CN103554293A - 一种活性低分子量岩藻聚糖的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种活性低分子量岩藻聚糖的制备方法及其用途，其方法为采用β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶水解岩藻聚糖，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液；再通过超滤膜分离得到5000-100000Da的低分子量岩藻聚糖。本发明的酶法制备低分子量岩藻聚糖生产工艺的反应条件温和，可控性强，低分子量岩藻聚糖的关键活性基团--硫酸根的保留度高；得到的低分子量岩藻聚糖具有很好的抗菌效果和抗菌稳定性。将制备的低分子量岩藻聚糖应用于抗菌，是一种安全、绿色的产品，可用于食品保鲜和储藏，减少农药或抗生素的使用，从而提高食品的安全性。

Description

一种活性低分子量岩藻聚糖的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于生物制剂领域，尤其涉及一种活性低分子量岩藻聚糖的制备方法及其在抗菌中的应用。

背景技术

“民以食为天”，随着全球经济的飞速发展，人们在吃的方面已发生了根本性的变化。在食品消费上会有更多的消费者不仅仅满足于数量上的充足，在食品的质量上会有更高的要求。滥用农药阻碍了现代农业的健康发展，餐桌污染也已成为危害人民健康的严重社会问题。无公害、无污染、优质的绿色食品将逐步成为大众食品。此外，抗生素的广泛使用，导致了临床上耐药菌的大量出现。据报道，目前病原菌对青霉素类的耐受率已达 70 %以上，对大多数喹诺酮类药物的耐受率也超过 50%，而在化脓感染性疾病中，多重耐药病原菌所致感染的发生率也持续升高。植物多糖由于其来源广，具有广泛的生理活性，如果能找到某些具有良好抗菌活性的多糖来代替抗菌素（农药）或作为抗菌增效剂，将具有重要的理论及应用意义。

岩藻聚糖（Fucoidan）是存在于褐藻（例如海带、马尾藻等）细胞壁基质中的一种水溶性硫酸多糖，含量高达3-5%，是海带中的主要生物活性成分之一。研究表明，多糖的生物活性与其取代基团数量、分子量大小、单糖组成等结构特征密切相关。对麒麟菜硫酸多糖及其酸解产物的抑菌活性的研究发现，未水解的硫酸多糖无抑菌活性，只有经水解后的硫酸多糖才具抑菌活性。此外，在抗肿瘤、抗HIV病毒及抗凝血活性方面，低分子岩藻聚糖的活性也明显好于大分子岩藻聚糖。因此，利用岩藻聚糖开发天然抗菌生物制剂的关键在于低聚岩藻聚糖的制备。

硫酸基团是岩藻聚糖的关键活性基团。从海洋小球藻中分离得到两种硫酸根含量不同的多糖，发现硫酸根含量高的多糖组分的抑菌效果要明显好于硫酸根含量较低的组分。国外学者从一种菊科植物（Tridax procumbens L.）中提取到硫酸多糖，研究发现其对海洋弧菌具有显著的抑菌作用。另外，硫酸基团含量高的岩藻聚糖在抗凝血、抗肿瘤等生物活性方面要显著高于硫酸基团含量较低的岩藻聚糖。因此，制备活性低聚岩藻聚糖的另一技术关键是对硫酸根的有效保护。

目前国内外用于制备低分子岩藻聚糖的技术主要采用酸、碱水解法及氧化法。这些方法虽然能够降低岩藻聚糖的分子量，但化学反应强烈，其后果是改变了多糖的立体结构，同时引起硫酸基团的部分脱落，最终降低了产品的生物活性甚至活性完全丧失。目前市面上有采用酶法制备低分子岩藻聚糖的。比如ZL200710008673.1保护了采用酸法和酶法（蛋白酶和果胶酶）制备低分子量岩藻聚糖，得到分子量1000-5000 Da的岩藻聚糖的方法；此方法在一定程度上能够实现高分子岩藻聚糖的低聚化，但专一性较差，产率较低，且酸降解的过程对硫酸根也存在一定程度的破坏。201310142757.X公开了一种采用复合酶制剂（包括果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶）制备得到岩藻聚糖的方法；ZL200910013017.X保护了一种用纤维素酶或果胶酶制备岩藻聚糖的方法；ZL200510047582.X保护了一种用纤维素酶和果胶酶制备岩藻聚糖的方法。以上酶法制备岩藻聚糖的方法主要是用于破坏褐藻细胞壁结构，使岩藻聚糖从由纤维素、半纤维素和果胶组成的胶束中释放出来，从而提高提取率，但未能解决岩藻聚糖低聚化的关键技术问题。

