KR100992213B1 - 라이조푸스를 이용한 저분자 키토산의 생산방법 및 이를 이용한 키토산 함유 식물의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물을 이용하여 저분자의 키토산을 생산하는 방법 및 이의 이용방법에 관한 것이다. 상기 저분자의 키토산은 건강보조식품, 의약품, 항균제 등의 용도로 사용될 수 있다. 추가로 본 발명은 상기 저분자 키토산을 이용하여 키토산이 함유된 식물을 생산하는 방법을 제공한다.

라이조푸스, 키토산, 토마토

Description

라이조푸스를 이용한 저분자 키토산의 생산방법 및 이를 이용한 키토산 함유 식물의 생산방법{A method for producing small molecule chitosan and plants comprising chitosan}

본 발명은 미생물을 이용하여 저분자의 키토산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 저분자 키토산을 이용하여 키토산이 함유된 식물을 생산하는 방법을 제공한다.

키토산(chitosan)은 무작위적으로 분포된 베타-(1-4)-연결된 D-글루코사민(탈아세틸화 단위) 및 N-아세틸-D-글루코사민(아세틸화 단위)으로 구성된 선형 다당류(linear polysaccharide)로, 인체에 흡수될 수 있다. 키토산은 갑각류의 외골격 및 곰팡이의 세포벽 내의 구성요소인 키틴(chitin)의 탈아세틸화에 의해 상업적으로 생산할 수 있다. 탈아세틸화도(%DA)는 NMR 로 결정할 수 있고, 상업적으로 생산되는 키토산의 %DA는 60-100 % 범위에 있다. 키토산의 아미노 그룹은 약 6.5의 pKa 값을 가지므로, 키토산은 양(+)의 전하를 띠며, pH 및 %DA-값에 의존하는 전하 밀도로 산성부터 중성 용액에까지 용해될 수 있다. 이러한 특성으로 인해 키토산은 음전하를 갖는 표면에 쉽게 부착될 수 있고, 상피세포를 통과하는 극성 약물들의 전달을 용이하게 한다.

키토산은 다수의 상업적 및 의약적 용도를 갖고 있다. 일반적으로 키토산은 노폐해진 세포를 활성화하여 노화를 억제하고 면역력을 강화해주며 질병 예방 효과를 보인다. 또한 생체의 자연적인 치유 능력을 활성화하는 기능과 함께 생체 리듬을 조절해주는 것으로 알려져 있다. 그 외 효능으로는 첫째, 체내에 과잉된 유해 콜레스테롤을 흡착, 배설하는 역할 즉 탈콜레스테롤 작용을 한다. 둘째, 암 세포의 증식을 억제하는 항암 작용을 한다. 셋째, 혈압 상승의 원인이 되는 염화물 이온을 흡착, 장에서의 흡수를 억제한 뒤 체외로 배출시킴으로써 혈압 상승 억제 작용 및 장내의 유효 세균을 증식시키고 세포를 활성화시킨다. 또한 혈당 조절과 간 기능 개선 작용, 체내 중금속 및 오염 물질 배출 등의 효과가 있다. 인체에 가장 흡수되기 쉬운 키토산의 형태는 키토산올리고당이다(Encyber 두산백과사전 참조).

상기와 같이 인체에 유용한 효과를 나타내는 키토산은 여러 형태의 건강보조식품이나 식품첨가물로 이용되고 있다(대한민국 등록특허 제0471654호(2005.02.02) 등). 또한 키토산은 항균 효과도 갖고 있는 것으로 알려져 있으며 이를 포함한 항균제가 특허등록 되었다(대한민국 등록특허 제0164923호). 그러나 아직까지 우리가 섭취할 수 있는 작물 자체에 키토산을 함유시키려는 시도는 없었다. 이에 본 발명자는 라이조푸스 균주가 키토산을 저분자화시킬 수 있음을 발견하고, 이를 이용한 키토산 함유 식물의 생산방법을 발명하게 되었다.

