CN101225121A - 一种不饱和果胶低聚糖及复合生物防腐剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种不饱和果胶低聚糖的制备及应用，以及含有所述不饱和果胶低聚糖的复合生物防腐剂。从含有果胶质的果皮或果渣中提取果胶，加入由黑曲霉(Aspergillus niger－wz 003)发酵产生的果胶裂解酶，经离心分离、酵母除单糖、活性炭脱色、经聚醚砜膜、再生纤维素膜分离，得到含有所述不饱和果胶低聚糖的溶液，也可再经干燥得到所述不饱和果胶低聚糖的粉末。本发明利用自制果胶裂解酶进行生产，原材料广泛易得，成本低廉，提供的果胶低聚糖和复合生物防腐剂具有无毒、高效、广谱、适用范围广，可减少化学防腐剂的添加量。

Description

一种不饱和果胶低聚糖及复合生物防腐剂
(一)技术领域
本发明涉及一种不饱和果胶低聚糖及含有所述不饱和果胶低聚糖的复合生物防腐剂，属于食品添加剂生产及应用技术领域。
(二)背景技术
果胶是构成植物细胞壁的多糖之一，广泛存在于高等植物的根、茎、叶和果实的细胞壁中，果胶结构最主要的特征是含有α-(1-4)连接的D-半乳糖醛酸单元的直链。用无机酸特别是盐酸对果胶进行降解，是应用最早的降解果胶方法，但酸法水解缺乏专一性，同时产生复合反应，温度愈高，复合反应愈多，生成的有色物质多，颜色深，用酸量多，需中和碱量大，因之产生的灰分也多。酶解法是利用专一性或非专一性的果胶酶对果胶进行降解的方法。在整个降解过程中，无其他反应试剂加入，不至于发生其他副反应，优于化学反应降解过程。具有高度的专一性，副产物少，纯度高，糖色浅，因此减少了净化工序和净化剂的用量，与酸法相比，可以转化较高浓度的固形物，提高效率，减少损耗，降低成本，所得母液还可以利用，而且在常温常压下进行，设备工艺都比较简单。而使用酸酶法既节省费用，缩短时间，糖化率高，纯度高，糖液色浅，容易结晶析出，用酸量少，而且产品质量高。
随着经济和社会的进步，食品工业已成为国民经济的三大支柱之一。细菌、霉菌、酵母菌等微生物的侵袭通常是导致食品腐败的主要原因。现在广泛使用的防腐剂，主要是化学防腐剂。我国当前使用的三大类主要食品防腐剂是苯甲酸及钠盐、山梨酸及钾盐和对羟基苯甲酸酯类，但它们的特征决定了其使用的局限性，如：山梨酸及山梨酸钾在空气中稳定性差，而且生产成本高；苯甲酸对产酸菌的作用差，且有不良的味道。乳酸链球菌产生的乳酸链菌素和由纳塔尔链霉菌产生的纳塔霉素是目前国际上批准使用的两种生物食品防腐剂，并且我国卫生部食品监督厅也批准在国内使用，已列入食品添加剂使用卫生标准。但由于价格较高，且抑菌性能不具有广谱性，应用范围并不广泛，一般只适合复配使用，故亟待开发更有效的安全性高的廉价食品防腐剂。
(三)发明内容
本发明目的是无毒副作用、成本低、抑菌效果好的果胶低聚糖及含有果胶低聚糖的复合生物防腐剂。
本发明采用的技术方案是：
一种不饱和果胶低聚糖，聚合度为2～20，平均分子质量为400～4000，结构如式(I)所示：
Figure S2008100595187D00021
式(I)中，n为2～20的自然数，
R1、R2各自独立为：-H、CH3、-CH2CH3、或-CH2CH2CH3。
所述不饱和果胶低聚糖水解反应式如下：
Figure S2008100595187D00022
所述不饱和果胶低聚糖由如下方法制备得到：(1)将含有果胶质的果皮或果渣(如柑橘皮渣、柚皮、苹果渣、葵花盘等)溶于10～20倍质量的水中，调pH值1.0～2.0，70～90℃水浴中水解1～2h，抽滤得到果胶提取液；(2)往果胶提取液中加入50～200U/mL果胶裂解酶，40～60℃、pH3.0～7.0下水解3～24h；(3)水解产物经离心分离，取上清液，按10～30g/L上清液的加入量往上清液中添加酵母，25～40℃发酵12～48h；(4)发酵液调pH值3.0～4.0，于40～60℃下活性炭脱色20～40min，依次经分子量为10000、5000的聚醚砜膜、分子量为3000、1000的再生纤维素膜分离，得到含有所述不饱和果胶低聚糖的溶液，再经干燥得到所述不饱和果胶低聚糖的粉末。应用时也可直接使用含有所述不饱和果胶低聚糖的溶液，无须转换为干燥粉末。上述方法制得的不饱和果胶低聚糖，其聚合度在2～26，平均分子质量在400～5000之间，经HPLC检测得到聚合度2～20的不饱和果胶低聚糖含量41.4％。
