CN104630123B - 地衣芽胞杆菌表达宿主 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多基因缺失的地衣芽胞杆菌宿主菌BL10，保藏编号为CCTCCNO：M2013400。该宿主菌来源于地衣芽胞杆菌WX‑02，部分或完全缺失了10个基因。这10个基因分别是8个蛋白酶基因(mpr，编码胞外金属蛋白酶；vpr，编码丝氨酸蛋白酶；aprX，胞内丝氨酸蛋白酶；epr，编码微小胞外蛋白酶；bpr，编码芽胞杆菌肽酶F；wprA，编码与细胞壁结合的蛋白酶；aprE，编码胞外碱性丝氨酸蛋白酶；bprA，编码芽胞杆菌肽酶F)和2个胞外分泌蛋白基因(hag，编码鞭毛蛋白；amyL，编码α‑淀粉酶)。BL10完全无胞外蛋白酶活性，可降低蛋白酶对目标蛋白的降解作用。当利用该表达宿主表达目标蛋白时，表达量更高，该宿主菌有利于增强蛋白的表达。

Description

地衣芽胞杆菌表达宿主

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及重组的地衣芽胞杆菌BL10宿主菌株，以及在此宿主细胞中表达目的蛋白的方法。

背景技术

在研究蛋白表达的过程中，发展了多种有价值的表达系统，主要包括原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统是最早被采用，也是目前研究得相对成熟的表达系统。目前最常用的原核表达系统有大肠杆菌表达系统、枯草芽胞杆菌表达系统和链霉菌表达系统等，其中大肠杆菌表达系统应用最为广泛，枯草芽胞杆菌用于分泌表达目标蛋白也越来越受到重视。目标蛋白在胞内完成转录翻译后，从胞内出来在周质空间正确折叠并通过细胞壁来到胞外，就需要选择合适的信号肽酶高效的切除信号肽，并抑制细胞壁和胞外存在的大量蛋白酶的活性，减少蛋白酶对目的蛋白的降解。提高目标蛋白分泌表达最重要的一步就是抑制其折叠环境的蛋白酶活性。通过缺失8个蛋白酶基因(nprE；nprB；aprE；epr；mpr；bpf，vpr；wprA)，前人构建了枯草芽胞杆菌WB800宿主菌，可高效表达多种目标蛋白，显示了巨大的应用潜力(Murashima等，J Bacteriol，2002，184：76-81；Westers等，J Biotechnol，2006，123：211-224)。缺失WB800菌株的的蛋白酶基因AprX(编码稳定期后期随细胞裂解释放到胞外的蛋白酶)和HtrA／HtrB(编码与细胞膜结合的蛋白酶)，得到重组菌Dpr9ΔhtrA／B，其表达α-amylase-A522-PreS2产量达到80mg／L，LipA的产量可达到1100mg／L，进一步提高了目标蛋白产量(Kodama等，Adv Appl Biotechnol，2012，8：163-176)。

地衣芽胞杆菌作为一个新型表达系统，目前对其研究主要在于利用野生型表达其自身的蛋白，对于该新型表达宿主的改造还处于初步的探索阶段，与枯草芽胞杆菌相比，地衣芽胞杆菌生长温度高5-7度；其生长速率适中，容易使刚跨膜的未合适折叠的蛋白充分折叠，分泌蛋白至培养基的能力大约是枯草芽胞杆菌的2倍，在特定优化的发酵工艺条件下，特定蛋白表达水平可达到30mg／ml，为所见报道的所有芽胞杆菌表达水平最高者。还未见构建同时缺失mpr(编码胞外金属蛋白酶)、vpr(编码丝氨酸蛋白酶)、aprX(胞内丝氨酸蛋白酶)、epr(编码微小胞外蛋白酶)、bpr(编码芽胞杆菌肽酶F)、wprA(编码与细胞壁结合的蛋白酶)、aprE(编码胞外碱性丝氨酸蛋白酶)、bprA(编码芽胞杆菌肽酶F)、hag(编码鞭毛蛋白)和amyL(编码α-淀粉酶)的地衣芽胞杆菌宿主菌。构建高效分泌表达目标蛋白的地衣芽胞杆菌宿主菌，具有重要的应用价值。本研究构建的目标蛋白表达系统，是一种性能优异的原核表达系统。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，通过构建无痕敲除载体，敲除能抑制目标蛋白表达的10个有关的基因，最终获得完全没有胞外蛋白酶活性的地衣芽胞杆菌宿主菌株。

