CN113521044A - 2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用 - Google Patents

2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药领域，公开了2‑(1‑(巯基甲基)环丙基)乙酸在作为和/或制备β‑内酰胺酶抑制剂中的应用。本发明首次公开了2‑(1‑(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物在作为和/或制备β‑内酰胺酶抑制剂中的应用，2‑(1‑(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物对β‑内酰胺酶(金属β‑内酰胺酶和/或丝氨酸β‑内酰胺酶)具有良好的抑制作用，可以保护抗生素不被细菌降解，提高细菌对抗生素敏感性，逆转细菌对抗生素的耐药；同时，2‑(1‑(巯基甲基)环丙基)乙酸和/或其衍生物与抗生素联用具有良好的协同效果，可作为抑制细菌的复合药物。

Description

2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在作为和/或制备β-内酰胺酶 抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用。
背景技术
β-内酰胺类抗生素是治疗革兰氏阴性菌感染最重要和最常用的抗生素，但近年来细菌对其耐药性的日益增加引发了人类的隐忧。碳青霉烯作为β-内酰胺类抗生素的其中一种，被认为是人类抗击细菌感染的最后一道防线，随着碳青霉烯酶的出现，人类逐渐失去这一最重要的筹码。
细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性的最主要原因是β-内酰胺酶的产生，其可通过水解β-内酰胺类抗生素的内酰胺环而使抗生素失去抗菌活性。根据DNA序列相似性，β-内酰胺酶可分为四类(A，B，C，D类)，其中A，C和D类酶是丝氨酸-β-内酰胺酶(SBLs)，B类酶是金属β-内酰胺酶(MBLs)，活性位点含有一个或两个锌离子。金属β内酰胺酶主要包括亚胺培南酶(IMPs)、Verona整合子编码的金属β-内酰胺酶(VIMs)和新德里金属β-内酰胺酶(NDMs)。其中NDM-1阳性细菌自本世纪初首次检测以来，已广泛传播。
2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸常用于抗哮喘病原料药孟鲁斯特钠的中间体。目前尚未见2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸作为β-内酰胺酶抑制剂方面的报道。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用。
本发明第二方面的目的，在于提供2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物在作为和/或制备提高细菌对抗生素敏感性的药物中的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供抗生素及2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸和/或其衍生物在制备抑制细菌的药物中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种包含抗生素及2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸和/或其衍生物的复合药物。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用。
2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸的分子式为C6H10O2S，CAS号为162515-68-6，结构式如式(I)所示。
Figure BDA0003101274950000021
优选地，所述衍生物包括2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
优选地，所述β-内酰胺酶为丝氨酸β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶中的至少一种；进一步优选地，所述β-内酰胺酶为金属β-内酰胺酶。
优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种；进一步优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种。
优选地，所述丝氨酸β-内酰胺酶为KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶。
优选地，所述β-内酰胺酶的来源包括自然界中提取或者从基因工程菌株中制备获得。
本发明的第二个方面，提供2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物在作为和/或制备提高细菌对抗生素敏感性的药物中的应用。
2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸的分子式为C6H10O2S，CAS号为162515-68-6，结构式如式(I)所示。
优选地，所述衍生物包括2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
优选地，所述细菌为表达金属β-内酰胺酶和/或丝氨酸β-内酰胺酶的耐药细菌；进一步优选地，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种。
优选地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素；进一步优选地，所述抗生素为青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素、硫霉素类抗生素和碳青霉烯类抗生素中的至少一种；更进一步优选地，所述抗生素为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢地尼、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林和阿莫西林中的至少一种。
优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种。
优选地，所述丝氨酸β-内酰胺酶为KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶。
本发明的第三个方面，提供抗生素及2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸和/或其衍生物在制备抑制细菌的药物中的应用。
2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸的分子式为C6H10O2S，CAS号为162515-68-6，结构式如式(I)所示。
优选地，所述衍生物包括2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
优选地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素；进一步优选地，所述抗生素为青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素、硫霉素类抗生素和碳青霉烯类抗生素中的至少一种；更进一步优选地，所述抗生素为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢地尼、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林和阿莫西林中的至少一种。
优选地，所述细菌为表达金属β-内酰胺酶和/或丝氨酸β-内酰胺酶的耐药细菌；进一步优选地，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中的至少一种。
优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种。
优选地，所述丝氨酸β-内酰胺酶为KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶。
本发明的第四个方面，提供一种药物，包含：
(1)抗生素；和
(2)2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸和/或其衍生物。
2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸的分子式为C6H10O2S，CAS号为162515-68-6，结构式如式(I)所示。
优选地，所述衍生物包括2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
优选地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素；进一步优选地，所述抗生素为青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素、头霉素类抗生素、硫霉素类抗生素和碳青霉烯类抗生素中的至少一种；更进一步优选地，所述抗生素为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢地尼、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林和阿莫西林中的至少一种。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的至少一种。
优选地，所述药物的制剂类型包括固体制剂、液体制剂和半固体制剂。
优选地，所述固体制剂包括片剂、颗粒剂、粉剂和胶囊剂。
优选地，所述液体制剂包括注射剂。