现有方法中，采用一次水解，并对果胶低聚糖进行膜分离，水解不完全，分离过程中损失较多，产品得率比较低，本发明采用酶膜反应器连续反应或分批连续反应，从而提高了果胶低聚糖的得率，为工业化生产打好了基础。本发明果胶低聚糖可作为一种新型的天然生物防腐剂，促进了我国食品添加剂工业的发展，同时又扩大了果胶低聚糖的应用范围，解决了柑橘皮渣、柚皮、苹果渣、葵花盘等果皮废渣的再利用问题。
所述果胶裂解酶可采用市购果胶酶，或者由黑曲霉经发酵培养获得。
黑曲霉种子斜面培养基可选用常见适用于黑曲霉的培养基，本发明中种子培养基终浓度组成为：NaNO3 2g/L，K2HPO4 1g/L，KCL 0.5g/L，MgSO40.5g/L，FeSO4 0.01g/L，蔗糖3g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH自然。121℃灭菌20min。
发酵培养可为液态发酵，也可为固态发酵，可选用本领域常见适用于黑曲霉的培养基。
本发明中，液态发酵培养基终浓度组成：麸皮10～100g/L，玉米粉10～50g/L，酵母膏10～100g/L，胡萝卜10～50g/L，CaCO3 10～30g/L，溶剂为水，起始pH7.0～7.5，灭菌、冷却，接种黑曲霉种曲，25～50℃、150～250r/min条件下培养24～96h，过滤得到果胶裂解酶的粗酶液。
固体发酵培养基终浓度每100g质量组成如下：麸皮15～30.0g，桔皮粉5～10.0g，NaNO3 5～10.0g，KH2PO4 0.1～1.0g，余量为水，灭菌、冷却，接种黑曲霉种曲，于25～55℃下培养24～96h，加入质量为培养基质量5～8倍的生理盐水，于120rpm、40℃水浴摇床中浸提2～4h，过滤得到果胶裂解酶的粗酶液。可将粗酶液直接应用于果胶低聚糖的酶法制备，也可干燥制成酶粉再应用于果胶低聚糖的制备。
本发明所述的果胶低聚糖可防腐剂应用于食品的防腐。具体的，所述应用为：以所述果胶低聚糖作为天然食品防腐剂添加到果汁类、牛奶、发酵制品等食品中，所述果胶低聚糖添加质量与食品质量的质量比为1∶100～1∶1000。也可将所述果胶低聚糖与现有化学防腐剂复配用于食品防腐，以减少化学防腐剂的用量。
单一使用任何一种防腐剂都不能对食品中的真菌、细菌、酵母菌等均有杀灭效果，也就是说各种杀菌剂都有一定的杀菌谱。一种食品中含有的腐败菌，有时不是一种防腐剂都能抑制的。
经实验证实：在酸性条件下，果胶低聚糖和乳酸链球菌素复配，抑菌效果好，并且可降低成本；果胶低聚糖和山梨酸钾复配，抑菌效果良好，可减少山梨酸钾用量，解决目前国内经常出现的食品中防腐剂超标问题，达到国家标准防腐剂含量指标要求。
本发明还涉及一种复合生物防腐剂，由所述的果胶低聚糖与下列化学防腐剂中的一种或多种复合而成：①苯甲酸钠、②山梨酸钾、③乳酸链球菌素，所述果胶低聚糖与化学防腐剂质量之比为0.5～20∶1。
优选的，所述复合生物防腐剂为果胶低聚糖与山梨酸钾质量比6～15∶1的混合物。
优选的，所述复合生物防腐剂为果胶低聚糖与乳酸链球菌素质量比0.6～5∶1的混合物。
本发明提供了一种生物防腐剂——果胶低聚糖，该防腐剂无毒、高效、广谱、适用范围广，可以和化学防腐剂(苯甲酸钠、山梨酸钾、乳酸链菌素等)一起复配使用，效果更好。
本发明原材料是果胶、橘皮或果胶质含量较高的果渣，如苹果渣，葵花盘等，广泛易得，成本低廉。可利用微生物发酵，无毒副作用。以黑曲霉(Aspergillus niger-wz 003)为出发菌种通过固态发酵、液态发酵两种方法制备低成本高活性的果胶裂解酶进行生产，降低投入成本。