本发明的另一目的是提供一种利用BL10高效表达目标蛋白的方法。

本发明的目的是这样实现的：

采用冷冻保藏的地衣芽胞杆菌WX-02(2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208065)为出发菌。分析WX-02基因组序列。利用多种数据库和软件，分析出WX-02中存在所有胞外蛋白酶(或肽酶)、与细胞壁结合和与细胞膜结合的蛋白酶(或肽酶)以及位于胞内的蛋白酶(或肽酶)。从中选择要删除的10个蛋白酶基因，其序列见SEQ ID NO.1到10，从WX-02基因组序列中查得其具体的基因序列。例如根据本实验测得的B.licheniformis WX-02全基因组序列中的amyL基因上下游序列，设计了α-淀粉酶基因的两个同源臂的引物：amyKF1，amyKR1和amyKF2，amyKR2。

amyKF1：5'-GCTCTAGA CCGAAACGATAAAACGGATG-3’(XbaI)

amyKR1：5'CCGTTTACGTGAAACTCTCCACCATTTTCCCTATATTTTC-3’

amyKF2：

5'-GAAAATATAGGGAAAATGGTGGAGAGTTTCACGTAAACGG-3’

amyKR2：5'CGGGATCC GCAAAGCATAATGATGACGG-3’(BamHI)

以B.licheniformis WX-02的基因组DNA作为模板，扩增得到上下游同源臂(A，B)片段各500bp左右，再以amyKF1和amyKR2为引物，SOE-PCR连接上下游同源臂，得到片段A+B，大小为1005bp。用限制性内切酶Xba I和BamHI双酶切A+B，得到的amyL(A+B)片段与经同样双酶切处理过的温敏型敲除质粒T2(ori)连接，连接产物转化E.coli DH5α。转化子经PCR验证确定为阳性克隆后，抽质粒进行双酶切验证并测序。得到的重组敲除质粒为T2-amyL。构建过程如图1。用同样的方法还构建了T2-aprE，T2-hag，T2-mpr、T2-aprX、T2-epr、T2-bpr、T2-wprA、T2-bprA。10个质粒的酶切验证结果如图2所示。

将敲除质粒T2-hag转化到野生型菌株WX-02中，通过在45℃单交换和37℃双交换，得到hag基因缺失的菌株BL1，双交换验证结果如图3所示。同样的方法，在BL1的基础上，依次叠加部分或完全删除另外9个基因。最终得到缺失突变株地衣芽胞杆菌BL1-10，其中BL10即是WX-02(Δhag；Δmpr；Δvpr；ΔaprX；Δepr；Δbpr；ΔwprA；ΔaprE；ΔamyL；ΔbprA)。其中敲除bprA基因(编码芽胞杆菌肽酶F)后，对宿主细胞影响最大，宿主细胞完全无胞外蛋白酶活性。

地衣芽胞杆菌BL10保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCC NO：M2013400，保藏日期为2013年9月10日。

在ME培养基中发酵，检测发酵液的特征。发现BL10宿主菌聚谷氨酸(γ-PGA)的产量比野生型的WX-02菌株大为降低，只有野生型菌株WX-02的16.8％，低聚谷氨酸含量有利于降低发酵粘度，促进发酵过程传质，并有利于发酵产品的分离纯化。

