溶性硫醇化壳聚糖的扫描电镜放大图，
图4为本发明中水溶性硫醇化壳聚糖的细菌生长曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段更易于了解，下面结合具体实施例进一步进行描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL的二甲基亚砜中，加入1.2g EDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH至5.0，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为38.55%。
实施例2
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为8 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH为5.0，在20 ℃下反应12h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为30.67%。
实施例3
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为12 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=5.0，在20 ℃下反应12h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为29.83%。
实施例4
将壳聚糖加入到质量浓度为0.3%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=5.0，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为27.5%。
实施例5
将壳聚糖加入到质量浓度为0.5%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为12 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=5.0，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为26.79%。
实施例6
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=4.5，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为33.72%。
实施例7
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=5.5，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为34.23%。
实施例8
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=5.0，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为24.51%。
实施例9
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=5.0，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为34.51%。
实施例10
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=5.0，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为23.80%。
实施例11
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL 二甲基亚砜中，加入1.2 gEDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH=5.0，在20 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为26.43%。
实施例12
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL的二甲基亚砜中，加入1.2g EDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH至5.0，在40 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为18.45%。
实施例13
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL的二甲基亚砜中，加入1.2g EDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH至5.0，在80 ℃下反应12 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为20.46%。
实施例14
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL的二甲基亚砜中，加入1.2g EDC•HCl和0.4 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH至5.0，在20 ℃下反应16 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为25.68%。
实施例15
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL的二甲基亚砜中，加入1.2g EDC•HCl和0.3 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH至5.0，在20 ℃下反应16 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为23.36%。
实施例16
将壳聚糖加入到质量浓度为0.33%的醋酸水溶液中, 使壳聚糖在壳聚糖酸溶液中的质量浓度为10 mg/mL，将1.0 g 1-巯甲基环丙基乙酸溶解于20 mL的二甲基亚砜中，加入1.2g EDC•HCl和0.24 g NHS，震荡溶解，将溶解后的1-巯甲基环丙基乙酸缓慢滴加到壳聚糖溶液中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH至5.0，在20 ℃下反应16 h后得到的溶液装入透析袋中，透析冷冻干燥得到硫醇化壳聚糖样品，8 h内对大肠杆菌的抑制率为29.20%。
实施例17
水溶性硫醇化壳聚糖抑菌圈直径测试，培养基的组成及配置过程参见国标GB4789.28-2013，将大肠杆菌菌液分散到上述未固化的培养基中，将锥形瓶摇匀使细菌浓度为106 CFU/mL (OD600=0.05)，取其中的20 mL趁热平均分装到4个直径为10 cm的培养皿中，常温冷却固化，配置pH=5.0的醋酸缓冲溶液，然后分别配置质量浓度为5 mg/L的壳聚糖和硫醇化壳聚糖溶液，紫外灭菌30 min，另外准备pH=5.0的醋酸缓冲溶液为阴性对照组，只含有培养基的为空白对照组，取0.1 mL菌液滴加到培养基中间，涂抹均匀，将上述平板放入到37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察细菌生长情况，
| 样品 | 抑菌圈直径 (mm) |
| 空白对照组 | 0 |
| 阴性对照组 | 5.02 |
| 壳聚糖 | 6.48 |
| 硫醇化壳聚糖 | 10.86 |
记录抑菌圈直径(mm)，结果如上表。
实施例18
本发明硫醇化壳聚糖抗菌生长曲线的测定，配置质量浓度为5 mg/L的壳聚糖和硫醇化壳聚糖溶液，紫外灭菌30 min，分别在三个250 mL锥形瓶中加入30 mL培养基和菌液，使得菌液浓度为106 CFU/mL (OD600=0.05)，在上述3个锥形瓶中分别加入pH=5.0的缓冲溶液，壳聚糖溶液和硫醇化壳聚糖溶液，充分摇匀，将上述3个锥形瓶放入37 ℃的恒温震荡培养箱中，每隔2 h取样2 mL，用紫外分光光度计测量600 nm的紫外吸收波长(OD600)，OD600表示菌液的光密度，在8 h内，对于阴性对照组，壳聚糖的抑菌率为14.82%，本发明制备的硫醇化壳聚糖的抑菌率为38.55%，通过壳聚糖和1-巯甲基环丙基乙酸的改性，本发明制备的硫醇化壳聚糖抑菌效果得到明显提高。
实施例19
硫醇化壳聚糖在不同pH值下的溶解度，
分别准确称取一定质量壳聚糖和硫醇化壳聚糖于试管中，分别加入10 mL的pH=4.25、pH=7.00和pH=10.25的缓冲溶液，在常温下溶解30 min后，倒出上清液分别计算壳聚糖和硫醇化壳聚糖在不同pH下的溶解度，
| pH=4.25下的溶解度 | pH=7.00下的溶解度 | pH=10.25下的溶解度 | |
| 壳聚糖 | 99.3g/100 mL | × | × |
| 硫醇化壳聚糖 | 99.6 g/100 mL | 99.2 g/100 mL | 98.7 g/100 mL |
溶解度根据下列公式计算，溶解度(%)=[(初始壳聚糖+试管的质量)-(最终壳聚糖+试管的质量)]/[(初始壳聚糖+试管的质量)-(初始试管的质量)]。
Claims (8)
1.一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，其特征在于：反应方程式如式I所示，
式I
在一定质量浓度的醋酸水溶液100 mL中加入一定质量的壳聚糖（分子量为3~5万），在不同的催化剂作用下，缓慢滴加一定质量的1-巯甲基环丙基乙酸/二甲基亚砜溶液20 mL，用物质的量浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值，在一定温度下反应一段时间，将混合液装入透析袋中透析，冷冻干燥后得到水溶性硫醇化壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，其特征在于，所述醋酸水溶液的质量浓度为0.3~0.5%，其中优选为0.33%。
3.根据权利要求1所述的一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，其特征在于，所述壳聚糖和醋酸的质量浓度为0.8 g/100 mL~1.2 g/100 mL，其中优选为1.0 g/100 mL。
4.根据权利要求1所述的一种新型水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法，其特征在于，用作催化剂的有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC•HCl)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)，其中优选EDC•HCl和NHS两种催化剂，1-巯甲基环丙基乙酸、EDC•HCl和NHS的质量比为1: 1.2: (0.3~0.5)，其中优选为1:1.2:0.4。
5.根据权利要求1所述的一种新型水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法，其特征在于，壳聚糖和1-巯甲基环丙基乙酸的质量比为(0.8~1.2) :1，其中优选1:1。
6.根据权利要求1所述的一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，其特征在于，使用0.1 mol/L的NaOH调节pH至4.5~5.5，其中优选pH=5.0。
7. 根据权利要求1所述的一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，其特征在于，所述反应温度为20-80 ℃，其中优选反应温度为20 ℃。
8.根据权利要求1所述的一种水溶性硫醇化壳聚糖的制备方法和应用，其特征在于，所述反应时间为10-16 h，其中优选反应时间为12 h。
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