CN108977455A

CN108977455A - 用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用

Info

Publication number: CN108977455A
Application number: CN201810865726.XA
Authority: CN
Inventors: 汪小锋; 吴玉峰; 汪卫; 刘艳红; 陈火晴
Original assignee: WUHAN KANGFUDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUHAN KANGFUDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: CN108977455B

Abstract

本发明公开了用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用。所述用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因和调控胞内锰离子浓度的基因。本发明将所述重组质粒导入大肠杆菌表达菌株和MntP基因缺失的大肠杆菌中，均得到可溶表达且有活性的草酸脱羧酶。并对重组菌株的培养温度和诱导温度进行了优化，发现培养温度为37℃，诱导温度为25℃时，草酸脱羧酶的表达量较高。通过有机溶剂沉淀和硫酸铵沉淀两步简单纯化，草酸脱羧酶比活力能达到45.6U/mg，纯度超过95％。本发明技术方案具有生产和纯化工艺简单，草酸脱羧酶的表达量和比活力高，易于工业放大，成本低，有利于草酸脱羧酶的工业化生产和应用。

Description

用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用。

背景技术

草酸(Oxalic acid)，是生物体的一种代谢产物，又叫乙二酸(Ethanedioicacid)，广泛分布于植物、动物和真菌体中，并在不同的生命体中发挥不同的功能。目前的研究发现至少有100多种植物富含草酸，尤以菠菜、苋菜、甜菜、马齿苋、芋头、茶叶、可可、甘薯和大黄等植物的叶片和种子中含量最高，由于草酸可降低矿质元素的生物利用率，在人体中容易与钙离子形成草酸钙导致肾结石，所以草酸往往被认为是一种矿质元素吸收利用的拮抗物。草酸在人体内不容易被氧化分解掉，经代谢作用后形成的产物，属于酸性物质，可导致人体内酸碱度失去平衡，吃得过多还会中毒。而且草酸在人体内如果遇上钙和锌离子便生成草酸钙和草酸锌，不易吸收而排出体外，影响钙与锌的吸收。儿童生长发育需要大量的钙和锌，如果体内缺乏钙和锌，不仅可导致骨骼、牙齿发育不良，而且还会影响智力发育，过量摄入草酸还会造成人体内血液和尿液中的草酸含量过高，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶体，草酸钙晶体很容易形成泌尿系结石。因此，控制从饮食中摄取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸量，从而降低患结石风险。低草酸饮食或降解食物中的草酸以防治草酸钙结石的策略在医学界已成为共识。

泌尿系结石是泌尿系统的常见病和多发病，全球有10％的人会患此疾病，该病的主要特点是临床治愈后复发率较高，给患者带来了极大的痛苦，给家庭带来了沉重的心理和经济上的负担。草酸钙是泌尿系结石的主要成分，占比达80％，导致草酸钙结石症的重要原因是人体内缺乏降解草酸的代谢途径。近年来，研究酶法降解草酸预防治疗草酸钙结石症成为该领域的研究热点(贺俊斌,林日辉,龙寒等.草酸降解酶预防治疗草酸钙结石症的研究进展.广东医学,36(7):1132-1136)。

目前生物界降解草酸的酶包括草酸氧化酶(Oxalate oxidase,EC 1.2.3.4)、草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase,EC 4.1.1.2，以下简称OXDC)和草酰辅酶A脱羧酶(Oxaly1-coenzymeA decarboxylase,EC 4.1.1.8)。OXDC是将草酸分解为甲酸和二氧化碳的酶，其内部含有锰。迄今已知，许多细菌(芽胞杆菌(Bacillus)属，集胞藻和乳酸菌属等、霉菌(曲霉(Aspergillus)属等)、金针菇(Flammulina velutipes)，彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)，疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)，白腐菌(Trametes versicolor),褐腐菌属(Monilinia)等)含有草酸脱羧酶基因(以下也称“oxdc基因”)。

草酸脱羧酶在上述物种中的表达量极低，而且多数菌种生长缓慢，成分复杂，分离提取纯化十分困难，不具备商业化应用可能，所以将草酸脱羧酶进行重组表达生产成为其商业化应用的必然选择。目前草酸脱羧酶中实现原核重组表达的还比较少，多数是在大肠杆菌中进行重组表达(Meenu Kesarwani,et al.Oxalate Decarboxylase from Collybiavelutipes.Journal of Biological Chemistry,2000,275(10):7230-7238；J.Biol.Chem.276(2001)，43627-43634；专利文献CN 102597225B,CN201610217032和CN101918551B),也有个别用枯草芽胞杆菌表达芽胞杆菌来源的oxdc基因的报道(专利文献CN201610217032)。金针菇来源的OXDC有通过烟草表达成功过报道，但表达量极低。大肠杆菌中表达真菌来源的OXDC存在酶活力低，不能实现分泌表达，非常易于形成包涵体，复性和纯化困难。真菌来源的OXDC多数在酸性pH条件下酶活力较高且较为稳定，溶解状态的OXDC对环境的pH比较敏感。

在大肠杆菌中共表达分子伴侣和真核生物来源的草酸脱羧酶，同时过表达锰离子通道相关蛋白，以促进草酸脱羧酶表达的研究，目前尚未有文献报道。。

发明内容

为了解决现有技术中，在大肠杆菌表达真核生物来源的草酸脱羧酶常常得到无活性的包涵体，且复性工艺复杂，成本高的问题，本发明的目的是提供生产草酸脱羧酶的重组质粒及包含所述重组质粒的大肠杆菌表达系统，利用该质粒/系统可以生产有活性的草酸脱羧酶。

