CN100439506C - 大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与应用。该载体是自5’至3’端顺次连接有热启动子，噬菌体裂解基因和大肠杆菌终止子的大肠杆菌表达载体。该大肠杆菌自裂解方法是将所述大肠杆菌自裂解载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，再将重组大肠杆菌热诱导后，大肠杆菌细胞裂解。实验证明该载体经适宜的温度诱导使Lambda噬菌体的裂解基因SRRz获得表达，从而使宿主细胞裂解，释放具有生物活性的外源目标蛋白到达培养基，以利于定向进化中后续的高通量筛选的进行，具有廉价、快捷的优点。

Description

大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与应用

技术领域

本发明涉及大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与应用，特别是涉及一种大肠杆菌自裂解方法及其专用载体与该方法在高通量筛选胞内酶中的应用。

背景技术

分子定向进化技术(Molecular Directed Evolution)是由美国工程院院士、加州理工学院(California Institute of Technology)化工系教授Frances Arnold于90年代初期开发出来的(Frances H.Arnold，Combinatorial and computationalchallenges for biocatalyst design.Nature.2001，409：253-257)。该技术是基因工程、蛋白质结构和计算技术互补发展和渗透的结果，标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造蛋白质(酶)，甚至设计出自然界中原本不存在的全新蛋白质(酶)。

分子定向进化技术，简单地说就是模拟达尔文的自然进化原理，在实验室的试管中将编码某一蛋白质(酶)的基因用随机突变(random mutagenesis)和随机杂交、重组的方法以产生大量的突变，构建突变库，然后根据特定功能指标对这些蛋白质(酶)的变种逐一进行筛选(screening)或者进行“适者生存”式的选择(selection)，从而得到在特定性能上的优良变种。与自然进化不同，分子定向进化技术是在人为引发条件下发生，并通过选择突变后的分子群来保留某一方向的进化而排除其它方向突变，整个进化过程完全是被事先特定的，即是定向的。

分子定向进化技术(Frances H.Arnold，Combinatorial and computationalchallenges for biocatalyst design.Nature.2001，409：253-257；Frances H.Arnold.When blind is better：Protein design by evolution.NatureBiotechnology.1998，16：617-618；Hyun Joo，Zhanglin Lin，and Frances H.Arnold，Laboratory evolution of peroxide-mediated cytochrome P450 hydroxylation，Nature.1999，399：670-673)属于对蛋白质(酶)分子的一种“自下而上”(bottom-up)的非理性设计(irrational design)，避开了对蛋白质(酶)分子结构及其结构与功能相关性认知的要求，简单的通过模拟达尔文自然进化原理，在分子水平上对蛋白质(酶)进行随机改变，并以多步渐进的方式，从众多的基因变种库中通过筛选(或选择)得到性能改良的变种，使蛋白质在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短至几年甚至几个月，大大拓宽了蛋白质(酶)工程的研究领域和应用范围，因此也说明定向进化技术具有很强的可操作性。

由于大肠杆菌(Escherichia coli)遗传背景清楚，易培养，生长快速，且具有大量可供选择的克隆载体和表达载体，因此在分子定向进化过程中选用大肠杆菌作为外源蛋白表达系统极为常见。但由于酶最初是在表达载体内部得以标定的，而酶的底物/产物都是在表达载体体外的，且多数很难透过载体细胞进入细胞，这给进化过程中的依据目标蛋白(酶)的活性而开展的高通量筛选工作带来了巨大困难，因此开发能够将具有生物活性的重组蛋白(目标蛋白)释放到菌体外或者培养基中的简易方法，将对高通量筛选具有重要意义。

目前，释放重组蛋白到菌体外的方法主要是通过破碎细胞(Anton P.J.Middelberg，Process-scale disruption of microorganisms，BiotechnologyAdvances.1995，13：491-551)，包括机械方法如French press裂解、超声破碎裂解(ultrasonication)、振动磨碎(vibration mills)裂解等，和非机械方法如化学试剂裂解、碱裂解以及酶降解等方法。机械方法很难在高通量筛选中实现，而非机械方法通常需要添加化学试剂或酶，从而给后续的酶的测定带来干扰问题，并增加了高通量筛选的工序和成本(如大量一次性耗材的使用)。