现有技术只是将岩藻聚糖从海藻中分离出来，此时多糖的分子量还很大，缺乏生理活性。

综上所述，开发一种高硫酸根保留度的活性低聚岩藻聚糖的生产工艺十分必要，将其代替抗菌素（农药）或作为抗菌增效剂应用于保鲜和储藏食品，对于提高食品安全具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高硫酸根保留度的活性低聚岩藻聚糖的生产工艺。

为实现上述目的， 本发明提供一种低分子量岩藻聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，

水解：岩藻聚糖干粉与β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶混合均匀，加入去离子水配成3重量%的糖溶液，加入4.0 mol/L HCl调节pH值至5.0，37 ℃下水解5 h 后，再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，加热至80 ℃并保温5 min，从而终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液。

分离：制备的不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液经过分子截留量为5000 Da和50000 Da的超滤膜分离，并收集5000-100000 Da的组分，喷雾干燥即可。

所述岩藻聚糖干粉与酶活力分别为30000 U/g的β-半乳糖苷酶和30000 U/g的β-葡萄糖苷酶按重量比为1000：0.5：0.5的比例混合。

所述岩藻聚糖干粉的制备方法为提取：80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，优选搅拌速度为2000 r/min，离心，优选3000 r/min, 10 min，取上清液，加入12 mol/L HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，优选3000 r/min,5 min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，优选5000 r/min, 10 min，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心，优选3000 r/min, 5 min，取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉。

所述分离步骤为将100 L含有所述不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离：蠕动泵以50 L/h的流量将所述不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液输送到分子截留量为100000 Da 中空改性聚氯乙烯膜进行分离，压力0.05 MPa，当溶液体积浓缩至1/5时，浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到溶液体积再次浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤100000 Da的溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤100000Da的溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000～100000Da的低聚岩藻聚糖浓缩液；该浓缩液经喷雾干燥后得到低分子量岩藻聚糖干燥粉状物。

所述的低分子量岩藻聚糖分子量范围为5000～100000 Da；硫酸根含量为26.9质量%；单糖组成为L-岩藻聚糖和D-甘露糖。

所述的低分子量岩藻聚糖用于抑菌的用途。优选为用于抑金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的用途。所述低分子量岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为0.2重量%和0.3重量%。

所述的低分子量岩藻聚糖用于食品保鲜和储藏的用途。

为实现上述目的， 本发明的技术解决方案是：

（1）80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，优选搅拌速度为2000 r/min，离心，优选3000 r/min, 10 min，取上清液，加入12 mol/L HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，优选3000 r/min,5 min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，优选5000 r/min, 10 min，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心，优选3000 r/min, 5 min，取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉；

（2）所述岩藻聚糖的结构特征为：该多糖是一种多糖硫酸酯，通过傅里叶-红外光谱分析，在840 cm^-1有吸收峰，说明硫酸基团结合在L-岩藻糖的C-4位点上，见图1。采用硫酸钡-悬浊法对岩藻聚糖的硫酸根含量进行了检测，其含量为29.6质量%。采用糖醇乙酸酯衍生-气相色谱法对该多糖进行单糖组成分析，表明该多糖是由L-岩藻糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖及D-甘露糖组成的杂多糖，见图2；