본 발명은 라이조푸스 균주를 이용하여 키토산을 저분자화 시키는 방법 및 이를 이용하여 키토산이 함유된 식물을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

제 1 양태로 본 발명은 라이조푸스 균주를 이용하여 저분자 키토산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 상기 방법은 라이조푸스를 배양하는 단계; 젖산 용액에 키토산을 용해시키는 단계; 및 상기 키토산이 용해된 용액에 상기 라이조푸스 배양물을 섞는 단계를 포함한다. 상기 라이조푸스의 배양은 라이조푸스가 생장할 수 있는 어떠한 조건에서도 가능하나, 영양생장을 위한 배지와 조건에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양방법은 통상의 라이조푸스 균주 배양방법에 따라 이루어질 수 있다. 상기 키토산을 용해시키는 단계에 사용되는 키토산에는 제한이 없으며, 상업적으로 구매하거나 자연적으로 얻을 수 있는 어떠한 키토산도 이용가능하다. 바람직하게 상기 라이조푸스 균주는, 이에 제한되는 것은 아니나, 라이조푸스 올리고스포러스(Rhizopus oligosporus)이다.

제 2 양태로 본 발명은 상기 방법으로 생산된 저분자 키토산을 이용하여 키토산이 포함된 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 저분자 키토산을 희석하는 단계; 및 상기 희석시킨 키토산을 관주 또는 엽면살포하여 식물에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 식물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 토마토이다.

본 발명의 키토산 저분자화 방법을 사용하면, 공업적 방법에 의하지 않고, 친환경적으로 저분자화 키토산을 대량으로 생산할 수 있다. 이렇게 생산된 저분자 키토산은 건강보조식품, 의약품, 항균제 등의 용도로 사용될 수 있다. 또한, 상기 저분자 키토산을 식물에 살포함으로써 키토산이 함유된 식물을 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 다만 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 라이조푸스 균주의 배양

1. 사용 균주

본 실시예에 사용된 균주는 라이조푸스 올리고스포러스(Rhizopus oligosporus)이다. 상기 균주는 등록특허 제10-0713059호에서 사용한 신규의 라이조푸스 올리고스포러스 균주로서, 2004년 11월 25일 한국미생물 보존센터에 기탁되었다(기탁번호: KCCM 10624).

2. 균주의 특징

(1) 배양적 특징

상기 균주는 PDA(Difco)에서 배양이 가능하며, 25℃ - 30℃에서 배양된다.

(2) 형태적 특징

고체배지에서 배양하면 색이 하얗게 되고, 액체배지에서 배양하면 지름 0.5 cm 정도 크기의 알갱이 모양으로 자란다.

(3) 균사 및 포자의 특징

포자가 매우 작고 포자의 모습이 터지는 듯한 형태를 하고 있으며, 접합 포자낭을 가지고 있다.

3. 균주의 배양

상기 라이조프스를 500L 배양기를 사용하여 배양하였다. 이때 사용한 액체 배지는 10% 밀기울 우려낸 액과 1% 글루코스(Glucose)를 영양원으로 사용하였고, 저분자화 된 키토산 용액과 옥수수전분, 광물질, 황토 등을 항균력 증가를 위해 첨가하였다. pH를 7.0으로 조절하여 5일간 배양하였다. 종배양은 PDB(DIFCO)를 이용하여 삼각플라스크에서 48시간 동안 진탕배양하였다.

실시예 2: 저분자 키토산의 생산

1. 재료

키토산은 고점도, 중점도 및 저점도의 키토산을 모두 구입하여 실험하였으며(제조사), 젖산은 90% 용액과 식품첨가물(?)로 이루어진 것을 사용하 였다(제조사).

2. 방법

(1) 시료 제조방법

① 2% 젖산 용액 (970:22.2)을 만든다.

② 2% 젖산용액에 키토산을 천천히 넣으면서 용액에 잘 녹도록 섞어준다.

③ 비닐로 윗부분을 막고 하루 정도 방치해 둔다(30℃ 이하 조건에서 온도가 높을수록 빨리 녹는다).

④ 키토산이 완전히 녹아서 색이 맑아지면, 상기 실시예 1에 따른 라이조푸스 대사물질을 위에 뿌리고 잘 섞어준다(10% 이상의 농도로 뿌려주면 색이 빨리 묽어진다).

⑤ 키토산이 담긴 통의 윗부분을 공기가 잘 통하는 천(거즈)으로 봉하고, 규칙적 또는 불규칙적인 시간간격으로 잘 섞어준다.

⑥ 시간이 지남에 따라 색이 점점 묽어지는 것을 확인할 수 있다.