以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主的噬菌体，能够在一定的外在条件下(如温度、化学物质、紫外等)裂解细胞，使细胞内积累的产物释放。该方法具有破壁效率高、可控、操作方便等优点，为高通量筛选提供了一个可能的手段。大肠杆菌(Escherichia coli)的Lambda噬菌体是目前研究最清楚、应用最广泛的噬菌体之一。Lambda噬菌体中导致细胞裂解的基因包括S、R和Rz三个基因，其中R基因编码的是一种可溶于水的转糖基酶(transglycosylase)，可以引起肽键的水解，分解细胞壁的肽聚糖(Corchero J.L.，Rafael C.etc，Cell lysis in Escherichia colicultures stimulates growth and biosynthesis of recombinant proteins insurviving cells，Microbiol.Res.2001，156：13-18)。Rz基因的产物可能是一种肽链内切酶(endopepidase)，它可以切割肽聚糖和寡糖之间和/或者肽聚糖与细胞壁外膜之间的连接(Ry Young，Bacteriophage lysis：Mechanism and regulation，Microbiological Reviews.1992，56：430-381)。R和Rz基因产物的功能都是降解细胞壁，而S基因(Ronald R.，Gregory N.，Charles S.，Jeffery S.，Ry Young，Dominancein Lambda S mutations and evidence for translational control.J.Mol.Biol.1988，199：95-105；Chung Y.C.，Kiebang N.，Ry Young，S gene Expression andthe timing of lysis by bacteriophage，J.Bacteriol.1995，177：3283-3294)产物的作用是改变细胞质膜的通透性，在细胞质膜上形成多孔的结构，以使R和Rz基因的产物穿过细胞质膜，并作用于细胞壁，使细胞壁破碎，释放胞内物质。

Lambda噬菌体的基因组中，有一些调控单元，如Lambda p_R启动子和温度敏感型阻遏蛋白cI857体系，现已广泛用于细菌中目的基因的表达。在该转录调控体系中目的基因克隆于其下游，低温时(30℃以下)，cI857阻遏蛋白结合在操纵子区域，完全抑制了p_R启动子，使得下游目的基因的转录完全受到抑制；当温度升高时，cI857阻遏蛋白失活，p_R启动子激活，从而下游基因获得转录和表达，而当温度升高至42℃时，p_R就是一个很强的启动子(Remaut，E.，Stanssens，P.，Fiers，W..Plasmid vectorsfor highefficiency expression controlled by the pL promoter of coliphageLambda.Gene.1981，15：81-93)，原理图见图1。因而含有该表达体系的重组菌在生长时，一般在低于30℃下生长，以完全抑制目的基因表达。

后来又发现，p_R启动子的一个突变体p_R(M)，序列构成如图2所示，在LambdacI857/p_R的一个操纵子区域，有一个碱基突变(T→C)，该突变体可以使p_R启动子在36℃时完全受到抑制，但在42℃时，仍然是很强的启动子，可以实现温度诱导(Jechl inger，W.，Szostak，M.P.，Witte，A.，Lubitz，W.Altered temperatureinduction sensitivity of the Lambda pR/cI857 system for controlled gene Eexpression in Escherichia coli.FEMS Microbiol.Lett.1999，173：347-352)，这样，菌体就可以在更高的温度(36℃)下生长，获得更快的生长速度。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于高通量筛选胞内酶的大肠杆菌自裂解载体。

本发明所提供的大肠杆菌自裂解载体，是自5’至3’端顺次连接有热启动子，噬菌体裂解基因和大肠杆菌终止子的大肠杆菌表达载体。

所述热启动子可为任意一种热诱导启动子，优选为Lambda噬菌体的cI857/p_R启动子或cI857/p_R(M)启动子；所述cI857/p_R启动子具有序列表中序列1的核苷酸序列，cI857/p_R(M)启动子具有序列表中序列2的核苷酸序列。

所述噬菌体裂解基因可为任意一种噬菌体裂解基因，优选为Lambda噬菌体的裂解基因SRRz，具有序列表中序列3的核苷酸序列。

所述大肠杆菌终止子也可为任意一种大肠杆菌终止子，优选为rrnB终止子，具有序列表中序列4的核苷酸序列。

用于构建所述大肠杆菌自裂解载体的出发载体可为任意一种大肠杆菌表达载体，如pUC18、pUC19或pET30a等。

以pUC18为出发载体，构建的大肠杆菌自裂解载体为pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB或pUC18-cI857/p_R(M)-SRRz-rrnB。

含有所述大肠杆菌自裂解载体的重组大肠杆菌也属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种大肠杆菌的自裂解方法。

本发明所提供的大肠杆菌的自裂解方法，是将上述大肠杆菌自裂解载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，将重组大肠杆菌进行热诱导后，大肠杆菌细胞裂解。

所述携带有cI857/p_R启动子的重组大肠杆菌的热诱导温度为38-42℃，诱导时间为0.5-3小时；所述携带有cI857/p_R(M)启动子的重组大肠杆菌的热诱导温度为40-42℃，诱导时间为0.5-1.5小时。