本发明的另一目的在于提供利用所述大肠杆菌表达系统生产草酸脱羧酶的方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

生产草酸脱羧酶的重组质粒，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因、促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因。

所述促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因包括：锰离子泵入基因MntH、锰离子伴侣基因MntS、锰转录调节基因OxyR(大肠杆菌抗氧化系统的调节因子)等，发明人经研究发现，所述的重组质粒包含草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因、促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因时，非常有利于促进草酸脱羧酶的可溶且有活性表达。

本发明提供的技术方案与传统的技术相比具有以下优势：(1)利用所述重组质粒进行表达的草酸脱羧酶大部分是可溶且有活性的，比活力高；(2)即使存在少量不可溶的包涵体，也是属于非典型包涵体，通过简单纯化或缓冲液溶解就可得到有活性的可溶酶；(3)草酸脱羧酶的分离纯化工艺简单；(4)总生产成本低，有利于工业化应用。

优选的，所述促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因为：来源于大肠杆菌的OxyR基因或与所述OxyR基因编码的蛋白有类似功能的来源于其他物种的基因。所述OxyR基因为促进锰离子泵入大肠杆菌胞内的调控蛋白基因，发明人发现在所有促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因中，OxyR基因促进草酸脱羧酶的可溶且有活性的表达最优。所述OxyR基因及其终止子DNA片段如序列表SEQ ID NO.3所示，可通过大肠杆菌K-12菌株的基因组扩增得到。

所述分子伴侣基因可以为dnaK-dnaJ-grpE、groES-groEL、groES-groEL-tig或tig中的任意一种或多种；优选的，所述分子伴侣基因为groES-groEL基因，所述分子伴侣基因的启动子选自P43启动子或/和M1-93启动子。所述M1-93启动子序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述P43启动子序列如序列表SEQ ID NO.4所示，均可通过全基因合成。

构建表达分子伴侣基因的大肠杆菌菌株，表达分子伴侣的质粒可以选用Takara公司的Chaperone Plasmid Set系列质粒，包括pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16；优选分子伴侣质粒为pG-KJE8、pGro7或pG-Tf2，最优选分子伴侣质粒为pGro7。

优选的，所述草酸脱羧酶为草酸脱羧酶A2，基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述草酸脱羧酶A2基因编码对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供包含所述重组质粒的大肠杆菌表达系统。所述的大肠杆菌表达系统中所用的大肠杆菌载体选自pET系列载体、pCold系列、pGEX系列载体、pCOLADuet-1载体或其他能用于大肠杆菌系统中表达蛋白的载体。

优选的，所述的大肠杆菌表达系统还包含有敲除或抑制或失活MntP基因的宿主菌株。MntP基因的表达产物是大肠杆菌中调控胞内锰离子浓度的，当胞内锰离子浓度过高时，用于将锰离子从大肠杆菌胞内泵出到胞外。发明人发现，敲除大肠杆菌的锰离子泵出蛋白MntP基因，再将所述重组质粒导入MntP基因缺失的大肠杆菌菌株中，更有利于草酸脱羧酶的表达。所述MntP基因序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

所述大肠杆菌表达系统共表达分子伴侣，同时过表达或抑制/敲除/失活锰离子通道相关蛋白表达或影响胞内锰离子浓度相关的蛋白，以促进草酸脱羧酶的可溶且有活性表达。具体的，所述过表达的是促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因中的任意一种或多种组合；抑制/敲除/失活的是锰离子泵出蛋白/锰离子负反馈抑制调控相关蛋白基因中的任意一种多种组合。

大肠杆菌宿主菌株可选自商业化的菌株BL21(DE3)、BL21trxB(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami2(DE3)、Origami B(DE3)或Rosetta-gami 2(DE3)中的任意一种，优选的，所述宿主菌株为Origami2(DE3)。

优选的，所述分子伴侣基因和促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因是过表达的。

本发明还提供利用所述的大肠杆菌表达系统生产草酸脱羧酶的方法，所述的大肠杆菌表达系统诱导表达草酸脱羧酶时，培养温度为37℃，诱导温度为25℃；发明人对重组菌株的培养温度和诱导温度进行了优化，此时草酸脱羧酶的表达量较高。

优选的，所述的大肠杆菌表达系统诱导表达草酸脱羧酶时，培养温度为37℃，所使用培养基为JL培养基，所述JL培养基包含：酵母提取物0.5-1％(w/v)，胰蛋白胨1-2.5％(w/v)，KH₂PO₄ 10-25mM，(NH₄)₂SO₄ 10-50mM，甘露醇1-3％(w/v)，丁二酸钠5-30mM，MgSO₄0.1-0.6mM，起始pH 6.0-6.5。

优选的，所述大肠杆菌表达系统诱导表达草酸脱羧酶时，在37℃条件下培养至OD600＝1.0-1.2开始诱导，诱导时补加0.5-1mM的IPTG和1-10mM的Mn²⁺溶液，诱导温度降低到25℃。更优选的，所述Mn²⁺溶液为MnCl₂或MnSO₄溶液。所述IPTG和Mn²⁺溶液作为诱导物添加。

