CN103305449A - 年年乐种子-细黄链霉菌培养到发酵用培养基的配方与制备 - Google Patents

年年乐种子-细黄链霉菌培养到发酵用培养基的配方与制备 Download PDF

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唐睿
韩铁冰
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本发明涉及一株放线菌“年年乐”的菌种：ACCC40027细黄链霉菌Streptomyces microflavus，培养保存到发酵生产使用的高产且不易退化的培养基配方及其制备的方法，其添加的特殊物质是：海藻糖、放线菌酮、重铬酸钾。

Description

年年乐种子-细黄链霉菌培养到发酵用培养基的配方与制备
技术领域
本发明涉及一株放线菌“年年乐”的菌种：ACCC40027细黄链霉菌Streptomycesmicroflavus，培养保存到发酵生产使用的高产且不易退化的培养基配方及其制备的方法，其添加的特殊物质是：海藻糖、放线菌酮、重铬酸钾。
技术背景
在植物病害生物防治中放线菌是最早应用到生产中的生防微生物，目前从微生物中发现的大约8000种生物活性物质中，有近70％是放线菌产生的，具有着重要的经济价值。而由它们所产生的抗生素能有效地防治人类和动物的传染性病害，特别是细菌性的病害以及农作物的某些病害，中发挥了巨大的作用。且在利用放线菌的次生代谢产物一“抗生素”制备的新农药，由于其具有无污染、无残留、可再生、易于产业化、成本低等特点已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向。
ACCC40027细黄链霉菌Streptomyces microflavus(获购于中国农业微生物菌种保藏管理中心，用于海南博士威农用化学有限公司获得国家登记的产品：年年乐-氨基酸嘌呤母液的发酵生产)，最新一代放线菌种，其代谢产物中含有生长素、抗菌素、苯乙酸、琥珀酸及细胞分裂素等作物生长所必须的生长调节剂成分，具有转化土壤中氮、磷、钾，提高土壤肥力，减少化肥用量；抑制病菌繁殖，防病保苗；刺激细胞分裂，促进作物生根、发芽、成熟，提高作物产量；促进有效物质合成，显著提高农产品的品质等作用，达到“增产增收、保水养田、抑制病害、提高品质”四效合一的功效。但细黄链霉菌在发酵生产过程中往往受到种子的质量、培养基的组成、杂菌污染、工艺条件及发酵过程的代谢调控等因素的影响，发酵产率和效果都不佳。
本发明主要目的是针对以往细黄链霉菌培养和发酵过程中存在的菌种繁殖速度慢，发酵产率低，容易污染杂菌和菌种易退化的等不足，研制出一套从种子培养到发酵生产，使菌种繁殖速度快、产率高，有效活菌比高、杂菌污染少、发酵料价廉等优点的培养基。
其主要添加的特殊物质是：
1.海藻糖：一种保持细胞活性，提高菌体存活率的保护剂。
2.放线菌酮：一种抑制真菌但不影响放线菌生长的抑制剂。
3.重铬酸钾：一种高效价廉的细菌抑制剂
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的：
发明内容
一、菌种的复壮：
从中国科学院微生物所购买回来的细黄链霉菌(Streptomyces microflavus KrainskyWaksman et Henrici，ACCC40027)。菌种在高氏一号培养基上进行复壮，备用。
二、种子培养基的筛选：
1、固体培养基的筛选
(1)筛选鉴定方法：分别以采用同孔径的已灭菌的打孔器、菌龄一致的复壮菌种打出菌饼，分别进行接种，每号培养基3个重复，每重复1菌饼，培养3～5d后，观察以速度长得快、菌落大、产孢多的为最优培养基。
(2)固体基础对照培养基(高氏一号培养基)：可溶性淀粉20.0g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂20g、pH7.2～7.4、蒸馏水1000mL。
1号培养基：在基础对照培养基上加入放线菌酮：40～120mg。
2号培养基：在基础对照培养基上加入重铬酸钾：30～90mg。
3号培养基：在基础对照培养基中加入海藻糖：3～5g。
2、摇床培养基的筛选
(1)筛选鉴定方法：采用同孔径的打孔器、菌龄一致的菌种，打出菌饼，分别进行接种，每号培养基3个重复，每重复采用250ml装量50ml培养基、1菌饼接种量接种，培养2～4d间，分时间段定时测定其OD600nm下的吸光值，同时分别对应的以同号未接种的培养基做空白对照，计算差异值，绘制生长曲线。判定结果以同一时间内各生长曲线增长斜率大的为最优培养基。
(2)液体基础对照培养基(去掉琼脂的高氏一号培养基)：可溶性淀粉20.0g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、蒸馏水1000mL、pH7.2～7.4。
1号培养基：在基础对照培养基上加入放线菌酮：40～120mg。
2号培养基：在基础对照培养基上加入重铬酸钾：30～90mg。
3号培养基：在基础对照培养基中加入海藻糖：3～5g。
三、发酵生产用培养基的筛选
(1)筛选鉴定方法：使用一致的菌龄、接种量、发酵原料量和发酵工艺参数，发酵3～5d后，采用黄化黄瓜子叶叶绿素合成法测定各发酵液中产细胞分裂素活性的大小，并结合各培养基配方成本来综合判定最优培养基。
黄化黄瓜子叶叶绿素合成法测定发酵液含细胞分裂素活性：
挑取大小均一的黄瓜种子(津研1号或2号)，用0.05-0.15％升汞水表面灭菌5-7min，无菌蒸馏水冲洗数次，置于垫有湿润滤纸的无菌平皿中，27-30℃下暗处发芽5-6d，在暗室绿光灯下，从每个幼苗上切下子叶，切除全部下胚轴，选取大小均一的子叶，在事先取出并稀释一定倍数的发酵液中沾一下，放在事先已加好的无菌湿润滤纸的平皿中，每皿25片子叶，叶面朝上，27-30℃下暗处培养20-24h，然后移至600-1000lux荧光灯下，距离10-30cm，光照2-4d。根据子叶的变绿及扩大程度，判断发酵液含细胞分裂素活性大小。蒸馏水做对照。