酸法提取粉碎漂洗后的果渣，水解方法简单易行，产品得率高。用无机酸特别是盐酸对果胶进行降解，缺乏专一性，同时产生复合反应，温度愈高，复合反应愈多，生成的有色物质多，颜色深，用酸量多，需中和碱量大，因之产生的灰分也多。酶解法具有高度的专一性，副产物少，纯度高，糖色浅，因此减少了净化工序和净化剂的用量，与酸法相比，可以转化较高浓度的固形物，提高效率，减少损耗，降低成本，所得母液还可以利用，而且在常温常压下进行，设备工艺都比较简单。而使用酸酶法既节省费用，缩短时间，糖化率高，纯度高，糖液色浅，容易结晶析出，用酸量少，而且产品质量高。
一定条件下向果胶提取液中加入市售果胶酶或自制果胶裂解酶直接进行酶解，降低酶粉成本，方法简单可行。果胶水解液经分子量为10000，5000的聚醚砜膜，分子量为3000，1000的再生纤维素膜的酶膜反应器分离后，聚合度在2～26，平均分子质量在400～4000，此外通过连续反应或分批反应也可提高低聚糖得率。
果胶低聚糖属天然防腐剂，可以和化学防腐剂(苯甲酸钠，山梨酸钾，乳酸链菌素等)一起复配使用，从而减少化学防腐剂的添加量，而且复配时配方合理，工艺简单。
另外，果胶低聚糖还可以促进双歧杆菌的生长繁殖，且双歧杆菌的增殖效果随跟水解液浓度的增加而增加。
实验显示果胶低聚糖除了可以抑制致病菌产生外，还有多种生理活性：如作为植物调节剂促进植物生长、促进双歧杆菌的增长、调节胃肠内的菌群结构、增强肌体免疫抗病力、降血脂、降胆固醇、抗龋齿性、促进矿物质吸收等等。单一使用某一种防腐剂添加量的增多，虽然可以达到防腐的目的，但使食品内部和感观性质都受到了破坏，综合的防腐系统则是利用可以影响这个系统的各种因素，尽管那个因素作用都不激烈，但总的结果是制止了有害菌的活动，达到了防腐的目的和效果。
本发明有益效果主要体现在：提供了成本低、无毒副作用、防腐性能好的果胶低聚糖，也可将果胶低聚糖与化学防腐剂复合使用提高化学防腐剂的防腐效果，既解决了生物防腐剂价格高和抑菌性能不具有广谱性的缺点，又解决了化学防腐剂超标问题。
(四)附图说明
图1为0.84％果胶低聚糖抑菌效果照片；
图2为0.5％的乳酸链球菌素抑菌效果照片；
图3为0.84％果胶低聚糖和0.5％的乳酸链球菌素体积比1∶1复合后抑菌效果照片；
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
种子斜面培养基：NaNO3 2g，K2HPO4 1g，KCL 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖3g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。121℃灭菌20min。接种黑曲霉(Aspergillus niger-wz 003)(浙江工业大学生物工程研究所提供)，35℃培养20h，获得斜面菌种。
实施例2：
液态发酵培养基组成：麸皮60g，玉米粉40g，酵母膏15.0g、胡萝卜12.0g，CaCO3 10.0g，水补足至1000mL，起始pH7.0，250mL三角瓶，装液量100mL，0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min，冷却后每瓶接入一环黑曲霉斜面菌种，发酵温度30℃、转速200r/min条件下培养48h，过滤得粗酶液，测得其中果胶裂解酶的酶活为375.3U/ml，为基础发酵条件下的6.225倍。
实施例3：
固态发酵培养方法如下：麸皮4.0g，桔皮粉2.0g，NaNO3 1.28g，KH2PO4 0.12g，加水100mL，分装于容器中，装料厚度为2.5～3.0cm，0.1Mpa蒸汽压力灭菌30min，冷却后接入一环黑曲霉斜面菌种，于40℃下培养72h后，在三角瓶中加入相当于培养基总量6倍(w/w)的生理盐水，放置于120rpm，40℃水浴摇床中浸提2h，经纱布初滤后，用一层滤纸过滤得到粗酶液。测得其中果胶裂解酶的酶活为328.2U/ml，为基础发酵条件下的5.443倍。
实施例4：
