CN102174557A

CN102174557A - 一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢及其制备方法

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Publication number: CN102174557A
Application number: CN2011100632737A
Authority: CN
Inventors: 陈克平; 王楠; 宁德刚; 李国辉; 姚勤
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2011-09-07
Also published as: WO2012122765A1

Abstract

将家蚕乙醇脱氢酶作为外源蛋白展示在枯草芽孢杆菌表面，属于重组融合蛋白技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因cotC为分子载体，与家蚕乙醇脱氢酶基因Bmadh重组，构建出融合表达家蚕乙醇脱氢酶BmADH的整合型重组质粒。以之转化枯草芽孢杆菌，通过同源重组使外源基因整合于染色体上特定位点的淀粉酶基因amyE中，使淀粉酶基因被破坏而导致重组菌株无淀粉酶活性，以此成功地筛选出含有融合表达CotC-BmADH的重组枯草芽孢杆菌菌株。通过诱导表达该重组菌株得到表面展示有家蚕乙醇脱氢酶融合蛋白的芽孢。本发明使原本对温度和pH不稳定的乙醇脱氢酶成为可在不同环境条件下具有相对稳定活性的乙醇脱氢酶融合蛋白，所产生的重组芽孢可用于动物直接口服。

Description

一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢及其制备方法

技术领域

本发明属于重组融合蛋白技术领域。具体涉及将乙醇脱氢酶作为外源活性蛋白展示在枯草芽孢杆菌表面的方法和重组芽孢。而言是指：利用枯草芽孢杆菌在极端的温度、干燥以及暴露于有机溶剂和其他毒性化学物质等不利条件下能长期存活的性质，通过分子生物学方法将有活性的乙醇脱氢酶基因与芽孢衣壳蛋白基因重组后进行表达，使原先对温度和PH不稳定的乙醇脱氢酶成为可在不同环境条件下具有相对稳定活性的乙醇脱氢酶融合蛋白。

背景技术

乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)属于氧化还原酶家族,能够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)为辅酶，催化伯醇和醛之间的可逆反应。ADHs 在很多生理过程中都起着重要作用，参与例如类固醇、类维生素A、脂质过氧化产物、脂肪酸、乙醇等代谢过程。在人和哺乳动物体内，ADH 与乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH)构成了乙醇脱氢酶系，参与体内乙醇代谢，是人和动物体内重要的代谢酶。

目前，ADH的应用研究主要体现在以下几个方面：①ADH生物电极和乙醇生物传感器，可用于工业分析乙醇浓度；②ADH的催化特性，在化学工业中应用于许多原材料及中间反应物的生产；③ADH作为人和动物重要的生理指标用于各项研究；④伴随生物技术和酶工业的发展，ADH被作为新的实验材料，用于开展各种新的研究。其中，利用乙醇脱氢酶开发有效的解酒产品已受到广泛关注。在肝脏中，ADH与ALDH总活力的高低决定了乙醇代谢的速度。因此，在众多的解酒药物研究方面，ADH活性已被作为一项重要的检测指标，用于观察解酒药物对ADH是否具有诱导作用，以便了解药物能否加快乙醇分解代谢，从而减少乙醇对人体的损害。同时开发高活性的 ADH与 ALDH也已经成为解酒药研究的重要方向之一。

