CN116814723B - 一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法 - Google Patents
一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，该方法是在普通高氏一号培养基中添加添加色氨酸和乳糖进行5406链霉素培养同时生产获得细胞分裂素和生长素。本发明首次解决同时产生获得细胞分裂素和生长素的5406链霉菌发酵的问题，操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法。
背景技术
5406链霉菌，又称泾阳链霉菌（Streptomyces jingyanggensis），是植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)的典型代表。5406链霉菌在我国作为抗生菌肥料已有多年，是从我国陕西泾阳等地土壤中分离到的，通过分类研究定名为泾阳链霉菌，5406为这个新种的典型菌株，在中国农业微生物菌种保藏管理中心菌种保藏号为ACCC40021，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为4.891。5406链霉菌不仅能抑制30多种病原菌的生长，同时还具有刺激植物生根、发芽等性能。5406链霉菌能产生抗病物质起到防治植物病害的作用，但其产生的具体物质、以及同时生产生长素和细胞分裂素的发酵方法尚无报道。
发明内容
本发明旨在提供一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，以填补现有技术的空白。
本发明技术方案如下：
一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，包括以下步骤：
（1）5406链霉菌活化；
（2）培养基配方及配制：在高氏一号液体培养基中添加色氨酸和乳糖（Lactobiose，CAS号：63-42-3）；
（3）5406链霉菌培养：取活化后的5406链霉菌单菌落，接种在步骤（2）所述培养基中，震荡培养。
优选的，色氨酸和乳糖在培养基中的添加量分别为色氨酸10~12 g/L、乳糖20~60g/L。
优选的，色氨酸和乳糖在培养基中的添加量分别为色氨酸11g/L、乳糖40g/L。
优选的，震荡培养的条件为转速250±50 rpm、温度30±2℃。
优选的，震荡培养的时间为至少5 d。
优选的，震荡培养的时间为5-6 d。
优选的，所述生长素包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-甲酸。
优选的，所述细胞分裂素包括呋喃甲基腺嘌呤-9-葡萄糖苷、玉米素。
与现有技术相比，本发明的有益成果在于：
（1）本发明提供了一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，填补了5406链霉菌同时生产生长素和细胞分裂素的发酵技术方面的空白。
（2）本发明在高氏一号培养基的基础上，同时添加色氨酸和乳糖进行发酵，可同时生产得到多种生长素和细胞分裂素。
（3）本发明方法简单、操作方便，利于科研工作者的研究。
附图说明
图1：质谱多反应监测模式（MRM）示意图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
实施例1 一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法
(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种（来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC 4.891）从-80℃ 取出，在PDA无抗平板上划线，30±2℃培养2-3天。
(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加色氨酸10g/L和乳糖20g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
(3)5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50 rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定生长素、细胞分裂素含量。
测试方法如下：
样本前处理：
移取50 μL样本，分别加入10 μL浓度为100 ng/mL的内标混合溶液，混匀，浓缩至干；浓缩后用100 μL 80%甲醇/水溶液复溶，过0.22 μm滤膜，置于进样瓶中，用于LC-MS/MS分析。
色谱质谱采集条件：
数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱（Ultra Performance LiquidChromatography，UPLC）（ExionLC™ AD，https://sciex.com.cn/）和串联质谱（TandemMass Spectrometry，MS/MS）（QTRAP® 6500+，https://sciex.com.cn/）。
液相条件主要包括：
1）色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（1.8 µm，100 mm×2.1 mmi.d.）；
2）流动相：A相，超纯水（加入0.04%的乙酸）；B相，乙腈（加入0.04%的乙酸）；
3）梯度洗脱程序：0 min A/B为95:5（V/V），1.0 min A/B为95:5（V/V），8.0 min为5:95（V/V），9.0 min为5:95（V/V），9.1 min为95:5（V/V），12.0 min为95:5（V/V）；
4）流速0.35 mL/min；柱温40°C；进样量2 μL。
质谱条件主要包括：
电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）温度550 °C，正离子模式下质谱电压 5500 V，负离子模式下质谱电压-4500 V，气帘气（Curtain Gas，CUR）35 psi。在Q-Trap 6500+中，每个离子对是根据优化的去簇电压（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）进行扫描检测。
定性与定量：
基于标准品构建MWDB（Metware Database）数据库，对质谱检测的数据进行定性分析。
定量是利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（Multiple ReactionMonitoring，MRM，如下图1）分析完成。MRM模式中，四级杆首先筛选目标物质的前体离子（母离子），排除掉其他分子量物质对应的离子以初步排除干扰；前体离子经碰撞室诱导电离后断裂形成多个碎片离子，碎片离子再通过三重四级杆过滤选择出所需要的特征碎片离子，排除非目标离子干扰，使定量更为精确，重复性更好。获得不同样本的质谱分析数据后，对所有目标物的色谱峰进行积分，通过标准曲线进行定量分析。
