CN108277177A - 细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法、发酵产物、生防产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法、发酵产物、生防产品和应用，涉及微生物发酵技术领域。细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮40‑50份、稻壳15‑25份、米糠25‑35份、碳酸钙3‑7份和水。细黄链霉菌的发酵方法包括：任选地将细黄链霉菌菌株经种子活化和液体种子培养后，采用细黄链霉菌固体发酵培养基进行发酵培养，得到发酵产物。本发明缓解了现有细黄链霉菌活菌数和产孢量少的缺陷，本发明通过采用上述培养基进行固体发酵培养，发酵周期短，活菌数多，适合工业化生产，得到的发酵产物在防治农作物青枯病方面效果显著，提高了农作物的品质和产量。

Description

细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法、发酵产 物、生防产品和应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法、发酵产物、生防产品和应用。

背景技术

植物病害是严重威胁农业生产的自然生物灾害之一，利用化学药剂不仅杀死了有益农田微生物，破坏农田生态系统，还残留于土壤、水体、农副产品和畜产品中，对人类健康造成威胁，而且使许多病原菌产生抗药性，导致化学药剂的使用频率和剂量逐年增加，防治效果差。而生物防治对环境中的有益微生物无影响、无残留无污染、不杀害天敌、不会产生抗药性、有利于人畜安全及环境保护、成本低、防治结合、是一种无公害植保新技术。

青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起，是一种毁灭性的土传病害，该病原菌可侵染番茄、茄子、辣椒、马铃薯、花生、烟草等许多具有重要经济价值的栽培植物，对该病的防治多以化学防治和抗病育种为主，化学防治在青枯病的防治中一直占主要地位，但是长期大量反复使用会对土壤和地下水造成严重污染，破坏生态平衡。抗病育种也存在诸多问题，目前还没有发现对该病有高抗性的品种。近年来，生物防治的研究和开发已经成为防治青枯病的重点和热点。

放线菌种类繁多，代谢功能各异，很多放线菌可产生多种抗生素，在微生物产生的新生物活性物质中，放线菌产生的就占到74％。用放线菌制成的活细胞制剂，具有无毒、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼容性好、防病持效期长等优点。放线菌活菌制剂的发酵生产、制剂加工、存储剂应用所要求的条件极为严格，这些条件随放线菌的不同变化较大。

细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)是链霉菌属(Streptomyces)的一个种类，其自身代谢产物可有效地促进植物生长，可产生玉米素、激动素等有效活性成分，但是，土壤中自然生长的细黄链霉菌数量太少，无法发挥上述作用。而现有技术中细黄链霉菌发酵后活菌数和产孢量少，菌剂的活性和质量稳定性差。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种细黄链霉菌固体发酵培养基，采用该培养基培养细黄链霉菌增殖多，产孢子量多。

本发明的目的之二在于提供一种上述细黄链霉菌固体发酵培养基的制备方法，操作简单，适合大规模生产。

本发明的目的之三在于提供一种细黄链霉菌的发酵方法，该方法采用上述细黄链霉菌固体发酵培养基进行固体发酵培养，发酵周期短，活菌数多，活性和质量稳定性好，适合工业化生产，得到的发酵产物在防治农作物青枯病方面效果显著，提高了农作物的品质和产量。

本发明的目的之四在于提供一种上述细黄链霉菌的发酵方法得到的细黄链霉菌发酵产物，该发酵产物中活菌数高、杂菌率低，具有高效防治农作物青枯病的效果。

本发明的目的之五在于提供一种包括上述细黄链霉菌发酵产物的生防产品，具有与上述发酵产物相同的优势。

本发明的目的之六在于提供一种上述细黄链霉菌发酵产物或上述生防产品在防治农作物青枯病中的应用，防治青枯病效果好。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

第一方面，提供了一种细黄链霉菌固体发酵培养基，所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮40-50份、稻壳15-25份、米糠25-35份、碳酸钙3-7份和水；

优选地，所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮42-48份、稻壳18-23份、米糠28-32份、碳酸钙3-6份和水；

优选地，所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮44-46份、稻壳19-21份、米糠29-31份、碳酸钙4-5份和水；

优选地，所述细黄链霉菌固体发酵培养基的含水率为45-55％。

第二方面，提供了一种上述细黄链霉菌固体发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：

将配方量的麸皮、稻壳、米糠、碳酸钙和水混合均匀，经灭菌处理，得到细黄链霉菌固体发酵培养基；

优选地，灭菌温度为110-130℃，和/或，灭菌时间为30-60min，优选 121℃灭菌40min。

第三方面，提供了一种细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

任选地将细黄链霉菌菌株经种子活化和液体种子培养后，采用上述细黄链霉菌固体发酵培养基或上述细黄链霉菌固体发酵培养基的制备方法制备得到的细黄链霉菌固体发酵培养基进行发酵培养，得到发酵产物。

优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，细黄链霉菌的发酵方法包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌菌株在无菌条件下接种于斜面培养基上，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子接种于液体培养基中，得到液体种子；

