CN102249753A - 一种生产多功能生物有机肥的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用芽胞杆菌通过植物源饼粕固体发酵生产多功能生物有机肥的方法及其应用，涉及生物有机肥技术。本方法中，所述的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、侧胞芽胞杆菌和/或胶冻样芽胞杆菌。所述的植物源饼粕包括大豆饼粕、花生饼粕、葵花饼粕、芝麻饼粕、菜籽饼粕和/或棉籽饼粕。生物有机肥主要应用于植物病害的生物防治以及促进植物生长。本发明的生产工艺简单易行，具有能耗少、成本低、绿色环保、对人畜无毒无害、对环境无污染、安全、高效等优点，具有工业化生产和广泛应用的巨大潜力，市场前景广阔。

Description

一种生产多功能生物有机肥的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物有机肥技术，具体涉及一种利用芽胞杆菌通过植物源饼粕固体发酵生产多功能生物有机肥的方法及其应用。

背景技术

在经济持续高速增长，环境压力不断增大的背景下，国家把建设资源节约型和环境友好型社会确定为国民经济与社会发展中长期规划的一项战略任务；国家要求大力发展循环经济，保护生态环境，加快建设资源节约型、环境友好型社会，促进经济发展与人口、资源、环境相协调，切实走新型工业化道路；国家坚持节约发展、清洁发展、安全发展，实现可持续发展。

在大力发展绿色生产的政策倡导下，发展生物产业成为食品、饲料和肥料等领域的主导。微生物发酵产品具有对人和动植物无毒无害无残留、绿色安全等优点，而倍受关注。

陈福星等(2002)采用饼粕、畜禽粪便、秸秆为原料，通过地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌培养生产的固体菌种发酵，腐熟后经风干或者烘干，粉碎制成生物有机肥。

丁科峰等(2005)以城市生活垃圾、农作物秸秆、秧蔓、畜禽粪便、食用菌渣、工业用炉的炉渣灰、酿造业废渣、木屑等为原料，添加除臭发酵剂，混合后送入槽式发酵池内分区段连续进行一次发酵，并通入空气充氧强制发酵，提高发酵温度，加快发酵速度，制成基肥料，再根据需要添加微生物调节剂、进行二次陈腐发酵，制取生物有机肥。

郭伟光等(2005)利用秸秆生物发酵剂将秸秆、谷壳、锯末等富含纤维素、半纤维素或木质素的物料进行发酵分解后作为载体，然后将多个生物菌种扩培制成复合生物菌剂，最后将发酵好的有机物料、复合生物菌剂以及适量的矿物质、微量元素按一定的比例配制成一种高效生物有机肥。

在当今肥料生产过程中，存在着原材料的利用率低导致生产成本高的问题。同时，农业生产中，农药和化肥的大量使用，使农产品中的药物残留十分严重，化学肥料的流失造成了土壤、水等自然环境的污染，给人类的生命健康也带来很大的威胁。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在缺点和不足，提供一种利用芽胞杆菌通过植物源饼粕固体发酵生产多功能生物有机肥的方法及其应用。

本发明的目的是这样实现的：

一、利用芽胞杆菌通过植物源饼粕固体发酵生产多功能生物有机肥的方法

本方法(简称固体发酵方法)包括下列步骤：

①在斜面保存或者甘油冻存的芽胞杆菌中挑取1-2环菌体，接种到种子培养基(重量百分比含有0.5％-1.0％的蛋白胨、0.3％-0.8％的酵母浸粉、0.5％-1.0％的氯化钠，调节pH至7.0-7.5，115℃-121℃高压灭菌15-30min)中，于28℃-37℃，150-250r/min摇瓶培养8-16h，得到一级种子液；

②在液体扩大LB培养基中以2％-5％的接种量接种一级种子液，于28℃-37℃，150-250r/min摇瓶培养18-24h，得到二级种子液；

③以溶液的形式，分别向植物源饼粕中添加重量比为0-2.0％的葡萄糖、蔗糖或淀粉、0-0.5％的谷氨酸钠、0-0.1％的磷酸氢二钾、0-0.1％的硫酸镁，以及重量比为10％-50％的作物秸秆、麸皮、米糠，再用水调节湿度至40％-80％，100℃蒸煮20-30min，冷却，得到固体培养基；