实施例2一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法
(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30±2℃培养2-3天。
(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加色氨酸11g/L和乳糖40g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
(3)5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50 rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定生长素、细胞分裂素含量。
实施例3 一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法
(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30±2℃培养2-3天。
(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加色氨酸12g/L和乳糖60g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
(3)5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50 rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定生长素、细胞分裂素含量。
对比例1 一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法
(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30±2℃培养2-3天。
(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
(3)5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50 rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定生长素、细胞分裂素含量。
对比例2一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法
(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30±2℃培养2-3天。
(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加色氨酸11g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
(3)5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50 rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定生长素、细胞分裂素含量。
对比例3一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法
(1)5406链霉菌活化：将5406链霉菌菌种从-80℃取出，在PDA无抗平板上划线，30±2℃培养2-3天。
(2)培养基配方及配制：配制高氏一号液体培养基（可溶性淀粉20g/L、KNO31g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4· 7H2O 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4· 7H2O 0.01g/L、pH=7.4-7.6）。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分。添加乳糖40g/L，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，121℃灭菌20min。
(3)5406链霉菌培养：从活化的PDA平板挑起单菌落，接种在步骤（2）配制的培养基中，250±50 rpm、30±2℃震荡培养5-6 d（本例优选6d）。
(4)激素含量测定：发酵液10000rpm离心10 min，去沉淀取上清液，采用LC-MS/MS法测定生长素、细胞分裂素含量。
为了说明本发明的效果，分别统计了前述实施例和对比例的生长素和细胞分裂素浓度。每组3次重复。结果见下表。
注：呋喃甲基腺嘌呤-9-葡萄糖苷，英文名称：Kinetin-9-glucoside，CAS号：98177-43-6 ，也叫激动素-9-葡萄糖苷。
研究结果表明，比较实施例和对比例可知，本发明在高氏一号培养基基础上，同时添加10~12 g/L色氨酸和20~60g/L乳糖，5406链霉菌可同时发酵生产生长素和细胞分裂素，其中吲哚-3-乙酸的含量最高。
以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）5406链霉菌活化；所述5406链霉菌来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC 4.891；
（2）培养基配方及配制：在高氏一号液体培养基中添加色氨酸和乳糖；色氨酸和乳糖在培养基中的添加量分别为色氨酸10~12 g/L、乳糖20~60 g/L；
（3）5406链霉菌培养：取活化后的5406链霉菌单菌落，接种在步骤（2）所述培养基中，震荡培养；
所述生长素为吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乳酸和吲哚-3-甲酸，所述细胞分裂素为呋喃甲基腺嘌呤-9-葡萄糖苷和玉米素。
2.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，色氨酸和乳糖在培养基中的添加量分别为色氨酸11g/L、乳糖40 g/L。
3.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，震荡培养的条件为转速250±50 rpm、温度30±2℃。
4.根据权利要求1所述的一种同时生产生长素和细胞分裂素的5406链霉菌发酵方法，其特征在于，震荡培养的时间为5-6 d。
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