CN104593297A - 一种具有产酸功能的微生物菌及其应用的有机肥料 - Google Patents

一种具有产酸功能的微生物菌及其应用的有机肥料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有产酸功能的微生物菌及其应用的有机肥料，其菌株在不同的发酵条件下均可产酸，相对于无机盐，产酸持久，无需经常施加，而且不会出现阴离子富集而产生的土壤结块等问题，同时能够优化碱性土壤作物根系生长微生态环境；菌株来源于贫瘠土壤玉米根际土壤中，能够明显促进油麦菜、玉米等作物对碱性土壤的耐受性，提高土壤尿酶活性，为油麦菜、玉米等作物在碱性土壤中生长提供了一种优良的液体菌肥；菌株制备的有机肥能够明显的提高油麦菜、玉米等作物的叶片组织的叶绿素含量、叶片Vc含量、以及产量，具有增加质量增加产量的良好效果。

Description

一种具有产酸功能的微生物菌及其应用的有机肥料
技术领域
本发明涉及一种微生物菌，尤其涉及一种发酵产酸、耐碱和抗生素的能力的解淀粉芽孢杆菌及其制成的有机肥料及应用。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆菌能够具有广泛地抑制真菌和细菌的活性。因此，近些年大量学者在对解淀粉芽孢杆菌的新发现与新应用以及基因功能研究和发酵条件的优化做了大量的探索。解淀粉芽孢杆菌能产生多种抗菌物质，杀菌谱广，对病原菌具有防治作用，故其防治作物、蔬菜、瓜果病害效果非常显著，市场发展前景巨大，更为重要的是，其为减少化学农药、保证食品安全提供了一条有效途径。
我国北方地区碱性土壤较多，而由于常年大量使用化学肥料，很多大棚内的土壤频频出现“红霜”、“白碱”，这都是土壤偏碱的症状。碱性土壤改良技术主要包括改良土壤，培肥地力，增强土壤的亲和性能，如施入腐熟的粪肥、泥炭、锯木屑、施用酸性肥料，如硫酸铅、硫酸亚铁、硫磺粉、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、过磷酸钙、磷酸二氢钾、硫酸钾等，定向中和碱性等。虽然以上方法改良土壤碱性见效快，但作用时间不长，需经常重复施用。结合有机肥的生物发酵，筛选产酸的解淀粉芽孢杆制作生物菌肥，可以通过微调根际土壤的微生态pH，解决碱性土壤作物根系生长微生态环境，从而促进作物健 康生长。
发明内容
针对上述问题，本发明旨在提供一种产酸能力强、生长速度快、对环境适应性强和耐逆性强的微生物菌，通过菌株产酸改善碱性土壤作物根际微生态pH及抑制土壤病害生长，从而能够显著提高蔬菜及作物产量和品质的微生物有机肥料及应用。
为实现该技术目的，本发明的方案是：一种具有产酸功能的微生物菌,包括菌株WSA061，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号为CGMCC 10070；
菌株WSA061的形态及生理生化特性如下：
菌株WSA061为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，能够产生芽孢；
LB琼脂平板上生长速度快，菌落圆形，中间小凸起(37℃，生长36小时)，乳白色不透明，菌落直径3-7毫米。细胞杆状，大小2.8-4.2x 1.5-1.8μm，具端生鞭毛。最适生长温度是28-37℃及最佳生长pH值6-8；
兼性厌氧，能在以糊精，D-葡萄糖，D-半乳糖，山梨糖，L-果糖，D-果糖，纤维二糖，松三糖，松二糖，海藻糖，甘露醇，L-阿糖醇，D-阿糖醇，山梨醇，己六醇，半乳糖醇，山梨糖醇，葡萄糖酸钠，琥珀酸钠，乳酸钠，苹果酸，甘油，D-葡萄糖醛酸钠，丁二胺，N-乙酰葡萄糖胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸，L-组氨酸，L-色氨酸，L-胱氨酸为唯一碳源的培养基上生长；
pH生长范围较广，可耐pH3-pH9；对NaCl敏感，NaCl浓度低于 1.0％可生长；对300μg/mL的氨苄青霉素、链霉素、四环素、红霉素仍有耐受性，耐庆大霉素可达100μg/mL，而对卡拉霉素、氯霉素、新霉素的耐受性差，低浓度(50μg/mL)的这几种抗生素就能抑制其生长；吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素IAA。
