CN105368762B - 一株可以高效分泌纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌 - Google Patents

Abstract

一株可以高效分泌纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌，属于酶工程和微生物技术领域。本方法采用分子生物学技术，通过对外源蛋白转运过程中起重要作用的信号肽进行筛选和替换，在之前实验室保存的地衣芽胞杆菌产纳豆激酶工程菌BL10(pP43SNT）的基础上，将其信号肽由来源于地衣芽胞杆菌WX‑02中胞外丝氨酸蛋白酶Vpr的信号肽替换为来源于枯草芽胞杆菌168中果聚糖酶SacC的信号肽，重新构建了地衣芽胞杆菌产纳豆激酶工程菌Bl10（pP43SacCNK）。在液体发酵的条件下该菌可以显著提高纳豆激酶的分泌水平，最大酶活力可达33.83FU/mL。该菌株于2014年6月16日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014253。

Description

一株可以高效分泌纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌

技术领域

一株可以高效分泌纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌，属于酶工程和微生物技术领域。

背景技术

纳豆激酶是由枯草纳豆芽胞杆菌分泌的一种单链丝氨酸蛋白酶，该酶具有良好的溶栓活性，Asp32，His64，Ser221组成的催化三联体结构构成其活性中心，相比于尿激酶，t-PA及链激酶等纤溶酶，纳豆激酶其良好的溶栓效果及生物安全性，使之成为未来可用于治疗心血管疾病的特效药。同时作为一种功能性保健食品，纳豆激酶食品也越来越受到消费者的青睐。

目前报道的用于生产纳豆激酶的芽胞杆菌主要有枯草芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌等。因为其高效的外源蛋白分泌效率和生物安全性，地衣芽胞杆菌可以作为一个优良的表达宿主用于表达外源蛋白，地衣芽胞杆菌Bl10是由野生菌地衣芽胞杆菌WX-02中缺失了8种自身胞外蛋白酶后得到的一株可用于高效外源蛋白表达的宿主菌，在前期的研究中，我们已实现了来源于枯草纳豆芽胞杆菌MBS 04-6中纳豆激酶基因AprN在地衣芽胞杆菌Bl10中的表达，但其酶活只有11.73 FU/mL。

外源蛋白分泌到胞外主要经过识别、结合、折叠和分泌三个阶段。信号肽在外源蛋白分泌过程中具有十分重要的作用，它就像一个带有定位系统的火车头引导外源蛋白跨膜，通过信号肽酶的剪切作用，前体蛋白变成成熟蛋白从而分泌到胞外。由于信号肽在外源蛋白分泌中的重要作用，使得我们可以通过优化信号肽来提高外源蛋白的表达量。Brockmeier et al（2006）和Degering et al（2010）通过建立信号肽筛选文库对地衣芽胞杆菌14580和枯草芽胞杆菌168中的Sec-SRP途径中的信号肽进行了筛选，通过筛选得到了可以提高相应目标蛋白表达的信号肽。同时，他们也提出了信号肽并没有普适性这一观点。与此同时，关于外源蛋白表达过程中其他元件的优化及信号肽特定位点的改造人们也做了很多的工作，这些策略都为加强外源蛋白的表达提出了新的思路，也为我们今后更好的研究和应用外源蛋白表达系统指明了方向。

发明内容

本发明提供一株可以高效分泌纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌（保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号：CCTCC NO：M 2014253；分类名称：地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）BL10（pP43SacCNK）；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号(武汉大学)；保藏日期：2014年6月12日），其在液体发酵过程中可以高效分泌纳豆激酶，为以后的科学研究和工业化生产奠定了基础。

技术路线

1 重组载体中表达元件的克隆

以枯草芽胞杆菌168的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出P43启动子和果聚糖酶SacC的信号肽（序列见SEQ ID NO：1），引物分别为P43-F/R，Sp-SacC-F/R；以枯草纳豆芽胞杆菌MBS 04-6的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出纳豆激酶基因AprN，引物为AprN-F/R；以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL的终止子序列，引物为TamyL-F/R。

2 以果聚糖酶SacC的信号肽为信号肽的纳豆激酶分泌型表达载体的构建

以实验室保存的表达载体pHY300PLK为初始载体构建纳豆激酶高效分泌表达载体。先将P43启动子、果聚糖酶SacC的信号肽、纳豆激酶基因AprN及淀粉酶基因amyL的终止子片段通过SOE-PCR的方法连到一起，构成PSacCNK。通过EcoRI/XbaI双酶切，纯化回收后与同样经过EcoRI/XbaI双酶切的pHY300PLK空质粒酶连，酶连温度为16°C，时间为8 h，酶连产物随后转化E.coliDH5α，挑转化子进行菌落PCR验证，将PCR验证正确的转化子挑菌接至含有5 mL LB培养基的PA瓶中（50 ug/mL氨苄抗生素），抽质粒并测序。