(c)发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种于所述细黄链霉菌固体发酵培养基中，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物干燥后，得到干燥的发酵产物。

优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(c)中液体种子的接种量为15-25％(v/w)；

优选地，步骤(c)中培养温度28-30℃，和/或，培养时间120-168h；

优选地，步骤(a)中培养温度28-30℃，和/或，培养时间96-120h；

优选地，步骤(b)中斜面种子用无菌水洗脱，接种于液体培养基中，接种量为5-10％(v/v)；

优选地，步骤(b)中培养温度28-30℃，和/或，培养时间30-48h。

优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(a)中斜面培养基包括8-12g/L的可溶性淀粉、8-12g/L的葡萄糖、2-5g/L的酵母粉、0.5-1g/L 的磷酸氢二钾、0.5-1g/L的硫酸镁和15-25g/L的琼脂，pH值为7.0-7.5；

优选地，步骤(b)中液体培养基包括8-12g/L的蛋白胨、8-12g/L的酵母浸粉、15-25g/L的葡萄糖和5-10g/L的碳酸钙，pH值为7.0-7.5；

优选地，斜面培养基和液体培养基均独立地在使用前进行灭菌处理，灭菌温度为110-130℃，和/或，灭菌时间为20-30min，优选121℃灭菌25min；

优选地，步骤(d)中发酵产物在40-50℃下干燥至含水率小于10％。

优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，上述细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌菌株在无菌条件下接种于无菌斜面培养基上，培养温度28-30℃，培养时间96-120h，得到斜面种子；

所述斜面培养基包括8-12g/L的可溶性淀粉、8-12g/L的葡萄糖、2-5g/L 的酵母粉、0.5-1g/L的磷酸氢二钾、0.5-1g/L的硫酸镁和15-25g/L的琼脂，pH值为7.0-7.5；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，以 5-10％(v/v)的接种量接种于无菌液体培养基中，培养温度28-30℃，培养时间30-48h，得到液体种子；

所述液体培养基包括8-12g/L的蛋白胨、8-12g/L的酵母浸粉、15-25g/L 的葡萄糖和5-10g/L的碳酸钙，pH值为7.0-7.5；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子以15-25％(v/w)的接种量接种于无菌细黄链霉菌固体发酵培养基中，混合均匀，培养温度 28-30℃，培养时间120-168h，得到发酵产物；

所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括40-50重量份的麸皮、15-25重量份的稻壳、25-35重量份的米糠、3-7重量份的碳酸钙和水，含水率45-55％；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于40-50℃下干燥，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，干燥结束，粉碎后得到干燥的发酵产物。

第四方面，提供了上述细黄链霉菌的发酵方法发酵得到的细黄链霉菌发酵产物。

第五方面，提供了包括上述细黄链霉菌发酵产物的生防产品。

第六方面，提供了上述细黄链霉菌发酵产物或上述生防产品在防治农作物青枯病中的应用；

优选地，所述农作物包括番茄或辣椒；

优选地，将所述细黄链霉菌发酵产物或所述生防产品稀释至有效活菌数0.9-1.5亿/mL，施用在农作物移栽后和座果期；

优选地，施用方式为灌根。

与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了一种适合于细黄链霉菌的固体发酵培养基，大部分采用农副产品，成分易得且价格低廉，配方合理，能够满足细黄链霉菌菌种大量繁殖的需要，增殖多，产孢子量多。

(2)本发明的细黄链霉菌的发酵方法采用上述细黄链霉菌固体发酵培养基进行固体发酵培养，能显著促进细黄链霉菌的生长，活菌数多。该方法发酵周期短，提高生产效率，降低企业的生产成本，适合工业化生产，菌活性和质量稳定性好，得到的发酵产物有效活菌数可达300亿/g以上，杂菌率低于10％。

(3)本发明得到的细黄链霉菌发酵产物和生防产品活菌数高、杂菌率低，不仅能高效地防治农作物青枯病，还能有效促进作物生长和提高作物产量，作为生物制剂具有很好的应用前景。

(4)本发明的发酵方法是一种固体发酵方法，固体发酵所使用的原料成本较经济，所产生的代谢物质更丰富，下游的回收纯化过程及废弃物处理通常较为简单，通常是整个基质都被使用，较液体发酵更具优势。此外，采用固体培养基能有效抑制培养过程中杂菌的感染。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

根据本发明的第一个方面，提供了一种细黄链霉菌固体发酵培养基，包括以下重量份的组分：麸皮40-50份、稻壳15-25份、米糠25-35份、碳酸钙3-7份和水。

细黄链霉菌Streptomyces具有以下生物学特性：在淀粉合成培养基的平板上生长时，常见有几种类型的菌落：凸型、扇形、帽型、凹形，其中以凸型最为理想。菌落正面观，颜色呈白色或粉红色，会产生茶褐色露珠，背面观呈土黄或褐红色，因培养基不同颜色也不同。