然而，ADH对乙醇的催化活力对环境条件敏感，如温度和PH值不适则易失活，这一缺点极大地影响了ADH的应用前景。随着生物工业生产对酶催化功能需求的日益增加，寻求一种新方法生产催化活性更稳定的酶蛋白是十分必要的。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是好氧型的革兰氏阳性菌，它在营养缺乏或其他胁迫条件下，能形成具有抗逆性的休眠体——芽孢，在适宜条件下芽孢又能萌发成具有繁殖能力的营养细胞。芽孢易培养易分离，可以免去复杂的分离纯化操作。芽孢是生命世界中抗逆性最强的一种结构，其稳定性好，能耐氧化，耐高温，并且在抗化学药物和抗辐射等方面也十分突出，可在恶劣环境中存活几年至几十年。芽孢在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，从而顺利通过动物消化道。研究证明，枯草芽孢杆菌对生物体无致病性，能作为抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的益生素被人或动物口服（Mazza, P. 1994. The use of Bacillus subtilis as an antidiarrhoeal microorganism. Boll. Chim. Farm. 133:3–18.) 目前市面上已有口服枯草芽孢杆菌活菌胶囊产品，北京紫竹药业有限公司，国药准字S20030018（http://www.777aaa.com/html/yao/200791823402711963569029.htm），表明枯草芽孢杆菌芽孢可以通过人口服使用而产生药效性。由于以上理化及生理特性，再加上其基因组的破译和可操作的遗传系统的建立，枯草芽孢杆菌芽孢成为备受关注的新型蛋白或酶类药物载体。芽孢衣壳上的三种蛋白CotB、CotC和CotG由于暴露在芽孢表面而成为外源蛋白的新型表达系统，目前已有报道利用这种新型表达系统成功表达了一些外源蛋白，如对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28等，但是由于生物的特异性、基因表达受多种因素影响等原因，利用该表达系统是否能成功表达其他特定的活性蛋白仍有待研究。

本发明以从模式生物家蚕Bombyx mori体内克隆得到的乙醇脱氢酶作为外源分子，以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC为载体，通过芽孢表面展示技术将家蚕乙醇脱氢酶（BmADH， GeneBank登录号：NP_001037610.1）展示在芽孢表面，使BmADH获得大量表达的同时具有良好的抗逆性，提供了快速大量制备具有稳定活性的重组乙醇脱氢酶产品的方法。本发明的产品在保持了枯草芽孢杆菌芽孢生理特性的基础上，对乙醇的催化稳定性较之原家蚕乙醇脱氢酶蛋白有明显提高，迄今尚未见类似的报道和发明专利。

发明内容

为了解决乙醇脱氢酶因在极端条件下的不稳定性而在工业应用上存在的困难，本发明以家蚕乙醇脱氢酶BmADH为例, 提供了一种表面展示乙醇脱氢酶ADH的重组芽孢的制备方法和产品。本发明以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC为载体，通过芽孢表面展示技术将BmADH展示在枯草芽孢杆菌的芽孢表面，得到在不同温度、PH条件下具有较稳定活性的融合蛋白，可用于动物直接口服，成为一种新型的乙醇脱氢酶药物营养品。相对于其他乙醇脱氢酶蛋白产品，本发明表面展示乙醇脱氢酶蛋白的制备方法和分离过程简单快速，产生的融合蛋白生物活性更稳定，具有更广泛的应用价值。

本发明所采用的技术方案为：

一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶BmADH重组芽孢的制备方法，利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与家蚕乙醇脱氢酶基因重组，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生芽孢，在芽孢表面展示具有乙醇脱氢酶活性的融合蛋白。

本发明的具体操作是：通过反转录PCR的方法从家蚕cDNA文库中扩增获得家蚕乙醇脱氢酶BmADH的 cDNA，将获得的基因连接到克隆载体中测序正确之后，再将家蚕乙醇脱氢酶基因Bmadh连接到融合表达质粒pJS700(本实验室保存)，构建出整合型重组质粒pJS700-BmADH。用该质粒转化枯草芽孢杆菌，采用耗竭法诱导宿主菌产生芽孢，在芽孢表面展示有融合蛋白CotC-BmADH。

本发明选择具有良好的转化能力并且可以产生芽孢的枯草芽孢杆菌菌株为重组质粒的转化菌株，例如Bacillus subtilis 168及其衍生的一系列菌株(Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210, USA)；选择芽孢衣壳蛋白基因cotC (GenBank序列号：NP_389653) 作为表面展示蛋白的分子载体，选择家蚕乙醇脱氢酶基因Bmadh为重组基因。枯草芽孢杆菌为环境友好型细菌，其在营养缺乏时会分化形成休眠体芽孢，芽孢具有极强的抗逆性，可耐酸碱、耐高温，存活能力较强；并因其比重大，容易进行分离纯化。枯草芽孢杆菌的培养方法简单方便，生长迅速，营养要求简单，容易进行工业放大培养。在枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示家蚕乙醇脱氢酶，使其在获得快速大量表达的同时具有良好的抗逆性和稳定性，并且分离纯化简便快捷。