优选地，所述半固体制剂包括软膏剂和霜剂。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用，2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物对β-内酰胺酶(金属β-内酰胺酶和/或丝氨酸β-内酰胺酶)具有良好的抑制作用，可以保护抗生素不被细菌降解，提高细菌对抗生素敏感性，逆转细菌对抗生素的耐药；同时，2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸和/或其衍生物与抗生素联用具有良好的协同效果，可作为抑制细菌的复合药物。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对β-内酰胺酶抑制活性的测定
底物被酶水解后会引起吸光度值的下降，因此，可以通过吸光度的变化来表征底物水解程度，从而判断酶的活性。以美罗培南(50μM)为报告底物，在300nm波长处测定底物在被金属β-内酰胺酶水解后的吸光度变化。β-内酰胺酶包括NDM-1型金属β-内酰胺酶、VIM-2型金属β-内酰胺酶和IMP-7型金属β-内酰胺酶，终浓度分别为2nM、4nM和5nM，缓冲液为50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，并添加ZnSO4(终浓度为0.1mM)、曲拉通X-100(终浓度为0.01％(v/v))、牛血清白蛋白(BSA、终浓度为0.1μg/mL)，pH＝7.2，反应温度为25℃，具体实验方法如下：
1.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对IMP-7型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定
(1)将2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸(对照组加入卡托普利，购自上海源叶生物科技有限公司，批号S30916)溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL IMP-7型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为5nM)，于25℃孵育15min，使2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸(卡托普利)与酶充分结合。
(2)体系转入至石英比色皿中，加入50μL美罗培南(终浓度为50μM)后迅速测定吸光度值的变化，记录数据。
(3)计算不同浓度的2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸及卡托普利对IMP-7型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对IMP-7型金属β-内酰胺酶残存活性作图，通过拟合曲线计算得到IC50值，并通过公式Ki＝IC50/(1+[S]/Km)(其中，[S]为底物浓度，Km是酶的米氏常数)计算得到Ki值。
2.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对NDM-1型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定
(1)将2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸(对照组加入卡托普利，购自上海源叶生物科技有限公司，批号S30916)溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL NDM-1型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为2nM)，于25℃孵育15min，使2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸(卡托普利)与酶充分结合。
(2)体系转入至石英比色皿中，加入50μL美罗培南(终浓度为50μM)后迅速测定吸光度值的变化，记录数据。
(3)计算不同浓度的2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸及卡托普利对NDM-1型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对NDM-1型金属β-内酰胺酶残存活性作图，通过拟合曲线计算得到IC50值，并计算得到Ki值。
3.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对VIM-2型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定
(1)将2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸(对照组加入卡托普利，购自上海源叶生物科技有限公司，批号S30916)溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、0.5、1、5、10、50、100、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL VIM-2型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为4nM)，于25℃孵育15min，使2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸(卡托普利)与酶充分结合。
(2)体系转入至石英比色皿中，加入50μL美罗培南(终浓度为50μM)后迅速测定吸光度值的变化，记录数据。
(3)计算不同浓度的2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸及卡托普利对VIM-2型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对VIM-2型金属β-内酰胺酶残存活性作图，通过拟合曲线计算得到IC50值，并计算得到Ki值。
2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸及卡托普利对IMP-7型、NDM-1型和VIM-2型金属β-内酰胺酶的抑制活性的结果如表1所示：2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对IMP-7型、VIM-2型、NDM-1型金属β-内酰胺酶具有抑制作用，尤其对IMP-7型、VIM-2型金属β-内酰胺酶具有良好的抑制作用(高于卡托普利)，IC50分别为17.06±1.84μM、21.22±1.45μM。
表1 2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸及卡托普利对IMP-7型、NDM-1型和VIM-2型金属β-内酰胺酶的IC50(μM)和Ki(μM)
Figure BDA0003101274950000061
实施例2 2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南联用抑制产β-内酰胺酶耐药菌效果的评价
采用微量肉汤稀释法测定2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南联用对产β-内酰胺酶耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)。实验所用的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pMAL-c5x-IMP-7购买自上海生工生物科技有限公司，E.coli BL21(DE3)/pET24a-VIM-2和E.coli BL21(DE3)/pET26b-NDM-1源自西北大学杨科武教授的馈赠，已在文献：张月娟，抗生素耐药靶蛋白金属β-内酰胺酶及其耐药细菌的表征与抑制研究[D]，西北大学，2019年；中公开；还包括购于北京百欧博伟生物技术有限公司的临床分离株E.coli BAA-2452(blaNDM-1)和E.coli BAA-2340(blaKPC-2)。
FICI用于判断两种药物联合使用时的相互作用，根据以下方程定义:FICI＝FICA+FICB＝CA/MICA+CB/MICB，其中MICA和MICB分别是化合物A和B单独使用的MIC值，而CA和CB是化合物A和B在有效组合中的药物浓度。若FICI≤0.5则认为两药具有协同作用，0.5＜FICI≤4说明两药协同作用较弱或无相关作用，FICI≥4则认为两药具有拮抗作用。FICI越小，则药物的协同作用越强。
具体实验方法如下：
1.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南联用抑制产IMP-7型耐药菌效果的评价
(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(E.coli BL21(DE3)/pMAL-c5x-IMP-7菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL氨苄西林)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×106CFU/mL。
(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对产IMP-7型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。
(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)联用对产IMP-7型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。
(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。
2.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南联用抑制产VIM-2型耐药菌效果的评价