优选的，诱导表达草酸脱羧酶至OD600到8.0停止，菌液13,000g离心5min，去上清，加入0.9％生理盐水清洗菌体一次，13,000g离心5min，去上清，加入pH 5.6、20mM乙酸-乙酸钠Buffer，充分悬浮菌体后超声裂解，获得细胞裂解液全液和上清。

优选的，所述诱导表达草酸脱羧酶后进行纯化过程，将上清中加入30-40％(v/v)的有机溶剂在冰水浴中孵育1h沉淀杂蛋白，离心，取上清，再向上清液中加入20-30％(w/v)的硫酸铵沉淀，沉淀用pH 3.5、20mM柠檬酸缓冲液溶解。纯化后即得草酸脱羧酶蛋白，该草酸脱羧酶可应用于降低各种来源的食物中的草酸含量，制备降低人尿草酸的药物以及预防和治疗肾结石的药物组合物。通过有机溶剂沉淀和硫酸铵沉淀两步简单纯化，草酸脱羧酶比活力能达到45.6U/mg，纯度超过95％。

优选的，所述有机溶剂为无水乙醇，丙酮或异丙醇中的任意一种。

更优选的，所述离心的条件为4℃下12,000g离心15分钟。

本发明还提供所述的方法获得的草酸脱羧酶的应用，其特征在于，所述应用包含制备治疗高尿酸血症的药物，制备预防和治疗肾结石的药物，制备低草酸食品，或降解草酸的工业领域应用中的任意一种或多种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：构建了包含草酸脱羧酶基因，及共表达分子伴侣基因、促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因的重组质粒，获得可溶且有活性的草酸脱羧酶。进一步的，通过选择理想的锰离子泵入大肠杆菌胞内的调控蛋白，优化提高大肠杆菌胞内的锰离子浓度，草酸脱羧酶、分子伴侣和锰离子泵入大肠杆菌胞内的调控蛋白共表达，优化培养基组成、培养诱导条件等手段，提供了多种可选择的更优化的大肠杆菌工程菌表达重组草酸脱羧酶的生产工艺，这同时也为最终找到表达草酸脱羧酶的最优组合提供了一个可能的发展方向和技术路线。与传统的大肠杆菌表达体系相比较，本发明所发展的表达体系将大肠杆菌中表达为无活性包涵体的草酸脱羧酶，改变成表达出可溶且有高活性的草酸脱羧酶，为草酸脱羧酶酶在大肠杆菌中的工业化生产应用提供了有益的理论及实践依据。

附图说明

图1为草酸脱羧酶A2基因表达质粒pOESL-A2图谱。

图2为实施例5中6种不同重组大肠杆菌菌株表达草酸脱羧酶的活力对比。

图3为实施例5中6种不同重组大肠杆菌菌株表达草酸脱羧酶的SDS-PAGE分析；条带M：蛋白marker；条带1-6：6种大肠杆菌重组菌株用20mM、pH5.6的乙酸-乙酸钠Buffer重悬，超声波细胞破碎液，在4℃下，14,000g离心15分钟后的上清作为上样的样品，上样体积为10μL；条带1：pOESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)；条带2：pOESL-A2/Origami2(DE3)；条带3：pCOLADuet-A2/Origami2(DE3)；条带4：pgroESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)；条带5：pCOLADuet-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)；条带6：pgroESL-A2/Origami2(DE3)。

图4为实施例6中不同培养温度下重组菌株pOESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)表达重组草酸脱羧酶的SDS-PAGE分析；条带M：蛋白marker；条带1-3：37℃培养；条带4-6：28℃培养；条带7-9:18℃培养；条带1,4,7：未添加诱导物的细胞裂解液上清样品处理后用10mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5-4.0)溶解；条带2,5,8：诱导细胞的裂解液上清经硫酸铵沉淀处理后用10mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5-4.0)溶解；条带:3,6,9：诱导细胞的裂解液上清经硫酸铵沉淀处理后用25mM Tris-HCl(pH8.0)溶解；上述所有样品的上样体积为10μL。

图5为实施例6中重组大肠杆菌菌株在不同温度下表达草酸脱羧酶的活力对比。

图6为实施例6中不同诱导温度下重组菌株pOESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)表达重组草酸脱羧酶的SDS-PAGE分析；条带M：蛋白marker；条带1-2：培养温度18℃；条带3-5：培养温度25℃；条带6-8：培养温度30℃；条带9-11：培养温度37℃；条带12-14：培养温度42℃；条带1-8：诱导温度15℃；条带9-14：诱导温度25℃；条带1,4,7,10,13：重组菌株细胞裂解液离心后的上清；条带2,5,8,11,14：重组菌株裂解液的全液；条带3,6,9,12：未诱导细胞裂解液离心后的上清；上述所有样品的上样体积为15μL。

图7为实施例7中纯化的重组草酸脱羧酶的SDS-PAGE分析；条带M：蛋白marker；条带1-2：纯化的样品，上样体积为10μL。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，所举实施例不作为对本发明的限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的表达分子伴侣的质粒来自Takara公司，本发明中用到的其它大肠杆菌菌株和质粒均通过国内外出售常规生物材料的公司购买；本发明中用到的分子生物学试剂从Thermofisher公司和TOYOBO公司购买；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(http://www.vazyme.com/)；其它常用生化试剂均是市售分析纯；PCR产物回收和胶回收DNA的方法均采用omega公司的试剂盒的方法。