本发明涉及发明所选择的芽孢衣壳蛋白基因cotC与Bmadh基因编码序列重组后构建的重组质粒，在此重组质粒中含有芽孢衣壳蛋白基因的启动子、不含终止密码子的编码序列与Bmadh基因的编码序列重组后的基因，可在枯草芽孢杆菌分化形成芽孢时融合表达CotC-BmADH。通过构建整合型重组质粒，使得融合基因cotC-Bmadh整合于枯草芽孢杆菌染色体上的特定位点并稳定地进行遗传繁殖，避免了质粒在枯草芽孢杆菌细胞中容易丢失的缺点。

带有Bmadh的表达载体可以通过热击法或电穿孔法转化宿主细胞。使用本领域熟知的方法鉴定经过成功转化带有本发明构建的融合基因的细胞。如细胞的收集、裂解、淀粉板鉴定、提取染色体和PCR鉴定等，也可以在诱导表达后用BmADH特异抗体进行Western blotting鉴定。

本发明还涉及所构建的重组整合型质粒转化枯草芽孢杆菌筛选所得到的重组菌株，这些重组菌株诱导形成的芽孢表面展示有重组家蚕乙醇脱氢酶，可通过SDS-PAGE和Western blotting 检测其芽孢表面展示的重组蛋白，并检测其对乙醇的催化活力。

本发明涉及基因Bmadh编码序列片段克隆的引物序列：

Bmadh-F：5’-GGGGTACCATGGCACCGGATTTCGTGAAGCGTT-3’, 下划线表示KpnI限制性酶切位点；

Bmadh-R：5’-CGAGCTCCTATGTCTTGGAGAGTATTTGGA-3’，下划线表示SacI限制性酶切位点。

本发明涉及枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amyE (GenBank序列号：NP_388186) 片段扩增的引物序列：

amyE-F：ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG

amyE-R：GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT

本发明的突出优点表现为：将家蚕乙醇脱氢酶BmADH展示在枯草芽孢杆菌表面，利用芽孢所具有的独特抗逆性，使得原本对温度、PH值不稳定的酶蛋白成为具有相对稳定的乙醇催化活力的融合蛋白，克服了乙醇脱氢酶普遍具有的不稳定性缺点。本发明构建的表面展示家蚕乙醇脱氢酶BmADH的枯草芽孢杆菌重组芽孢可通过动物消化道屏障直接用于口服，成为一种新型的乙醇脱氢酶营养品或动物营养品。本发明产品表达量大、制备方法和分离过程相对于其他乙醇脱氢酶样品更为简单快速，具有更好的稳定性和更广泛的应用价值，在一定程度上拓展了其工业应用前景，也为提高其他酶蛋白的稳定性提供了参考。

附图说明

图1是发明人克隆的家蚕乙醇脱氢酶BmADH在GenBank中检索到的核苷酸序列和氨基酸序列, 登录号NP_001037610.1。小写字母为核苷酸序列, 起始密码子和终止密码子用方框标出; 大写字母为氨基酸序列, TATA-box用斜体带下划线标出，Poly-A信号用下划线标出，方框中的为保守氨基酸序列。

图2是融合表达CotC-BmADH整合型重组质粒pJS700-BmADH的构建方法及其结构图谱。amyE 5’-end和amyE 3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端，Amp ^r ，Em ^r分别表示氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因。cotC-Bmadh为在Bacillus subtilis 168 (trp ^-)的芽孢中融合表达CotC-BmADH重组蛋白的基因片段。oriC为大肠杆菌复制子片段。

图3是Em ^r -cotC-Bmadh基因片段在Bacillus subtilis 168 (trp ^-)染色体中的整合示意图。

图4是重组菌株Bacillus subtilis 168 (trp ^-)/pJS700-BmADH的淀粉酶活性分析。A：在淀粉平板上培养野生型菌株Bacillus subtilis 168 (trp ^-)和重组菌株Bacillus subtilis 168 (trp ^-)/pJS700-BmADH；B：在淀粉平板上被碘液染色后的野生型菌株和重组菌株。