所述菌株WSA061含量为1.5×108cfu/ml以上,全氮含量质量比为3～7％，总氮磷钾养分质量比为5～11％、有机质含量质量比不低于40％。
菌株WSA061制成的有机肥料在油麦菜和玉米栽培中的应用。
本发明涉及的产酸功能的微生物菌及其制备有机肥具有如下有益效果：
1.菌株WSA061为一种发酵产酸功能的解淀粉芽孢杆菌，在不同的发酵条件下均可产酸，相对于无机盐，产酸持久，无需经常施加，而且不会出现阴离子富集而产生的土壤结块等问题，同时能够优化碱性土壤作物根系生长微生态环境。
2.菌株WSA061来源于贫瘠土壤玉米根际土壤中，能够明显促进油麦菜、玉米等作物对碱性土壤的耐受性，提高土壤尿酶活性，为油麦菜、玉米等作物在碱性土壤中生长提供了一种优良的液体菌肥。
3.菌株WSA061制备的有机肥能够明显的提高油麦菜、玉米等作物的叶片组织的叶绿素含量、叶片Vc含量、以及产量，具有增加质量增加产量的良好效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明的具有产酸功能的微生物菌是通过采用80℃处理杀死非芽胞杆菌，用改良MRS培养(1L)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，硫酸铵1.63g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温80mL，碳酸钙1g，琼脂18g，加蒸馏水至1000mL，pH 6.4士0.2，分别在厌氧和好氧条件下培养。从广州贫瘠的土壤上生长的玉米植物中分离、纯化获得8株产酸的芽孢杆菌。对8株菌的发酵产酸能力进一步筛选，得到生长速度快，产酸能力强，且在不同培养基配方下均能够产酸，产酸稳定的菌株WSA061；该菌株作为接种剂，施用碱性土壤，微调土壤微生态pH，促进油麦菜、玉米等作物的生长。
一、具有产酸功能的微生物菌--菌株WSA061：
菌株WSA061，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号为CGMCC 10070，保藏日期为2014年11月27日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
(一)、菌株WSA061的形态及生理生化特性
菌株WSA061为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，能够产生芽孢；
LB琼脂平板上生长速度快，菌落圆形，中间小凸起(37℃，生长36小时)，乳白色不透明，菌落直径3-7毫米。细胞杆状，大小2.8-4.2x 1.5-1.8μm，具端生鞭毛。最适生长温度是28-37℃及 最佳生长pH值6-8；
兼性厌氧，能在以糊精，D-葡萄糖，D-半乳糖，山梨糖，L-果糖，D-果糖，纤维二糖，松三糖，松二糖，海藻糖，甘露醇，L-阿糖醇，D-阿糖醇，山梨醇，己六醇，半乳糖醇，山梨糖醇，葡萄糖酸钠，琥珀酸钠，乳酸钠，苹果酸，甘油，D-葡萄糖醛酸钠，丁二胺，N-乙酰葡萄糖胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸，L-组氨酸，L-色氨酸，L-胱氨酸为唯一碳源的培养基上生长；
pH生长范围较广，可耐pH3-pH9；对NaCl敏感，NaCl浓度低于1.0％可生长；对300μg/mL的氨苄青霉素、链霉素、四环素、红霉素仍有耐受性，耐庆大霉素可达100μg/mL，而对卡拉霉素、氯霉素、新霉素的耐受性差，低浓度(50μg/mL)的这几种抗生素就能抑制其生长；吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素IAA。
(二)、本发明解淀粉芽孢杆菌WSA061的分子分类地位的确定