除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

实施例1表达载体pCOLADuet-A2的构建

以全基因合成的草酸脱羧酶A2基因(如序列表SEQ ID NO.1所示)为模版，设计引物对F1/R1，对该基因进行扩增，对扩增产物进行胶回收纯化，方法参照市售DNA小量纯化试剂盒说明书的方法，最终得到A2基因片段。PCR体系为：10×PCR Buffer 5μL，2mMdNTP 5μL，25mM MgSO₄ 5μL，10μM primer F/R各1.5μL，模版DNA 0.5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，ddH₂O32.5μL；PCR反应条件如下：94℃3min,30个循环(98℃10s，60℃30s，68℃35s)，68℃5min，4℃保温10min；以下载体构建的叙述中PCR体系与上述叙述都是一致的，下面不再赘述，PCR反应条件略有不同，主要是退火温度和延伸时间不同。提取pCOLADuet-1质粒，用限制性内切酶Nde I和AvrII分别对获得的A2基因片段和pCOLADuet-1质粒进行双酶切，按照DNA纯化试剂盒的方法对上述双酶切的DNA片段进行回收，按照DNA连接酶说明书的方法对A2基因和pCOLADuet-1质粒双酶切的片段进行连接，将2μl连接的质粒加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰浴放置30分钟，42℃水浴中热激90秒，再在冰中放置3分钟，加入800μl无抗生素培养基，37℃恒温振荡摇床培养40分钟。取100μl涂布含有50μg/ml卡那霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pCOLADuet-A2。用Inoue法制备DH5α超级感受态，方法参考《分子克隆实验指南(第3版)》，所用引物序列如下：

F1：5’-GGAATTCCATATGATGGCTCCAGCACCTTCCAG-3’

R1：5’-CAGCAGCCTAGGCTAAGCAGGACCGACCACAAT-3’。

实施例2表达载体pgroESL-A2的构建

以实施例1获得的重组质粒pCOLADuet-A2为模板，设计引物F2/R2进行扩增，产物纯化后得到DNA片段1；以合成的M1-93启动子DNA(如序列表SEQ ID NO.2所示)片段为模板，设计引物对F3/R3进行扩增，产物纯化后得到DNA片段2；以分子伴侣质粒pGro7质粒为模板，设计引物对F4/R4进行扩增，产物纯化后得到DNA片段3；通过无缝克隆试剂盒说明书的方法，于冰水浴中配制如下的反应体系，将上述DNA片段1、2和3连接起来，转化大肠杆菌DH5α。

ddH₂O	Up to 20μl
		5×Buffer	4μl
DNA片段1	80ng
		DNA片段2	40ng
DNA片段3	60ng
		重组酶	2μl

用Inoue法制备DH5α超级感受态，方法参考《分子克隆实验指南(第3版)》，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pgroESL-A2；所用引物序列如下：

F2：5’-TTCAACCCAGTCAGCTCCTT-3’

R2：5’-AGATCCCGGTGCCTAATGAG-3’

F3：5’-TAGGCACCGGGATCTTTATCTCTGGCGGTGTTGAC-3’

R3：5’-TGGACGAATATTCATATGAGCTGTTTCCTGGTTTA-3’

F4：5’-CAGGAAACAGCTCATATGAATATTCGTCCATTGCAT-3’

R4：5’-GCTGACTGGGTTGAATCGTCCGTGTCTGAATCTTA-3’。

实施例3表达载体pOESL-A2的构建

以大肠杆菌K12MG1655菌株的基因组DNA为模板，设计引物对F5/R5扩增OxyR基因及其终止子DNA片段(如序列表SEQ ID NO.3所示)；提取重组质粒pgroESL-A2，用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别对OxyR基因和终止子的DNA片段和pgroESL-A2质粒进行双酶切，按照DNA连接酶说明书的方法对上述双酶切的片段进行连接，将2μl连接的重组质粒加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰水浴中放置30分钟，42℃水浴中热激90秒，再在冰中放置3分钟，加入800μl无抗生素培养基，37℃恒温振荡摇床培养40分钟。取100μl涂布含有50μg/ml卡那霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pgroESL-OxyR-A2。以合成的P43启动子DNA(SEQ ID NO.4)片段为模板，设计引物对F6/R6进行扩增，产物纯化后得到P43片段；以质粒pgroESL-OxyR-A2为模板，设计引物F7/R7进行扩增，产物纯化后得到pgroESL-OxyR-A2质粒DNA片段；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述P43和pgroESL-OxyR-A2质粒DNA片段连接起来，转化大肠杆菌DH5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证(验证引物为F8/R8)和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pOESL-A2(图1)。所用引物序列如下：

F5：5’-CATGCCATGGGCAATATTCGTGATCTTGAGT-3’

R5：5’-CCGGAATTCCGAAATTATTCATATCGGTC-3’

F6：5’-CCTGCATTAGGAAATTGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’

R6：5’-ATGGTATATCTCCTTCGTTCATGTCTCCTTTTTTAT-3’

F7：5’-AAGGAGATATACCATGGGCAAT-3’

R7：5’-ATTTCCTAATGCAGGAGTCGC-3’

F8：5’-GGATCTCGACGCTCTCCCT-3’

