CN114271277B

CN114271277B - 一种利云型果聚糖的应用

Info

Publication number: CN114271277B
Application number: CN202111622199.8A
Authority: CN
Inventors: 梁明祥; 水晨; 连丹
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-05-19
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114271277A

Abstract

本发明提供了一种利云型果聚糖的应用。本发明所述的果聚糖是一种由士麦那盐单胞菌(Halomonas smyrnensis)AAD6(T)合成的利云型果聚糖，其本身无毒无害也不具备抑菌活性，但可以激活植物免疫力从而提高抵抗赤霉病和纹枯病的能力。同时该利云型果聚糖可溶于水，使用时无需添加任何有机溶剂，符合绿色农药的要求。

Description

一种利云型果聚糖的应用

技术领域

本发明提供一种利云型果聚糖的应用，属于绿色农药领域。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是我国主要的粮食类作物，在我国占有重要地位，其种植面积占全国耕地面积的22％-30％，主要集中在黄河流域下游地区。随着小麦播种面积的逐年减少，保障小麦产量显得尤为重要。赤霉病(Fusarium head blight)是导致小麦减产的重要病害之一，又被称为烂穗病，由多种镰刀菌引起，整个生育期均可发生，导致苗腐、茎腐、穗腐。流行年份，赤霉病使小麦感病率达50-100％，减产10-20％，其产生的毒素还间接威胁人畜健康。

水稻(Oryza sativa)是确保我国粮食安全的压舱石，其种植面积占世界第二，产量占世界第一。据统计我国65％以上的人口以稻米为主食，年消费量达1.3亿吨，且随着人口数量的增长，稻米的需求量将持续增长。纹枯病(Rice sheath blight)和稻瘟病(Riceblast)是我国水稻的主要病害，其中纹枯病又称云纹病，由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起，广泛分布世界各稻区。在我国纹枯病发生普遍，长江流域和南方稻区为害严重，近年来北方稻区发病趋势逐年上升，导致减产10-30％，严重可达60％以上，是我国目前水稻生产上发生面积最广、为害最重的病害。稻瘟病又称稻热病、叩头瘟等，由半知菌亚门的稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引起。稻瘟病遍布世界稻区又以亚洲、非洲为害最重，发病期导致水稻减产10-20％，严重时可达40-50％，部分地区甚至颗粒无收。

农药是农业生产应用中的一种投入品，是国民经济的重要战略物资，在消除病虫草害、保障农产品供给方面发挥着重大的作用。但是农药的过度使用也给农产品质量安全和生态环境带来了严峻的挑战。因此，新型农药的创制是我国高毒农药品种替代、农药零增长和减肥减药战略实施的保障。在绿色发展理念的引导下，绿色农药已是大势所趋，也取得了显著的进展。绿色农药主要通过杀菌或提高植物免疫力来促进植物健康生长且对环境没有危害，其中提高植物抵抗力的绿色农药又被称为植物免疫激活剂，由于其不具备直接的杀菌活性，病菌不易产生抗药性，防治谱广。据报道，植物免疫激活剂主要包括有机酸类、无机化合物类、寡糖或多糖类和蛋白多肽类。

利云型果聚糖是属于寡糖或多糖类的一种植物免疫激活剂，主要是果糖间以β(2-6)糖苷键为主链、β(2-1)为部分侧链连接而成的一种多糖类生物高分子，广泛存在于禾本科植物中，也是多数微生物细胞壁或胞外多糖的主要成分。本发明所述的利云型果聚糖为微生物源，由士麦那盐单胞菌(Halomonas smyrnensis)AAD6(T)合成，其本身不具备抑菌活性，但能提高植物抵抗病菌的能力，促进植物健康生长。因此，利云型果聚糖在生物防治和绿色农药的应用上具有广阔的前景。

发明内容

为确保我国粮食安全和解决现有农药污染严重、残效期长等弊端，本发明提供一种提高植物抵抗病害能力的利云型果聚糖，可直接溶于水，不添加任何有机溶剂，对环境无污染，防治谱广，可应用于纹枯病和赤霉病等病害的防治。

本发明提供以下技术方案：

一种利云型果聚糖在提高植物抵抗病菌的能力中的应用，所述的病菌选自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F0609、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-1A；所述的利云型果聚糖由士麦那盐单胞菌(Halomonas smyrnensis)AAD6(T)的发酵液中提取获得,利云型果聚糖的制备参考Burak Adnan Erkorkmaz的方法(Burak Adnan Erkorkmazet al，2018DOI:10.1007/s00449-018-1952-x)。

