CN113215040A - 一种5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

一种5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法，该培养基包含以下重量百分数的组分：30～65％碎米和豆粕、10～30％麦麸、20～40％土，且所述豆粕和碎米的质量比为2：7～3：6；该培养基采用石灰和过磷酸钙调节pH值，石灰占该培养基组分总质量的1％，过磷酸钙占该培养基组分总质量的1％。本发明的5406放线菌固体发酵培养基培养的5406放线菌的活菌数远远高于国家标准，有利于5406放线菌的发酵培养，为5406放线菌菌肥的生产提供保障。

Description

一种5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法
技术领域
本发明涉及一种放线菌固体发酵培养基，具体涉及一种5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法。
背景技术
5406放线菌(Streptomycesjingyanggensis)又名泾阳链霉菌，是一类生防型放线菌，其代谢过程中能够产生次级代谢抗菌素、生长素以及细胞分裂素等生物活性物质，能够刺激种子生根、发芽，对土著性病原菌具有较好的抑菌作用，减少种子受病害侵害，使土壤中无效磷、钾得到转化，促进作物生长，防止作物及果蔬枯萎病、白粉病等多种病害的发生，提高作物及果蔬的品质及产量。
目前，培养5406放线菌试管菌种常用高氏1号培养基，在5406放线菌培养过程中常发生菌丝生长慢、甚至停止生长等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法，该培养基培养的5406放线菌的活菌数远远高于国家标准，有利于5406放线菌的发酵培养，为5406放线菌菌肥的生产提供保障。
为了达到上述目的，本发明提供了一种5406放线菌固体发酵培养基，该培养基包含以下重量百分数的组分：30～65％碎米和豆粕、10～30％麦麸、20～40％土，且所述豆粕和碎米的质量比为2：7～3：6；该培养基采用石灰和过磷酸钙调节pH值，石灰占该培养基组分总质量的1％，过磷酸钙占该培养基组分总质量的1％。
优选地，该培养基包含以下重量百分数的组分：45～50％碎米和豆粕、10～15％麦麸、40％土。
优选地，该培养基包含以下重量百分数的组分：45％碎米和豆粕、15％麦麸、40％土。
优选地，所述豆粕和碎米的质量比为2：7。
本发明的另一目的是提供一种5406放线菌固体发酵方法，该方法采用所述的培养基发酵5406放线菌。
优选地，该方法包含：将5406放线菌种子悬液接种于如权利要求1-4中任意一项所述的培养基中，所述5406放线菌种子悬液与所述的培养基的体积质量比为1：5，在28～31℃的条件下培养96～144h。
优选地，所述5406放线菌种子悬液的制备，包含：将活化后的5406放线菌平板用无菌水洗涤，制成菌悬液；取所述菌悬液接种于B培养基中，所述菌悬液与B培养基的体积比为1～2：50，于28～32℃，200rpm振荡培养4～7d；所述B培养基包含：马铃薯、碎米、豆粉和蔗糖，所述马铃薯、碎米、豆粉和蔗糖的质量比为20：1：1：3。
优选地，所述B培养基的制备，包含：将马铃薯和碎米按比例称取并用水熬煮，过滤，在滤液中加入按比例称量的豆粉和蔗糖，混匀，高压灭菌，得到B培养基。
优选地，所述5406放线菌平板的制备，包含：将5406放线菌接种于高温灭菌后的A培养基的平板上活化，置于温度为28～31℃的恒温箱中培养96～144h；其中，所述A培养基为高氏一号培养基。
优选地，所述A培养基的制备，包含：称取改良高氏一号培养基37.5g，于1000mL蒸馏水中加热溶解，121℃高压灭菌15min，冷却后加入无菌的3％重铬酸钾溶液1mL，混匀。
本发明的5406放线菌固体发酵培养基及发酵方法，具有以下优点：
本发明的5406放线菌固体发酵培养基，采用碎米、豆粕、麦麸和土，各组分的含量对5406放线菌的发酵均有较大的影响，尤其碎米和豆粕的比例，当豆粕和碎米的比例为2:7时，发酵得到的5406放线菌的活菌数最多，而且以土含量为40％和麦麸含量为15％的效果最好，活菌数最多，为9.1×108cfu/g。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1不同豆粕/碎米比例对5406放线菌发酵的影响
(1)5406放线菌种子悬液的制备