R8：5’-GATTATGCGGCCGTGTACAA-3’。

实施例4大肠杆菌MntP基因的敲除

MntP基因的表达产物是大肠杆菌中调控胞内的锰离子浓度的通道蛋白，当胞内的锰离子浓度过高时，将锰离子从大肠杆菌胞内泵出到胞外。本实施例采用Red同源重组方法对在大肠杆菌MntP基因(如序列表SEQ ID NO.6所示)敲除，大肠杆菌以Origami2(DE3)为例，其它大肠杆菌表达菌株的基因敲除方法类似。具体方案如下：设计和合成引物F9/R9，以pKD3质粒为模版进行扩增，得到含有氯霉素抗性基因的片段，经过DNA纯化试剂盒纯化后得到DNA片段4。将pKD46质粒转化到大肠杆菌以Origami2(DE3)中，涂布到含有50μg/ml氨苄青霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选阳性克隆子，命名为pKD46/Origami2(DE3)。将菌株pKD46/Origami2(DE3)接种到含有100mg/L的LB培养基中进行培养，18℃培养过夜至OD600＝0.56-0.65之间，制备pKD46/Origami2(DE3)菌株的感受态细胞，将上述DNA片段4转化pKD46/Origami2(DE3)菌株的感受态细胞，涂布到含有10μg/ml氯霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选阳性克隆子，通过PCR验证(验证引物为F10/R10)和测序验证阳性克隆子，得到的阳性菌株命名为pKD46/Origami2(DE3MntP::CAT)。将转化成功的菌株在氯霉素平板上划线接种，置于42℃培养箱中孵育24h，挑取单菌落依次接种于含有10μg/ml氯霉素的抗性LB固体培养基平板和含有50μg/ml氨苄青霉素的抗性LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，挑选在氯霉素平板上生长，在氨苄青霉素平板上不生长的菌落，进行PCR检测确定(验证引物为F11/R11)，得到pKD46质粒丢失的菌株Origami2(DE3MntP::CAT)。用质粒小提试剂盒提取pCP20质粒，转化上述的Origami2(DE3MntP::CAT)菌株，涂布到含有50μg/ml氨苄青霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选阳性克隆子。将阳性克隆子在氨苄青霉素平板上划线接种，置于42℃培养箱中孵育24h，挑取单菌落依次接种于含有10μg/ml氯霉素的抗性LB固体培养基平板、含有50μg/ml氨苄青霉素的抗性LB固体培养基平板和无抗性的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑选在无抗平板上生长，在氨苄青霉素和氯霉素平板都上不生长的菌落，进行PCR验证(验证引物为F10/R10)和测序验证阳性克隆子，得到的阳性菌株命名为Origami2(DE3MntP::FRT)。所用引物序列如下：

F9:

5’-ATGAATATCACTGCTACTGTTCTTCTTGCGTTTGGTATGTCGATGGATGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

R9:

5’-TTAACCGTGGAAGTGCGTCCAGAGGATCTGGACGCCGATGCCGATCAGCAATG

GGAATTAGCCATGGTCC-3’

F10：5’-ACTGTTCTTCTTGCGTTTGGT-3’

R10：5’-TTAACCGTGGAAGTGCGTC-3’

F11：5’-GGAATTCGAGCTCTAAGGAGG-3’

R11：5’-CCTCTGAATCAATATCAACCTGG-3’。

实施例5草酸脱羧酶A2基因在大肠杆菌中的摇瓶发酵测试

按照质粒小提试剂盒的方法提取pCOLADuet-A2，pgroESL-A2和pOESL-A2质粒DNA，分别转化大肠杆菌Origami2(DE3)和Origami2(DE3MntP::FRT)菌株，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性LB固体培养基平板上筛选，通过PCR验证阳性克隆子，得到6种不同的大肠杆菌重组菌株pCOLADuet-A2/Origami2(DE3)、pgroESL-A2/Origami2(DE3)、pOESL-A2/Origami2(DE3)、pCOLADuet-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)、pgroESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)和pOESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)。

将抗性平板上的单克隆接种到LB液体种子培养基(酵母提取物0.5％(w/v)，胰蛋白胨1％(w/v)，NaCl 1％(w/v)，50μg/ml卡那霉素)中培养至OD600＝1.0-1.2，以2％(v/v)的接种量接种到JL培养基(酵母提取物0.75％(w/v)，胰蛋白胨1.5％(w/v)，KH₂PO₄ 15mM，(NH₄)₂SO₄ 25mM，甘露醇1.8％(w/v)，丁二酸钠20mM，MgSO₄ 0.25Mm，起始pH 6.5)中，培养温度37℃，摇床转速150转每分钟，培养至OD600达到1.0开始诱导，所有菌株补加终浓度为0.5mM的IPTG和终浓度为5mM的MnCl₂，诱导时降低温度到30℃，培养至OD600到8.0左右停止培养，取1.5mL菌液13,000g离心5min，去上清，加入1.5mL0.9％生理盐水清洗菌体一次，13,000g离心5min，去上清，加入1.5mL 20mM乙酸-乙酸钠Buffer(pH 5.6)，充分悬浮菌体后超声裂解。取细胞裂解液上清进行酶活力检测。草酸脱羧酶酶活力测定方法采用HPLC法(MKesarwani et al.The Journal of Biological Chemistry,2000,275:7230-7238)。摇瓶发酵结果发现，A2基因在Origami2(DE3)菌株中单独表达形成没有活性的包涵体，A2基因与分子伴侣基因共表达的菌株活力较低，只有A2基因、分子伴侣基因和OxyR共表达的菌株有较高的活力，且同时敲除MntP基因的宿主菌株更利于草酸脱羧酶的表达(图2)；另外，SDS-PAGE分析结果显示摇瓶表达活力较高的菌株可溶表达的草酸脱羧酶的含量越高(图3)。6种不同重组大肠杆菌菌株表达草酸脱羧酶时，pOESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)最优，pOESL-A2/Origami2(DE3)次优。