本发明提供一种利用宿主细胞BL10表达目标蛋白的方法，是这样实现的：

根据NCBI公布的B.subtillis168基因组上P43启动子的序列设计一对引物P43F和P43R1，

P43F：5'-GGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’(EcoRI)

P43R1：5'-AAGCCGTTTTTGTTGTTTCATTTCATGTGTACATTCCTCTC-3’

PCR扩增得到启动子P43片段，大小为305bp。

根据本实验测得的B.licheniformis WX-02全基因组序列中的amyL基因序列(见SEQ ID NO.9)，在NCBI上的登陆编号为MUY_00877，设计一对引物PamyLF1和PamyTR，

PamyLF1：

5'-GAGAGGAATGTACACATGAAATGAAACAACAAAAACGGCTT-3’

PamyTR：5'-GAAGATCT CGCAATAATGCCGTCGCACTG-3’(BglII)

以B.licheniformis WX-02的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到amyL基因的编码区(包括信号肽)和终止子片段，大小约为2040bp；将P43启动子基因与目标蛋白基因纯化回收后作为模板，用SOE-PCR连接在一起，纯化后回收，用EcoR I和Bgl II双酶切，酶切后纯化回收检测。然后将pHY300PLK空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连接。连接产物转化E.coli DH5α。既获得分泌表达载体pP43SAT。电转化至地衣芽胞杆菌BL10表达宿主，获得工程菌。用同样的方法，即可将脂肪酶基因和各种蛋白酶基因与P43启动子基因连接构建表达载体，进而电转化至BL10获得表达目标蛋白的工程菌株。

对于淀粉酶基因来说，利用相同的方法同时转化淀粉酶缺缺失的B.licheniformisWX-02(ΔamyL)，获得了工程菌B.licheniformis WX-02(ΔamyL；pP43SAT)作为对照，进行淀粉酶发酵。相比WX-02(ΔamyL；pP43SAT)(241.72U／mL)，BL10(pP43SAT)(263.18U／mL)的淀粉酶酶活力提高了9％，说明蛋白酶缺失宿主菌有利于增强目标蛋白的表达。

本发明的有益效果：

(1)首次在地衣芽胞杆菌WX-02中叠加敲除了10个基因，得到系列突变株BL1-10；

(2)其中敲除bprA(编码芽胞杆菌肽酶F基因)，完全消除了宿主细胞胞外蛋白酶活性。

(3)突变株地衣芽胞杆菌BL10完全没有胞外蛋白酶活性，可以使目的蛋白表达过程中折叠时不被蛋白酶所降解；

(4)利用表达宿主BL10分泌表达目标蛋白时，酶活力高于野生型WX-02。

附图说明

图1：敲除载体T2-amyL的构建过程；

图2：10个敲除质粒的双酶切鉴定；泳道1：线性质粒T2(2)-ori(通过Xba I和Sac I酶切)；泳道M₁：DL5000DNA Maker；泳道2-11：敲除载体T2-hag(Xba I+sac I)／T2-mpr(XbaI+Sac I)／T2-vpr(BamH I+Sac I)／T2-aprX(Xba I+Sac I)／T2-epr(Xba I+Sac I)／T2-bpr(Xba I+Sac I)／T2-wprA(Xba I+Sac I)／T2-aprE(BamH I+Xba I)／T2-amyL(BamH I+XbaI)／T2-bprA(Xba I+Sac I)酶切结果；泳道M₂： DL5000DNA Maker。

图3：T2-hag双交换结果菌株PCR鉴定；泳道M：DL2000DNAMarker；泳道1-4：以菌株BL1总DNA为模板的PCR结果(引物hagKYF和hagKYR，目标片段长度约1100bp)；泳道5：以菌株WX-02总DNA为模板的PCR结果(引物hagKYF和hagKYR，目标片段长度约2000bp)。

图4：BL1-9胞外蛋白酶明胶酶谱结果；泳道1-10：菌株WX-02，BL1，BL2，BL3，BL4，BL5，BL6，BL7，BL8，BL9的胞外蛋白酶明胶酶谱图。

