CN110055203A - 一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸高产菌株及制备工艺 - Google Patents

一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸高产菌株及制备工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗植物病毒ε‑聚赖氨酸高产菌株及制备工艺，所述高产菌株的名称为细黄链霉菌(Streptomyces microflavus var.liaoningensis)X，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15355，保藏日期为2018年2月12日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；所述一种抗植物病毒ε‑聚赖氨酸的制备工艺包括以下步骤：菌种扩繁过程，发酵生成抗植物病毒ε‑聚赖氨酸过程，发酵后成品制备过程。本发明的有意之处在于，本发明的一种抗植物病毒ε‑聚赖氨酸高产菌株及制备工艺能够大幅度提高ε‑聚赖氨酸产量，这对于ε‑聚赖氨酸的工业化大规模生产具有着非常重要的意义。

Description

一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸高产菌株及制备工艺
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，特别涉及一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的高产菌株及ε-聚赖氨酸的制备工艺。
背景技术
植物病毒病称为“植物癌症”，是继植物真菌病后第二大植物病害，对农业产生了重大损失。植物病毒一直是许多农作物、蔬菜和观赏植物的主要问题，严重影响了不同作物产品的质量和产量。全世界每年因植物病毒病造成的经济损失高达600亿美元，单因粮食作物的损失就达到了200亿美元。一旦病毒入侵宿主，其繁殖就与宿主植物的代谢相结合。所以经常出现的情况是抑制病毒复制的药物也可能对宿主造成伤害，因此难以控制植物病毒病。目前，除了筛选抗病毒品种外，用于控制病毒病的最直接有效的方法就是化学药剂。但化学农药虽具有提高产量，节省劳动力，降低病害损失风险的优点，但也带来了一系列严重问题，如植物病原体的耐药性和环境污染的增加，农药残留过多，使人畜中毒，农产品质量下降等。
本发明提供了一种可产抗植物病毒ε-聚赖氨酸的细黄链霉菌辽宁变种(Streptomyces microflavus var.liaoningensis)。ε-聚赖氨酸是由微生物分泌的、具广谱抗微生物活性的多肽类物质，易被生物降解，对人体无害。作为生物防腐剂,ε-聚赖氨酸具有抗菌谱广,稳定性高的特点,在中性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌也有一定的抑菌效果，但是ε-聚赖氨酸在农业上作用于植物病毒病的研究却未见报道，基于此，本发明提供了可产抗病毒ε-聚赖氨酸的细黄链霉菌及其发酵方法(主要针对烟草花叶病毒)，从而能够大幅度提高ε-聚赖氨酸产量，这为ε-聚赖氨酸的长远甚至工业化大规模生产提供了有利资料，垫下了坚实的基础，且ε-聚赖氨酸很有可能成为未来高效的绿色农药及促进植物生长的调节剂，改变未来农药和农业制剂的产业结构,成为农业发展的新方向,所以其应用前景十分广阔，所以本发明有着非常重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能有效控制植物病毒病害、提高农产品的产量和质量，同时能保障人畜安全和保护环境，高效、低毒、低残留、无“三致”、无公害的产抗植物病毒ε-聚赖氨酸的细黄链霉菌及其制备工艺。