橘皮酸酶法水解条件：10g橘皮渣溶于100ml水中，调pH1.2，80℃水浴中，水解1h。抽滤得到果胶提取液，调整pH6.8，加入40mL的实施例2所得果胶裂解酶粗酶液，于40℃下水解4h，得到还原糖的量为2272ug/mL，低聚糖得率为42％。
实施例5：
苹果渣酸酶法水解条件：15g苹果渣溶于100ml水中，调pH1.5，90℃水浴中，水解1h。抽滤得到果胶提取液，调整pH5.2，加入45mL的实施例2所得果胶裂解酶粗酶液，于45℃下水解6h，得到还原糖的量为1687ug/mL，低聚糖得率为36％。
实施例6：
葵花盘酸酶法水解条件：12g葵花盘溶于100ml水中，调pH1.2，沸水浴中，水解1h。抽滤得到果胶提取液，调整pH4.8，加入25mL的实施例2所得果胶裂解酶粗酶液，于40℃下水解4h，得到还原糖的量为1196ug/mL，低聚糖得率为33％。
实施例7：
按照实施例2方法，制得粗酶液，再喷雾干燥，得果胶裂解酶粉末(8000～10000U/g)，备用。
2g高酯果胶(衢州果胶有限公司)溶于pH6.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液100mL中，加入自制果胶裂解酶(8000～10000U/g)0.25g，40℃条件水解210min左右，可以获得抑菌效果较好的不饱和果胶低聚糖。
实施例8：
制备不同聚合度的果胶低聚糖：用20g/L的酵母(哈尔滨马利酵母有限公司)接种量在30℃下发酵24h，分别除去实施例4～6所得果胶水解液中的部分单糖。过滤后得到的滤液再经活性炭脱色，脱色率为46.5％。过滤后得到的果胶低聚糖液，经过分子量为10000，5000的聚醚砜膜，分子量为3000，1000的再生纤维素膜，得到聚合度2～26的果胶低聚糖。聚醚砜膜的截流率分别是60％，84.4％；再生纤维素膜的截流率分别是56.25％，61.4％；经酶膜反应器分离后低聚糖得率进一步得到提高。分离后的果胶水解液经HPLC法来确定低聚糖的含量及分子量范围。HPLC和凝胶柱检测得到果胶低聚糖中聚合度7以上的居多，聚合度范围为2～20的果胶低聚糖含量为42％，在35～40℃的条件下，旋转蒸发，得到果胶低聚糖浓缩液。
实施例9：
果胶低聚糖对各试验菌的最小抑菌浓度：将待测抑菌果胶低聚糖浓缩液进行倍比稀释，各取1.0mL加入到含2.0mL培养基(牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化钠5g；水1000mL；pH4.0)的无菌试管中，接入1.0mL实验菌悬液，充分振荡均匀，使各管中含菌量约为107～108cfu/ml，培养1～2天。培养完成后观察试管内溶液是否清亮：取溶液开始变为混浊的梯度前后的几个样品，分别移取500μL至平板培养基(牛肉膏3g；蛋白胨10g；氯化钠5g；琼脂15～20g；水1000mL；pH7.0～7.2)，涂布培养观察有无菌落生长；以无菌生长的药物最低浓度为MIC。另设含等体积不添加果胶低聚糖液的缓冲液做阴性对照；及不添加菌悬液，只添加无菌水和果胶低聚糖液的培养基空白对照，每种处理做3个平行。
表1：果胶低聚糖对各试验菌的最小抑菌浓度(pH4.2)
菌种     果胶低聚糖浓度(％，w/w)
    0.042     0.105    0.210    0.420    0.630    0.840
  金黄色葡萄球菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌     +++     +-++    ---    ---    ---    ---
注：“+”表示样品混浊长菌，“-”表示样品清亮不长菌，“+-”表示有少许悬浮物，难以判断是否有活菌存在。
由表1知，果胶低聚糖的最低抑菌浓度范围在0.105％～0.210％之间。进一步细分浓度并进行平板涂布实验得果胶低聚糖对三类菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.105％，0.147％，0.168％。
实施例10：