(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(E.coli BL21(DE3)/pET24a-VIM-2菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×106CFU/mL。
(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对产VIM-2型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。
(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)联用对产VIM-2型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。
(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。
3.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南联用抑制产NDM-1型耐药菌效果的评价
(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(E.coli BL21(DE3)/pET26b-NDM-1菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×106CFU/mL。
(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对产NDM-1型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。
(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)联用对产NDM-1型耐药菌的MIC，每个浓度设三个复孔。
(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。
4.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南联用抑制临床分离株E.coli BAA-2452(blaNDM-1)效果的评价
(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(临床分离株E.coli BAA-2452(blaNDM-1))接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×106CFU/mL。
(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对临床分离株E.coli BAA-2452(blaNDM-1)的MIC，每个浓度设三个复孔。
(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)联用对临床分离株E.coli BAA-2452(blaNDM-1)的MIC，每个浓度设三个复孔。
(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。
5.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南联用抑制临床分离株E.coli BAA-2340(blaKPC-2)效果的评价
(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(临床分离株E.coli BAA-2340(blaKPC-2))接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×106CFU/mL。
(2)在96孔平板的第2～12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对临床分离株E.coli BAA-2340(blaKPC-2)的MIC，每个浓度设三个复孔。
(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤(2)，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625～128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)，终浓度为2～128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸)联用对临床分离株E.coli BAA-2340(blaKPC-2)的MIC，每个浓度设三个复孔。
(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。
美罗培南与2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸联用对表达NDM-1、VIM-2、IMP-7或KPC-2耐药菌的抗菌活性的结果如表2所示：抑制剂(2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸、卡托普利)可以提高美罗培南的抗菌活性：当抑制剂浓度为128μg/mL时，与美罗培南联合使用，可提高美罗培南对多种表达β-内酰胺酶的耐药菌的抑菌效果，且与单独使用美罗培南相比，联合用药能够有效降低美罗培南对耐药菌株的MIC值，最高可降低32倍，且效果均优于卡托普利。
2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或卡托普利与美罗培南联用对表达β-内酰胺酶的耐药菌的FICI值如表3所示：2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南联用对表达β-内酰胺酶的耐药菌的FICI值均小于等于0.5，表明两者具有良好的协同作用；而卡托普利与美罗培南联用对表达β-内酰胺酶的耐药菌的FICI值均大于2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸，表明其与美罗培南的协同效果不如2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸与美罗培南的协同效果。
上述结果表明：与美罗培南联用下，2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸对多种表达β-内酰胺酶的耐药菌具有有效的协同抗菌活性，说明2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸可以作为β-内酰胺酶抑制剂，能够逆转碳青霉烯耐药菌的耐药性，有效保护美罗培南不被β-内酰胺酶水解，提高美罗培南对产β-内酰胺酶的耐药菌的抗菌活性。因此，2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸可以作为β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素制备成复合制剂。
表2 2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或卡托普利与美罗培南联用对表达β-内酰胺酶的耐药菌的MIC(μg/mL)
Figure BDA0003101274950000101
Figure BDA0003101274950000111
表3 2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或卡托普利与美罗培南联用对表达β-内酰胺酶的耐药菌的协同抗菌指数(FICI)
Figure BDA0003101274950000112
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物在作为和/或制备β-内酰胺酶抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述β-内酰胺酶为丝氨酸β-内酰胺酶和金属β-内酰胺酶中的至少一种；
优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种；
优选地，所述丝氨酸β-内酰胺酶为KPC-2型丝氨酸β-内酰胺酶；
优选地，所述衍生物包括2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
3.2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸或其衍生物在作为和/或制备提高细菌对抗生素敏感性的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述抗生素为β-内酰胺类抗生素。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述细菌为表达金属β-内酰胺酶和/或丝氨酸β-内酰胺酶的耐药细菌；
优选地，所述衍生物包括2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
6.抗生素及2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸和/或其衍生物在制备抑制细菌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述抗生素为β-内酰胺类抗生素。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述细菌为表达金属β-内酰胺酶和/或丝氨酸β-内酰胺酶的耐药细菌；
优选地，所述衍生物包括2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸在药学上可以接受的盐、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
9.一种药物，包含：
(1)抗生素；和
(2)2-(1-(巯基甲基)环丙基)乙酸和/或其衍生物。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于：
所述抗生素为β-内酰胺类抗生素。
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