图5是PCR检测重组菌株中的Em ^r -cotC-Bmadh片段。Marker: λ-EcoT14 I digest Marker；分别以Bacillus subtilis 168 (trp ^-) (Wild-type, W)和Bacillus subtilis 168 (trp ^-)/pJS700-BmADH (Mutant, M)的染色体为模板，用amyE-F/amyE-R、BmADH-F/ BmADH -R、BmADH -F/ amyE-R和amyE-F/ BmADH -R四对引物（引物对的在染色体中的位置见附图3）进行PCR鉴定重组基因。

图6是转基因重组芽孢表面展示的CotC-BmADH融合蛋白的SDS-PAGE和Western blotting鉴定。M为Marker，泳道1为野生型菌株Bacillus subtilis 168 (trp ^-)对照，泳道2为重组菌株融合蛋白。

图7是转基因重组芽孢表面展示的CotC-BmADH融合蛋白与原BmADH蛋白在不同PH值和温度条件下的乙醇脱氢酶活力比较。实线所示PJS700-BmADH表示本发明所得融合蛋白，虚线所示BmADH表示原BmADH蛋白。

具体实施方式

实验材料：

各种限制性内切酶、T₄DNA ligase、LA Taq、Taq酶，pMD18-T载体均购至宝生物工程（大连）有限公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由百奥迈科(Biomics)生物技术有限公司完成，用于本发明的所有DNA片段的回收均采用Omega Bio-Tek Gel Extraction Kit分离纯化，大肠杆菌菌株DH5α（中国普通微生物保藏管理中心CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，100101）为本实验室保存，其它试剂均为国产分析纯。

在本发明中所使用的术语，非特别说明的情况下，一般为本领域普通技术人员所理解的含义。以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照《分子克隆实验指南》（Sambrook等编著，科学出版社，1992年版）、试剂盒说明书、及产品说明书进行。以下的实施例只是为了举例说明本发明，并非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的一些过程和方法都为本领域技术人员熟悉和了解的常规方法。所用试剂的来源、商品名，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的相同。本发明实施例中涉及的由发明人保存的生物材料，均可向公众提供20年。

实施例1：家蚕乙醇脱氢酶Bmadh基因的克隆、测序及鉴定

本发明所用家蚕品种由江苏大学生命科学院饲养提供。取家蚕中肠组织，放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮进行研磨，用RNA提取试剂盒分离mRNA，通过反转录PCR技术获得家蚕乙醇脱氢酶基因的cDNA序列。

家蚕乙醇脱氢酶Bmadh基因片段的PCR扩增引物为：

Bmadh-F：5’-GGGGTACCATGGCACCGGATTTCGTGAAGCGTT-3’（ SEQ ID NO.1）, 下划线表示KpnI限制性酶切位点；

Bmadh-R：5’-CGAGCTCCTATGTCTTGGAGAGTATTTGGA-3’ （SEQ ID NO.2），下划线表示SacI限制性酶切位点。

PCR反应体系按TaKaRa LA Taq使用说明书严格进行，25μL反应体系中含TaKaRa LA Taq 0.2μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺Plus) 2.5μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2.5μL，模板DNA 1μL，上下游引物(20μM)各0.5μL,加灭菌超纯水补齐。PCR条件为：94℃变性5min，94℃ 1min，61℃ 40 s，72℃ 2min，30个循环。将大小为825bp的PCR产物克隆于pMD18-T载体中，转化大肠杆菌DH5α，筛选克隆菌株，提取质粒，通过PCR及KpnI和SacI双酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆后，对重组质粒进行测序。克隆的重组质粒命名为pMD18-T-BmADH，重组子菌株命名为DH5α/pMD18-T-BmADH。阳性重组菌株保存在含有15%甘油的LB培养基中，冻存于-80℃。

经测序重组质粒中乙醇脱氢酶Bmadh基因序列为SEQ ID NO.3所示，测序结果与GenBank中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的核苷酸序列一致，见图1。

实施例2：以CotC为载体展示BmADH的枯草芽孢杆菌重组芽孢的制备

1. 重组整合型质粒pJS700-BmADH的构建

质粒pJS700（李倩．以CotX为分子载体表面展示WSSV囊膜蛋白Vp19和Vp28的枯草芽孢杆菌重组芽孢的研究[D]．江苏镇江：江苏大学，2010:36-38）由江苏大学环境学院宁德刚副教授惠赠，该质粒大小约为5.5kb。在pJS700质粒中，amyE 5’-end和amyE 3’-end分别表示淀粉酶基因amyE (GenBank登录号：NP_388186)编码序列的5’端和3’端，通过同源重组整合在Bacillus subtilis 168 (trp ^-)染色体的淀粉酶基因中。