果胶低聚糖与市售防腐剂最低抑菌浓度的比较：
测得市售食品防腐剂的最低抑菌浓度，并与果胶低聚糖比较如表2所示。
表2：市售食品防腐剂最低抑菌浓度(pH4.2)
防腐试剂   最低抑菌浓度(％，w/w)
  大肠杆菌   金黄色葡萄球菌   枯草芽孢杆菌
  苯甲酸钠山梨酸钾乳酸链球菌素果胶低聚糖   0.010.051.50.16   0.010.0250.850.12   0.010.050.50.184
实施例11：
果胶低聚糖与市售防腐剂抑菌活性的比较(杯碟法)：试验菌株经活化培养后，用无菌移液枪移取10ml无菌生理盐水至斜面试管内，在无菌操作条件下用接种环小心将菌苔洗下。倒入带有玻璃珠的烧瓶内，将菌悬液均匀打散。并用10倍稀释法将菌液稀释，采用平板计数法计数(见国标GB478912-1994)，配制菌浓度为1×107～8cfu/ml的菌悬液。
将灭过菌的培养基倒入培养皿，待其冷却凝固。用无菌移液枪各吸取500μL菌悬液到平板上，涂布均匀；平稳等距离放置3个无菌牛津杯于培养基表面上，各移取200μL一定浓度的抑菌剂加入牛津杯，以相应的缓冲液作为对照。每种浓度重复做3次，最后将平皿放置于相应温度的培养箱培养，细菌37℃，真菌28℃。1～2天后取出培养皿，将剩余药液吸出，测定抑菌圈的直径大小，取实验平均值。
表3：比较果胶低聚糖与市售食品防腐剂的抑菌活性
样品   浓度(％，w/w)   抑菌圈直径(cm)
  大肠杆菌   金黄色葡萄球菌   枯草芽孢杆菌
果胶低聚糖   0.841.682.52   1.461.632.10   1.431.802.21   1.251.651.92
苯甲酸钠   0.10.250.5   1.601.752.08   1.351.702.15   1.501.752.1
山梨酸钾   0.10.250.5   1.321.672.20   0.911.511.72   1.431.601.91
乳酸链球菌素   0.10.250.5   1.101.221.50   0.881.272.10   1.151.251.54
  对照(pH4.2缓冲液)   1.00   1.05   0.75
实施例12：
果胶低聚糖与乳酸链球菌素的复配效果：将含0.84％(w/w)的果胶低聚糖溶液与0.5％(w/w)的乳酸链球菌素(Nisin)以体积比1∶1复合对大肠杆菌进行抑菌圈实验，发现抑菌圈大大增加，结果如图1～3所示，含0.84％的果胶低聚糖溶液抑菌圈直径1.46cm(图1)，0.5％的乳酸链球菌素抑菌圈直径1.50cm(图2)，复合后抑菌圈直径为2.20cm(图3)。
实施例13：
果胶低聚糖对桔汁的防腐效果比较：在桔子汁或牛奶之中添加本身含量为42％(w/w)的果胶低聚糖、和市售食品防腐剂至不同浓度，对鲜榨桔子汁进行防腐实验。每隔24h观察一次，共观察5天。肉眼观察桔子汁的清亮度，结果如表5所示。
表5：桔子汁的清亮度变化
  样品   浓度(％，w/w)   桔子汁清亮度
  24h   48h   72h   96h   120h
果胶低 0.21 - - - - +-
  聚糖   0.84   -   -   -   -   +-
  1.68   -   -   -   -   -
苯甲酸钠   0.02   -   -   +   ++   +++
  0.2   -   -   -   +-   +
  2   -   -   -   -   -
山梨酸钾   0.02   -   -   +   ++   +++
  0.2   -   -   -   +-   ++
  2   -   -   -   -   +-
  乳酸链球菌素   0.05   -   +-   ++   +++   ++++
  0.5   -   -   +   ++   +++
  1.0   -   -   +   ++   +++
  5.0   -   -   -   -   +
  对照(pH4.2缓冲液)   +-   +   ++   ++++   ++++
