CN115530159B - 一种利云型果聚糖在辣椒疫病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利云型果聚糖在辣椒疫病中的应用。本发明所述的果聚糖是一种由士麦那盐单胞菌(Halomonas smyrnensis)AAD6(T)合成的利云型果聚糖，可以激活植物自身的免疫抗性从而提高辣椒抵抗疫霉病的能力，其本身无毒害也不具备抑菌活性。同时，该利云型果聚糖易溶于水，使用时无需添加任何有机溶剂，无残留，符合绿色农药的要求。

Description

一种利云型果聚糖在辣椒疫病中的应用
技术领域
本发明提供一种利云型果聚糖在辣椒疫病中的应用，属于绿色农药领域。
背景技术
辣椒(Capsicum annuum L.)是世界上广泛种植的作物之一，在我国是重要的风味蔬菜。其果实富含多种营养元素，且具有一定的药用价值，可防治坏血病。由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是一种毁灭性土传病害，不仅能够在土壤中传播，也可通过空气、浇水、雨水淋溅和病株残体等途径广泛传播，短期内病情即可爆发，可使辣椒减产一半以上，甚至绝产。
番茄(Solanum lycopersicum)为茄科番茄属植物，原产于南美洲，是全世界年产量最高的作物之一。番茄营养丰富，富含番茄红素、有机酸、维生素等，具有健脾开胃和提高机体免疫力的作用，我国也是全球最大的番茄生产和消费国之一。番茄青枯病是由青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性土传细菌病害，一旦发生则难以控制，易导致连作障碍，严重影响番茄的产量，给农业生产带来巨大的经济损失。
植物病害一直是制约农业生产的重要因素，化学农药的大量使用导致病原物抗药性增加，使病害防治工作越来越困难。因此，新型农药的创制是我国高毒农药品种替代、农药零增长和减肥减药战略实施的保障。植物免疫激活剂，它能够利用免疫诱导技术来提高植物自身抗性，是一种有害生物绿色防控的新技术和新方法。它通过激发植物内相应的免疫反应，来大幅度减轻病虫害的发生，从而减少化学农药的施用，且具有广谱性，是解决环境污染，农产品安全，实现农药零增长的有效途径。
利云型果聚糖是属于寡糖或多糖类的一种植物免疫激活剂，主要是果糖间以β(2-6)糖苷键为主链、β(2-1)为部分侧链连接而成的一种多糖类生物高分子，广泛存在于禾本科植物中，也是多数微生物细胞壁或胞外多糖的主要成分。
发明内容
为确保我国粮食安全和解决现有农药污染严重、残效期长等弊端，本发明提供一种提高植物抵抗病害能力的利云型果聚糖，可直接溶于水，不添加任何有机溶剂，对环境无污染，防治谱广，可应用于辣椒疫霉病等病害的防治。
本发明提供以下技术方案：
一种利云型果聚糖在提高植物抵抗病菌的能力中的应用，所述的病菌选自疫霉菌(Phytophthora capsici)；所述的利云型果聚糖由士麦那盐单胞菌(Halomonassmyrnensis)AAD6(T)的发酵液中提取获得,利云型果聚糖的制备参考Burak AdnanErkorkmaz的方法(Burak Adnan Erkorkmazet al，2018DOI:10.1007/s00449-018-1952-x)。
一种利云型果聚糖在制备植物免疫激活剂中的应用，所述的植物免疫激活剂针对的病菌选自疫霉菌(Phytophthora capsici)；所述的利云型果聚糖由士麦那盐单胞菌(Halomonas smyrnensis)AAD6(T))的发酵液中提取获得，利云型果聚糖的制备参考BurakAdnan Erkorkmaz的方法(Burak Adnan Erkorkmazet al，2018DOI:10.1007/s00449-018-1952-x)。
一种利云型果聚糖水剂，每1000ml的水中含有5g利云型果聚糖，以及0.0001％的Tween-20。
作为本发明的一种优选，所述的利云型果聚糖水剂在70℃以下的温水中振荡水浴10分钟以上，直至水剂呈淡蓝色，来增加植物对水剂的吸收。
本发明取得以下有益效果：
本发明提供的利云型果聚糖水剂，不添加任何有机试剂，对环境无污染，对植物无危害，对粮食生产安全。
本发明提供的利云型果聚糖水剂，以喷施方式能有效的控制辣椒疫霉病害，在防治辣椒疫霉病中具有优异的效果。
附图说明
图1疫霉菌侵染叶片病斑面积和疾病严重等级分类
图2三种处理下辣椒叶片对疫霉的防效
图3青枯菌侵染整株番茄发病率
图4三种处理下番茄防控青枯病的效果
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1利云型果聚糖的制备
利云型果聚糖的制备参考Burak Adnan Erkorkmaz的方法(Burak AdnanErkorkmazet al，2018DOI:10.1007/s00449-018-1952-x)，即将士麦那盐单胞菌AAD6(T)接种于发酵培养基，所述发酵培养基包含成分如下：137.2g/L NaCl，50g/L蔗糖，7g/L K2HPO4，2g/L KH2PO4，0.1g/L MgSO4·7H2O，1g/L(NH4)2SO4，0.5g/L酪蛋白蛋白胨，50mM H3BO3，0.8mg/L硫胺素，微量元素(0.36mg/L MnCl2·4H2O，0.44mg/L ZnSO4·7H2O，2.3mg/LFeSO4·7H2O，0.05mg/L CuSO4·5H2O)，用5M NaOH和HCl溶液将pH调至7.0，水补充至1L。其中，硫胺素和微量元素溶液为滤膜过滤灭菌，蔗糖溶液在121℃下高压灭菌3分钟灭菌。NaCl、矿物溶液、NaOH、HCl和硼源溶液在121℃下高压灭菌15分钟。将接种的发酵培养基于37℃、180rpm条件下发酵154h，收集发酵液，在10000RCF离心20min(4℃)，将上清转移到新的离心管中，加入等体积预冷的乙醇充分混匀，-20℃下过夜，再次10000RCF离心30min。将聚合物颗粒在热蒸馏水中完全溶解后，在4℃下进行透析3d(通过透析管、纤维素膜、截留分子量＝14,000Da)。将透析后的溶液转移至60℃烘箱中风干至恒重。