麸皮为小麦最外层的表皮。

麸皮典型但非限制性的含量例如为40重量份、41重量份、42重量份、 43重量份、44重量份、45重量份、46重量份、47重量份、48重量份、49 重量份或50重量份。

稻壳为稻谷外面的一层壳，稻壳富含纤维素、木质素、二氧化硅，脂肪、蛋白质的含量较低。

稻壳典型但非限制性的含量例如为15重量份、16重量份、17重量份、 18重量份、19重量份、20重量份、21重量份、22重量份、23重量份、24 重量份或25重量份。

米糠典型但非限制性的含量例如为25重量份、26重量份、27重量份、 28重量份、29重量份、30重量份、31重量份、32重量份、33重量份、34 重量份或35重量份。

碳酸钙典型但非限制性的含量例如为3重量份、4重量份、5重量份、 6重量份或7重量份。

pH自然，即不需要调节pH。

优选地，细黄链霉菌固体发酵培养基的含水率(所含水重量占固体发酵培养基总重的比值)为45-55％，例如45％、50％或55％。

由于固态发酵培养基的湿度(体现在水分含量上)对微生物生产繁殖及代谢有很大关系，通过保证适宜含水率可以促进细黄链霉菌的生产繁殖和代谢。

本发明所述的“包括”，意指其除所述组份外，还可以包括其他组份，这些其他组份赋予所述培养基不同的特性。除此之外，本发明所述的“包括”，还可以替换为封闭式的“为”或“由……组成”。

该培养基大部分采用农副产品，成本低，配方合理，通过一定量的麸皮、稻壳、米糠和碳酸钙的配合，能够满足细黄链霉菌菌种大量繁殖的需要，增殖多，产孢子量多，同时能有效抑制培养过程中杂菌的感染。

优选地，细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮 42-48份、稻壳18-23份、米糠28-32份、碳酸钙3-6份和水。

进一步优选地，细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮44-46份、稻壳19-21份、米糠29-31份、碳酸钙4-5份和水。

通过优化各组分间配比，能够得到配比更加合理、培养效果更好的细黄链霉菌固体发酵培养基。

根据本发明的第二个方面，提供了上述细黄链霉菌固体发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：

将配方量的麸皮、稻壳、米糠、碳酸钙和水混合均匀，经灭菌处理，得到细黄链霉菌固体发酵培养基。

培养基制备方法简单，适合大规模生产。

优选地，灭菌温度为110-130℃，和/或，灭菌时间为30-60min，优选 121℃灭菌40min。

灭菌温度典型但非限制性的例如为110℃、115℃、120℃、125℃或 130℃。

灭菌时间典型但非限制性的例如为30min、35min、40min、45min、 50min、55min或60min。

经过一定温度灭菌，获得无菌的细黄链霉菌固体发酵培养基。

根据本发明的第三个方面，提供了一种细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

任选地将细黄链霉菌菌株经种子活化和液体种子培养后，采用上述细黄链霉菌固体发酵培养基或上述细黄链霉菌固体发酵培养基的制备方法制备得到的细黄链霉菌固体发酵培养基进行发酵培养，得到发酵产物。

细黄链霉菌菌株可以从中国农业微生物菌种保藏管理中心获取，菌株编号为ACCC40027。

细黄链霉菌固体发酵培养基的描述与本发明第一方面或第二方面的描述相同。

该方法采用上述细黄链霉菌固体发酵培养基进行固体发酵培养，发酵效果好，能显著促进细黄链霉菌的生长，活菌数多，且发酵周期短，提高生产效率，适合工业化生产，菌活性和质量稳定性好，得到的发酵产物有效活菌数可达300亿/g以上，杂菌率低于10％，经试验发现其在防治农作物青枯病方面效果显著，提高了农作物的品质和产量。

在一种优选的实施方式中，细黄链霉菌的发酵方法包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌菌株在无菌条件下接种于斜面培养基上，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子接种于液体培养基中，得到液体种子；

(c)发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种于所述细黄链霉菌固体发酵培养基中，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物干燥后，得到干燥的发酵产物。

步骤(a)

种子活化是将保藏菌种从休眠状态转变成对数生长状态，以便菌种能很快适应扩大培养的需要，操作是接种保藏菌种于固体斜面。种子活化不仅活化菌种，也培养一定数量的斜面种子。

斜面培养基是固体培养基的一种形式，制作时应趁热定量分装于试管内，并凝固成斜面，用于菌种扩大转管及菌种保藏。将细黄链霉菌菌株在无菌条件下接种于斜面培养基，对细黄链霉菌种子进行活化。

优选地，斜面培养基包括8-12g/L的可溶性淀粉、8-12g/L的葡萄糖、 2-5g/L的酵母粉、0.5-1g/L的磷酸氢二钾、0.5-1g/L的硫酸镁和15-25g/L的琼脂，pH值为7.0-7.5。