（3）称取（1）所制备的岩藻聚糖干粉与酶活力分别为30000 U/g的β-半乳糖苷酶和30000 U/g的β-葡萄糖苷酶按重量比为1000：0.5：0.5的比例混合均匀，加入去离子水配成3重量%(w/w)的糖溶液，加入4.0 mol/L HCl调节pH值至5.0，37 ℃下水解5 h 后，再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，加热至80 ℃并保温5 min，从而终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液；

（4）将（3）制备的不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液经过分子截留量为5000 Da和100000 Da的超滤膜分离，并收集5000-100000 Da的组分，喷雾干燥即可；优选将100 L含有不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离；蠕动泵以50 L/h的流量输送到分子截留量为100000 Da 中空改性聚氯乙烯膜进行分离，压力0.05 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到多糖溶液体积浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤100000 Da的多糖溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤100000 Da的多糖溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000～100000 Da的低聚岩藻聚糖组分；该浓缩液经喷雾干燥后得到低分子量岩藻聚糖干燥粉状物。

经糖苷酶水解、超滤分离、喷雾干燥得到的低分量岩藻聚糖的结构特征在于：经分子截留量为100000 Da和5000 Da的超滤膜分离得到分子量范围为5000-100000 Da的低分子量岩藻聚糖；采用糖醇乙酸酯衍生-气相色谱法对该多糖进行单糖组成分析，发现其单糖组成为L-岩藻聚糖和D-甘露糖（见图3），说明岩藻聚糖中的半乳糖苷键和葡萄糖苷键得到了充分的水解；采用硫酸钡-悬浊法对该低分子量岩藻聚糖的硫酸根含量进行了检测，其含量为26.9质量%。

本发明采用牛津杯法评价了从（4）中制备的低分子量岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌活性。通过实施例3可知，未经水解的岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都没有抑制活性，然而，经糖苷酶水解后得到的分子量范围在5000～100000 Da的低分子岩藻聚糖显示了较好的抑菌活性，0.5～3.0重量%浓度的低分子岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到了7～37 mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径达到了5～30 mm，显示了明显的量效关系。实施例4的最小抑菌浓度（MGC）实验发现，该低分子量岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为0.2重量%和0.3重量%，说明低分子量岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效果好于大肠杆菌；实施例5的抗菌稳定性实验发现，2.0重量%的低分子量岩藻聚糖在37 ℃恒温箱密封保存3个月后，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性分别从最初的抑菌圈直径36.8 mm和29.3 mm降到了32.2 mm 和28.3 mm，说明该低聚糖在储存过程中较为稳定，产品的抗菌作用在室温下至少可以保持二年。

本发明采用β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶联合水解岩藻聚糖，制备低分子量岩藻聚糖具有如下优点：（1）反应条件温和，可控度高，低分子岩藻聚糖产物分子量均一；（2）不引起活性基团—硫酸基团的脱落。从岩藻聚糖的结构分析可知，该多糖是由L-岩藻糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖等组成的杂多糖，因此以上糖苷酶可以对该杂多糖进行水解，从而得到高硫酸基团保留度的低聚岩藻聚糖。随着生物技术的发展，目前可以用于水解岩藻聚糖部分糖苷键的工具酶，如β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的生产技术难题已经解决，为制备高硫酸基团的低聚岩藻聚糖提高了技术保障。

本发明是建立在对岩藻聚糖分子结构充分认识的基础上，针对其糖苷结构中含有β-半乳糖苷和β-葡萄糖苷结构，选用β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶对其糖苷键进行靶向水解，同时采用超滤膜分离低聚岩藻聚糖，不仅能够有效实现对高分子岩藻聚糖的低聚化、防止硫酸根的脱落，且产率高。β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶是商品化的工业酶，为工业化生产提供了技术保障。

本发明的优点是，采用酶法制备低分子量岩藻聚糖的生产工艺，反应条件温和，可控性强，低分子量岩藻聚糖的关键活性基团--硫酸根的保留度高；将制备的低分子量岩藻聚糖应用于抗菌，是一种安全、绿色的产品，可用于食品保鲜和储藏，减少农药或抗生素的使用，从而提高食品的安全性。