发酵工艺参数：培养基121℃蒸气灭菌30分钟，冷却，按5％-8％接种量于无菌条件下接入种子，在搅拌转速200r/min、温度25-32℃、罐压0.04-0.06MPa、相对湿度70-100RH、通风量1-2(换气次数/小时)、发酵时间50-72小时结束。
(2)发酵生产用基础对照培养基：豆饼粉20g、葡萄糖20g、NaCl3g、CaCO31g、水1000ml、pH7.2-7.5。
1号培养基：豆饼粉8-12g、玉米淀粉5-12g、木薯粉5-12g、鱼粉1-3g、NaCl3g、CaCO31g、海藻糖3-5g、放线菌酮40-120mg、重铬酸钾30-90mg、水1000ml、pH7.2-7.5。
2号培养基：豆饼粉8-12g、玉米粉5-12g、葡萄糖5-10g、蔗糖饴糖3-6g、海藻糖3-5g、放线菌酮40-120mg、重铬酸钾30-90mg、NaCl3g、CaCO31g、水1000ml、pH7.2-7.5。
3号培养基：豆饼粉8-12g、花生壳5-10g、小米粉5-10g、鱼粉1-3g、NaCl3g、CaCO31g、海藻糖3-5g、放线菌酮40-120mg、重铬酸钾30-90mg、水1000ml、pH7.2-7.5。
具体实施方式：
实施例1.在固体培养基上分别添加特殊物质：海藻糖、重铬酸钾、放线菌酮的效果。
具体试验步骤有：
(1)配制培养基，灭菌。
CK(高氏一号)：可溶性淀粉20.0g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.2-7.4。
1#：放线菌酮40、60、80、100、120mg，分别在CK的基础上加入。
2#：重铬酸钾30、50、70、90mg，分别在CK的基础上加入。
3#：海藻糖3。0、3.5、4.0、4.5、5.0g分别在CK的基础上加入。
(2)分别以采用同孔径的已灭菌的打孔器、菌龄一致的复壮菌种打出菌饼，分别进行接种，每培养基3个重复，每重复1菌饼，培养3-5d后，观察以速度长得快、菌落大、产孢多的为最优培养基。
(3)与CK比较，试验结果证明了高氏一号培养基分别加入放线菌酮、重铬酸钾、海藻糖的培养基细黄链霉菌生长速度快，产孢多，杂菌污染少。
实施例2.在液体培养基上分别添加特殊物质：海藻糖、重铬酸钾、放线菌酮的效果。
(2)配制培养基，灭菌。
CK(高氏一号)：可溶性淀粉20.0g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.2-7.4。
1#：放线菌酮40、60、80、100、120mg，分别在CK的基础上加入。
2#：重铬酸钾30、50、70、90mg，分别在CK的基础上加入。
3#：海藻糖3。0、3.5、4.0、4.5、5.0g分别在CK的基础上加入。
(2)采用同孔径的打孔器、菌龄一致的菌种，打出菌饼，分别进行接种，每号培养基3个重复，每重复采用250ml装量50ml培养基、1菌饼接种量接种，摇床上180r/min，30℃培养2～4d间，分时间段定时测定其OD600nm下的吸光值，同时分别对应的以同号未接种的培养基做空白对照，计算差异值，绘制生长曲线。判定结果以同一时间内各生长曲线增长斜率大的为最优培养基。
(3)试验结果证明了高氏一号培养基分别加入放线菌酮、重铬酸钾、海藻糖的培养基细黄链霉菌生长速度快，产孢多，杂菌污染少。
实施例3.一种细黄链霉菌的发酵生产培养基的筛选。
(1)原辅料混配：
CK：豆饼粉20g、葡萄糖20g、NaCl3g、CaCO31g、水1000ml、pH7.2-7.5。
1号培养基：豆饼粉10g、玉米淀粉10g、木薯粉10g、鱼粉1g、NaCl3g、CaCO31g、海藻糖3g、放线菌酮80mg、重铬酸钾60mg、水1000ml、pH7.2-7.5。
2号培养基：豆饼粉10g、玉米粉10g、葡萄糖10g、蔗糖饴糖4g、海藻糖3g、放线菌酮80mg、重铬酸钾mg、60NaCl3g、CaCO31g、水1000ml、pH7.2-7.5。
3号培养基：豆饼粉10g、花生壳10g、小米粉10g、鱼粉1g、NaCl3g、CaCO31g、海藻糖3g、放线菌酮80mg、重铬酸钾60mg、水1000ml、pH7.2-7.5。
(2)高压灭菌：通入过热蒸汽升温灭菌，1.5公斤/平方厘米，121℃，30min。
(3)接种：将高压灭菌后的原辅料降温至28℃时，按质量比8％接种液体发酵所得的细黄链霉菌的种子并搅拌混匀。
(4)发酵：工艺参数如下：
转速200r/min、温度28-30℃、罐压0.04-0.06MPa、相对湿度70RH、湿度40％、通气比初始1∶1(V/V/min)的条件下发酵24小时，通气量增至1∶1.5(V/V/min)，发酵24小时，通气量降至1∶1(V/V/min)，发酵20小时，结束发酵。
(5)黄化黄瓜子叶叶绿素合成法测定发酵液含细胞分裂素活性：
挑取大小均一的黄瓜种子(津研1号或2号)，用0.05-0.15％升汞水表面灭菌5-7min，无菌蒸馏水冲洗数次，置于垫有湿润滤纸的无菌平皿中，27-30℃下暗处发芽5-6d，在暗室绿光灯下，从每个幼苗上切下子叶，切除全部下胚轴，选取大小均一的子叶，在事先取出并稀释一定倍数的发酵液中沾一下，放在事先已加好的无菌湿润滤纸的平皿中，每皿25片子叶，叶面朝上，27-30℃下暗处培养20-24h，然后移至600-1000lux荧光灯下，距离10-30cm，光照2-4d。根据子叶的变绿及扩大程度，判断发酵液含细胞分裂素活性大小。蒸馏水做对照。
(6)结合培养基配方物料成本综合判定最优培养基。