图5：BL9和BL10胞外蛋白酶明胶酶谱结果；泳道1-2：菌株BL10的胞外蛋白酶明胶酶谱图；泳道3-4：菌株BL9的胞外蛋白酶明胶酶谱图。

图6：BL10双交换菌株的PCR验证；泳道1，3，5，7，9，11，13，15，17，19：以菌株BL10总DNA为模板的PCR结果，引物分别为hagKYF／hagKYR(1100bp)，mprKYF／mprKYRR(1100bp)，vprKYF／vprKYR(760bp)，aprXKYF／aprXKYR(1251bp)，eprKYF／eprKYR(1115bp)，bprKYF／bprKYR(1188bp)，wprAKYF／wprAKYR(1166bp)，aprEKYF／aprEKYR(1133bp)，amyKYF／amyKYR(1037bp)，bprAKYF／bprAKYR(1302bp)；泳道2，4，6，8，10，12，14，16，18，20：以菌株WX-02总DNA为模板的PCR结果，引物分别为hagKYF／hagKYR(1410bp)，mprKYF／mprKYRR(2200bp)，vprKYF／vprKYR(3187bp)，aprXKYF／aprXKYR(2551bp)，eprKYF／eprKYR(2820bp)，bprKYF／bprKYR(4154bp)，wprAKYF／wprAKYR(3188bp)，aprEKYF／aprEKYR(2364bp)，amyKYF／amyKYR(2679bp)，bprAKYF／bprAKYR(2872bp)。

图7：WX-02和BL10的发酵液特征比较。

图8：表达载体pP43SAT的构建过程。

图9：表达质粒pP43SAT的酶切鉴定；泳道1：菌株SAT的SOE-PCR结果(引物P43F／PamyTR，目标片段长度为2345bp)；泳道2：质粒pHY300PLK的BglII／EcoRI酶切结果(4870bp)；泳道3：质粒pP43SAT的BglII／EcoRI酶切结果(4870bp，2345bp)。图10：表达淀粉酶工程菌的SDS-PAGE结果。

序列简述

SEQ ID NO：1是鞭毛蛋白合成酶基因hag的编码区DNA序列。

SEQ ID NO：2是胞外金属蛋白酶基因mpr的编码区DNA序列。

SEQ ID NO：3是丝氨酸蛋白酶基因vpr的编码区DNA序列。

SEQ ID NO：4是胞内丝氨酸蛋白酶基因aprX的编码区DNA序列。

SEQ IDNO：5是微小胞外蛋白酶基因epr的编码区DNA序列。

SEQ ID NO：6是芽胞杆菌肽酶F的一种基因bpr的编码区DNA序列。

SEQ ID NO：7是与细胞壁结合的蛋白酶基因wprA的编码区DNA序列。

SEQ ID NO：8是胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因aprE的编码区DNA序列。

SEQ ID NO：9是合成α-淀粉酶基因amyL的编码区DNA序列。

SEQ ID NO：10是芽胞杆菌肽酶F另一个基因bprA的编码区DNA序列。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限制。

实施例1蛋白酶缺失菌株BL10的构建

1、地衣芽胞杆菌WX-02蛋白酶(或肽酶)的注释

利用MEROPS数据库中列出的Bacillus licheniformis的所有的已知和假定的蛋白酶或肽酶，Blast找出WX-02基因组序列中相应的蛋白酶或肽酶基因，再用Signal-3L和Cell-PLoc预测出其在细胞中的位置，在胞外(包括细胞壁)、胞内或细胞膜。随后用已报道的B.licheniformis的胞外蛋白组学结果做参考，修正一些没有信号肽却能分泌到胞外的蛋白酶或肽酶，并利用EditSeq计算出其蛋白分子量。通过对测序得到的B.licheniformis基因组序列的分析，得出该基因组中存在166个已知和假定的蛋白酶(或肽酶)，其中与细胞膜和细胞壁结合的(已知和假定的)蛋白酶(或肽酶)有33个，细胞内有119个，细胞外有14个。表1列出了本发明选择敲除的蛋白酶基因。