附图说明

图1是本发明所涉及的未经水解的岩藻聚糖糖的红外光谱图；

图2是本发明所涉及的未经水解的岩藻聚糖糖的单糖组成气相色谱图；

图3是本发明所涉及的经水解后的岩藻聚糖糖的单糖组成气相色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：岩藻聚糖的制备

80 目海带粉按1:25（w/v）比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，搅拌速度为2000 r/min，离心（3000 r/min, 10 min），取上清液，加入HCl（12 mol/L）使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心（3000 r/min, 5 min），去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30%（v/v），过夜；离心（5000 r/min, 10 min），取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60%（v/v），过夜；离心（3000 r/min, 5 min），取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉。

将所得到的岩藻聚糖进行红外光谱分析，结果见图1和图2，图1中846 cm^-1处的吸收峰说明该多糖是一种硫酸多糖，且硫酸根结合在岩藻糖的C-4位点上；图2是岩藻聚糖糖的单糖组成气相色谱图；表明是未经水解的岩藻聚糖。

 实施例2：低分子量岩藻聚糖的制备

水解：将实施例1所得的岩藻聚糖干粉与酶活力分别为30000 U/g的β-半乳糖苷酶（上海佳和生物科技有限公司，型号：Amresco9031-11-2）和30000 U/g的β-葡萄糖苷酶（上海华蓝化学科技有限公司，型号：9001-22-3）按重量比为1000：0.5：0.5的比例混合均匀，加入去离子水配成3重量%(w/w)的糖溶液，加入4.0 mol/L HCl调节pH值至5.0，37 ℃下水解5 h 后，再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，加热至80 ℃并保温5 min，从而终止水解反应，得到不同分子片段的低分子量岩藻聚糖水溶液。

分离：将100 L含有不同分子片段的低分子量岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置（北京众益中和生物技术有限公司）进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离；蠕动泵以50 L/h的流量输送到分子截留量为100000 Da 中空改性聚氯乙烯膜进行分离（压力0.05 MPa），当多糖溶液体积浓缩至1/5时浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到多糖溶液体积浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤100000 Da的多糖溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤100000 Da的多糖溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当多糖溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000～100000 Da的低聚岩藻聚糖组分；该浓缩液经喷雾干燥后得到低分子量岩藻聚糖干燥粉状物（分子量为5000～100000 Da，硫酸根含量为26.9重量%）。

将所得到的低分子量岩藻聚糖岩藻聚糖进行气相色谱图分析，结果见图3。

 实施例3：低分量岩藻聚糖的抗菌实验

   本实验所涉及的金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）菌株（菌种编号为ACCCNO.02863，保藏日期为2007年10月20日）和大肠杆菌(Escherichia coli)菌株（菌种编号为ACCCNO.01623，保藏日期为2006年5月22日）由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供。

1. 实验方法

a．按实施例1的方法，从海带中提取岩藻聚糖；按实施例2的方法，分别制备分子量范围为≤5000 Da，5000～100000 Da和≥100000 Da的岩藻聚糖，硫酸钡-悬浊法检测硫酸根含量分别为28.2质量%、26.9质量%和25.3质量%；

b. 将步骤a制备的低分子量岩藻聚糖配制浓度为3.0重量%的多糖母液，过滤除菌，并将分子量范围为5000～100000 Da的低分子量岩藻聚糖制备一系列不同浓度的试样（0.5～3.0重量%）；

c.培养基的配制

采用双层培养基培养细菌。按质量百分比，培养基的配方如下：

底层培养基：蛋白胨1重量%，牛肉提取物0.3重量%， Nacl 0.5重量%，琼脂 1.5重量%，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液调pH至7.0～7.2，121 ℃高温灭25 min，得底层培养基；