一种利云型果聚糖在制备植物免疫激活剂中的应用，所述的植物免疫激活剂针对的病菌选自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)F0609、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)AG-1A；所述的利云型果聚糖由士麦那盐单胞菌(Halomonas smyrnensis)AAD6(T))的发酵液中提取获得,利云型果聚糖的制备参考Burak Adnan Erkorkmaz的方法(BurakAdnan Erkorkmazet al，2018DOI:10.1007/s00449-018-1952-x)。

一种利云型果聚糖水剂，含有如下重量体积百分含量(g/100mL)的组分：利云型果聚糖0.5％、水补充至100％。

作为本发明的一种优选，所述的利云型果聚糖水剂中还包含0.0001％的Tween-20。

本发明取得以下有益效果：

本发明提供的利云型果聚糖水剂，不添加任何有机试剂，对环境无污染，对植物无危害，对粮食生产安全。

本发明提供的利云型果聚糖水剂，以浸种、喷施、浸种+喷施三种方式均能有效的控制赤霉病和纹枯病病害，在防治赤霉病和纹枯病中具有优异的效果。

本发明所述抑菌试验表明，利云型果聚糖本身不存在抑菌、杀菌作用，因此病原菌对其不易产生抗药性，防治谱广。

附图说明

图1禾谷镰刀菌侵染叶片病斑面积和疾病严重等级分类

图2立枯丝核菌侵染叶片疾病严重等级分类

图3稻瘟病菌侵染叶片病斑面积和疾病严重等级分类

图4利云型果聚糖对三种病原菌的抑菌效应

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1利云型果聚糖的制备

利云型果聚糖的制备参考Burak Adnan Erkorkmaz的方法(Burak AdnanErkorkmazet al，2018DOI:10.1007/s00449-018-1952-x)，即将士麦那盐单胞菌AAD6(T)接种于发酵培养基，所述发酵培养基包含成分如下：137.2g/L NaCl，50g/L蔗糖，7g/L K₂HPO₄，2g/L KH₂PO₄，0.1g/L MgSO₄·7H₂O，1g/L(NH₄)₂SO₄，0.5g/L酪蛋白蛋白胨，50mM H₃BO₃，0.8mg/L硫胺素，微量元素(0.36mg/L MnCl₂·4H₂O，0.44mg/L ZnSO₄·7H₂O，2.3mg/LFeSO₄·7H₂O，0.05mg/L CuSO₄·5H₂O)，用5M NaOH和HCl溶液将pH调至7.0，水补充至1L。其中，硫胺素和微量元素溶液经过过滤灭菌，蔗糖溶液在121 ℃下高压灭菌3分钟，以避免糖焦糖化。NaCl、矿物溶液、NaOH、HCl和硼源溶液在121 ℃下高压灭菌15分钟。将接种的发酵培养基于37℃、180rpm条件下发酵154h，收集发酵液，在10000RCF离心20min(4℃)，将上清转移到新的离心管中，加入等体积预冷的乙醇充分混匀，-20℃下过夜，10000RCF离心30min。将聚合物颗粒在热蒸馏水中完全溶解后，在4℃下进行透析3d(通过透析管、纤维素膜、截留分子量＝14,000Da)。将透析后的溶液转移至60℃烘箱中风干至恒重。

实施例2利云型果聚糖水剂对植物材料的处理

一种利云型果聚糖水剂，由如下重量体积百分含量(g/100mL)的组分组成：利云型果聚糖0.5％、水补充至100％(用于喷施时需加0.0001％的Tween-20作为表面活性剂)。

本试验以盐麦3号为植物材料，处理包括浸种、喷施、浸种+喷施三种方式，具体步骤为：挑选籽粒饱满的种子，用1％次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗干净，用无菌滤纸将种子表面的水分吸干，浸泡在清水或利云型果聚糖水剂中24h。参考国标GB/T 7416-2008，将种子置于内衬双层湿润滤纸的培养皿内，封口放在20℃、80％湿度的黑暗培养箱中3d，然后将萌发的种子转移到花盆中进行砂培，每盆8颗。砂培4d后用喷雾瓶在距离幼苗15cm处进行喷施处理，每盆喷施含Tween-20的利云型果聚糖水剂或清水5ml，3d后剪取幼苗第一叶中段5-6cm，用湿润的脱脂棉将叶片表面擦干净，采用三明治法将叶片两端夹于1％水琼脂培养基之间，离体接种病原菌。每种处理至少接种20片叶。