3 地衣芽胞杆菌纳豆激酶工程菌株Bl10（pP43SacCNK）的构建

将构建好的纳豆激酶分泌型表达载体和pHY300PLK空质粒分别转化地衣芽胞杆菌Bl10。首先做地衣芽胞杆菌Bl10感受态，在平板上活化菌种，然后挑菌至含有5 mL LB的PA瓶中，37°C过夜培养，随后以5%的接种量转接至生长培养基中，37°C，200 rpm培养至OD₆₀₀到0.85左右，5500 rpm离心6 min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，5500 rpm离心6 min，重复三次后加入1 mL洗涤培养基重悬菌体，分装至灭过菌的1.5 mLEP管中，—80°C保存。

将吹干后的电转杯在冰上预冷15 min，然后将100 ul的地衣芽胞杆菌Bl10感受态细胞与10 ul重组载体混匀后加入电转杯中，冰上预冷3-5 min后，2.4 kV条件下点击，电击时间4.8-5.2ms，随后立即加入800ul恢复培养基并转移至1.5 mLEP管中。37°C，100rpm培养3 h后涂LB平板（20 ug/mL 四环抗生素）。待长出转化子后挑菌进行菌落PCR验证和抽质粒验证，验证正确后保存菌种。验证引物为pHY-F/R。

4 地衣芽胞杆菌Bl10（pP43SacCNK）发酵实验

在平板上活化菌种，挑菌接至含有50 mL液体LB的250 mL三角瓶中，37°C，180 rpm培养10 h，随后以1%的接种量接种至发酵培养基中，37°C，180 rpm培养48 h。

5 纳豆激酶酶活的测定

采用平板法测定发酵液中纳豆激酶的酶活。先将发酵液10000 rom离心5 min取上清，倒纤维蛋白原平板，待平板凝固后用微量打孔器打孔，后取10 ul发酵上清液点孔，37°C条件下培养10-12 h，使用游标卡尺来计算平板上透明圈的直径并与标准液相比较从而得到纳豆激酶的酶活。

6 定量测定地衣芽胞杆菌Bl10（pP43SacCNK）发酵终点纳豆激酶的分泌量

BSA标准曲线的制作。预先准备好不同浓度的BSA溶液（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6mg/mL、0.8 mg/mL、1 mg/mL），与等量的2*SDS-PAGE buffer混合后，跑SDS-PAGE，点样量均为10ul。染色脱色后根据蛋白胶上目标条带的深度及条带面积得到BSA蛋白的标准曲线。

样品预处理。1.5 mLEP管中加入900 ul发酵液上清，与100 ul 100%TCA混匀后，4°C条件下静置过夜，10000 rpm离心10 min，随后用500 ul无水乙醇洗去TCA，重复三次，待乙醇吹干后加入45 ul的2M硫脲和8M尿素的混合溶液，与等量的2*SDS-PAGE buffer混匀后点样，点样量为10ul。根据样品条带的深度及面积，参照蛋白的标准曲线得到发酵液中纳豆激酶蛋白的分泌量。

附图说明

图1为纳豆激酶分泌型载体中表达元件琼脂糖凝胶图

泳道1为来源于枯草芽胞杆菌168中启动子P43的条带（305 bp）；泳道2为来源枯草芽胞杆菌168中果聚糖酶SacC的信号肽条带（72 bp）；泳道3为来源于枯草纳豆芽胞杆菌MBS04-6中纳豆激酶基因AprN序列条带（1056 bp），泳道4为来源于地衣芽胞杆菌wx-02中淀粉酶基因amyL条带（502 bp），泳道5为5K DNA marker（从上到下依次为：5000bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp）。

图2为纳豆激酶分泌型载体质粒图谱

以表达质粒pHY300PLK为原始质粒，在其基础上加入来源于枯草芽胞杆菌168的启动子P43，来源于枯草芽胞杆菌168中果聚糖酶SacC的信号肽，来源于纳豆芽胞杆菌MBS 04-6中的纳豆激酶基因AprN及来源于地衣芽胞杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL的终止子，构建了重组质粒pP43SacCNK。

图3为重组载体转化地衣芽胞杆菌Bl10菌落PCR验证图

泳道1 为5K marker（从上到下依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp），通道2-5为用验证引物pHY-F/pHY-R进行菌落PCR验证条带（2207 bp）

图4为地衣芽胞杆菌Bl10（pP43SacCNK）发酵终点测定纳豆激酶分泌量的SDS-PAGE图。

图4中泳道1为浓缩10倍后的发酵上清液样，品M：200 KDa protein marker（200K,150K, 120K, 100K, 85K, 70K, 60K, 50K, 40K, 30K, 25K, 20K, 15K, 10K），泳道2 - 6分别为1 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL BSA溶液条带。