将活化后的5406放线菌平板用2～5mL的无菌水洗涤平板，制成菌悬液，接着取1mL的5406放线菌分别接种于含50mL的B培养基的100mL三角瓶中，于28～32℃，200rpm振荡培养4～7d。
上述B培养基的制作方法为：称取200g马铃薯、10g碎米、10g豆粉和30g蔗糖，将称好的马铃薯和碎米用约700mL蒸馏水熬煮30min，过滤，之后在滤液中加入称好的豆粉和蔗糖，混匀，定容至1000mL，经121℃高压灭菌20min。
(2)5406放线菌固体发酵配方的制备
共设5个处理，豆粕和碎米的质量比按照1：8、2：7、3：6、4：5、5：4的比例进行配比，麦麸的质量百分数为15％、土的质量百分数为40/％，加1％(占豆粕、碎米、麦麸和土总质量的比例)石灰和1％(占豆粕、碎米、麦麸和土总质量的比例)过磷酸钙，1％石灰和1％过磷酸钙起稳定pH的作用，pH约7.0左右，具体配方见表1。
将碎米、豆粕、麦麸、土、石灰和过磷酸钙按设置比例混合均匀，在121℃条件下灭菌20min，待培养基降到室温后将5406放线菌接种于发酵瓶中，每个发酵瓶中的培养基为50g，每个发酵瓶接种量为10mL，接种后在30℃条件下持续培养7d，称取发酵好的同配方的3瓶处理各1g共3g，加入3mL水混匀，取100μL溶液加入到900μL水中，稀释至10-6，摇匀后取100μL置于90*90培养皿上涂板。
结果如下表1所示，豆粕：碎米的质量比为2：7、3：6、4：5、5：4时，活菌数均可达到国家标准(2.0×108cfu/g)；当豆粕：碎米的质量比为2：7时，活菌数最多，为5.4×108cfu/g。
表1豆粕和碎米的比例对5406放线菌固体发酵的影响
Figure BDA0003061083170000031
Figure BDA0003061083170000041
实验例2不同土含量对5406放线菌发酵的影响
(1)5406放线菌种子悬液的制备同实验例1。
(2)5406放线菌固体发酵配方的制备
共设4个处理，固定豆粕/碎米的质量比为2：7，麦麸的质量百分比为15％，土按照质量百分比为0、20％、40％、60％的比例进行配比，加1％(占豆粕、碎米、麦麸和土总质量的比例)石灰和1％(占豆粕、碎米、麦麸和土总质量的比例)过磷酸钙，自然pH值，每个处理3个重复，具体处理配比见表2。
将碎米、豆粕、麦麸、土、石灰和过磷酸钙按设置比例混合均匀，在121℃条件下灭菌20min，待培养基降到室温后将5406放线菌接种于发酵瓶中，每个发酵瓶中的培养基为50g，每个发酵瓶接种量为10mL，接种后在30℃条件下持续培养7d，称取发酵好的同配方的3瓶处理各1g共3g，加入3mL水混匀，取100μL溶液加入到900μL水中，稀释至10-6，摇匀后取100μL置于90*90培养皿上涂板。
结果如下表2所示，豆粕/碎米的比量比固定为2:7，麦麸含量为15％，当土含量为0、20％、60％时，活菌数均可达到国家标准(2.0×108cfu/g)；当土含量为40％时，活菌数最多，为8.3×108cfu/g。
表2不同土含量对5406放线菌发酵的影响
Figure BDA0003061083170000042
实验例3不同麦麸含量对5406放线菌发酵的影响
(1)5406放线菌种子悬液的制备同实验例1。
(2)5406放线菌固体发酵配方的制备
共设3个处理，固定豆粕：碎米的质量比为2:7，土的质量百分比为40％，麦麸按照质量百分比为0、15％、30％的比例进行配比，加1％(占豆粕、碎米、麦麸和土总质量的比例)石灰和1％(占豆粕、碎米、麦麸和土总质量的比例)过磷酸钙，自然pH值，每个处理3个重复，具体处理配比见表3。
将碎米、豆粕、麦麸、土、石灰和过磷酸钙按设置比例混合均匀，在121℃条件下灭菌20min，待培养基降到室温后将5406放线菌接种于发酵瓶中，每个发酵瓶中的培养基为50g，每个发酵瓶接种量为10mL，接种后在30℃条件下持续培养7d，称取发酵好的同配方的3瓶处理各1g共3g，加入3mL水混匀，取100μL溶液加入到900μL水中，稀释至10-6，摇匀后取100μL置于90*90培养皿上涂板。
结果如下表3所示，豆粕/碎米的比量比固定为2：7，土的质量百分比为40％，当麦麸含量为15％和30％时，活菌数均可达到国家标准(2.0×108cfu/g)；当麦麸含量为15％时，活菌数最多，为8.6×108cfu/g。
表3不同麦麸含量对5406放线菌发酵的影响
Figure BDA0003061083170000051
实验例4不同豆粕/碎米比例与麦麸含量组合对5406放线菌发酵的影响
(1)5406放线菌种子悬液的制备同实验例1。
(2)5406放线菌固体发酵配方的制备