实施例6温度对重组菌株pOESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)表达草酸脱羧酶的影响

将抗性平板上重组菌株pOESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)的单克隆接种到LB液体种子培养基(酵母提取物0.5％(w/v)，胰蛋白胨1％(w/v)，NaCl 1％(w/v)，50μg/ml卡那霉素)中培养至OD600＝1.0-1.2，以2％(v/v)的接种量接种到JL培养基(酵母提取物0.5％(w/v)，胰蛋白胨2％(w/v)，KH₂PO₄ 15mM，(NH₄)₂SO₄ 25mM，甘露醇1.0％(w/v)，丁二酸钠20mM，MgSO₄ 0.5mM，起始pH 6.0)中，设置三个不同的培养温度(37℃，28℃和18℃)，摇床转速150转每分钟，培养至OD600达到1.0开始诱导，并补加1mM的IPTG和5mM的MnSO₄，诱导时降低温度到25-30℃，诱导培养至OD600到8.0左右停止培养，取1.5mL菌液13,000g离心5min，去上清，加入1.5mL 0.9％生理盐水清洗菌体一次，13,000g离心5min，去上清，加入1.5mL20mM乙酸-乙酸钠Buffer(pH 5.6)，充分悬浮菌体后超声裂解。将裂解后的裂解液在4℃下14,000转离心15分钟，上清液用25％(w/v)硫酸铵进行沉淀，沉淀用1.0mL10mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5)或用25mM Tris-HCl(pH8.0)溶解，在4℃下14,000转离心10分钟，取上清测酶活力检测和SDS-PAGE分析，未添加诱导剂的菌株作为对照菌株(条带1,4,7)。结果发现3种不同的培养温度下表达草酸脱羧酶A2均有活力，分子量约在50kDa左右(图4)，在28℃的培养温度下活力最高，达到12,650U/L(图5)，表达的草酸脱羧酶经过硫酸铵沉淀后在不同的溶解Buffer中溶解度不同，由条带3,6,9可知，在10mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5)中溶解度较好(图4)。

培养温度和诱导温度不同，培养基和培养条件和上述类似的条件下进行发酵对比(不同之处是诱导添加的IPTG是0.5mM，添加的Mn²⁺是2mM)。第一组培养温度采用18℃，25℃和30℃，诱导温度为15℃；第二组培养温度采用37℃和42℃，诱导温度采用25℃，未添加诱导剂的菌株作为对照菌株。对细胞裂解液的全液，4℃下14,000g离心15分钟的细胞裂解液的上清，以及未添加诱导物的细胞裂解液的上清，进行酶活力测定和SDS-PAGE分析(图6)。根据全液和裂解液的上清结果可以发现，重组菌株pOESL-A2/Origami2(DE3MntP::FRT)在不同的培养温度和诱导温度下表达出的草酸脱羧酶几乎都是可溶状态的；培养温度为37℃，诱导温度为25℃时表达效果最好，酶活力最高，达到14,950U/L(图5)。

实施例7草酸脱羧酶A2的纯化

将实施例6中培养温度为37℃，诱导温度为25℃时表达的草酸脱羧酶进行纯化。取100mL细胞裂解液，4℃下14,000g离心15分钟，取上清。将上清中加入30-40％(v/v)的有机溶剂在冰水浴中孵育1h，所述有机溶剂可以选择无水乙醇、丙酮或异丙醇，本实施例中选择无水乙醇，4℃下12,000g离心15分钟，取上清。向上清液中加入20-30％的硫酸铵(w/v)，沉淀用15mL 20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5)溶解，得到纯化的草酸脱羧酶蛋白。采用BCA试剂盒的方法测定纯化的草酸脱羧酶的蛋白浓度，同时测定酶活力，纯化酶的比活力达到45.6U/mg，纯度超过95％(图7)。

本实施例纯化后的草酸脱羧酶可应用于降低各种来源的食物中的草酸含量，制备降低人尿草酸的药物以及预防和治疗肾结石的药物组合物。

本发明将所述重组质粒导入大肠杆菌表达菌株和MntP基因缺失的大肠杆菌中，均得到可溶表达且有活性的草酸脱羧酶。并对重组菌株的培养温度和诱导温度进行了优化，发现培养温度为37℃，诱导温度为25℃时，草酸脱羧酶的表达量较高。通过有机溶剂沉淀和硫酸铵沉淀两步简单纯化，草酸脱羧酶比活力能达到45.6U/mg，纯度超过95％。本发明技术方案具有生产和纯化工艺简单，草酸脱羧酶的表达量和比活力高，易于工业放大，成本低，有利于草酸脱羧酶的工业化生产和应用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 武汉康复得生物科技股份有限公司