④在固体培养基中，分别接种0.1％-5％的芽胞杆菌二级菌种，充分混匀，将其分装于发酵盘中，厚度2-30cm，于28℃-40℃保温或室温发酵，每隔8-14h翻样1次，发酵36-48h后，得到发酵产品；

⑤上述发酵产品于45℃-65℃鼓风干燥2-24h，得到干燥的发酵产品；

⑥将上述干燥发酵产品经粉碎机粉碎，过60-100目的分样筛，得到富含聚-γ-谷氨酸、(脂)肽类抗生物质、活性氨基酸、根际促生抗病菌株等多功能生物有机肥。

A、芽胞杆菌

所述的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、侧胞芽胞杆菌和/或胶冻样芽胞杆菌。

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)3-10，保藏号为CCTCC NO：M2011100，保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心；

地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，保藏号为CCTCC NO：M208065，保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心；

巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)，保藏号：ACCC NO：10010，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)；

侧胞芽胞杆菌(Bacillus laterosporus)，保藏号：ACCC NO：11079，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)；

胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)，保藏号：ACCC NO：10168，购自中国农业微生物菌种保藏中心(地址：北京市海淀区中关村南大街12号)。

B、植物源饼粕

所述的植物源饼粕包括大豆饼粕、花生饼粕、葵花饼粕、芝麻饼粕、菜籽饼粕和/或棉籽饼粕。

二、本有机肥主要活性成分

经检测，本有机肥主要活性成分包括聚-γ-谷氨酸、(脂)肽类抗生物质(伊枯草菌素、丰杆菌素、表面活性素等)、根际促生抗病菌株(枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、侧胞芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、胶冻样芽胞杆菌)等。

有机肥各活性成分的含量是：

a、聚-γ-谷氨酸：10-50g/kg，

b、(脂)肽类抗生物质：0.5-10g/kg，

c、氨基酸：50-100g/kg，

d、芽胞杆菌总菌数：10⁸-10¹¹CFU/g。

三、有机肥的应用

本有机肥主要应用于植物病害的生物防治以及促进植物生长。

1、施加该有机肥后，烟草、蔬菜、水果的产量分别提高了30-80％；

2、对植物真菌病害的病指防效达到60-90％。

本发明具有下列优点和积极效果：

①该多功能生物有机肥可以提高饼粕的利用率和附加值

植物源废弃饼粕经芽胞杆菌转化后，发酵产品中富含由芽胞杆菌合成的多种活性产物，如聚-γ-谷氨酸，可以作为肥料增效剂，促进植物对肥料的利用；(脂)肽类抗生物质如伊枯草菌素、丰杆菌素和表面活性素等，可以抑制多种植物病原真菌的生长，有效防治多种植物病害；饼粕大分子蛋白被降解为小分子活性肽或者活性氨基酸，增强了肥效，植物更容易吸收利用其营养成分，显著促进植物生长。

②该多功能生物有机肥中的枯草芽胞杆菌可以合成脂肽类抗生素，同时本身也可以作为根际生防促生菌，促进植物生长，防止植物病害的发生；其他种类的芽胞杆菌，如巨大芽胞杆菌、侧胞芽胞杆菌、胶冻样芽胞杆菌等，分别可以用作解磷、抗病、解钾微生物，促进对土壤中矿物质的吸收利用，为微生物菌剂的生产提供丰富的资源。

③该多功能生物有机肥对植物的生长具有显著的促进作用，可以明显改善农产品品质，提高作物产量，同时可以有效防治多种植物病原真菌引起的植物病害，具有绿色环保、对人畜无毒无害、对环境无污染、安全、高效等优点，应用价值高、市场前景广阔。

④该多功能生物有机肥的生产工艺简单易行，能耗少，成本低，具有工业化生产的巨大潜力。

具体实施方式

下面结合具体实例，对本方法进一步说明：

1、实施例1

本方法包括下列步骤：

①在斜面保存或者甘油冻存的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、侧胞芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和胶冻样芽胞杆菌菌种中挑取1-2环菌体，分别接种到LB培养基(重量百分比含有1.0％的蛋白胨、0.5％的酵母浸粉、1.0％的氯化钠，调节pH至7.2-7.4，121℃高压灭菌20min)中，于37℃，200r/min摇瓶培养10h，得到一级种子液；