可溶性淀粉典型但非限制性的含量，例如为8g/L、9g/L、10g/L、11g/L 或12g/L；葡萄糖典型但非限制性的含量，例如为8g/L、9g/L、10g/L、11g/L 或12g/L；酵母粉典型但非限制性的含量，例如为2g/L、3g/L、4g/L或5g/L；磷酸氢二钾典型但非限制性的含量，例如为0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、 0.9g/L或1g/L；硫酸镁典型但非限制性的含量，例如为0.5g/L、0.6g/L、 0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L或1g/L；琼脂典型但非限制性的含量，例如为15g/L、 16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L或 25g/L。

可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、磷酸氢二钾和硫酸镁是细黄链霉菌菌种的基础营养物质，通过各组分之间的合理配比关系，可满足细黄链霉菌菌种的生长需要。适宜生长的pH值为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。

优选地，步骤(a)中培养温度28-30℃，和/或，培养时间96-120h。

典型但非限制性的培养温度为28℃、29℃或30℃，和/或，典型但非限制性的培养时间为96h、100h、110h或120h，得到斜面种子。

步骤(b)

液体种子培养是经过扩大培养，获得供发酵接种的足够数量和优质质量的种子。扩大培养可经过摇瓶和种子罐进行逐级扩大培养。

优选地，将斜面种子用无菌水洗脱，接种于液体培养基中，接种量为 5-10％(v/v)。

接种量是指移入的斜面种子无菌水体积和接种后液体培养基体积的百分比。

典型但非限制性的接种量例如为5％、6％、7％、8％、9％或10％。

优选地，液体培养基包括8-12g/L的蛋白胨、8-12g/L的酵母浸粉、15-25g/L的葡萄糖和5-10g/L的碳酸钙，pH值为7.0-7.5。

蛋白胨典型但非限制性的含量，例如为8g/L、9g/L、10g/L、11g/L或 12g/L；酵母浸粉典型但非限制性的含量，例如为8g/L、9g/L、10g/L、11g/L 或12g/L；葡萄糖典型但非限制性的含量，例如为15g/L、16g/L、17g/L、 18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L或25g/L；碳酸钙典型但非限制性的含量，例如为5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L。

蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖和碳酸钙是菌种的基础营养物质，通过各组分之间的合理配比关系，可满足细黄链霉菌菌种的生长需要。适宜生长的pH值为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。

优选地，步骤(b)中培养温度28-30℃，和/或，培养时间30-48h。

典型但非限制性的培养温度为28℃、29℃或30℃，典型但非限制性的培养时间为30h、32h、34h、35h、36h、38h、40h、42h、44h、46h或48h，得到液体种子。

优选地，斜面培养基和液体培养基均独立地在使用前进行灭菌处理，灭菌温度为110-130℃，和/或，灭菌时间为20-30min，优选121℃灭菌25min。

灭菌温度典型但非限制性的例如为110℃、115℃、120℃、125℃或 130℃。

灭菌时间典型但非限制性的例如为20min、22min、25min、26min、28min 或30min。

优选地，采用高压蒸汽灭菌。培养基在制备过程中容易混入各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24h内完成灭菌。

经过在一定温度下灭菌获得无菌的斜面培养基和液体培养基。

步骤(c)

将液体种子接种于上述细黄链霉菌固体发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物。

优选地，步骤(c)中液体种子的接种量为15-25％(v/w)。

接种量是指移入的种子液体积和接种后固体培养基质量的百分比。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短菌丝繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来。

典型但非限制性的接种量例如为15％、16％、17％、18％、19％、20％、 21％、22％、23％、24％或25％。

优选地，步骤(c)中培养温度28-30℃，和/或，培养时间120-168h。

典型但非限制性的培养温度为28℃、29℃或30℃，典型但非限制性的培养时间为5天、6天或7天，得到发酵产物。

发酵时间过短，不利于菌种的繁殖与生长，发酵时间过长，不利于提高生产效率。

步骤(d)

最后对发酵产物进行干燥，优选烘干。

发酵后干燥主要是为了迅速降低发酵产生的大量水分，避免与空气接触感染变质。

优选地，步骤(d)中发酵产物在40-50℃下干燥至含水率小于10％。

典型但非限制性的烘干温度例如为40℃、42℃、44℃、45℃、46℃、 48℃或50℃。

优选地，一种典型的细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌菌株在无菌条件下接种于无菌斜面培养基上，培养温度28-30℃，培养时间96-120h，得到斜面种子；

所述斜面培养基包括8-12g/L的可溶性淀粉、8-12g/L的葡萄糖、2-5g/L 的酵母粉、0.5-1g/L的磷酸氢二钾、0.5-1g/L的硫酸镁和15-25g/L的琼脂， pH值为7.0-7.5；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，以 5-10％(v/v)的接种量接种于无菌液体培养基中，培养温度28-30℃，培养时间30-48h，得到液体种子；

所述液体培养基包括8-12g/L的蛋白胨、8-12g/L的酵母浸粉、15-25g/L 的葡萄糖和5-10g/L的碳酸钙，pH值为7.0-7.5；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子以15-25％(v/w)的接种量接种于无菌细黄链霉菌固体发酵培养基中，混合均匀，培养温度 28-30℃，培养时间120-168h，得到发酵产物；