淀粉酶基因amyE的PCR扩增引物为：

amyE-F：ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG（SEQ ID NO.4）

amyE-R：GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT（SEQ ID NO.5）

Amp ^r ，Em ^r分别表示氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因，在大肠杆菌和Bacillus subtilis 168 (trp ^-)中作为筛选标记。cotC为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC基因，该基因片段含有cotC基因(GenBank序列号：NP_389653)的启动子序列、不含有cotC终止密码子的CotC编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段。

分别用KpnI和SacI 酶切质粒pMD18-T-BmADH和pJS700，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收Bmadh片段和pJS700，用T₄DNA ligase连接两双酶切后纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板中37℃培养过夜，次日挑选阳性单克隆菌株于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12至16h，提取质粒，通过PCR及KpnI和SacI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，鉴定正确后将重组整合型质粒命名为pJS700-BmADH，阳性重组菌株命名为DH5α/pJS700-BmADH。该重组整合型质粒pJS700-BmADH中含有重组基因cotC-Bmadh，该质粒的构建过程及其图谱见图2。

2. 融合表达重组芽孢的枯草芽孢杆菌菌株的筛选与鉴定

将整合型重组质粒pJS700-BmADH转化Bacillus subtilis 168 (trp ^-) (Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210, USA)，两者的同源区域发生重组, 且重组基因插入淀粉酶基因amyE， 破坏了其淀粉水解酶活性，见图3。用含有0.4μg/mL红霉素（Sigma）的LB平板筛选重组子，从平板上挑选单菌落接种于含1%淀粉的LB平板中，37℃过夜培养，次日用碘-碘化钾溶液对淀粉平板染色来鉴定重组菌株。1%淀粉平板的制备方法：100mL LB固体培养基中加可溶性淀粉0.1g，高压蒸汽灭菌后倒制平板。碘-碘化钾溶液的配制：碘化钾2g，碘1g，蒸馏水300mL，先将碘化钾溶于少量去离子水中，待全部溶解后再加入碘，振荡溶解后稀释至300mL，避光保存在棕色玻璃瓶中，用时可稀释2~10倍。取适量碘-碘化钾溶液滴于淀粉平板上，菌落周围产生透明水解圈表明重组基因没有插入淀粉水解酶基因amyE中，菌落及其周围颜色变蓝表明重组基因成功的插入到了Bacillus subtilis 168 (trp ^-)染色体上的淀粉酶基因amyE中，因而导致淀粉水解酶失去活性，见图4。

为了进一步鉴定重组菌株中正确插入了Em ^r -cotC-Bmadh基因，发明人以枯草芽孢杆菌的染色体为模板，分别以amyE-F/amyE-R、BmADH-F/BmADH-R、BmADH-F/amyE-R和amyE-F/BmADH-R四对引物进行PCR扩增。PCR反应体系按TaKaRa LA Taq使用说明书严格进行，25μL反应体系中含TaKaRa LA Taq 0.2μL，10×LA PCR BufferⅡ(Mg²⁺Plus) 2.5μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2.5μL，模板DNA 1μL，上下游引物(20μM)各0.5μL，最后加灭菌超纯水补齐。PCR反应条件根据各个引物对的特征分别设置。在重组菌株中分别检测到大小约为4200bp、825bp、700bp和2650bp的扩增片段，而野生型菌株中只检测到约1100bp的淀粉酶基因，见图5。这表明重组菌株染色体上含有Em ^r -cotC-Bmadh重组基因，并且Em ^r -cotC-Bmadh重组片段成功的插入到了淀粉水解酶基因amyE中。将鉴定后的重组菌株命名为Bacillus subtilis 168 (trp ^-)/pJS700-BmADH。