表1地衣芽胞杆菌WX-02的部分蛋白酶(肽酶)

2、敲除载体的构建

以B.licheniformis WX-02基因组DNA为模板，用hagKF1／hagKR1为引物，

hagkF1：5'-GCTCTAGACGCCGTTCGTCGTCCTTCAG-3’(XbaI)

hagkR1：5'-GGCCAAGATCTTTTTAAAATCACTTTTTTTGTGAGG-3’PCR扩增出敲除hag的上游同源臂hag(A)；同时以基因组DNA为模板，hagKF2／hagKR2为引物，

hagkF2：5'-CCTCACAAAAAAAGTGATTTTAAAAAGATCTTGGCC-3’

hagkR2：5'-CGAGCTCTTCTATGTAGTTTTATCGAC-3’(SacI)

PCR扩增出下游同源臂hag(B)。再以hag(A)和hag(B)为模板，hagKF1／hagKR2为引物，经SOE-PCR扩增出上下游同源臂连在一起的片段hag(A+B)。利用Xba I和Sac I双酶切hag(A+B)，与经过同样酶切处理的空质粒T2(2)-ori连接，转化E.coli DH5a，涂含Kan抗性的平板，并挑转化子抽质粒跑胶验证，得到敲除质粒T2-hag，酶切验证见图2。

T2-mpr、T2-vpr、T2-aprX、T2-epr、T2-bpr、T2-wprA、T2-aprE、T2-amyL、T2-bprA、质粒的构建过程如T2-hag，构建成功后酶切验证如图2。

3、缺失突变株Bacillus lihcheniformis BL1的构建

T2-hag电转野生型B.lihcheniformis WX-02，在Kan抗性的平板上筛选阳性转化子，挑阳性转化子抽质粒，并用Xba I和Sac I双酶切验证。将阳性克隆在45℃单交换，转接培养3次，每次12h，并用菌落PCR检测单交换菌株。将得到的单交换菌株在37℃，转接培养6次，每次8-12h，以hagKYF／hagKYR为验证引物，菌落PCR验证双交换菌株，将得到的双交换菌株抽总DNA，再用hagKYF／hagKYR引物PCR验证，如图3所示。将得到的双交换成功菌株命名为B.lihcheniformis BL1，缺失基因hag。

4、缺失突变株Bacillus lihcheniformis BL2-9的构建

构建方法如3，依次分别叠加删除mpr、vpr、aprX、epr、bpr、wprA、aprE、amyL得到BL2-9。

5、缺失突变株BL10的构建

构建了敲除载体T2-bprA，在BL9的基础上敲除bprA基因，由图4和图5可知，当bprA基因在BL9中缺失后，胞外蛋白酶活性为0。将得到的完全无胞外蛋白酶活性的缺失突变株命名为BL10，缺失基因包括hag、mpr、vpr、aprX、epr、bpr、wprA、aprE、amyL和bprA，其基因组PCR验证结果如图6所示。

6、地衣芽胞杆菌BL10的发酵液特征

分别挑取菌落B.licheniformis BL10和B.licheniformis WX-02接种于5mL的新鲜的LB培养基中，37℃，180r／min振荡培养过夜。再以4％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD₆₀₀为1.0时，以1％的接种量接种到50mL新鲜的γ-PGA高产培养基中(g/L：葡萄糖50.0，谷氨酸钠60.0，柠檬酸钠12.0，NH₄Cl7.0，K₂HPO₄0.5，MgSO₄·7H₂O0.5，FeSO₄·6H₂O0.04，CaCl₂·2H₂O0.15，MnSO₄·H₂O0.104，pH7.2)，37℃，180r／min振荡培养33h(稳定期后期)。取样，用生物传感仪测定残留葡萄糖和残留谷氨酸盐，用干重法测γ-PGA产量，结果如图7所示。较少的y-PGA产量有利于目标蛋白的表达和分离纯化。