所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括40-50重量份的麸皮、15-25重量份的稻壳、25-35重量份的米糠、3-7重量份的碳酸钙和水，含水率45-55％；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于40-50℃下干燥，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，干燥结束，粉碎后得到干燥的发酵产物。

根据本发明的第四个方面，提供了一种上述细黄链霉菌的发酵方法发酵得到的细黄链霉菌发酵产物。

本发明通过上述细黄链霉菌的发酵方法得到的细黄链霉菌发酵产物活菌数高、杂菌率低，有效活菌数可达300亿/g以上，杂菌率低于10％，能高效地防治农作物青枯病，还能有效促进作物生长和提高作物产量。

根据本发明的第五个方面，提供了一种包括上述细黄链霉菌发酵产物的生防产品。

生防产品指生物防控型产品，例如生物制剂或生物农药等。

该生防产品具有与上述发酵产物相同的优势。

根据本发明的第六个方面，提供了一种上述细黄链霉菌发酵产物或上述生防产品在防治农作物青枯病中的应用。

优选地，所述农作物包括番茄或辣椒；

利用该发酵产物可制备生物制剂或生物农药，在防治农作物特别是番茄和辣椒青枯病方面效果显著，提高了农作物的品质和产量，可应用于农业生物防治领域。

优选地，将细黄链霉菌发酵产物或生防产品稀释至有效活菌数0.9-1.5 亿/mL(例如0.9亿/mL、1亿/mL或1.5亿/mL)，施用在农作物移栽后和座果期；

优选地，施用方式为灌根。

采用以上方式施用能够起到显著防治农作物青枯病和提高了农作物品质和产量的效果。

为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明的方法及效果作进一步详细的说明。

实施例1

一种细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌ACCC 40027在无菌条件下接种于由8g/L的可溶性淀粉、12g/L的葡萄糖、2g/L的酵母粉、1g/L的磷酸氢二钾、0.5g/L的硫酸镁和25g/L的琼脂，pH 7.0，121℃灭菌25min配制的斜面培养基上，培养温度28℃，培养时间120h，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，并用无菌移液管接种到由8g/L的蛋白胨、12g/L的酵母浸粉、15g/L的葡萄糖和10g/L的碳酸钙，pH 7.0，121℃灭菌25min配制的液体培养基中，液体培养基为1L三角瓶装样量200mL，接种量15mL/瓶，培养温度28℃，摇床180r/min，培养时间48h，得到液体种子；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种到由48重量份的麸皮、23重量份的稻壳、28重量份的米糠、6重量份的碳酸钙和水，含水率50％，pH自然，121℃灭菌40min配制的固体发酵培养基中，接种量 15％(v/w)，1L固体培养瓶装300g固体料，搅拌均匀，培养温度28℃，培养时间168h，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于40℃下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，烘干结束，并将固体物进行粉碎至80目，进行分装，得到干燥的发酵产物。

实施例2

一种细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌ACCC 40027在无菌条件下接种于由12g/L的可溶性淀粉、8g/L的葡萄糖、5g/L的酵母粉、0.5g/L的磷酸氢二钾、1g/L的硫酸镁和15g/L的琼脂，pH7.5，121℃灭菌25min配制的斜面培养基上，培养温度30℃，培养时间96h，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，并用无菌移液管接种到由12g/L的蛋白胨、8g/L的酵母浸粉、25g/L的葡萄糖和5g/L的碳酸钙，pH 7.5，121℃灭菌25min配制的液体培养基中，液体培养基为1L三角瓶装样量200mL，接种量10mL/瓶，培养温度30℃，摇床 180r/min，培养时间30h，得到液体种子；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种到由42重量份的麸皮、18重量份的稻壳、32重量份的米糠、5重量份的碳酸钙和水，含水率55％，pH自然，121℃灭菌40min配制的固体发酵培养基中，接种量 25％(v/w)，1L固体培养瓶装300g固体料，搅拌均匀，培养温度30℃，培养时间120h，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于50℃下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，烘干结束，并将固体物进行粉碎至80目，进行分装，得到干燥的发酵产物。

实施例3

一种细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌ACCC 40027在无菌条件下接种于由10g/L的可溶性淀粉、10g/L的葡萄糖、3g/L的酵母粉、0.5g/L的磷酸氢二钾、0.5g/L的硫酸镁和20g/L的琼脂，pH 7.2，121℃灭菌25min配制的斜面培养基上，培养温度29℃，培养时间108h，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，并用无菌移液管接种到由10g/L的蛋白胨、10g/L的酵母浸粉、20g/L的葡萄糖和8g/L的碳酸钙，pH 7.2，121℃灭菌25min配制的液体培养基中，液体培养基为1L三角瓶装样量200mL，接种量12mL/瓶，培养温度29℃，摇床180r/min，培养时间36h，得到液体种子；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种到由45重量份的麸皮、20重量份的稻壳、30重量份的米糠、5重量份的碳酸钙和水，含水率50％，pH自然，121℃灭菌40min配制的固体发酵培养基中，接种量 20％(v/w)，1L固体培养瓶装300g固体料，搅拌均匀，培养温度29℃，培养时间144h，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于45℃下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，烘干结束，并将固体物进行粉碎至80目，进行分装，得到干燥的发酵产物。