枯草芽孢杆菌染色体的提取方法为：挑单菌落接于LB培养基中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀值为1.0左右。取1.5mL菌液于Eppendorf管中，8000rpm离心10min，弃上清，加100μL pH8.0的TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1 mM EDTA）洗沉淀，离心去上清，再加100μL TE悬浮沉淀；向悬浮液中加30μL 100mg/ml溶菌酶溶液，不要摇晃，在37℃培养箱中放1h，加50μL 10%SDS和20μL 20mg/mL蛋白酶K，37℃继续培养1h；补TE至300μL，分别加150μL苯酚和氯仿抽提，12000rpm离心10min，取上清；再加300μl氯仿，12000rpm离心5min，取上清，加1/4体积5M的NaCl，2倍体积的无水乙醇，室温下沉淀DNA 2h，12000rpm离心10min，收集沉淀，用500μL 70%的乙醇洗沉淀，待挥发干后，加10μL TE缓冲液溶解沉淀，取1μL用琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，剩余的可放于-20℃中保存备用。

3. 表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢的诱导及鉴定

用DSM培养基诱导重组菌株Bacillus subtilis 168 (trp ^-)/pJS700-BmADH形成芽孢。DSM培养基的配方为：0.8% nutrient broth（营养肉汤Difo），0.1% KCl，0.025% MgSO₄·7H₂O，1.0mM Ca(NO₃)₂·4H₂O，10μM MnCl₂，1.0μM FeSO₄。将和重组菌株分别接种于DSM培养基中，采用耗竭法培养48小时诱导宿主菌产生芽孢，取培养物进行处理。芽孢蛋白的处理方法：12000rpm×10min离心收集菌体，重悬于相同体积的GTE Buffer（50mM葡萄糖，20mM pH7.5 Tris-HCl，10mM EDTA，2mg/mL溶菌酶）中，37℃处理30分钟用以破坏营养细胞，12000rpm×10min沉淀芽孢，用pH7.4的PBS洗3次后重悬于相同体积的SDS-DTT缓冲液（0.1mM pH 7.4 PBS，50mM DTT，1.5%SDS）中，65℃水浴处理10min，进行SDS-PAGE后用考马斯亮蓝染色得到大小约为41kD的条带。为了鉴定该条带是否为目标融合蛋白，以兔抗BmADH血清为一抗做Western blotting检测重组菌株和野生型菌株的芽孢蛋白。杂交结果显示：野生型菌株48h的培养物中没有检测到蛋白条带，而重组菌株泳道出现大小约为41kD的条带，表示在芽孢形成的过程中，BmADH随着芽孢衣壳蛋白CotC一同得到表达，因而能作为融合蛋白被BmADH特异抗体检测到，见图6。这表明重组芽孢中家蚕乙醇脱氢酶通过衣壳蛋白载体CotC被展示在了重组芽孢的表面。并且从PAGE胶上可以看出，孢子上的其他蛋白相对目标融合蛋白表达量十分小，即杂蛋白量少，体现了本发明纯化步骤简单的优点。

4. 融合蛋白的乙醇脱氢酶活力测定

由于乙醇脱氢酶在催化乙醇的过程中消耗辅酶NAD⁺产生NADH，其酶活力可通过用紫外分光光度计在340nm处检测NAD⁺/NADH的含量测得。反应液成分及体积比为：2 M 乙醇：0.5M NAD⁺：缓冲液=1：3：2。将本反应体系在一定温度下孵育10分钟后，按30：1的体积比加入重组孢子蛋白。在第1、4、6、8、10分钟分别取混合液离心后记录上清液在340nm处吸光值，读数差值记为△A₃₄₀。以野生型菌株Bacillus subtilis 168 (trp ^-)的孢子蛋白作为负对照。每分钟消耗1μmol NAD⁺被定义为1个单位（unit）的乙醇脱氢酶活力。计算公式: (△A₃₄₀×V) / (6.22 ×b×W×△t)，V为反应液总体积，b为比色皿厚度，W为样本蛋白含量，用BCA蛋白定量试剂盒（Pierce）测得，△t为吸光值改变的前后时间差（分钟）。