实施例3利云型果聚糖水剂处理对赤霉病的防治效果

将禾谷镰刀菌F0609接种至PDA平板，于25℃黑暗活化3d，挑取少量菌丝接种至绿豆培养基，180r/min，25℃震荡培养3d，过8层纱布收集孢子。将孢子液浓度调整为1×10⁶个/ml，震荡混匀。接种方法采用刺穿法，用直径1mm的针头将实施例2所述叶片中间部位刺穿，吸取5μl孢子液滴加在穿孔上，盖上培养皿盖子，封口置于25℃培养箱，进行光/暗12h交替培养，2d后进行病斑面积分析和疾病严重等级分类(结果见图1)。

根据病斑面积的大小将疾病严重等级分为三类：病斑面积＜20mm²为轻度，介于20-30mm²之间为中度，＞30mm²为重度。如图1所示，浸种、喷施、浸种+喷施三种处理方式均使叶片病斑面积大幅度减小。喷施处理后叶片病斑面积较对照组减小25.1％，浸种处理后减小25.6％，浸种+喷施处理后减小27.4％，且与对照相比显著性差异极为显著(**表示p＜0.01)(图1A)。与对照组相比，三种处理后的叶片疾病等级主要集中在轻度和中度，而疾病等级为重度所占比例大幅度减少(图1B)。喷施、浸种、浸种+喷施三种处理使重度疾病所占比例分别下降54.2％、58.3％、54.2％。因此，三种处理方式下叶片感染赤霉病的严重等级显著降低。

实施例4利云型果聚糖水剂处理对纹枯病的防治效果。

立枯丝核菌AG-1A在PDA平板上活化3d，用直径5mm的打孔器压出菌饼接种至新的PDA平板生长3d。在同一半径处压出菌饼并接种至实施例2所述的离体叶片中间部位，盖上培养皿盖子，封口置于25℃培养箱进行光/暗12h交替培养，24h后挑去菌饼再放回培养箱，2d后进行病斑面积分析和疾病严重等级分类(结果见图2)。

由于纹枯病病斑不集中、形状不规则且在每个叶片上发病程度差异大等特点，按照病斑面积大小进行评级的方法不再适用。因此，根据病斑占叶片面积的相对百分比对疾病严重等级进行评估。当病斑面积占叶片面积的百分比＜1％则认为无病，介于1-25％为轻度，介于25-50％为中度，＞50％为重度。如图2所示，三种处理后的叶片疾病严重等级主要集中在无病和轻度。与对照相比喷施、浸种、浸种+喷施三种处理后发病率分别降低29.2％、50％、54.2％，重度疾病等级所占比例分别降低34.5％、38.7％、42.9％，中度疾病等级所占比列分别降低25％、6.7％、25％。按照病斑占叶片面积的平均百分比对总体防治效果进行评估，三种处理方式下的叶片疾病严重等级均为轻度，而对照组则为中度，显著性差异极为显著(**表示p＜0.01)。因此，三种处理方式下纹枯病的发病率和疾病严重等级显著降低。

实施例5利云型果聚糖水剂处理对稻瘟病的防治效果

将稻瘟病菌Guy11接种在CM固体平板，于28℃黑暗培养箱活化3-4d，用直径5mm的打孔器压出菌饼，接种至SDC(straw decoction&corn medium)产孢培养基，每个培养皿接种三个菌饼，于28℃黑暗培养箱培养7d。将平板转移至黑光灯下诱导3d，每培养皿加3ml无菌水，用玻璃棒或离心管轻刮菌落，过Miracloth滤布收集孢子。将孢子液浓度调整为1×10⁵个/ml，震荡混匀，吸取20μl滴于实施例2所述的叶片中央，盖上培养皿盖，用封口膜封口，置于25℃培养箱中黑暗培养24h，然后进行光/暗12h交替培养，3d后进行病斑面积分析和疾病严重等级分类(结果见图4)。

疾病等级分类方法与实施例3一致，三种处理方式均使离体叶片的病斑面积有所减小，但是与对照组相比显著性差异为不显著(p＞0.05)(图4A)。浸种和浸种+喷施处理后叶片的疾病严重等级略有下降(图4B)。