具体实施方法

结合以下实例，对本发明进行进一步说明：

实例1 地衣芽胞杆菌产纳豆激酶工程菌Bl10（pP43SacCNK）的构建

根据NCBI公布的枯草芽胞杆菌168的基因组序列，采用PCR的方法扩增出启动子P43的序列和果聚糖酶SacC的信号肽序列。引物分别为：

P43-F：CGGAATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG

P43-R：CTTGAATCAGTCTCTTTTTCATTTCATGTGTACATTCCTCTC

Sp-SacC-F：GAGAGGAATGTACACATGAAATGAAAAAGAGACTGATTCAAG

Sp-SacC-R：CTGTACTGCTTTTTCCGGCTGCATCTGCCGAAAATGCCATAG

根据NCBI上公布的枯草纳豆芽胞杆菌基因组序列，采用PCR的方法扩增出纳豆激酶基因AprN序列。引物如下：

AprN-F：CTATGGCATTTTCGGCAGATGCAGCCGGAAAAAGCAGTACAG

AprN-R：ATCCGTCCTCTCTGCTCTTTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTGAT

根据NCBI上公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列，采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因amyL终止子的序列。引物如下

TamyL-F：ATCAACGTACAAGCAGCTGCACAAAAGAGCAGAGAGGACGGAT

TamyL-R：GCTCTAGAGCCGCAATAATGCCGTCGCACTG

实例2 地衣芽胞杆菌Bl10（pP43SacCNK）的发酵实验及酶活测定

种子液：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，10 g/L氯化钠 pH7.2 - 7.4 250 mL三角瓶装液量为50 mL

种子培养时间：10 h

发酵培养基：20 g/L葡萄糖，10 g/L蛋白胨，15 g/L酵母浸粉，10 g/L氯化钠，6 g/L硫酸铵；10 g/L大豆蛋白胨，5 g/L玉米浆 pH 7.0 - 7.2 250 mL三角瓶装液量为30 mL

接种量：3%

培养时间：48 h

发酵液预处理：取2 mL发酵液于2 mLEP管中，10000 rpm离心5 min后上清转移至另外一个2 mLEP管中，4°C保存备用。

纤维蛋白原平板法测酶活：50°C条件下，10 mL纤维蛋白原溶液（2.0 mg/mL）与10mL琼脂糖溶液（1.0%, w/v）快速混合，随后加入0.5 mL凝血酶溶液（20 U/mL)，混匀后倒平板，室温放置待冷却凝固，用微型打孔器打孔，并取酶液和标准酶液10 uL点孔，37°C时放置12-16 h，通过使用游标卡尺测量透明圈的直径并与标准酶液比较从而得到样品的酶活。

实例3 地衣芽胞杆菌Bl10（pP43SacCNK）发酵终点纳豆激酶分泌量的测定

BSA标准曲线的制作：不同浓度的BSA溶液（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8mg/mL、1 mg/mL）与等量的2*SDS-PAGE buffer混匀后取10ul点样，电泳结束后通过检测其不同浓度BSA条带的深度和面积得到BSA的标准曲线，为：y=1.3522 x + 0.7429 ( R²=0.9955, y:蛋白条带的深度面积积 x:蛋白总量 )

发酵液样品预处理：根据的方法，对发酵液上清进行预处理，与2*SDS-PAGEbuffer混匀后取10ul点样，根据其电泳结束后蛋白条带的颜色深度及面积并与BSA的标准曲线进行比较从而得到发酵液中纳豆激酶蛋白量为163.52 mg/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一株可以高效分泌纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌

<130> 2014

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌168中果聚糖酶SacC的信号肽

<400> 1

atgaaaaaga gactgattca agtcatgatc atgttcaccc tgctgttgac tatggcattt 60

tcggcagatg ca 72

Claims (2)

1.一种地衣芽胞杆菌BL10 pP43SacCNK，其特征在于，所述地衣芽胞杆菌BL10pP43SacCNK保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014253。

2.根据权利要求1所述的一种地衣芽胞杆菌BL10 pP43SacCNK发酵生产纳豆激酶的方法，其特征在于：

(1)出发菌株：地衣芽胞杆菌BL10 pP43SacCNK；

(2)种子培养：

种子培养基为LB培养基：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L；

种子培养：培养温度为37℃，250mL三角瓶中装液量为50mL，摇床转速180r/min，培养时间为10h；

液体发酵培养：

液体发酵培养基：20g/L葡萄糖；10g/L蛋白胨；15g/L酵母浸粉；10g/L大豆蛋白胨；10g/L氯化钠；6g/L硫酸铵；5g/L玉米浆pH7.0-7.2；

液体发酵培养条件：发酵温度为37℃，250mL三角瓶中装液量30mL，摇床转速180r/min，发酵周期48h。