一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的高产菌株，其特征在于该高产菌株的名称为细黄链霉菌辽宁变种(Streptomyces microflavus var.liaoningensis)X，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15355，保藏日期为2018年2月12日。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌种扩繁过程：将所述高产菌株X接种到装有经20-40min灭菌后的种子培养基的种子罐中培养30～60小时制备得到种子液，控制所述种子罐的培养条件为温度范围25～35℃，pH范围7.0～7.4，压强范围0.05～0.2Mpa；所述种子培养基按重量百分含量计的组成为玉米粉为2.0％、花生饼粉3.0％、淀粉1.0％、酵母粉0.05％、氯化钠1.5％、硫酸铵0.02％、七水和硫酸镁0.002％、磷酸氢二甲0.0025％、其余为水；
(2)发酵生成抗植物病毒ε-聚赖氨酸过程：将步骤(1)制备得到的所述种子液接种到装有经灭菌后的发酵培养基的发酵罐中培养50～70小时制备得到发酵液，控制所述发酵罐培养条件为消毒前pH范围6.0～7.0，压强范围0.1～0.12Mpa，空气流量范围1：0.2～1；所述发酵培养基按重量百分含量计的组成为玉米粉2.0％，花生饼粉3.0％，淀粉1.0％，葡萄糖2.0％，酵母粉0.2％，硫酸铵0.4％，硫酸钙0.4％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，其余为水；
(3)发酵后成品制备过程：在无菌条件下将加热使到100℃的所述发酵液压入板框过滤机，过滤制得清液，用浓度为6N的HCl或草酸调整所述清液的pH值；之后将pH4.0～5.0的所述清液抽入到浓缩罐中进行减压浓缩，制备得到效价25000u/mL以上的浓缩液，所述减压浓缩过程控制条件为700mmHg真空度、蒸汽压0.02～0.06Mpa、温度70℃～80℃；之后在所述浓缩液中加入稳定剂，助剂，抽样测定生物效价合格后得到成品。
作为一种优选的方案是，前述步骤(2)中将种子液接种到装有经灭菌后的发酵培养基的发酵罐中的接种量为所述种子液占发酵培养基的体积百分比为7.5％～15％，所述种子液的种龄30～40小时。
更为优选的是，前述步骤(2)中需要在发酵罐中加入体积分数为0.5～0.8/万的硅酮消泡剂。
更为优选的是，前述步骤(3)中稳定剂种类和加入量为发酵液重量百分含量0.08％的苯甲酸钠或0.05～1.5％的对羟基苯甲酸丁酯，所述助剂为Toween80。
本发明的有益之处在于，本发明提供的一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的高产菌株及ε-聚赖氨酸的制备工艺具有以下优势：
①具有稳定的原料来源，且成本低，适合大规模工业化生产。
②产品质量稳定：在保证原料稳定的同时，可以通过严格控制各项发酵参数，来控制成品的质量，从而形成科学完整的质量体系，该产品对光、热、酸等稳定，浓缩液可以在常温下保存2年不失效。
③本产品低毒：对人、畜无毒害，对作物无药害，不刺激皮肤、眼，耐雨水冲刷等。
④预防植物病毒病效果明显：据辽宁省几个市、县及北京、吉林、黑龙江等地蔬菜、烟草、玉米等作物大田试验，ε-聚赖氨酸对烟草花叶病、辣椒花叶病、番茄蕨叶病、玉米矮花叶病平均预防效果达83.7％以上，明显高于对照药剂。
⑤治疗植物病毒病效果更为突出：据辽宁省5846亩辣椒、番茄大田试验，在辣椒花叶病、番茄蕨叶病发生以后，喷施ε-聚赖氨酸，平均防治效果达73.2％以上，显著优于对照药剂宁南霉素和氨基寡糖素。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌种扩繁过程：将高产菌株X接种到装有经20min灭菌后的种子培养基的种子罐中培养30小时制备得到种子液，控制种子罐的培养条件为温度范围25℃，pH范围7.0，压强范围0.05Mpa；种子培养基按重量百分含量计的组成为，玉米粉2.0％，花生饼粉3.0％，淀粉1.0％，酵母粉0.05％，NaCl为1.5％，(NH4)2SO4为0.02％，MgSO4·7H2O为0.002％，K2HPO4为0.0025％，其余为水；