上述大肠杆菌自裂解方法适用于任何一种大肠杆菌。

本发明的第三个目的是提供一种胞内酶的表达筛选方法。

本发明所提供的胞内酶的表达筛选方法，包括以下步骤：

1)将外源基因插入到上述大肠杆菌自裂解载体中，得到胞内酶表达筛选载体；

2)将步骤1)构建的含有外源基因的胞内酶表达筛选载体导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；

3)发酵重组大肠杆菌，先加入诱导剂对胞内酶进行诱导表达，然后提升温度进行热诱导，再恢复温度继续培养，菌体细胞裂解，胞内酶释放到发酵液中；

4)对发酵液中的胞内酶进行筛选，得到目的蛋白。

在上述表达筛选方法中，步骤2)中的大肠杆菌可为任意适于蛋白表达的大肠杆菌菌株，如E.coli BL21、BL21(DE3)、HB101、XL1-Blue或DH5-α等。

为提高转化效率，将步骤1)构建的含有外源基因的胞内酶表达筛选载体导入大肠杆菌的方法优选为电穿孔转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如，氯化钙转化法、氯化锂转化法、原生质体转化法等等。

步骤3)根据具体所用的载体和宿主菌选择合适的诱导剂，如对于以pUC18或pET30a为出发载体构建的大肠杆菌自裂解载体，可采用异丙基β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thigalactopyranoside，IPTG)作为诱导剂。

步骤4)中可按照常规方法对发酵液中的胞内酶进行活性测定，经筛选得到活性高的目的蛋白。

本发明提供了一种大肠杆菌的自裂解方法及其专用载体。实验证明该载体可在cI857/p_R启动子或其突变体cI857/p_R(M)的调控下，经适宜的温度诱导使Lambda噬菌体的裂解基因SRRz获得表达，从而使宿主细胞裂解，释放具有生物活性的外源目标蛋白到达培养基，以利于定向进化中后续的高通量筛选的进行；经报告蛋白β-半乳糖苷酶的酶活检测，裂解效率可分别达到90％和98％。此外，在温度诱导条件下即可用本发明的载体进行胞内酶的高通量筛选，具有廉价、快捷的优点。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为Lambda噬菌体cI857/p_R调控单元的原理图

图2为Lambda噬菌体启动子cI857/p_R的突变体cI857/p_R(M)的序列构成

图3为pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB和pUC18-cI857/p_R(M)-SRRz-rrnB质粒的构建示意图

图4为合成的recA启动子序列图

图5为在热诱导启动子cI857/p_R控制下裂解基因SRRz的表达及裂解效率检测结果

图6为在热诱导启动子cI857/p_R(M)控制下裂解基因SRRz的表达及裂解效率检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物、基因序列合成及测序工作均由上海生工完成。

实施例1、胞内酶表达筛选专用载体的构建

现以pUC18(TaKaRa公司)为出发载体，构建胞内酶表达筛选专用载体pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB和pUC18-cI857/p_R(M)-SRRz-rrnB，质粒构建的示意图参见图3，具体方法如下：

一、pUC18-recA-SRRz-rrnB的构建

1、构建重组载体pUC18-recA-rrnB

1)合成recA启动子

根据recA启动子的核苷酸序列人工合成recA启动子序列(序列表中序列6)，并在其5’端添加限制性内切酶Sap I识别位点，3’端添加限制性内切酶Xho I和EcoR I识别位点，序列构成如图4所示。

2)PCR扩增rrnB终止子序列

根据rrnB终止子的核苷酸序列(序列表中序列4)设计PCR扩增引物，并在上游引物的5’端添加限制性内切酶EcoR I和Nco I识别位点，下游引物的5’端添加限制性内切酶Afl III识别位点，引物序列如下：

P1(正向引物)：

EcoR I    Nco I

5’-CTA

AAGT

AGGCATCAAATAAAACGAAAG-3’

P2(反向引物)：

Afl III

5’-CGATAGATATGACGACAGGAAG-3’

提取E.coli DH5-α的基因组DNA并以此为模板，在引物P1和P2的引导下，PCR扩增rrnB终止子序列。

3)重组

用限制性内切酶Sap I和Afl III对质粒pUC18进行双酶切；对PCR扩增的rrnB终止子用限制性内切酶EcoR I和Afl III进行双酶切；将两种双酶切产物与合成的recA启动子连接，将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，将转化细胞接种于LB抗性培养平板(每升培养基含有胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，pH7.0，氨苄青霉素(Ampicillin)50μg/mL)筛选阳性克隆，提质粒，得到连接有recA启动子和rrnB终止子的重组质粒，命名为pUC18-recA-rrnB。