②在液体扩大LB培养基中以2％的接种量接种一级种子液，于37℃，200r/min摇瓶培养18h，得到二级种子液；

③以溶液的形式，分别向大豆饼粕中添加重量比为0.2％的谷氨酸钠、0.05％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁，以及重量比为10％-50％的作物秸秆、麸皮、米糠等，再用水调节湿度至60％，100℃蒸煮30min，冷却，得到固体培养基；

④在固体培养基中，分别接种3％的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、侧胞芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和胶冻样芽胞杆菌二级菌种，充分混匀，将其分装于发酵盘中，厚度10cm，于28℃-30℃保温保湿发酵过程中，每隔12h翻样1次，发酵48h后，得到发酵产品；

⑤上述发酵产品于50℃鼓风干燥20h，得到干燥的发酵产品；

⑥将上述干燥发酵产品经粉碎机粉碎，过80目的分样筛，得到富含聚-γ-谷氨酸、(脂)肽类抗生物质、活性氨基酸和根际促生抗病菌株等多功能生物有机肥，具体活性成分的含量见表1。

2、实施例2

根据实施例1，本实施例所用饼粕为花生饼粕。其中步骤③以溶液的形式，分别向花生饼粕中添加重量比为0.3％的谷氨酸钠、0.05％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁，以及重量比为10％-50％的作物秸秆、麸皮、米糠等，再用水调节湿度至60％，100℃蒸煮30min，冷却，得到固体培养基。

3、实施例3

根据实施例1，本实施例所用饼粕为葵花饼粕。其中步骤③以溶液的形式，分别向葵花饼粕中添加重量比为0.4％的谷氨酸钠、0.05％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁，以及重量比为10％-50％的作物秸秆、麸皮、米糠等，再用水调节湿度至60％，100℃蒸煮30min，冷却，得到固体培养基。

4、实施例4

根据实施例1，本实施例所用饼粕为菜籽饼粕。其中步骤③以溶液的形式，分别向菜籽饼粕中添加重量比为0.5％的谷氨酸钠、0.05％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁，以及重量比为10％-50％的作物秸秆、麸皮、米糠等，再用水调节湿度至60％，100℃蒸煮30min，冷却，得到固体培养基。

5、实施例5

根据实施例1，本实施例所用饼粕为芝麻饼粕。其中步骤③以溶液的形式，分别向芝麻饼粕中添加重量比为0.1％的葡萄糖、0.5％的谷氨酸钠、0.05％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁，以及重量比为10％-50％的作物秸秆、麸皮、米糠等，再用水调节湿度至60％，100℃蒸煮30min，冷却，得到固体培养基。

6、实施例6

根据实施例1，本实施例所用饼粕为棉籽饼粕。其中步骤③以溶液的形式，分别向棉籽饼粕中添加重量比为0.2％的葡萄糖、0.5％的谷氨酸钠、0.05％的磷酸氢二钾、0.05％的硫酸镁，以及重量比为10％-50％的作物秸秆、麸皮、米糠等，再用水调节湿度至60％，100℃蒸煮30min，冷却，得到固体培养基。

表1不同实施例中多功能生物有机肥各活性成分的含量

7、实施例7

多功能生物有机肥在烟草种植中的应用，以烟草幼苗为研究对象，考察多功能生物有机肥对烟草赤星病的防治效果以及对烟草幼苗的促生长效果。

【实验设计】

土壤的准备：土壤每隔12h间歇灭菌一次，每次121℃、30min，共灭菌3次；

种子的消毒：用温汤浸种将干种子投入55-60℃温水中处理约10min，处理过程要不断搅拌，之后再降温到28-30℃浸种4-6h，冲洗干净后进行催芽。

种子的催芽：种子经消毒处理后，清洗一遍，去水甩干，用布包好，置于30℃下催芽，催芽过程中要常翻动种子，使种子承受温度均匀，待种子露出根尖时，温度可适当降低，维持25℃，经两天左右可以出齐。

播种与培养：选择芽长较一致的种子，每盆播种4粒种子，共播种8盆。然后其他处理如下述实验设计，处理完成后，于28℃温室培养，每天浇水一次，保持室内湿度为90％，光照强度为8000lux，每天光照时间为12h，21天后统计烟草幼苗的发病率、根长、苗长、根的干重和湿重、苗的干重和湿重。