<120> 用于生产草酸脱羧酶的重组质粒、大肠杆菌表达系统及方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctccag caccttccag cgcagcttcc tccatcgttg tctccgctac ttcatcatcg 60

actgtttcga gtgcacccgt gagcgtttcg agcttcctgc ccactacctc cattgctgct 120

gcaactccta gttcaatcgc tgtggcttta tcatccacag ctacggttcc cttcatcgac 180

ttgaatccta atggacctct gtgggacccg tctgtgagcg gtgtacctca ggctgaacgt 240

ggttccttgg gagcaactat catgggacct acagatgtgg acacgacaaa ggcaaatcca 300

gacctgttgg caccacctac tactgaccac ggttctgtag ataatgcaaa atgggcattt 360

tccttatccc ataacagatt gcaaactggc ggttgggcca gggagcaaaa cataggtgcc 420

atgccaattg caactgaaat ggcatctgtc aacatgaggc ttgaaccagg tgctattaga 480

gaattgcact ggcataagac agcagagtgg gcttacgtcc taaagggaaa tactcaggtg 540

actgctgttg atcaaaatgg taaaaacttt atcggtactg taggaccagg tgatctttgg 600

tacttcccac cgggtattcc tcattcgcta caagctacag gtgatgaccc agaaggctca 660

gagttcatac tggttttcga ttctggtgct ttttctgagg attccacctt tttgttgact 720

gattggatga gtcatgttcc agtggaagtc ttggccaaaa acttccagac cgatatctca 780

gcatttgcca gaatcccagc tgaggagttg tatatctttc ccgctgccgt tccacctgat 840

tctcaacaag accctacatc tcctgaagga accgtcccaa atccttttac ttttgcttta 900

tccaaggtcc cacctatgca attgtctgga ggtaccgcaa aaatcgttga ctcaacaact 960

tttaccgttt ctaaggccat cgcagctgcc gaggtaacta tagaaccagg cgctatcaga 1020

gaacttcatt ggcaccccac acaagacgag tggtcatttt tcatcgaggg tagagctaga 1080

atgacaattt tcgccgctca gtctaatgct cgtacattcg actaccaagc cggtgacatt 1140

ggttacgttc ccgcaactat gggacattat gtggagaata ttggaaacac aacagtgcgt 1200

tatctggaga ttttcaacac ggctgttttt gaagatattt ccctcagtaa ttggttagcc 1260

ttaacgccac cagaattggt taaagcacac ttgggtttcg atgacgctac aatggctcac 1320

ttggctaagg taaaaccaat tgtggtcggt cctgcttag 1359

<210> 2

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cgtattgtta 60

gcatgtacgt ttaaaccagg aaacagctca t 91

<210> 3

<211> 1048

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaatattc gtgatcttga gtacctggtg gcattggctg aacaccgcca ttttcggcgt 60

gcggcagatt cctgccacgt tagccagccg acgcttagcg ggcaaattcg taagctggaa 120

gatgagctgg gcgtgatgtt gctggagcgg accagccgta aagtgttgtt cacccaggcg 180

ggaatgctgc tggtggatca ggcgcgtacc gtgctgcgtg aggtgaaagt ccttaaagag 240

atggcaagcc agcagggcga gacgatgtcc ggaccgctgc acattggttt gattcccaca 300

gttggaccgt acctgctacc gcatattatc cctatgctgc accagacctt tccaaagctg 360

gaaatgtatc tgcatgaagc acagacccac cagttactgg cgcaactgga cagcggcaaa 420

ctcgattgcg tgatcctcgc gctggtgaaa gagagcgaag cattcattga agtgccgttg 480

tttgatgagc caatgttgct ggctatctat gaagatcacc cgtgggcgaa ccgcgaatgc 540

gtaccgatgg ccgatctggc aggggaaaaa ctgctgatgc tggaagatgg tcactgtttg 600

cgcgatcagg caatgggttt ctgttttgaa gccggggcgg atgaagatac acacttccgc 660

gcgaccagcc tggaaactct gcgcaacatg gtggcggcag gtagcgggat cactttactg 720

ccagcgctgg ctgtgccgcc ggagcgcaaa cgcgatgggg ttgtttatct gccgtgcatt 780

aagccggaac cacgccgcac tattggcctg gtttatcgtc ctggctcacc gctgcgcagc 840

cgctatgagc agctggcaga ggccatccgc gcaagaatgg atggccattt cgataaagtt 900

ttaaaacagg cggtttaaac cgtttaacgc agctacccga taggcttccg ccatcgtcgg 960

gtagttaaag gtggtgttga cgaagtactc aatagtgttg ccgccacctt tctgttccat 1020

aatcgcctga ccgatatgaa taatttcg 1048

<210> 4

<211> 331

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccaggagg gctggaagaa gcagaccgct 300

aacacagtac ataaaaaagg agacatgaac g 331

<210> 5

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ile Val Val Ser Ala

1 5 10 15

Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Ser Ala Pro Val Ser Val Ser Ser Phe