注：“-”表示清亮透明，“+-”表示略微混浊，“+”表示混浊。且“+”越多，表示杂菌越多，试样越混浊。
桔子汁在试管中培养两天后，把稀释后的桔子汁涂到平板上，再放在培养箱中待观察，数菌落数。结果如表6所示：
表6：桔子汁防腐实验的菌落数变化
  样品   浓度(％，w/w)   菌落数变化值cfu/mL
  24h   48h   72h
果胶低聚糖   0.25   0   600   2000
  0.5   0   500   900
  0.75   0   200   400
  1.0   0   100   300
  1.25   0   100   200
  1.5   0   0   100
  山梨酸钾   0.05   0   500   1100
  乳酸链球菌素   0.02   0   600   2900
  对照(pH4.2缓冲液)   10000   30000   30000
实施例14：
果胶低聚糖对牛奶的防腐效果比较：无菌试管中加入10ml牛奶，再加入抑菌药物至一定浓度，相应的缓冲液作为对照，每种浓度做3个平行，巴氏灭菌30min。最后放于37℃培养箱中。牛奶培养2天后，用100倍、1000倍稀释法将牛奶稀释，用无菌移液枪各吸取200μL牛奶到平板上，涂布均匀。将平皿放置于37℃培养箱中，待1～2天后数菌落数。结果如表7所示：(牛奶的pH是6.5)
表7：牛奶防腐实验的菌落数变化
  样品   浓度(％，w/w)   菌落数变化值cfu/ml
  24h   48h   72h
  果胶低聚糖   0.5   100   300   2400
  1.0   0   400   2400
  山梨酸钾   0.05   100   1200   2300
  乳酸链球菌素   0.02   100   500   1100
  对照(pH4.2缓冲液)   30000   60000   80000
实施例15：
果胶低聚糖与化学防腐剂复配后对桔子汁的抑菌：在桔子汁10mL中分别加入果胶低聚糖与化学防腐剂，使其浓度分别为：(1)质量分数0.25％或0.5％的果胶低聚糖；(2)质量分数0.25％的果胶低聚糖与质量分数0.025％的山梨酸钾复合；(3)质量分数为0.05％的山梨酸钾；(4)质量分数0.125％的果胶低聚糖与质量分数0.01％的乳酸链球菌素复合；(5)质量分数0.02％的乳酸链球菌素；之后将桔子汁巴氏灭菌30min，放于37℃培养箱中，培养1～3天，用100倍、1000倍稀释法将桔子汁稀释，用无菌移液枪各吸取200μL桔子汁到平板上，涂布均匀。将平皿放置于37℃培养箱中，待1～2天后数菌落数。结果如表8所示：
表8：桔子汁的防腐复配实验
样品 浓度(％，w/w)   菌落数变化值cfu/ml
  24h   36h   72h
果胶低聚糖   0.25   0   600   2000
  0.5   0   500   900
  果胶低聚糖+山梨酸钾 0.25+0.025 0 400 1000
  山梨酸钾   0.05   0   500   1100
  果胶低聚糖+乳酸链球菌素 0.125+0.01 0 600 2600
  乳酸链球菌素   0.02   0   600   2900
  对照(pH4.2缓冲液)   10000   30000   30000
实施例16：
将100mL浓度为12％(w/w)果胶(衢州果胶有限公司)H0、经过酶解、酵母发酵、树脂吸附黄酮、活性炭脱色、酒精沉淀分别得到的H1、H2、H3、H4、H5或稀释或浓缩最后分别定容至200ml、100ml和50ml。再以这些作为样品等量的加入到双歧杆菌试验培养基中。以双歧杆菌基础培养基做对照观察研究各水解液对促进双歧杆菌生长的影响。结果见表9。
表9：双歧杆菌在试验培养基上培养48h后的结果
  样品液编号   样品液稀释倍数   各样品的pH值   样品液中还原糖浓度(mg/ml)   菌落生长级别