防治烟草赤星病实验设计如下：

对照(CK)：无菌土壤

处理1(T1)：无菌土壤+病原菌孢子[10⁶孢子/g土壤(干重)]

处理2(T2)：无菌土壤+初始固体基质[4g/kg土壤(干重)]+多功能生物有机肥[4g/kg土壤(干重)]

处理3(T3)：无菌土壤+病原菌孢子[10⁶孢子/g土壤(干重)]+多功能生物有机肥[4g/kg土壤(干重)]

促生长实验设计如下：

对照(CK)：无菌土壤

处理4(T4)：无菌土壤+初始固体基质[4g/kg土壤(干重)]

处理5(T5)：无菌土壤+多功能生物有机肥[4g/kg土壤(干重)]

【统计分析】

病害分级：

烟草赤星病的病害严重度分级标准按国家行业标准YC/T39-1996规定执行，以叶片为单位进行调查。

0级：全叶无病；

0.5级：病斑面积占叶片面积的1％以下；

1级：病斑面积占叶片面积的1％-5％；

2级：病斑面积占叶片面积的5％-10％；

3级：病斑面积占叶片面积的10％-20％；

4级：病斑面积占叶片面积的20％以上。

计算公式：

发病率(％)＝发病株数/株数总和×100

病情指数＝∑(病级株数×代表数值)/(株数总和×发病最重级的代表数值)×100

病指防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

【实验结果】

多功能生物有机肥能够明显促进烟草幼苗的生长(表1)，同时，对烟草赤星病的防治效果十分显著(表2)。添加多功能生物有机肥后，烟草幼苗的株高和干重分别提高了48.0％和30.8％，对烟草赤星病防治效果达到89.7％。

表2多功能生物有机肥对烟草幼苗的促生长效果

注：字母代表显著性差异水平(p＜0.05)

表3多功能生物有机肥对烟草赤星病的防治效果

注：字母代表显著性差异水平(p＜0.05)

Claims (4)

1.一种利用芽胞杆菌通过植物源饼粕固体发酵生产多功能生物有机肥的方法，其特征在于包括下列步骤：

①在斜面保存或者甘油冻存的芽胞杆菌中挑取1-2环菌体，接种到种子培养基中，于28℃-37℃，150-250 r/min摇瓶培养8-16 h，得到一级种子液；

所述培养基是：重量百分比含有0.5%-1.0%的蛋白胨、0.3%-0.8%的酵母浸粉、0.5%-1.0%的氯化钠，调节pH至7.0-7.5，115℃-121℃高压灭菌15-30 min；

②在液体扩大LB培养基中以2%-5%的接种量接种一级种子液，于28℃-37℃，150-250 r/min摇瓶培养18-24 h，得到二级种子液；

③以溶液的形式，分别向植物源饼粕中添加重量比为0-2.0%的葡萄糖、蔗糖或淀粉、0-0.5%的谷氨酸钠、0-0.1%的磷酸氢二钾、0-0.1%的硫酸镁，以及重量比为10%-50%的作物秸秆、麸皮或米糠，再用水调节湿度至40%-80%，100℃蒸煮20-30 min，冷却，得到固体培养基； 

④在固体培养基中，分别接种0.1%-5%的芽胞杆菌二级菌种，充分混匀，将其分装于发酵盘中，厚度2-30 cm，于28℃-40℃保温或室温发酵，每隔8-14 h翻样1次，发酵36-48 h后，得到发酵产品；

⑤上述发酵产品于45℃-65℃鼓风干燥2-24 h，得到干燥的发酵产品；

⑥将上述干燥发酵产品经粉碎机粉碎，过60-100目的分样筛，得到富含聚-γ-谷氨酸、（脂）肽类抗生物质、活性氨基酸和根际促生抗病菌株多功能生物有机肥。

2.按权利要求1所述的生产多功能生物有机肥的方法，其特征在于：

所述的芽胞杆菌包括枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、侧胞芽胞杆菌和/或胶冻样芽胞杆菌。

3.按权利要求1所述的生产多功能生物有机肥的方法，其特征在于：

所述的植物源饼粕包括大豆饼粕、花生饼粕、葵花饼粕、芝麻饼粕、菜籽饼粕和/或棉籽饼粕。

4.按权利要求1所述的多功能生物有机肥的应用，其特征在于：

主要应用于植物病害的生物防治以及促进植物生长。