2、PCR扩增Lambda噬菌体SRRz裂解基因

根据SRRz裂解基因的核苷酸序列(序列表中序列3)设计PCR扩增引物，并在上游引物的5’端添加限制性内切酶Xho I识别位点，下游引物的5’端添加限制性内切酶Nco I识别位点，引物序列如下：

P3(上游引物)：

XhoI

5’-GGACCTGA

GCCACTGTCTGTCCTGAATTC-3’

P4(下游引物)：

Nco I

5’-CGGTTTTA

TAGGCATTTATACTCCGCTGGA-3’

提取Lambda噬菌体(Lambda DNA，Sam7)的基因组DNA并以此为模板，在引物P3和P4的引导下，PCR扩增SRRz裂解基因，并在基因两端分别添加限制性内切酶XhoI和Nco I识别位点(由于Lambda噬菌体的SRRz基因是“S”缺失的，现运用定点突变的方法去掉“S”基因中的终止密码子，从而获得具有完整功能的SRRz裂解基因)。

3、pUC18-recA-SRRz-rrnB的获得

对重组质粒pUC18-recA-rrnB和PCR扩增的SRRz基因用限制性内切酶Xho I和Nco I进行双酶切，连接，再将连接产物转化E.coliBL21感受态细胞，将转化细胞接种于与步骤1相同的LB抗性培养平板筛选阳性克隆，提质粒，得到连接有recA启动子、SRRz和rrnB终止子的重组质粒，命名为pUC18-recA-SRRz-rrnB。

二、pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB的构建

1、cI857/p_R启动子的合成

根据cI857/p_R启动子的核苷酸序列(序列表中序列1)设计PCR扩增引物，并在上游引物的5’端添加限制性内切酶Sap I识别位点，下游引物的5’端添加限制性内切酶Xho I识别位点，引物序列如下：

P5(正向引物)：

Sap I

5’-AGACGCTA

CGCTTGATGATTATCAGCCAGCAGAG-3’；

P6(反向引物)：

Xho I

5’-AGTACAGA

ATGCAACCATTATCACCGCC-3’

提取Lambda噬菌体的基因组DNA并以此为模板，在引物P5和P6的引导下，PCR扩增cI857/p_R启动子序列。

2、pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB的获得

对重组质粒pUC18-recA-SRRz-rrnB和PCR扩增的cI857/p_R启动子用限制性内切酶Sap I和Xho I进行双酶切，连接，再将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，将转化细胞接种于与步骤一相同的LB抗性培养平板筛选阳性克隆，提质粒，得到连接有cI857/p_R启动子、SRRz和rrnB终止子的重组质粒，命名为

pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB。

三、pUC18-cI857/p_R(M)-SRRz-rrnB的构建

1、cI857/p_R(M)启动子的合成

根据cI857/p_R(M)启动子的核苷酸序列(序列表中序列2)设计PCR扩增引物，并在上游引物的5’端添加限制性内切酶Sap I识别位点，下游引物的5’端添加限制性内切酶Xho I识别位点，引物序列如下：

P7(正向引物)：

Sap I

5’-AGACGCTACGCTTGATGATTATCAGCCAGCAGAG-3’；

P8(反向引物)：

Xho I

5’-AGTACAGA

ATGCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAATAGTCAACACGCGCGGT-3’

提取Lambda噬菌体的基因组DNA并以此为模板，在引物P7和P8的引导下，PCR扩增cI857/p_R(M)启动子序列。

2、pUC18-cI857/p_R(M)-SRRz-rrnB的获得

对重组质粒pUC18-recA-SRRz-rrnB和PCR扩增的cI857/p_R(M)启动子用限制性内切酶Sap I和Xho I进行双酶切，连接，再将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，将转化细胞接种于与步骤一相同的LB抗性培养平板筛选阳性克隆，提质粒，得到连接有cI857/p_R(M)启动子、SRRz和rrnB终止子的重组质粒，命名为pUC18-cI857/p_R(M)-SRRz-rrnB。

实施例2、以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)作为报告蛋白的SRRz裂解基因的效果检验

一、热诱导启动子cI857/p_R控制下裂解基因SRRz的表达及裂解效率的检测

挑选实施例1中携带有胞内酶表达筛选专用质粒pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，在28℃、250rpm下摇瓶培养至OD₆₀₀值为0.4-0.5时，用终浓度1mM的IPTG诱导报告蛋白β-半乳糖苷酶的表达，诱导培养1.5小时至OD₆₀₀值为0.8-1.0，将菌液分装于50mL培养管中，7mL/管，在38℃下热诱导2小时后继续转到28℃下分别培养0，2，4小时以及过夜(18-20小时)培养后收获细胞，测定细胞内、外的β-半乳糖苷酶酶活(Miller J.H.，Experiments in MolecularGenetics，352-355，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork(1972))，同时计算各个时间点的裂解效率。每个样品平行做3次，同时设立对照组(未经热诱导)。