(2)发酵生成抗植物病毒ε-聚赖氨酸过程：将步骤(1)制备得到的种子液按体积百分比为7.5％的接种量接种到装有经灭菌后的发酵培养基的发酵罐中培养50小时制备得到发酵液，控制发酵罐培养条件为消毒前pH值范围6.0，压强范围0.1Mpa，空气流量范围1：0.2；发酵培养基按重量百分含量计的组成为，玉米粉2.0％，花生饼粉3.0％，淀粉1.0％，葡萄糖2.0％，酵母粉0.2％，硫酸铵0.4％，硫酸钙0.4％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，其余为水；发酵过程中在发酵罐中加入体积分数为0.5/万的硅酮消泡剂；
(3)发酵后成品制备过程：在无菌条件下将加热使到100℃的所述发酵液压入板框过滤机，过滤制得清液，用浓度为6N的HCl调整清液的pH值；之后将pH为4.0的清液抽入到浓缩罐中进行减压浓缩，制备得到效价25000单位/mL以上的浓缩液，所述减压浓缩过程控制条件为700mmHg真空度、蒸汽压0.02Mpa、温度70℃；之后在所述浓缩液中加入重量百分含量0.08％的苯甲酸钠或重量百分含量0.05％的对羟基苯甲酸丁酯稳定剂、Toween80助剂，抽样测定生物效价合格后得到成品。
对步骤(2)制备得到的发酵液进行ε-聚赖氨酸效价检测，结果为25200u/mL；步骤(3)制备成品的收率为92％。
实施例2
一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌种扩繁过程：将高产菌株X接种到装有经40min灭菌后的种子培养基的种子罐中培养60小时制备得到种子液，控制种子罐的培养条件为温度范围35℃，pH范围7.4，压强范围0.2Mpa；种子培养基按重量百分含量计的组成为，玉米粉2.0％，花生饼粉3.0％，淀粉1.0％，酵母粉0.05％，NaCl为1.5％，(NH4)2SO4为0.02％，MgSO4·7H2O为0.002％，K2HPO4为0.0025％，其余为水；
(2)发酵生成抗植物病毒ε-聚赖氨酸过程：将步骤(1)制备得到的种子液按体积百分比为15％的接种量接种到装有经灭菌后的发酵培养基的发酵罐中培养50小时制备得到发酵液，控制发酵罐培养条件为消毒前pH值范围7.0，压强范围0.12Mpa，空气流量范围1：1.0；发酵培养基按重量百分含量计的组成为，玉米粉2.0％，花生饼粉3.0％，淀粉1.0％，葡萄糖2.0％，酵母粉0.2％，硫酸铵0.4％，硫酸钙0.4％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，其余为水；发酵过程中在发酵罐中加入体积分数为0.8/万的硅酮消泡剂；
(3)发酵后成品制备过程：在无菌条件下将加热使到100℃的所述发酵液压入板框过滤机，过滤制得清液，用草酸调整清液的pH值；之后将pH为5.0的清液抽入到浓缩罐中进行减压浓缩，制备得到效价26000单位/mL以上的浓缩液，所述减压浓缩过程控制条件为700mmHg真空度、蒸汽压0.06Mpa、温度80℃；之后在所述浓缩液中加入重量百分含量0.8％的苯甲酸钠或重量百分含量1.5％的对羟基苯甲酸丁酯稳定剂、Toween80助剂，抽样测定生物效价合格后得到成品。
对步骤(2)制备得到的发酵液进行ε-聚赖氨酸效价检测，结果为26800u/mL；步骤(3)制备成品的收率为93％。
实施例3
一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌种扩繁过程：将高产菌株X接种到装有经40min灭菌后的种子培养基的种子罐中培养60小时制备得到种子液，控制种子罐的培养条件为温度范围35℃，pH范围7.4，压强范围0.2Mpa；种子培养基按重量百分含量计的组成为，玉米粉2.0％，花生饼粉3.0％，淀粉1.0％，酵母粉0.05％，NaCl为1.5％，(NH4)2SO4为0.02％，MgSO4·7H2O为0.002％，K2HPO4为0.0025％，其余为水；
(2)发酵生成抗植物病毒ε-聚赖氨酸过程：将步骤(1)制备得到的种子液按体积百分比为15％的接种量接种到装有经灭菌后的发酵培养基的发酵罐中培养50小时制备得到发酵液，控制发酵罐培养条件为消毒前pH值范围7.0，压强范围0.12Mpa，空气流量范围1：1.0；发酵培养基按重量百分含量计的组成为，玉米粉2.0％，花生饼粉3.0％，淀粉1.0％，葡萄糖2.0％，酵母粉0.2％，硫酸铵0.4％，硫酸钙0.4％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，其余为水；发酵过程中在发酵罐中加入体积分数为0.8/万的硅酮消泡剂；