(2) 키토산 검출방법

1) 상기 혼합액을 5일(C-3), 6일(C-4 및 C-5), 9일(C-2) 및 10일(C-1)간 라이조푸스 대사물질과 혼합시켜 진탕된 용액을 시료로 사용하여, 키토산의 분자량을 측정하였다. 측정은 한국고분자시험연구소(주)에서 이루어졌으며, 시료처리 및 분석 조건은 다음과 같다.

2) 시료처리

① 시료전처리 : 바로 사용

② 시료용해상태 : 완전용해

③ 시료용액여과 : Target® 0.45㎛ NYLON filter

④ 안료/색상유무 : 해당사항 없음

⑤ 나노입자 유무 : 해당사항 없음

⑥ 기타 특이사항 : 없음

3) 분석조건

① 측정기기 : Waters GPC system

② 펌프 : Waters 515

③ 검출기 : Waters 2410 Differential Refractometer

④ 용매 : 10% Acetic acid + 0.1M NaCl

⑤ 컬럼(maker, model no.) : 2 × Jordi gel Polar Pack Wax Mixed-Bed

(7.8 × 300mm)

⑥ 온도 : 35℃

⑦ 유속 : 1.0 mL/min

⑧ 주입양 : 120 ㎕

⑨ 데이터처리 : EMPOWER

⑩ 표준시료 : Polysaccharide

3. 결과

(1) 키토산의 용해도

상기 키토산이 젖산에 녹는 속도는 고점도, 중점도, 저점도 순이었다. 고점도 키토산은 가장 빨리 녹고, 라이조푸스 대사물질을 넣은 후 묽어 지는 속도도 가장 빨랐지만, 용해시킬 수 있는 최고 농도는 5% 수준이었다. 저점도 키토산의 경우 용해가능한 농도는 상대적으로 높아졌으나 젖산에 녹는 속도가 현저히 떨어졌다. 중점도 키토산은 젖산에 녹인 최고농도가 10%였고, 젖산에 녹이는 시간은 하루 정도 걸렸다.

(2) 저분자 키토산의 검출

상기 5일(C-3), 6일(C-4 및 C-5), 9일(C-2) 및 10일(C-1)간 라이조푸스 대사물질과 혼합 진탕된 혼합액을 시료로 사용하여, 키토산의 분자량을 측정하였다(표 1). 상기 실험에서 사용한 구입한 키토산의 평균 분자량은 약 25만이었다. 상기 키토산이 저분자화되었음을 표 1에서 알 수 있다. 발효 10일차의 경우 분자량의 감소효과가 가장 컸으며 최저 평균분자량은 1296 이었다.

실시예 3: 키토산이 함유된 토마토의 생산

1. 방법

상기 저분자화된 키토산을 농도가 0.05%가 되도록 희석하여 토마토의 생육기간 중 1단 화방의 꽃이 필 무렵부터 관수가 필요한 시기에 관주하였다. 총 생육기간 중 5-6회 관주하였다. 또한 저분자화된 키토산의 농도가 1-2%가 되도록 희석하여 토마토 과실의 크기가 직경 1cm 내외 일 때부터 각 화방당　3-4회 엽면살포하였다. 본 실험의 토마토의 화방은 6단까지 재배하였다.

2. 결과

한국식품연구소(부산지소)에 키토산의 검출을 시험의뢰한 결과 0.3%의 키토산이 검출되었다(도 1). 이러한 결과는 키토산을 합성하지 못하는 토마토를 비롯한 다수의 작물들에 대해 본 발명에 따른 방법으로 키토산을 함유시킬 수 있음을 보여준다.

도 1은 본 발명의 생산방법에 따라 생산한 키토산 함유 토마토에 대해 한국식품연구소(부산지소)에 키토산의 검출을 시험의뢰한 결과이다.

Claims (3)

1. 삭제
2. 젖산 용액에 키토산을 용해시키는 단계;

   상기 키토산이 용해된 용액에 라이조푸스 올리고스포러스 KCCM 10624 배양물을 섞어 분자량 3600 이하의 저분자 키토산을 생산하는 단계; 및

   상기 저분자 키토산을 토마토에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 저분자 키토산 함유 토마토의 생산방법.
3. 삭제

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