实施例4

一种细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌ACCC 40027在无菌条件下接种于由9g/L的可溶性淀粉、9g/L的葡萄糖、4g/L的酵母粉、1g/L的磷酸氢二钾、 1g/L的硫酸镁和20g/L的琼脂，pH 7.1，121℃灭菌25min配制的斜面培养基上，培养温度28℃，培养时间96h，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，并用无菌移液管接种到由8g/L的蛋白胨、8g/L的酵母浸粉、25g/L的葡萄糖和10g/L的碳酸钙，pH 7.1，121℃灭菌25min配制的液体培养基中，液体培养基为1L三角瓶装样量200mL，接种量15mL/瓶，培养温度28℃，摇床180r/min，培养时间30h，得到液体种子；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种到由50重量份的麸皮、25重量份的稻壳、25重量份的米糠、3重量份的碳酸钙和水，含水率45％，pH自然，121℃灭菌40min配制的固体发酵培养基中，接种量 20％(v/w)，1L固体培养瓶装300g固体料，搅拌均匀，培养温度30℃，培养时间168h，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于45℃下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，烘干结束，并将固体物进行粉碎至80目，进行分装，得到干燥的发酵产物。

实施例5

一种细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌ACCC 40027在无菌条件下接种于由11g/L的可溶性淀粉、11g/L的葡萄糖、4g/L的酵母粉、0.8g/L的磷酸氢二钾、0.8g/L的硫酸镁和18g/L的琼脂，pH 7.4，121℃灭菌25min配制的斜面培养基上，培养温度30℃，培养时间120h，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，并用无菌移液管接种到由12g/L的蛋白胨、12g/L的酵母浸粉、15g/L的葡萄糖和5g/L的碳酸钙，pH 7.4，121℃灭菌25min配制的液体培养基中，液体培养基为1L三角瓶装样量200mL，接种量15mL/瓶，培养温度30℃，摇床180r/min，培养时间48h，得到液体种子；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种到由50重量份的麸皮、15重量份的稻壳、35重量份的米糠、3重量份的碳酸钙和水，含水率55％，pH自然，121℃灭菌40min配制的固体发酵培养基中，接种量25％(v/w)，1L固体培养瓶装300g固体料，搅拌均匀，培养温度28℃，培养时间120h，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于50℃下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，烘干结束，并将固体物进行粉碎至80目，进行分装，得到干燥的发酵产物。

实施例6

一种细黄链霉菌的发酵方法，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌ACCC 40027在无菌条件下接种于由10g/L的可溶性淀粉、10g/L的葡萄糖、3g/L的酵母粉、1g/L的磷酸氢二钾、0.8g/L的硫酸镁和20g/L的琼脂，pH 7.3，121℃灭菌25min配制的斜面培养基上，培养温度30℃，培养时间108h，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，并用无菌移液管接种到由10g/L的蛋白胨、10g/L的酵母浸粉、22g/L的葡萄糖和6g/L的碳酸钙，pH 7.3，121℃灭菌25min配制的液体培养基中，液体培养基为1L三角瓶装样量200mL，接种量15mL/瓶，培养温度28℃，摇床180r/min，培养时间36h，得到液体种子；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种到由40重量份的麸皮、25重量份的稻壳、25重量份的米糠、7重量份的碳酸钙和水，含水率50％，pH自然，121℃灭菌40min配制的固体发酵培养基中，接种量 15％(v/w)，1L固体培养瓶装300g固体料，搅拌均匀，培养温度30℃，培养时间144h，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于40℃下烘干，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，烘干结束，并将固体物进行粉碎至80目，进行分装，得到干燥的发酵产物。

实施例7

一种细黄链霉菌的发酵方法，除了步骤(c)接种量为10％以外，其余步骤与实施例1相同。

实施例8

一种细黄链霉菌的发酵方法，除了步骤(c)培养时间为96h以外，其余步骤与实施例1相同。

对比例1

一种细黄链霉菌的发酵方法，除了步骤(c)中固体发酵培养基由20 重量份的稻壳、30重量份的米糠、5重量份的碳酸钙和水，含水率50％， pH自然，121℃灭菌40min配制而成；

固体发酵培养基中没有麸皮，其余步骤与实施例3相同。

对比例2

一种细黄链霉菌的发酵方法，除了步骤(c)中固体发酵培养基由45 重量份的麸皮、30重量份的米糠、5重量份的碳酸钙和水，含水率50％， pH自然，121℃灭菌40min配制而成；

固体发酵培养基中没有稻壳，其余步骤与实施例3相同。

对比例3

一种细黄链霉菌的发酵方法，除了步骤(c)中固体发酵培养基由45 重量份的麸皮、20重量份的稻壳、5重量份的碳酸钙和水，含水率50％， pH自然，121℃灭菌40min配制而成；