其中，胞内酶(β-半乳糖苷酶)的提取方法包括以下步骤：

1)于热诱导后培养0，2，4以及过夜(18-20小时)后，分别收获0.5mL的菌液，13000rpm离心5min，取上清测胞外酶活性(活性测定方法可参考：Sambrook J.，Russell，D.W.Molecular cloning：A laboratory Manual，3^rd ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(2001))；

2)加入0.5mL细菌裂解缓冲液(50mM Tris-Cl，pH 7.2；5％甘油；50mM NaCl)重悬细胞；

3)将重悬细胞液置于液氮中冷冻1min，取出放置在25℃水浴中融化，如此反复冻融3次；

4)于1.5mL EP管中超声破碎；

5)向悬液中加入溶菌酶至终浓度为0.2mg/mL，于脱色摇床上室温平缓摇动(100rpm)1小时；

6)13000rpm离心4min，取上清进行酶活性测定，所测酶活即为胞内酶活。

β-半乳糖苷酶活性的检测方法(酶标仪)和裂解效率计算方法如下：

β-半乳糖苷酶的活性是通过显色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(oNPG，购自Sigma公司)来测定的，产物在420nm处有最大吸收峰，因此通过测定420nm处的吸光度A₄₂₀，运用如下公式：酶活＝1000×稀释因子×A₄₂₀/(t×V×OD₆₀₀)，其中t表示在28℃下的反应时间，V表示收获细胞的体积，即可计算出胞内、胞外酶活(MillerJ.H.，Experiments in Molecular Genetics，352-355，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York(1972))。然后对所提取的胞内、胞外β-半乳糖苷酶在96孔板中用酶标仪SpectroMAX 190测定酶动力学，以获得A₄₂₀/t。其中，为确保所测得的吸光度在线性范围内，先用逐级稀释的方法获得线性稀释倍数。在96孔板中，每孔的反应体系为：125μl酶液(必要时需要稀释，pH7.6的磷酸盐缓冲液)加上50μl 4g/L oNPG。30min的动力学测定，2min的时间间隔，得到吸光度A₄₂₀随时间的变化率，即可计算出酶活。

菌体的裂解效率可按该式计算：裂解效率＝胞外酶活/胞内、胞外总酶活。

结果在原始型热诱导启动子cI857/p_R的控制下，Lambda噬菌体裂解基因SRRz获得表达，并使菌体有效裂解。在38℃下热诱导2小时后，再转移到28℃下，菌体基本上已经完全裂解，菌液变得澄清(见图5中的图a)。此时，通过报告蛋白-β-半乳糖苷酶的活性测定，算出裂解效率为90％(见图5中的图b)，而且4小时、6小时后裂解效率更高一些。但是当菌体过夜培养(18-20小时)后，残余的未裂解的菌体又生长起来，计算胞外、胞内酶活及裂解效率，结果培养18-20小时后，裂解效率下降至仅为42.6％。对照组在没有热诱导的条件下，菌体没有裂解，SRRz几乎没有本底表达，表明cI857/p_R启动子严格受温度调控。

二、热诱导启动子cI857/p_R(M)控制下裂解基因SRRz的表达及裂解效率的检测

挑选实施例1中携带有胞内酶表达筛选专用质粒

pUC18-cI857/p_R(M)-SRRz-rrnB的阳性克隆，接种于LB液体培养基中，在35℃、250rpm下摇瓶培养至OD₆₀₀值为0.4-0.5时，用终浓度1mM的IPTG诱导报告蛋白β-半乳糖苷酶的表达，诱导培养1小时至OD₆₀₀值为0.8-1.0，将菌液分装于50mL培养管中，7mL/管，在42℃下热诱导0.5小时后继续转到35℃下分别培养0，2，4小时以及过夜(18-20小时)培养后收获细胞，用与步骤一相同的方法测定细胞内、外的β-半乳糖苷酶酶活，同时计算各个时间点的裂解效率。每个样品平行做3次，同时设立对照组(未经热诱导)。

在热诱导启动子cI857/p_R(M)的控制下，Lambda噬菌体裂解基因SRRz获得表达，并使菌体有效裂解。在42℃下热诱导0.5小时后，再转移到35℃下，菌体基本上已经完全裂解，菌液变得澄清(见图6中的图a)。此时，通过报告蛋白-β-半乳糖苷酶的活性测定，算出裂解效率为98％(见图6中的图b)。对照组在没有热诱导的条件下，菌体没有裂解，SRRz几乎没有本底表达，表明cI857/p_R(M)启动子也严格受温度调控。