Claims (2)

1.一种放线菌“年年乐”的生产用菌种：ACCC40027细黄链霉菌Streptomyces microflavus，培养保存到发酵生产使用的高产且不易退化的培养基配方及其制备的方法，其特征在于：在原高氏1号培养基的基础上，加入了放线菌酮：40～120mg，重铬酸钾：30～90mg，海藻糖：3～5g。 
2.权利要求1所述的“年年乐”的生产用菌种发酵生产用培养基，其特征在于： 
（1）号生产用培养基：豆饼粉8-12g、玉米淀粉5-12g、木薯粉5-12g、鱼粉1-3g、NaCl3g、CaCO31g、海藻糖3-5g、放线菌酮40-120mg、重铬酸钾30-90mg、水1000ml、pH7.2-7.5； 
（2）号生产用培养基：豆饼粉8-12g、玉米粉5-12g、葡萄糖5-10g、蔗糖饴糖3-6g、海藻糖3-5g、放线菌酮40-120mg、重铬酸钾30-90mg、NaCl3g、CaCO31g、水1000ml、pH7.2-7.5； 
（3）号生产用培养基：豆饼粉8-12g、花生壳5-10g、小米粉5-10g、鱼粉1-3g、NaCl3g、CaCO31g、海藻糖3-5g、放线菌酮40-120mg、重铬酸钾30-90mg、水1000ml、pH7.2-7.5。 
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