上层培养基：蛋白胨1重量%，牛肉提取物0.3重量%，Nacl 0.5重量%，琼脂 1重量%，配好后用4.0 mol/L的NaOH溶液调pH至7.0～7.2，121 ℃高温灭25 min，得上层培养基；

  d.菌悬液的制备

用灭过菌的接种环挑取已经活化的待测菌，放入装有10 mL灭过菌的去离子水的试管中，充分震荡摇匀，逐步稀释至细菌浓度约为10⁶-10⁸ cfu/mL；

  e．抗菌活性的检测

在经121 ℃高温高压灭菌的培养皿中加入下层检测培养基 20 mL，摇匀，置水平位置待其凝固作为底层。取稀释的菌悬液1 mL于试管中，加入4 mL冷却至50~60 ℃上层培养基，倒入培养皿中摇匀使其均匀分布在底层培养基上，水平放置待其凝固后，在每个培养皿中等距离放置牛津杯。用移液枪分别吸取待检测多糖溶液200 uL注入牛津杯中，以蒸馏水作空白。在4 ℃低温下放置过夜，使待测多糖溶液充分渗透入培养基中。37 ℃培养24 h ，观察菌体生长情况，用游标卡尺测定抑菌圈直径。以抑菌圈的直径衡量抑菌效果。

 2.实验结果与讨论

表1  3 %浓度下不同分子量岩藻聚糖的抗菌活性

表2 不同浓度低分量(5000~100000 Da）岩藻聚糖的抗菌活性

本实施例对比了水解前后以及水解后的不同分量范围的岩藻聚糖的抗菌活性，结果表明，未经水解的岩藻聚糖在3.0重量%浓度下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都没有抑菌活性；当岩藻聚糖经β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶水解，并经超滤分离得到3个不同分子量范围的低聚岩藻聚糖（≤5000 Da，5000～100000 Da和≥100000 Da），分子量范围≤5000 Da和≥100000 Da的岩藻聚糖仅有微弱的抗菌活性，而分子量范围在5000～100000 Da的低分子量岩藻聚糖则显示了较好的抑菌活性，在3.0重量%浓度下，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈分别达到了36.5 mm和29.3 mm。同时，实验检测了三个分子量范围岩藻聚糖的硫酸根含量，分别为28.2质量%、26.9质量%和25.3质量%，说明岩藻聚糖的抗菌活性除了与高硫酸根含量有关，还与分子量大小密切相关，在同样硫酸根含量下，分子量过低或过高都不具备良好的抑菌活性。

本实施例进一步观察了分子量范围在5000～100000 Da的岩藻聚糖的抑菌活性与浓度之间的关系。在0.5～2.0重量%浓度范围的低分子岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性随着浓度的增加而增强，抑菌圈直径分别从7 mm和5.0 mm增加到了36.6 mm和29.5 mm，显示了明显的量效关系。然而，当低分子量岩藻聚糖的浓度从2.0重量%增加到3.0重量%时，对两种受试菌的抑菌活性没有明显的增加，说明2.0重量%浓度时低分子量岩藻聚糖的抑菌活性已经趋于平稳。这可能与浓度过大的岩藻聚糖水溶液的粘性较大有关，粘度过高并不利于岩藻聚糖的流动或扩散。因此，将低分子量岩藻聚糖应用于抗菌生物制剂的最大浓度应控制在≤2.0重量%。 

 实施例4：低分子量岩藻聚糖的最小抑菌浓度（MGC）实验

1.实验方法

a.将分子质量范围在5000～100000 Da的低聚岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行抑菌实验，岩藻聚糖的终浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%；

b. 抑菌活性评价方法采用实施例3的方法。将平板置37 ℃条件下，培养24 h后观察平板菌落生长情况，用游标卡尺测定抑菌圈直径，以抑菌圈的直径衡量抑菌效果。以出现抑菌圈的平板中岩藻聚糖的最小浓度为最低抑菌浓度（MGC）； 

2.实验结果与讨论

表3低分量(5000~100000 Da）岩藻聚糖的最小抑菌浓度

实验显示，分子量范围在5000～100000 Da的岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度（MGC）分别为0.2重量%和0.3重量%。