上述检测结果表明用本发明的胞内酶表达筛选专用载体可获得较好的菌体裂解效果，可用于重组蛋白的高通量筛选。

实施例3、以枯草芽孢杆菌168脂肪酶A(Bacillus subtilis 168 Lipase A)作为报告蛋白的SRRz裂解基因的效果检验

一、将脂肪酶基因克隆入热诱导表达载体pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB多克隆位点中

1、PCR扩增枯草芽孢杆菌168脂肪酶A基因

根据枯草芽孢杆菌168脂肪酶A基因序列(序列表中序列5)，设计PCR引物，并在上游引物的5’端添加限制性内切酶Sac I识别位点，下游引物的5’端添加限制性内切酶Xba I识别位点，引物序列如下：

P9(正向引物)：

Sac I

5’-TCTCCCATGGCTGAACACAATCCAG-3’；

P10(反向引物)：

Xba I

5’-CTAC

TTAATTCGTATTCTGGCCCC-3’；

提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA并以此为模板，在引物P9和P10的引导下，PCR扩增枯草芽孢杆菌168脂肪酶A基因序列。

2、脂肪酶表达载体pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB-lipase的获得

对重组质粒pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB和PCR扩增的脂肪酶基因用限制性内切酶Sac I和Xba I进行双酶切，连接，再将连接产物转化E.coli BL21感受态细胞，将转化细胞接种于与实施例1步骤一中相同的LB抗性培养平板筛选阳性克隆，提质粒，得到含有枯草芽孢杆菌168脂肪酶A基因的热诱导自动裂解质粒，命名为pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB-lipase。

二、热诱导启动子cI857/p_R控制下裂解基因SRRz的表达及脂肪酶释放效率的检测

挑选步骤一中携带有脂肪酶表达裂解质粒pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB-lipase的阳性克隆，分别接种于LB抗性液体培养基(含氨苄青霉素(Ampicilin)，浓度为50μg/mL)中，在28℃、250rpm下摇瓶培养至OD₆₀₀值为0.4-0.5时，用终浓度0.5mM的IPTG诱导脂肪酶的表达，分别诱导培养1，2，3小时，将菌液分装于50mL培养管中，5mL/管，在38℃下热诱导2小时后收获细胞，用与实施例2中步骤一中相同的方法提取胞内酶，测定细胞内、外的脂肪酶酶活。同时计算不同诱导条件下的裂解效率。每个样品平行做3次，同时设立对照组(未经热诱导)。

脂肪酶的活性是通过显色底物对硝基苯棕榈酸酯(pNPP，购自Sigma公司)来测定的，产物在405nm处有最大吸收峰(Winkler，U.K.and M.Stuckmann.1979.Glycogen，hyaluronate，and some other polysaccharides greatly enhance theformation of exolipase by Serratia marcescens.J.Bacteriol.138：663-670)。酶活测定也是在酶标仪中进行，β-半乳糖苷酶酶活的测定方法与实施例2中相同。在96孔板中，每孔的反应体系为：10μl酶液(必要时需要稀释，pH8.0的磷酸钠盐缓冲液)，加上190μl 0.4mM的pNPP反应底物(其中还含有50mM磷酸钠盐缓冲液，pH 8.0；0.2％胆氧酸钠和0.1％阿拉伯树胶粉)。30min的动力学测定，1min的时间间隔，得到吸光度A₄₀₅随时间的变化率，即可计算出脂肪酶活。

菌体的裂解效率用报告蛋白β-半乳糖苷酶来计算，计算方法同实施例2。

脂肪酶的释放效率可按该式计算：释放效率＝胞外酶活/胞内、胞外总酶活。

结果在原始型热诱导启动子cI857/p_R的控制下，Lambda噬菌体裂解基因SRRz获得表达，使菌体有效裂解，从而使胞内表达的脂肪酶自动释放到胞外。在38℃下热诱导2小时后，菌体基本上已经完全裂解，菌液变得澄清。此时，通过胞内、胞外脂肪酶活性的测定，分别得到：对应于IPTG诱导脂肪酶表达的时间1小时，2小时和3小时，脂肪酶的裂解效率分别为95.35％±1.04％，93.19％±1.09％和93.65％±1.84％，该结果与相同条件下用β-半乳糖苷酶表征的菌体裂解效率相一致。此外，对于脂肪酶诱导时间为3小时，胞外脂肪酶的酶活最大，为474.73±19.2Units/mL。而对于未经热诱导的对照组，由于菌体的本底裂解很少，因此脂肪酶的本底渗漏也很少。