共设9个处理，土的质量百分比固定为40/％，豆粕和碎米的质量比按照1：8、2：7、3：6的比例配比，麦麸的质量百分比为10％、15％、20％的比例设置添加量，每个处理3个重复，具体处理配比见表4。
将碎米、豆粕、麦麸、土、石灰和过磷酸钙按设置比例混合均匀，在121℃条件下灭菌20min，待培养基降到室温后将5406放线菌接种于发酵瓶中，每个发酵瓶中的培养基为50g，每个发酵瓶接种量为10mL，接种后在30℃条件下持续培养7d，称取发酵好的同配方的3瓶处理各1g共3g，加入3mL水混匀，取100μL溶液加入到900μL水中，稀释至10-5，摇匀后取100μL置于90*90培养皿上涂板。结果如表4所示。
结果如下表4所示，豆粕/碎米的质量比为2：7，麦麸含量为15％，土含量为40％时，活菌数最多，为9.1×108cfu/g。
表4不同豆粕/碎米比例与麦麸含量组合对5406放线菌发酵的影响
Figure BDA0003061083170000061
应用实例5：5406放线菌的浅盆发酵
按照土的质量百分比为40％，豆粕/碎米的质量比为2：7(10％豆粕，35％碎米)，麦麸的质量百分比为15％的比例制备培养基，加1％(占豆粕、碎米、麦麸和土总质量的比例)石灰和1％(占豆粕、碎米、麦麸和土总质量的比例)过磷酸钙，自然pH值，含水量约45％，每个处理3个重复。将碎米、豆粕、麦麸、土、石灰和过磷酸钙按设置比例混合均匀，装入浅盆中，料高3～5cm，在121℃条件下灭菌20min。
待培养基温度降到室温后，将实验例4处理5发酵后的培养物按1：5的比例接种到灭菌浅盆中，接种后在30℃条件下持续培养7d。
称取发酵好的培养物3盆各1g共3g，加入3mL水混匀，取100μL溶液加入到900μL水中，稀释至10-5，摇匀后取100μL置于90*90培养皿上涂板计数。
结果表明，浅盆发酵获得的5406放线菌活菌数为14.3×108cfu/g。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种5406放线菌固体发酵培养基，其特征在于，该培养基包含以下重量百分数的组分：30～65％碎米和豆粕、10～30％麦麸、20～40％土，且所述豆粕和碎米的质量比为2：7～3：6；该培养基采用石灰和过磷酸钙调节pH值，石灰占该培养基组分总质量的1％，过磷酸钙占该培养基组分总质量的1％。
2.根据权利要求1所述的5406放线菌固体发酵培养基，其特征在于，该培养基包含以下重量百分数的组分：45～50％碎米和豆粕、10～15％麦麸、40％土。
3.根据权利要求1所述的5406放线菌固体发酵培养基，其特征在于，该培养基包含以下重量百分数的组分：45％碎米和豆粕、15％麦麸、40％土。
4.根据权利要求3所述的5406放线菌固体发酵培养基，其特征在于，所述豆粕和碎米的质量比为2：7。
5.一种5406放线菌固体发酵方法，其特征在于，该方法采用如权利要求1-4中任意一项所述的培养基发酵5406放线菌。
6.根据权利要求5所述的5406放线菌固体发酵方法，其特征在于，该方法包含：
将5406放线菌种子悬液接种于如权利要求1-4中任意一项所述的培养基中，所述5406放线菌种子悬液与所述的培养基的体积质量比为1：5，在28～31℃的条件下培养96～144h。
7.根据权利要求6所述的5406放线菌固体发酵方法，其特征在于，所述5406放线菌种子悬液的制备，包含：
将活化后的5406放线菌平板用无菌水洗涤，制成菌悬液；取所述菌悬液接种于B培养基中，所述菌悬液与B培养基的体积比为1～2：50，于28～32℃，200rpm振荡培养4～7d；
所述B培养基包含：马铃薯、碎米、豆粉和蔗糖，所述马铃薯、碎米、豆粉和蔗糖的质量比为20：1：1：3。
8.根据权利要求5所述的5406放线菌固体发酵方法，其特征在于，所述B培养基的制备，包含：
将马铃薯和碎米按比例称取并用水熬煮，过滤，在滤液中加入按比例称量的豆粉和蔗糖，混匀，高压灭菌，得到B培养基。
9.根据权利要求5所述的5406放线菌固体发酵方法，其特征在于，所述5406放线菌平板的制备，包含：
将5406放线菌接种于高温灭菌后的A培养基的平板上活化，置于温度为28～31℃的恒温箱中培养96～144h；其中，所述A培养基为高氏一号培养基。
10.根据权利要求9所述的5406放线菌固体发酵方法，其特征在于，所述A培养基的制备，包含：
称取改良高氏一号培养基37.5g，于1000mL蒸馏水中加热溶解，121℃高压灭菌15min，冷却后加入无菌的3％重铬酸钾溶液1mL，混匀。
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