 实施例5：低分子量岩藻聚糖抑菌稳定性实验

1.实验方法

a. 采用37 ℃加速试验。将低分子量岩藻聚糖粉末装于铝箔袋中，真空包装密封后，置于37 ℃恒温箱中3个月；

b. 抑菌活性评价方法采用实施例3的方法；

 2.实验结果与讨论

表4低分量(5000~100000 Da）岩藻聚糖的抑菌活性稳定性

抗菌稳定性实验发现，2.0重量%的低分子量岩藻聚糖在37 ℃恒温箱密封保存3个月后，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性分别从最初的抑菌圈直径36.8 mm和29.3 mm降到了32.2 mm 和28.3 mm，说明该低聚糖在储存过程中较为稳定，产品的抗菌作用在室温下至少可以保持二年。

 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种低分子量岩藻聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，

水解：岩藻聚糖干粉与β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶混合均匀，加入去离子水配成3重量%的糖溶液，加入4.0 mol/L HCl调节pH值至5.0，37 ℃下水解5 h 后，再加入4 mol/L的NaOH水溶液调节pH值至中性，加热至80 ℃并保温5 min，从而终止水解反应，得到不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液；

分离：制备的不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液经过分子截留量为5000 Da和50000 Da的超滤膜分离，并收集5000-100000 Da的组分，喷雾干燥即可。

2.权利要求1所述低分子量岩藻聚糖的制备方法，其特征在于，所述岩藻聚糖干粉与酶活力分别为30000 U/g的β-半乳糖苷酶和30000 U/g的β-葡萄糖苷酶按重量比为1000：0.5：0.5的比例混合。

3.权利要求1所述低分子量岩藻聚糖的制备方法，其特征在于，所述岩藻聚糖干粉的制备方法为提取：80 目海带粉按重量体积比1:25的比例加入去离子水，80 ℃下提取3 h，提取过程中不断搅拌，优选搅拌速度为2000 r/min，离心，优选3000 r/min, 10 min，取上清液，加入12 mol/L HCl使之终浓度为0.1 mol/L；然后离心，优选3000 r/min,5 min，去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为30体积%，过夜；离心，优选5000 r/min, 10 min，取上清液，并加入无水乙醇，使之终浓度为60体积%，过夜；离心，优选3000 r/min, 5 min，取沉淀物，真空干燥后得到岩藻聚糖干粉。

4.权利要求1所述低分子量岩藻聚糖的制备方法，其特征在于，所述分离步骤为将100 L含有所述不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液采用中型超滤膜分离装置进行不同分子量低聚岩藻聚糖的分离：蠕动泵以50 L/h的流量将所述不同分子片段的低聚岩藻聚糖水溶液输送到分子截留量为100000 Da 中空改性聚氯乙烯膜进行分离，压力0.05 MPa，当溶液体积浓缩至1/5时，浓缩液补充去离子水到50 L，继续浓缩，直到溶液体积再次浓缩至1/5，停止超滤，收集分子截留量≤100000 Da的溶液；将装置的超滤膜换成分子截留量为5000 Da的中空改性聚氯乙烯超滤膜，将分子截留量≤100000Da的溶液进行超滤浓缩；蠕动泵的输送流量为50 L/h，分离压力为0.08 MPa，当溶液体积浓缩至1/5时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为5000～100000Da的低聚岩藻聚糖浓缩液；该浓缩液经喷雾干燥后得到低分子量岩藻聚糖干燥粉状物。

5.权利要求1-4任一所述的低分子量岩藻聚糖分子量范围为5000～100000 Da；硫酸根含量为26.9质量%；单糖组成为L-岩藻聚糖和D-甘露糖。

6.权利要求1-4任一所述的低分子量岩藻聚糖用于抑菌的用途。

7.权利要求6所述的用于抑金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的用途。

8.权利要求7所述的用于抑金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的用途，其特征在于，权利要求1-4任一所述低分子量岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为0.2重量%和0.3重量%。

9.权利要求1-4任一所述的低分子量岩藻聚糖用于食品保鲜和储藏的用途。

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