20 25 30

Leu Pro Thr Thr Ser Ile Ala Ala Ala Thr Pro Ser Ser Ile Ala Val

35 40 45

Ala Leu Ser Ser Thr Ala Thr Val Pro Phe Ile Asp Leu Asn Pro Asn

50 55 60

Gly Pro Leu Trp Asp Pro Ser Val Ser Gly Val Pro Gln Ala Glu Arg

65 70 75 80

Gly Ser Leu Gly Ala Thr Ile Met Gly Pro Thr Asp Val Asp Thr Thr

85 90 95

Lys Ala Asn Pro Asp Leu Leu Ala Pro Pro Thr Thr Asp His Gly Ser

100 105 110

Val Asp Asn Ala Lys Trp Ala Phe Ser Leu Ser His Asn Arg Leu Gln

115 120 125

Thr Gly Gly Trp Ala Arg Glu Gln Asn Ile Gly Ala Met Pro Ile Ala

130 135 140

Thr Glu Met Ala Ser Val Asn Met Arg Leu Glu Pro Gly Ala Ile Arg

145 150 155 160

Glu Leu His Trp His Lys Thr Ala Glu Trp Ala Tyr Val Leu Lys Gly

165 170 175

Asn Thr Gln Val Thr Ala Val Asp Gln Asn Gly Lys Asn Phe Ile Gly

180 185 190

Thr Val Gly Pro Gly Asp Leu Trp Tyr Phe Pro Pro Gly Ile Pro His

195 200 205

Ser Leu Gln Ala Thr Gly Asp Asp Pro Glu Gly Ser Glu Phe Ile Leu

210 215 220

Val Phe Asp Ser Gly Ala Phe Ser Glu Asp Ser Thr Phe Leu Leu Thr

225 230 235 240

Asp Trp Met Ser His Val Pro Val Glu Val Leu Ala Lys Asn Phe Gln

245 250 255

Thr Asp Ile Ser Ala Phe Ala Arg Ile Pro Ala Glu Glu Leu Tyr Ile

260 265 270

Phe Pro Ala Ala Val Pro Pro Asp Ser Gln Gln Asp Pro Thr Ser Pro

275 280 285

Glu Gly Thr Val Pro Asn Pro Phe Thr Phe Ala Leu Ser Lys Val Pro

290 295 300

Pro Met Gln Leu Ser Gly Gly Thr Ala Lys Ile Val Asp Ser Thr Thr

305 310 315 320

Phe Thr Val Ser Lys Ala Ile Ala Ala Ala Glu Val Thr Ile Glu Pro

325 330 335

Gly Ala Ile Arg Glu Leu His Trp His Pro Thr Gln Asp Glu Trp Ser

340 345 350

Phe Phe Ile Glu Gly Arg Ala Arg Met Thr Ile Phe Ala Ala Gln Ser

355 360 365

Asn Ala Arg Thr Phe Asp Tyr Gln Ala Gly Asp Ile Gly Tyr Val Pro

370 375 380

Ala Thr Met Gly His Tyr Val Glu Asn Ile Gly Asn Thr Thr Val Arg

385 390 395 400

Tyr Leu Glu Ile Phe Asn Thr Ala Val Phe Glu Asp Ile Ser Leu Ser

405 410 415

Asn Trp Leu Ala Leu Thr Pro Pro Glu Leu Val Lys Ala His Leu Gly

420 425 430

Phe Asp Asp Ala Thr Met Ala His Leu Ala Lys Val Lys Pro Ile Val

435 440 445

Val Gly Pro Ala

450

<210> 6

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaatatca ctgctactgt tcttcttgcg tttggtatgt cgatggatgc atttgctgca 60

tcaatcggta aaggtgccac cctccataaa ccgaaatttt ctgaagcatt gcgaaccggc 120

cttatttttg gtgccgtcga aaccctgacg ccgctgatcg gctggggaat gggcatgtta 180

gccagccggt ttgtccttga atggaaccac tggattgcgt ttgtgctgct gatattcctc 240

ggcgggcgaa tgattattga gggttttcgt ggcgcagatg atgaagatga agagccgcgc 300

cgtcgacacg gtttctggct actggtaacc accgcgattg ccaccagcct ggatgccatg 360

gctgtgggtg ttggtcttgc tttcctgcag gtcaacatta tcgcgaccgc attggccatt 420

ggttgtgcaa ccttgattat gtcaacatta gggatgatgg ttggtcgctt tatcggctca 480

attattggga aaaaagcgga aattctcggc gggctggtgc tgatcggcat cggcgtccag 540

atcctctgga cgcacttcca cggttaa 567

Claims

1.用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，其特征在于，包含：草酸脱羧酶基因、分子伴侣基因、促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因。

2.根据权利要求1所述的用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，其特征在于，所述促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因为：来源于大肠杆菌的OxyR基因或与所述OxyR基因编码的蛋白有类似功能的来源于其他物种的基因。

3.根据权利要求1所述的用于生产草酸脱羧酶的重组质粒，其特征在于，所述分子伴侣基因为groES-groEL基因，所述分子伴侣基因的启动子选自P43启动子或/和M1-93启动子。

4.包含权利要求1～3任一项所述重组质粒的大肠杆菌表达系统。

5.根据权利要求4所述的大肠杆菌表达系统，其特征在于，还包含有敲除或抑制或失活MntP基因的宿主菌株。

6.根据权利要求4所述的大肠杆菌表达系统，其特征在于，所述宿主菌株为Origami2(DE3)。

7.根据权利要求4所述的大肠杆菌表达系统，其特征在于，所述分子伴侣基因和促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因是过表达的。

8.利用权利要求4所述的大肠杆菌表达系统生产草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述的大肠杆菌表达系统诱导表达草酸脱羧酶时，培养温度为37℃，诱导温度为25℃。

9.根据权利要求8所述的生产草酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述诱导表达草酸脱羧酶后进行纯化过程，将上清中加入30-40％(v/v)的有机溶剂在冰水浴中孵育1h沉淀杂蛋白，离心，取上清，再向上清液中加入20-30％(w/v)的硫酸铵沉淀，沉淀用pH 3.5、20mM柠檬酸缓冲液溶解。

10.权利要求8或9所述的方法获得的草酸脱羧酶的应用，其特征在于，所述应用包含制备治疗高尿酸血症的药物，制备预防和治疗肾结石的药物，制备低草酸食品，或降解草酸的工业领域应用中的任意一种或多种。