上述脂肪酶的表达和释放检测结果表明，用本发明的大肠杆菌自裂解载体可获得较好的菌体裂解和胞内酶释放效果，可用于重组蛋白的高通量筛选。

序列表

<160>6

<210>1

<211>1019

<212>DNA

<213>Lambda噬菌体

<400>1

ggtgatgatt atcagccagc agagaattaa ggaaaacaga caggtttatt gagcgcttat     60

ctttcccttt atttttgctg cggtaagtcg cataaaaacc attcttcata attcaatcca    120

tttactatgt tatgttctga ggggagtgaa aattccccta attcgatgaa gattcttgct    180

caattgttat cagctatgcg ccgaccagaa caccttgccg atcagccaaa cgtctcttca    240

ggccactgac tagcgataac tttccccaca acggaacaac tctcattgca tgggatcatt    300

gggtactgtg ggtttagtgg ttgtaaaaac acctgaccgc tatccctgat cagtttcttg    360

aaggtaaact catcaccccc aagtctggct atgcagaaat cacctggctc aacagcctgc    420

tcagggtcaa cgagaattaa cattccgtca ggaaagcttg gcttggagcc tgttggtgcg    480

gtcatggaat taccttcaac ctcaagccag aatgcagaat cactggcttt tttggttgtg    540

cttacccatc tctccgcatc acctttggta aaggttctaa gcttaggtga gaacatccct    600

gcctgaacat gagaaaaaac agggtactca tactcacttc taagtgacgg ctgcatacta    660

accgcttcat acatctcgta gatttctctg gcgattgaag ggctaaattc ttcaacgcta    720

actttgagaa tttttgtaag caatgcggcg ttataagcat ttaatgcatt gatgccatta    780

aataaagcac caacgcctga ctgccccatc cccatcttgt ctgcgacaga ttcctgggat    840

aagccaagtt catttttctt tttttcataa attgctttaa ggcgacgtgc gtcctcaagc    900

tgctcttgtg ttaatggttt cttttttgtg ctcatacgtt aaatctatca ccgcaaggga    960

taaatatcta acaccgtgcg tgttgactat tttacctctg gcggtgataa tggttgcat    1019

<210>2

<211>1019

<212>DNA

<213>Lambda噬菌体

<400>2

ggtgatgatt atcagccagc agagaattaa ggaaaacaga caggtttatt gagcgcttat     60

ctttcccttt atttttgctg cggtaagtcg cataaaaacc attcttcata attcaatcca    120

tttactatgt tatgttctga ggggagtgaa aattccccta attcgatgaa gattcttgct    180

caattgttat cagctatgcg ccgaccagaa caccttgccg atcagccaaa cgtctcttca    240

ggccactgac tagcgataac tttccccaca acggaacaac tctcattgca tgggatcatt    300

gggtactgtg ggtttagtgg ttgtaaaaac acctgaccgc tatccctgat cagtttcttg    360

aaggtaaact catcaccccc aagtctggct atgcagaaat cacctggctc aacagcctgc    420

tcagggtcaa cgagaattaa cattccgtca ggaaagcttg gcttggagcc tgttggtgcg    480

gtcatggaat taccttcaac ctcaagccag aatgcagaat cactggcttt tttggttgtg    540

cttacccatc tctccgcatc acctttggta aaggttctaa gcttaggtga gaacatccct    600

gcctgaacat gagaaaaaac agggtactca tactcacttc taagtgacgg ctgcatacta    660

accgcttcat acatctcgta gatttctctg gcgattgaag ggctaaattc ttcaacgcta    720

actttgagaa tttttgtaag caatgcggcg ttataagcat ttaatgcatt gatgccatta    780

aataaagcac caacgcctga ctgccccatc cccatcttgt ctgcgacaga ttcctgggat    840

aagccaagtt catttttctt tttttcataa attgctttaa ggcgacgtgc gtcctcaagc    900

tgctcttgtg ttaatggttt cttttttgtg ctcatacgtt aaatctatca ccgcaaggga    960

taaatatcta acaccgcgcg tgttgactat tttacctctg gcggtgataa tggttgcat    1019

<210>3

<211>1549

<212>DNA

<213>Lambda噬菌体

<400>3

gccactgtct gtcctgaatt cattagtaat agttacgctg cggcctttta cacatgacct     60

tcgtgaaagc gggtggcagg aggtcgcgct aacaacctcc tgccgttttg cccgtgcata    120

tcggtcacga acaaatctga ttactaaaca cagtagcctg gatttgttct atcagtaatc    180

gaccttattc ctaattaaat agagcaaatc cccttattgg gggtaagaca tgaagatgcc    240

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tgactcgatt ggttcgctta tcaaacgctt cgctgctaaa aaagccggag tagaagatgg   540