实施例6利云型果聚糖对病原菌的抑菌效应

CM培养基，包含如下重量(或体积)百分含量的组分：20×硝酸盐溶液^*5％、1000×微量元素溶液^*0.1％、D-葡萄糖1％、蛋白胨0.2％、酵母提取物0.1％、酪蛋白氨基酸0.1％、维生素溶液^*1％、琼脂1.5％、pH6.5(W/NaOH)、水补充至100％。其中，20×硝酸盐溶液^*包含如下重量百分含量的组分：硝酸钠12％、氯化钾1.04％、七水合硫酸镁1.04％、磷酸二氢钾3.04％、水补充至100％；1000×微量元素溶液^*包含如下重量百分含量的组分：七水合硫酸锌2.2％、硼酸1.1％、四水合氯化锰0.5％、七水合硫酸亚铁0.5％、六水合氯化钴0.17％、五水合硫酸铜0.16％、二水合锰酸钠0.15％、乙二胺四乙酸四钠5％、水补充至100％；维生素溶液^*包含如下重量百分含量的组分：生物素0.01％、吡哆醇0.01％、硫胺素0.01％、核黄素0.01％、对氨基苯甲酸0.01％、烟酸0.01％、水补充至100％。

一种PDA培养基，包含如下重量百分含量的组分：马铃薯浸粉0.5％、葡萄糖2％、琼脂1.4％、水补充至100％。

将CM固体培养基于121℃高压湿热灭菌20min，PDA培养基于116℃高压湿热灭菌15min，待温度降低至55℃时将利云型果聚糖溶于少量无菌水，过0.45μm水系滤膜加入培养基，使培养基中利云型果聚糖的终浓度为0.5％g/ml，充分摇匀后倒平板，不加利云行果聚糖的平板作为对照。其中含有利云型果聚糖的PDA培养基，应用于禾谷镰刀菌和立枯丝核菌抑菌试验，含有利云型果聚糖的CM培养基，应用于稻瘟病菌抑菌试验。

如实施例3-5所述，将禾谷镰刀菌F0609和立枯丝核菌AG-1A压出直径5mm的菌饼，分别接种至PDA平板中央，将活化后的稻瘟菌Guy11压出直径5mm菌饼接种至CM平板中央，根据实际生长情况，观察利云型果聚糖对各病原菌的抑菌效应。每个平板重复三次(结果见图4)。

根据各病原菌的生长速度，在第3d和6d观察禾谷镰刀菌的生长情况(图4)，第3d时对照组和处理组的培养基表型无明显的差别，采用十字交叉法测量菌落直径，显著性差异为不显著(p＞0.05)，第6d时菌丝布满整个培养皿，且表型一致，说明利云型果聚糖对禾谷镰刀菌的生长不存在抑菌效应。在第1d和3d观察立枯丝核菌的生长情况(图4C)，在第1d时，处理组和对照组菌落直径显著性差异为不显著(p＞0.05)，第3d时，菌落布满整个平板，且处理组较对照组长出更多的菌丝团，优先趋于成熟，说明利云型果聚糖对立枯丝核菌的生长也不存在抑菌效应。在第5d和10d观察稻瘟病菌的生长情况(图4C)。第5d时处理组的菌落直径比对照组大0.31cm，尽管显著性差异为不显著(p＞0.05)，但足以说明利云型果聚糖对稻瘟病菌不存在抑菌效应，甚至还能促进稻瘟病菌的生长。在第10d时，稻瘟菌菌丝接近布满整个平面，而处理组菌丝较对照组颜色更深更加趋于成熟，也说明利云型果聚糖促进了稻瘟菌的生长。综上所述，利云型果聚糖对禾谷镰刀菌、立枯丝核菌和稻瘟病菌均不存在抑菌效应，因此所述病原菌不易对利云型果聚糖产生抗药性。

最后应当说明的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明所附权利的情况下可进行适当的改进，这些改进也在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种利云型果聚糖在提高小麦抵抗病菌能力中的应用，所述的病菌为禾谷镰刀菌Fusarium graminearum F0609；所述的利云型果聚糖由士麦那盐单胞菌Halomonas smyrnensis AAD6^T的发酵液中提取获得。

2.一种利云型果聚糖作为活性成分在制备小麦免疫激活剂中的应用，所述免疫激活为提高小麦抵抗病菌的能力，所述的病菌为禾谷镰刀菌Fusarium graminearum F0609；所述的利云型果聚糖由士麦那盐单胞菌Halomonas smyrnensis AAD6^T的发酵液中提取获得。