采用细菌16S rDNA基因通用引物25f和1492r进行扩增，将PCR产物直接进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank进行比对，初步确定本发明的解淀粉芽孢杆菌在分类学中的菌株种属的位置。结果发现本发明的解淀粉芽孢杆菌属于芽孢杆菌属(Baci l lus sp.)，与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien)模式菌株LMG 12234有98％的相似性。生理生化测试特征和16S rRNA基因序列分析表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌WSA061与解淀粉芽孢杆菌模式菌株LMG12234存在着差异。结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列分析 结果，本发明的解淀粉芽孢杆菌应归属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.),是该属的一个新菌株，具有发酵产酸能力。
(三)、本发明菌种的分离纯化方法
3.1富集：称取贫瘠土壤生长的玉米根际土壤20g于含50mL无菌水的三角瓶中，充分振荡打散，制成悬浊液，与富集营养液按1：2比例装人三角瓶中，静置于培养箱中，30±2℃，培养5天，小心取出上清液于另一灭菌的烧杯中，加热到80℃杀死非芽孢菌。
取此第一代培养瓶中的加热处理菌悬液500μL至250mL富集营养液进行第二代培养，培养方法与第一代相同。
3.2分离纯化：吸取第二代菌体培养液1ml于9ml无菌水试管制成10-1倍稀释菌液，再取此浓度菌悬液如法稀释至10-2、10-3倍，直至稀释到10-6倍。分别吸取10-4、10-5、10-6三个梯度的菌悬液100μL，依次采用平板涂布培养法和倾注厌氧培养法，30±2℃下培养，观察不同培养方法下菌体的生长情况，挑取长势较好并且具有不同特征的菌落用平板划线法进行反复传代培养，直至菌落的形状、颜色、质地、透明度一致。最后通过简单染色和镜检，进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。
3.3保存：将分离纯化后的菌株在分离培养基平板及斜面上培养2～5d后，收集平板上的菌体。部分保存于15％灭菌甘油(-20℃)和 (-80℃)。
其中富集培养液(1L)：KH2PO40.5g，K2HPO40.6g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.2g，酵母膏1g，蛋白胨10.0g，1L水)，PH为7.0±0.2。
其中分离培养基(1L)：酵母膏3g，蛋白胨3g，碳酸钙1g，琼脂粉17g，pH 7.0±0.2。
二、生物有机肥料制备：
将菌株WSA061接种到培养基进行发酵生产，发酵生产的条件为室温下，发酵5-8天，溶液pH值为3.7-4.3，发酵之间中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量≥1.5×108cfu/ml，其中所用培养基的配方为：含有100g/L的土豆汁液，酵母粉1g，糖蜜5g，KH2PO40.01g，氯化钠1g，K2HPO40.01g。完成发酵后加热至80℃杀死非芽孢菌。
将菌株WSA061发酵液加入到猪粪堆肥和菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH3.5-4.5，进行发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃(共5-8天)，固体发酵开始后，堆物的pH会不断降低，每次翻堆时用含碱液体调节含水量和pH。
最后得到菌株WSA061含量为1.5×108cfu/ml以上,全氮含量质量比为3～7％，总氮磷钾养分质量比为5～11％、有机质含量质量比不低于40％的微生物有机肥料。
三、盆栽实验：
(一)油麦菜盆栽实验
1.1发酵产酸：将菌株WSA061接种到发酵液中，1L发酵液中，含有100g/L的土豆汁液，酵母粉1g，糖蜜5g，KH2PO40.01g，氯化钠1g，K2HPO40.01g，室温下发酵5-7天，溶液pH值为3.8-4.2之间。
1.2施用：土壤混合均匀一致，原初始pH值为8.0，将活化得到的单菌落于15ml的新鲜LB种子液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，再将培养好的液体种子培养液按3％接种量转接到发酵培养基A中，37℃，180rpm振荡培养28h，备用。盆栽试验做4个处理，5个重复。I1：化肥；I2：等量空白营养液；I3：只有等量菌剂；CK：只浇清水不施肥。以上四个处理其他日常管理一致。