固体发酵培养基中没有米糠，其余步骤与实施例3相同。

对比例4

一种细黄链霉菌的发酵方法，除了步骤(c)中固体发酵培养基45重量份的麸皮、20重量份的稻壳、30重量份的米糠和水，含水率50％，pH 自然，121℃灭菌40min配制而成；

固体发酵培养基中没有碳酸钙，其余步骤与实施例3相同。

对比例5

一种细黄链霉菌的发酵方法，除了步骤(c)中固体发酵培养基由30 重量份的麸皮、30重量份的稻壳、10重量份的米糠、10重量份的碳酸钙和水，含水率50％，pH自然，121℃灭菌40min配制而成；

固体发酵培养基中麸皮、稻壳、米糠、碳酸钙配比与本发明不同，其余步骤与实施例3相同。

效果例1发酵产物活菌计数

对各实施例和各对比例得到的发酵产物进行活菌计数，得到有效活菌数和杂菌率。

活菌计数：以平板涂布法进行计数。

试验结果如表1所示。

表1发酵产物有效活菌数和杂菌率结果

由表1可以看出，本发明的发酵产物中细黄链霉菌有效活菌数可达300 亿/g以上，杂菌率低于10％。

实施例1与实施例7相比，实施例1的液体种子的接种量较实施例7 大，发酵产物中有效活菌数更多，杂菌率更低。这是由于接种量大，促进菌种生长繁殖，得到的有效活菌数更多。实施例1与实施例8相比，实施例1的固体发酵培养时间更长，得到的发酵产物中有效活菌数更多，杂菌率更低，可见在一定温度下保证一定的培养时间，菌种生长繁殖更好。

对比例1～对比例5的有效活菌数与实施例相比有显著降低，杂菌也有所增加。这是由于对比例1～对比例4采用的固体发酵培养基中缺少部分营养成分，不能使细黄链霉菌得到有效生长繁殖，对比例5采用的固体发酵培养基中的营养成分配比与本发明不同，也不能获得较好的发酵效果。

效果例2防治辣椒青枯病田间试验

1)供试药剂

生防菌产品：选择实施例3细黄链霉菌发酵产物；

化学杀菌剂：77％可杀得；

2)供试作物

移栽7d后，长势基本一致的辣椒苗；每组处理数为300棵。

3)试验地情况、试验设计及安排

试验田选择在山东省济南市唐王镇辣椒种植大棚，选择地块的特点是常年种植辣椒，重茬现象严重，往年该地块的辣椒青枯病发病严重，试验期间种植管理条件一致。

4)施用方法

处理组A：细黄链霉菌发酵产物，稀释200倍，施用方式是灌根，移栽后和座果期；

处理组B：77％可杀得，稀释500倍，施用方式是灌根，移栽后和座果期；

空白组CK：清水，施用方式是灌根，移栽后和座果期。

以上处理三次重复。

5)施用效果

处理组A：施用细黄链霉菌发酵产物的辣椒发病率为54.7％，防治效果达到76.3％；

处理组B：施用77％可杀得的辣椒发病率为59.2％，防治效果达到 73.1％；

空白组CK：施用清水对照组的辣椒发病率67％，死棵现象严重。

试验结果表明，与其他处理试验结果相比，施用细黄链霉菌发酵产物对辣椒青枯病的预防和防治效果明显，减少病棵和死棵的数量，从而提高作物的产量，增加种植户的经济效益。

效果例3防治番茄青枯病田间试验

1)供试药剂

生防菌产品：选择实施例3细黄链霉菌发酵产物；

化学杀菌剂：青枯立克；

2)供试作物

移栽7d后，长势基本一致的番茄；每组处理数为400棵。

3)试验地情况、试验设计及安排

试验田选择在山东省青岛市平度的番茄种植大棚，选择地块的特点是常年种植番茄重茬现象严重，往年该地块的番茄青枯病发病严重，试验期间种植管理条件一致。

4)施用方法

处理组A：细黄链霉菌发酵产物，稀释200倍，施用方式是灌根，移栽后和座果期；

处理组B：青枯立克，稀释600倍，施用方式是灌根，移栽后和座果期；

空白组CK：清水，施用方式是灌根，移栽后和座果期。

以上处理三次重复。

5)施用效果

处理组A：施用细黄链霉菌发酵产物的番茄发病率为51.2％，防治效果达到75.8％；

处理组B：施用青枯立克的番茄发病率为53.3％，防治效果达到73.9％；

空白组CK：施用清水对照组的番茄发病率61％，死棵现象严重。

试验结果表明，与其他处理组相比，施用细黄链霉菌发酵产物对番茄青枯病的预防和防治效果明显，减少病棵和死棵的数量，从而提高作物的产量，增加种植户的经济效益。

以上可以看出，采用本发明得到的细黄链霉菌发酵方法得到的发酵产物在防治番茄和辣椒青枯病方面效果显著，提高了番茄和辣椒的品质和产量。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种细黄链霉菌固体发酵培养基，其特征在于，所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮40-50份、稻壳15-25份、米糠25-35份、碳酸钙3-7份和水；