实施例2利云型果聚糖水剂对植物材料的处理
一种利云型果聚糖水剂，由如下重量体积百分含量(g/100mL)的组分组成：利云型果聚糖0.5％、水补充至100％。水剂在70℃以下的温水中振荡水浴10分钟以上，直到水剂呈现淡蓝色，静置到常温待用，喷施前再加入0.0001％的Tween-20作为表面活性剂。
本试验以苏椒五号和红矮生为植物材料，处理包括喷施水、菊粉、利云型果聚糖三种方式，具体步骤为：挑选籽粒饱满的种子，用3％过氧化氢溶液浸泡10min，无菌水冲洗干净，后将种子置于含有30ml无菌水的方形培养皿内，封口放在30℃、80％湿度的黑暗培养箱中2d，然后将萌发的种子转移到花盆中进行砂培，每盆1棵。砂培40d，植物长至五叶一心时，用喷雾瓶在距离幼苗15cm处进行喷施处理，每盆喷施含Tween-20的利云型果聚糖水剂，菊粉水剂或清水5ml。3d后剪取辣椒幼苗的1-4叶，用无菌水洗去叶片表面残留的利云，吸水纸擦干，叶柄用湿润的脱脂棉包裹，叶片下垫一层吸水纸和纱布用于保湿，离体接种病原菌。每种处理至少接种20片叶。3d后，用灌根法将50ml青枯菌菌悬液均匀接入长有番茄幼苗的石英砂中，每天统计发病情况，一共统计14d。
实施例3利云型果聚糖水剂处理对疫霉病的防治效果
将疫霉菌LT263接种至V8平板，于25℃黑暗活化6d，在同一半径处用直径5mm的打孔器压出菌饼并接种至离体叶片中间部位，叶片和菌饼之间滴加10μl dd H2O，盖上培养皿，封口置于25℃培养箱培养42h，后用台盼蓝染色(结果见图2)，进行病斑面积分析和疾病严重等级分类(结果见图1)。
根据病斑面积的大小将疾病严重等级分为四类：病斑面积＜10mm2为轻度，介于10-50mm2之间为中度，50-100mm2为重度，>100mm2为极重度。如图1所示，喷施利云型果聚糖使叶片病斑面积大幅度减小。喷施处理后叶片病斑面积较对照组减小44.8％，且与对照相比差异极显著(**表示p＜0.01)(图1A)。与对照组相比，利云型果聚糖处理后的叶片疾病等级主要集中在轻度和中度，而疾病等级为重度所占比例大幅度减少(图1B)。喷施利云型果聚糖处理使中度和极重度疾病所占比例分别下降73.3％，68.0％。因此，利云型果聚糖处理方式下叶片感染疫霉病的严重等级显著降低。喷施菊粉处理方式均使离体叶片的病斑面积有所减小，但是与对照组相比显著性差异为不显著(p＞0.05)(图1A)，疾病严重等级略有下降(图1B)。
实施例4利云型果聚糖水剂处理对青枯病的防治效果。
用接种环挑取-80℃保存的青枯菌菌体划线于NA平板上，28℃培养36h后，挑取流动性强的菌株接种到液体NA培养基中，30℃振荡(180rpm)培养20h，获得青枯菌发酵液，用液体NA培养基调整发酵液的浓度为1×106cfu/ml。用灌根法将50ml青枯菌菌悬液均匀接入长有番茄幼苗的石英砂中。
根据植株叶片萎蔫程度，将发病级别分5级：0表示植株正常；1表示植株叶片萎蔫≤25％；2表示26％≤植株叶片萎蔫≤50％；3表示51％≤植株叶片萎蔫≤75％；4表示76％≤植株叶片萎蔫或死亡。每天记录番茄青枯病发病程度，一共统计14天。如图3和4所示，无论是喷施利云型果聚糖还是菊粉都无法降低青枯菌的发病率，不存在防治效果。
最后应当说明的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明所附权利的情况下可进行适当的改进，这些改进也在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种利云型果聚糖在提高植物抵抗疫霉菌能力中的应用，所述的利云型果聚糖由士麦那盐单胞菌（Halomonas smyrnensis）AAD6T的发酵液中提取获得，所述的利云型果聚糖制备成浓度为0.5g/100mL的水剂施用。
2.一种利云型果聚糖在制备植物免疫激活剂中的应用，所述的植物免疫激活剂针对的病菌为疫霉菌（Phytophthora capsici），所述的利云型果聚糖由士麦那盐单胞菌（Halomonas smyrnensis ）AAD6T的发酵液中提取获得，所述的利云型果聚糖在植物免疫激活剂中的浓度为0.5g/100mL。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114271277A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 南京农业大学 一种利云型果聚糖的应用

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Title
Development of a cost-effective production process for Halomonas levan;Burak Adnan Erkorkmaz等;《Bioprocess and Biosystems Engineering》;第1-3页 *
Levan果聚糖的应用与生产研究进展;陆娟;唐俊;肖敏;屈长青;;生物学杂志(06);第 86-90页 *

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