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ttactgatta ctccgatcac cctcgcaaac ttgtcacgct aaacccaaaa ctcaaatcaa   720

caggcgccgg acgctaccag cttctttccc gttggtggga tgcctaccgc aagcagcttg   780

gcctgaaaga cttctctccg aaaagtcagg acgctgtggc attgcagcag attaaggagc   840

gtggcgcttt acctatgatt gatcgtggtg atatccgtca ggcaatcgac cgttgcagca   900

atatctgggc ttcactgccg ggcgctggtt atggtcagtt cgagcataag gctgacagcc   960

tgattgcaaa attcaaagaa gcgggcggaa cggtcagaga gattgatgta tgagcagagt  1020

caccgcgatt atctccgctc tggttatctg catcatcgtc tgcctgtcat gggctgttaa  1080

tcattaccgt gataacgcca ttacctacaa agcccagcgc gacaaaaatg ccagagaact  1140

gaagctggcg aacgcggcaa ttactgacat gcagatgcgt cagcgtgatg ttgctgcgct  1200

cgatgcaaaa tacacgaagg agttagctga tgctaaagct gaaaatgatg ctctgcgtga  1260

tgatgttgcc gctggtcgtc gtcggttgca catcaaagca gtctgtcagt cagtgcgtga  1320

agccaccacc gcctccggcg tggataatgc agcctccccc cgactggcag acaccgctga  1380

acgggattat ttcaccctca gagagaggct gatcactatg caaaaacaac tggaaggaac  1440

ccagaagtat attaatgagc agtgcagata gagttgccca tatcgatggg caactcatgc  1500

aattattgtg agcaatacac acgcgcttcc agcggagtat aaatgccta              1549

<210>4

<211>246

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>4

aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt     60

ttgtcggtga acgctctccg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga    120

agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta    180

agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt cctgtcgtca    240

tatcta                                                               246

<210>5

<211>546

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌168(Bacillus Subtilis 168)

<400>5

gctgaacaca atccagtcgt tatggttcac ggtattggag gggcatcatt caattttgcg     60

ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagctgta tgcagttgat    120

ttttgggaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa    180

aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc    240

gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg    300

acggttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcaaggcgc ttccgggaac agatccaaat    360

caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgata tgattgtcat gaattactta    420

tcaagattag atggtgctag aaacgttcaa atccatggcg ttggacacat cggccttctg    480

tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg    540

aattaa                                                               546

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gctacttgat actgtatgag catacagtat aattg                                35

Claims (10)

1、大肠杆菌自裂解载体，是自5’至3’端顺次连接有热启动子、噬菌体裂解基因和大肠杆菌终止子的大肠杆菌表达载体；所述热启动子为碱基序列如序列表中序列1所示的Lambda噬菌体的cI857/p_R启动子或碱基序列如序列表中序列2所示的cI857/p_R(M)启动子；所述噬菌体裂解基因为碱基序列如序列表中序列3所示的Lambda噬菌体的裂解基因SRRz。

2、根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述大肠杆菌终止子为rrnB终止子，其碱基序列如序列表中序列4所示。

3、根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：用于构建所述载体的出发载体为pUC18、pUC19或pET30a。

4、根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述大肠杆菌自裂解载体为如图3所示的pUC18-cI857/p_R-SRRz-rrnB或pUC18-cI857/p_R(M)-SRRz-rrnB。

5、含有权利要求1所述载体的重组大肠杆菌。

6、一种大肠杆菌自裂解方法，是将权利要求1所述的大肠杆菌自裂解载体导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，再将重组大肠杆菌进行热诱导后，大肠杆菌细胞裂解。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述携带有cI857/p_R启动子的重组大肠杆菌的热诱导温度为38-42℃，诱导时间为0.5-3小时；所述携带有cI857/p_R(M)启动子的重组大肠杆菌的热诱导温度为40-42℃，诱导时间为0.5-1.5小时。

8、权利要求6所述的大肠杆菌自裂解方法在胞内酶表达筛选中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述胞内酶的表达筛选方法，包括以下步骤：

1)将外源基因插入到权利要求1所述的大肠杆菌自裂解载体中，得到胞内酶表达筛选载体；

2)将步骤1)构建的含有外源基因的胞内酶表达筛选载体导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；

3)发酵重组大肠杆菌，先加入诱导剂对胞内酶进行诱导表达，然后提升温度进行热诱导，再恢复温度继续培养，菌体细胞裂解，胞内酶释放到发酵液中；

4)对发酵液中的胞内酶进行筛选，得到目的蛋白。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述步骤2)中的大肠杆菌为E.coliBL21、BL21(DE3)、HB101、XL1-Blue或DH5-α。

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