为了测得融合蛋白酶活力在不同PH值下的稳定性，发明人选取了0.1M醋酸钠缓冲液，pH 4.0；0.1M磷酸盐缓冲液 (NaH2PO4–Na2HPO4)，pH 7.0；0.1M NaOH/甘氨酸缓冲液，pH8.0、9.0、10.0，分别作为缓冲液加入反应液体系，测定25℃时不同PH值条件下的酶活力。为了测得融合蛋白酶活力在不同温度下的稳定性，发明人以pH9.0的0.1M NaOH/甘氨酸为缓冲液，分别测定融合蛋白在16℃、20℃、25℃、30℃、37℃下的酶活力。将结果与原来的BmADH蛋白酶活力做比较（Nan Wang, et al. 2011.Genetics and Molecular Biology, accepted），结果显示本发明所的产品的酶活力稳定性大大增加，见图7。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢及其制备方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggggtaccat ggcaccggat ttcgtgaagc gtt 33

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgagctccta tgtcttggag agtatttgga 30

<210> 3

<211> 1104

<212> DNA

<213> 家蚕

<400> 3

gctgcaggaa ttcgaattcg gcaacagtac agtgcactgc gtcgctatct acggacacca 60

gtaacatata aatatgatgt aattgttggt ttccaaatgg caccggattt cgtgaagcgt 120

tttgtggatg tcgacgataa agtgttcttg gtgaccggtg gtgcggccgg cgtcggcgct 180

ggcttggtca aggcgttgct gttcgaaaat gcacggcacg tcgcgtttct agatgtcgct 240

gaccgagaag gggccgccct ggaggcccaa cttataatca agttcggtgc cttgagagtg 300

aagttcataa agtgcgacgt aggagacgaa cgtcaactcg cttctgcata caaacaagtg 360

ttggacaaat acaaaaggct tgacggcgtc ataaacagcg ctgcagtact tagcgtcgat 420

gataactctt tcaacagaat gattgatatc aattttacgg gcacagtgaa tagtactctg 480

aaagcgctcg atattatggg ggcagataaa ggcggttctg gcggtgttat agtgaatata 540

tcgtccctac ttgctcttaa tctcaccagc catttacctg tttacgccgc tactaaagca 600

gcggtattac agttcagcat tagaatgggc acgcaggaac aatttacccg gactaaagta 660

cgggtattgt ccgtatgcct cgggcccact gacactgcta tcctttacaa gaacaactta 720

accaagtttg atacagagta cgctccgtgt ttgtcttcgc gtgcccccgt gagacaaaga 780

gtcgagtcag ccgttaaggg tattttggag gtgatcaaca aagcgagcac cggagatacg 840

tggatcgtgg aaagcgacaa accggcatac gattttactc aaaatatatc cgaagccttc 900

caaatactct ccaagacata gatttacgag ttattataaa tcggctatac ggcgaaatcg 960

attctgaggc ttcctgcgca aagctaatat tttccttgat gctatatttt ctcataatgt 1020

aagatattcg aataggtaaa tattgtgaat cgtattgtta ttggattttg tattacacgt 1080

ctattttcat atcaaaaaaa aaaa 1104

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attgctcggg ctgtatgact gg 22

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gttacaccat cactgttcgt tcctt 25

Claims

1.一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢的制备方法，其特征在于：利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与家蚕乙醇脱氢酶基因重组，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示家蚕乙醇脱氢酶的重组芽孢。

2.按照权利要求1所述的表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢的制备方法，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为cotC。

3.按照权利要求2所述的表面展示家蚕乙醇脱氢酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于：所述的融合表达的整合型重组质粒是将枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因cotC与家蚕乙醇脱氢酶基因重组构建的质粒。

4.按照权利要求3所述的表面展示家蚕乙醇脱氢酶的重组芽孢的制备方法，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌重组菌株是整合型重组质粒转化枯草芽孢杆菌所得到的菌株，该菌株染色体上含有适用于枯草芽孢杆菌的选择标记基因、以及芽孢衣壳蛋白基因与家蚕乙醇脱氢酶基因的编码序列重组后的基因，这些基因插入淀粉酶基因中导致重组菌株的淀粉酶基因失活。

5.按照权利要求4所述的表面展示家蚕乙醇脱氢酶的重组芽孢，其特征在于，重组芽孢是枯草芽孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌的芽孢，芽孢表面展示有家蚕乙醇脱氢酶BmADH。

6.一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢，其特征在于：是通过以下方法制备：利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与家蚕乙醇脱氢酶的基因重组，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示家蚕乙醇脱氢酶的重组芽孢。