优选地，所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮42-48份、稻壳18-23份、米糠28-32份、碳酸钙3-6份和水；

优选地，所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括以下重量份的组分：麸皮44-46份、稻壳19-21份、米糠29-31份、碳酸钙4-5份和水；

优选地，所述细黄链霉菌固体发酵培养基的含水率为45-55％。

2.一种权利要求1所述的细黄链霉菌固体发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将配方量的麸皮、稻壳、米糠、碳酸钙和水混合均匀，经灭菌处理，得到细黄链霉菌固体发酵培养基；

优选地，灭菌温度为110-130℃，灭菌时间为30-60min，优选121℃灭菌40min。

3.一种细黄链霉菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

任选地将细黄链霉菌菌株经种子活化和液体种子培养后，采用权利要求1所述的细黄链霉菌固体发酵培养基或权利要求2所述的细黄链霉菌固体发酵培养基的制备方法制备得到的细黄链霉菌固体发酵培养基进行发酵培养，得到发酵产物。

4.按照权利要求3所述的细黄链霉菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌菌株在无菌条件下接种于斜面培养基上，得到斜面种子；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子接种于液体培养基中，得到液体种子；

(c)发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子接种于所述细黄链霉菌固体发酵培养基中，得到发酵产物；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物干燥后，得到干燥的发酵产物。

5.按照权利要求4所述的细黄链霉菌的发酵方法，其特征在于，步骤(c)中液体种子的接种量为15-25％(v/w)；

优选地，步骤(c)中培养温度28-30℃，培养时间120-168h；

优选地，步骤(a)中培养温度28-30℃，培养时间96-120h；

优选地，步骤(b)中斜面种子用无菌水洗脱，接种于液体培养基中，接种量为5-10％(v/v)；

优选地，步骤(b)中培养温度28-30℃，培养时间30-48h。

6.按照权利要求4或5所述的细黄链霉菌的发酵方法，其特征在于，步骤(a)中斜面培养基包括8-12g/L的可溶性淀粉、8-12g/L的葡萄糖、2-5g/L的酵母粉、0.5-1g/L的磷酸氢二钾、0.5-1g/L的硫酸镁和15-25g/L的琼脂，pH值为7.0-7.5；

优选地，步骤(b)中液体培养基包括8-12g/L的蛋白胨、8-12g/L的酵母浸粉、15-25g/L的葡萄糖和5-10g/L的碳酸钙，pH值为7.0-7.5；

优选地，斜面培养基和液体培养基均独立地在使用前进行灭菌处理，灭菌温度为110-130℃，和/或，灭菌时间为20-30min，优选121℃灭菌25min；

优选地，步骤(d)中发酵产物在40-50℃下干燥至含水率小于10％。

7.按照权利要求4或5所述的细黄链霉菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)斜面种子活化：将细黄链霉菌菌株在无菌条件下接种于无菌斜面培养基上，培养温度28-30℃，培养时间96-120h，得到斜面种子；

所述斜面培养基包括8-12g/L的可溶性淀粉、8-12g/L的葡萄糖、2-5g/L的酵母粉、0.5-1g/L的磷酸氢二钾、0.5-1g/L的硫酸镁和15-25g/L的琼脂，pH值为7.0-7.5；

(b)液体种子培养：将步骤(a)得到的斜面种子用无菌水洗脱，以5-10％(v/v)的接种量接种于无菌液体培养基中，培养温度28-30℃，培养时间30-48h，得到液体种子；

所述液体培养基包括8-12g/L的蛋白胨、8-12g/L的酵母浸粉、15-25g/L的葡萄糖和5-10g/L的碳酸钙，pH值为7.0-7.5；

(c)固体发酵培养：将步骤(b)得到的液体种子以15-25％(v/w)的接种量接种于无菌细黄链霉菌固体发酵培养基中，混合均匀，培养温度28-30℃，培养时间120-168h，得到发酵产物；

所述细黄链霉菌固体发酵培养基包括40-50重量份的麸皮、15-25重量份的稻壳、25-35重量份的米糠、3-7重量份的碳酸钙和水，含水率45-55％；

(d)将步骤(c)得到的发酵产物于40-50℃下干燥，期间取样测定水分，当含水率低于10％时，干燥结束，粉碎后得到干燥的发酵产物。

8.权利要求3-7任一项所述的细黄链霉菌的发酵方法发酵得到的细黄链霉菌发酵产物。

9.包括权利要求8所述的细黄链霉菌发酵产物的生防产品。

10.权利要求8所述的细黄链霉菌发酵产物或权利要求9所述的生防产品在防治农作物青枯病中的应用；

优选地，所述农作物包括番茄或辣椒；

优选地，将所述细黄链霉菌发酵产物或所述生防产品稀释至有效活菌数0.9-1.5亿/mL，施用在农作物移栽后和座果期；

优选地，施用方式为灌根。