1.3结果：
其中，I3组的土壤尿酶活性为0.626±0.16mg/g，Vc含量0.347±0.008mg/g。
I3组相对其他组的对比提升量(％)：
  I1 I2 CK
土壤尿酶活性 35.32 28.87 38.46
叶绿素含量 / / 38.04
Vc含量 33.11 28.56 38.21
产量 15.23 16.12 18.49
从上述数据可以看出，用含有菌株WSA061的肥料种植的油麦菜产量高，Vc含量和土壤尿酶活性的含量明显高于I1化肥组、I2等 量空白营养液组和CK只浇清水不施肥组，其中叶绿素相对于CK只浇清水不施肥组有明显提升。
(二)玉米盆栽实验
2.1发酵产酸：将菌株WSA061接种到发酵液中，1L发酵液中，含有150g/L的土豆汁液，氯化钠0.5g，酵母浸膏2g，KH2PO40.01g，麸皮8g，K2HPO40.01g，室温下发酵5-8天，溶液pH值为3.7-4.3之间。
2.2施用：将活化得到的单菌落于15ml的新鲜LB种子液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养24h，再将培养好的液体种子培养液按3％接种量转接到发酵培养基B中，37℃混合培养24h，备用。田间试验做4个处理，3个重复共12个小区。处理B1:菌液；处理B2：等量的培养液；处理B3：化肥；处理B4：清水，其他日常管理一致。
2.3结果：
B1、B2、B3相对于B4组对比提升量(％)：
  B1 B2 B3
土壤尿酶活性 25.2 15.5 20.9
叶绿素含量 20.6 10.3 4.1
Vc含量 24.7 12.5 4.6
从上述数据可以看出，用含有菌株WSA061种植的B1菌液组的玉米，土壤尿酶活性、叶绿素含量和Vc含量的增幅明显高于B2：等量的培养液、B3：化肥、B4：清水三个组。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种具有产酸功能的微生物菌,其特征在于：包括菌株WSA061，为解淀粉芽孢杆菌(Baci l lus amylol iquefaciens)，保藏号为CGMCC10070；
菌株WSA061的形态及生理生化特性如下：
菌株WSA061为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，能够产生芽孢；
LB琼脂平板上生长速度快，菌落圆形，中间小凸起(37℃，生长36小时)，乳白色不透明，菌落直径3-7毫米。细胞杆状，大小2.8-4.2x 1.5-1.8μm，具端生鞭毛。最适生长温度是28-37℃及最佳生长pH值6-8；
兼性厌氧，能在以糊精，D-葡萄糖，D-半乳糖，山梨糖，L-果糖，D-果糖，纤维二糖，松三糖，松二糖，海藻糖，甘露醇，L-阿糖醇，D-阿糖醇，山梨醇，己六醇，半乳糖醇，山梨糖醇，葡萄糖酸钠，琥珀酸钠，乳酸钠，苹果酸，甘油，D-葡萄糖醛酸钠，丁二胺，N-乙酰葡萄糖胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸，L-组氨酸，L-色氨酸，L-胱氨酸为唯一碳源的培养基上生长；
pH生长范围较广，可耐pH3-pH9；对NaCl敏感，NaCl浓度低于1.0％可生长；对300μg/mL的氨苄青霉素、链霉素、四环素、红霉素仍有耐受性，耐庆大霉素可达100μg/mL，而对卡拉霉素、氯霉素、新霉素的耐受性差，低浓度(50μg/mL)的这几种抗生素就能抑制其生长；吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素IAA。
2.一种运用权利要求1所述微生物菌的微生物有机肥料,其特征在于：所述菌株WSA061含量为1.5×108cfu/ml以上,全氮含量质量比为3～7％，总氮磷钾养分质量比为5～11％、有机质含量质量比不低于40％。
3.权利要求2所述的微生物有机肥料在油麦菜和玉米栽培中的应用。
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