H0   *2*1   4.244.0   0.0650.131   ++
  *0.5   3.83   0.260   +
H1   *2*1*0.5   3.834.04.2   0.631.262.45   +++++
H2   *2*1*0.5   3.253.203.10   0.3250.651.20   ++++++++
H3   *2*1*0.5   3.503.423.35   0.3050.611.15   ++++++++
H4   *2*1*0.5   3.853.723.65   0.2860.571.02   ++++++++
H5   *2*1*0.5   3.953.803.72   0.2650.531.00   ++++++++
  双歧杆菌基础培养基   6.80   0.00   ++
注：*2稀释一倍，*1不稀释也不浓缩，*0.5浓缩一倍，+稀疏、++均匀、+++致密
由表9可知，跟双歧杆菌基础培养基相比加有果胶水解液的双歧杆菌试验培养基更能促进双歧杆菌的生长繁殖，且双歧杆菌的增殖效果随跟水解液浓度的增加而增加。

Claims (8)

1.一种不饱和果胶低聚糖，聚合度为2～20，平均分子质量为400～4000，结构如式(I)所示：
Figure S2008100595187C00011
式(I)中，n为2～20的自然数，
R1、R2各自独立为：-H、-CH3、-CH2CH3、或-CH2CH2CH3。
2.如权利要求1所述的不饱和果胶低聚糖，其特征在于所述不饱和果胶低聚糖由如下方法制备得到：(1)将含有果胶质的果皮或果渣溶于10～20倍质量的水中，调pH值1.0～2.0，70～90℃水浴中水解1～2h，抽滤得到果胶提取液；(2)往果胶提取液中加入50～200U/mL的果胶裂解酶，40～60℃、pH3.0～7.0下水解3～24h；(3)水解产物经离心分离，取上清液，按10～30g/L上清液的加入量往上清液中添加酵母，25～40℃发酵12～48h；(4)发酵液调pH值3.0～4.0，于40～60℃下活性炭脱色20～40min，依次经分子量为10000、5000的聚醚砜膜、分子量为3000、1000的再生纤维素膜分离，得到含有所述果胶低聚糖的溶液，再经干燥得到所述不饱和果胶低聚糖的粉末。
3.如权利要求2所述的不饱和果胶低聚糖，其特征在于：所述果胶裂解酶由黑曲霉经液体发酵培养获得；液体发酵培养基终浓度组成：麸皮10～100g/L，玉米粉10～50g/L，酵母膏10～100g/L，胡萝卜10～50g/L，CaCO3 10～30g/L，溶剂为水，起始pH7.0～7.5，灭菌、冷却，接种黑曲霉种曲，25～50℃、150～250r/min条件下培养24～96h，过滤得到果胶裂解酶的粗酶液。
4.如权利要求2所述的不饱和果胶低聚糖，其特征在于：所述果胶裂解酶由黑曲霉经固体发酵培养获得；固体发酵培养基终浓度每100g质量组成如下：麸皮15～30.0g，桔皮粉5～10.0g，NaNO3 5～10.0g，KH2PO40.1～1.0g，余量为水，灭菌、冷却，接种黑曲霉种曲，于25～55℃下培养24～96h，加入质量为培养基质量5～8倍的生理盐水，于120rpm、40℃水浴摇床中浸提2～4h，过滤得到果胶裂解酶的粗酶液。
5.一种复合生物防腐剂，由如权利要求1所述的不饱和果胶低聚糖与下列化学或生物防腐剂中的一种或多种复合而成：①苯甲酸钠、②山梨酸钾、③乳酸链球菌素，所述果胶低聚糖与所述化学或生物防腐剂质量之比为0.5～20∶1。
6.如权利要求5所述的复合生物防腐剂，其特征在于所述复合生物防腐剂为不饱和果胶低聚糖与山梨酸钾质量比6～15∶1的混合物。
7.如权利要求5所述的复合生物防腐剂，其特征在于所述复合生物防腐剂为不饱和果胶低聚糖与乳酸链球菌素质量比0.6～5∶1的混合物。
8.如权利要求1或2所述的不饱和果胶低聚糖在促进双歧杆菌增殖中的应用。
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