(3)发酵后成品制备过程：在无菌条件下将加热使到100℃的所述发酵液压入板框过滤机，过滤制得清液，用草酸调整清液的pH值；之后将pH为5.0的清液抽入到浓缩罐中进行减压浓缩，制备得到效价25000单位/mL以上的浓缩液，所述减压浓缩过程控制条件为700mmHg真空度、蒸汽压0.06Mpa、温度80℃；之后在所述浓缩液中加入重量百分含量0.8％的苯甲酸钠或重量百分含量1.5％的对羟基苯甲酸丁酯稳定剂、Toween80助剂，抽样测定生物效价合格后得到成品。
对步骤(2)制备得到的发酵液进行ε-聚赖氨酸效价检测，结果为25900u/mL；步骤(3)制备成品的收率为94％。
应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的高产菌株，其特征在于该高产菌株的名称为细黄链霉菌辽宁变种(Streptomyces microflavus var.liaoningensis)X，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15355，保藏日期为2018年2月12日。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌种扩繁过程：将所述高产菌株X接种到装有经20-40min灭菌后的种子培养基的种子罐中培养30～60小时制备得到种子液，控制所述种子罐的培养条件为温度范围25～35℃，pH范围7.0～7.4，压强范围0.05～0.2Mpa；所述种子培养基按重量百分含量计的组成为玉米粉为2.0％、花生饼粉3.0％、淀粉1.0％、酵母粉0.05％、氯化钠1.5％、硫酸铵0.02％、七水和硫酸镁0.002％、磷酸氢二甲0.0025％、其余为水；
(2)发酵生成抗植物病毒ε-聚赖氨酸过程：将步骤(1)制备得到的所述种子液接种到装有经灭菌后的发酵培养基的发酵罐中培养50～70小时制备得到发酵液，控制所述发酵罐培养条件为消毒前pH范围6.0～7.0，压强范围0.1～0.12Mpa，空气流量范围1：0.2～1；所述发酵培养基按重量百分含量计的组成为玉米粉2.0％，花生饼粉3.0％，淀粉1.0％，葡萄糖2.0％，酵母粉0.2％，硫酸铵0.4％，硫酸钙0.4％，碳酸钙0.4％，氯化钠0.3％，其余为水；
(3)发酵后成品制备过程：在无菌条件下将加热使到100℃的所述发酵液压入板框过滤机，过滤制得清液，用浓度为6N的HCl或草酸调整所述清液的pH值；之后将pH4.0～5.0的所述清液抽入到浓缩罐中进行减压浓缩，制备得到效价25000u/mL以上的浓缩液，所述减压浓缩过程控制条件为700mmHg真空度、蒸汽压0.02～0.06Mpa、温度70℃～80℃；之后在所述浓缩液中加入稳定剂，助剂，抽样测定生物效价合格后得到成品。
3.根据权利要求2所述的一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的制备工艺，其特征在于：所述步骤(2)中将种子液接种到装有经灭菌后的发酵培养基的发酵罐中的接种量为所述种子液占发酵培养基的体积百分比为7.5％～15％，所述种子液的种龄30～40小时。
4.根据权利要求2或3所述一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的制备工艺，其特征在于：所述步骤(2)中需要在发酵罐中加入体积分数为0.5～0.8/万的硅酮消泡剂。
5.根据权利要求4所述一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的制备工艺，其特征在于：所述步骤(3)中稳定剂种类和加入量为发酵液重量百分含量0.08％的苯甲酸钠或0.05～1.5％的对羟基苯甲酸丁酯，所述助剂为Toween80。
6.根据权利要求1所述一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的高产菌株，其特征在于：所述一种抗植物病毒ε-聚赖氨酸的高产菌株的ε-聚赖氨酸产量可以达到2％～5％。
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