实施例2α-淀粉酶的高效分泌表达

B.licheniformis α-淀粉酶表达质粒pP43SAT的构建过程如图8所示。根据NCBI公布的B.subtillis168基因组上P43启动子的序列设计一对引物P43F和P43R1，

P43F：5'-GGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’(EcoRI)

P43R1：5'-AAGCCGTTTTTGTTGTTTCATTTCATGTGTACATTCCTCTC-3’

PCR扩增得到启动子P43片段，大小为305bp。

根据本实验测得的B.licheniformis WX-02全基因组序列中的amyL基因序列(见SEQ ID NO.9)，在NCBI上的登陆编号为MUY_00877，设计一对引物PamyLF1和PamyTR，

PamyLF1：

5'-GAGAGGAATGTACACATGAAATGAAACAACAAAAACGGCTT-3’

PamyTR：5'-GAAGATCT CGCAATAATGCCGTCGCACTG-3’(BglII)

以B.licheniformis WX-02的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到amyL基因的编码区(包括信号肽)和终止子片段，大小约为2040bp；将P43启动子基因与目标蛋白基因纯化回收后作为模板，用SOE-PCR连接在一起，纯化后回收，用EcoR I和BglII双酶切，酶切后纯化回收检测。然后将pHY300PLK空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连接。连接产物转化E.coli DH5a。即获得分泌表达载体pP43SAT。将构建好的质粒pP43SAT分别电转入淀粉酶缺失菌株B.licheniformis WX-02(ΔamyL)、BL9和BL10，并以空质粒pHY300PLK电转入BL10作为阴性对照。以设计在pHY300PLK载体上PHY-F／PHY-R为引物，菌落PCR验证阳性克隆，挑阳性克隆过夜培养后，抽质粒，酶切验证结果如图9所示。最终得到工程菌BL9(pP43SAT)、BL10(pP43SAT)和对照BL10(pHY300PLK)。

分别挑取菌落B.licheniformis WX-02(ΔamyL；pP43SAT)，B.licheniformis BL9(pP43SAT)，B.licheniformis BL10(pP43SAT)和B.licheniformis BL10(pHY300PLK)接种于5mL的有四环素(20μg／mL)的LB培养基中，37℃，180r／min振荡培养过夜。再以4％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD₆₀₀为1.0时，以1％的接种量接种到50mL新鲜的产淀粉酶培养基(g/L：玉米浆干粉5，酵母粉5，蛋白胨10，柠檬酸钠12，K₂HPO₄.3H₂O1，MgSO₄.7H₂O0.5，CaCl₂.2H₂O0.15，pH7.0-7.2)中，37℃，180r／min振荡培养42h，测定淀粉酶活力，相比WX-02(ΔamyL；pP43SAT)(241.72U／mL)，BL10(pP43SAT)(263.18U／mL)的淀粉酶酶活力提高了9％，说明蛋白酶缺失宿主菌有利于增强目标蛋白的表达。取B.licheniformis BL9(pP43SAT)，B.licheniformis BL10(pP43SAT)和B.licheniformisBL10(pHY300PLK)的发酵液，跑SDS-PAGE，AmyL大小为58.5KDa，结果如图10(箭头所指)，进一步证明淀粉酶在BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT)中获得了表达。

Claims (1)

1.一种利用地衣芽孢杆菌表达目标蛋白的方法，其中所述目标蛋白是淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶；

所述的地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL10，保藏编号为CCTCC NO：M2013400；所述的方法中，是选择枯草芽孢杆菌强启动子P43与目标蛋白基因连接，插入到pHY300PLK空质粒中，构建分泌表达载体，电转化至地衣芽孢杆菌BL10表达宿主，获得工程菌。