CN103725699A - 一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其表达载体和工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其表达载体和工程菌。本发明提供一种重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列，如SEQIDNo：1所示。本发明根据大肠杆菌密码子使用偏爱性，对ThermusthermophilusHB27来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，当优化后的锰过氧化氢酶在大肠杆菌中表达时，摇瓶发酵液中最高可检测到过氧化氢酶酶活为120U/mL；而当该锰过氧化氢酶与Mn离子转运蛋白MntH共表达时，摇瓶发酵培养液中过氧化氢酶发酵酶活可达1300U/mL。

Description

一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其表达载体和工程菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其表达载体和工程菌。

背景技术

过氧化氢酶（Catalase，简称CAT），催化分解过氧化氢为水和氧气。CAT广泛应用于食品、纺织、造纸和医药等行业，其中在纺织工业中主要用于布料漂白后残余H₂O₂的消除。与传统工艺的水洗或化学助剂相比，CAT具有减少污染、提高后续印染质量等优点；但值得关注的是，印染工序通常是在高温（T>70℃）碱性（pH>9）环境中进行的，这就需要CAT具备嗜热嗜碱的应用特性。尽管CAT来源丰富，几乎存在于所有的需氧微生物中，但市场上目前仍缺乏具备优良纺织应用特性的CAT。

过氧化氢酶按催化中心结构差异可分为两类：（1）含铁卟啉环结构CAT，又称铁过氧化氢酶（FeCAT）；（2）由锰离子代替铁离子的卟啉结构，又称锰过氧化氢酶（MnCAT），目前已发现约280种FeCAT和30种MnCAT。近年来，研究者发现个别来源于高温碱性环境中的古细菌可以产生具有嗜热嗜碱特性的MnCAT，例如：Metallosphaera hakonensis来源的MnCAT，在pH8.0-10.0环境中处理60min酶活损失小于20%；在70℃下处理50min，酶活残留率约在60%(Alkali-tolerant high-activity catalase from a thermophilic bacterium and itsoverexpression in Escherichia coli,Protein expression and purification,2008.57(2):255-260.)。但目前这类嗜热MnCAT的研究仍处于初级阶段，国外文献报道的该类MnCAT最高发酵酶活力仅约为20U/ml，而国内还未见其相关报道（Non-heme manganese catalase–the‘other’catalase,Archives of biochemistry and biophysics,2012,525:111-120.）。

发明内容

本发明鉴于上述情况，根据大肠杆菌密码子使用偏爱性，对Thermus thermophilus HB27来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，提供一种嗜热碱性重组含锰过氧化氢酶及其表达载体和工程菌，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No：1所示。

所述多核苷酸序列根据Thermus thermophilus来源的锰过氧化氢酶基因核苷酸序列，按照大肠杆菌（Escherichia coli）密码子使用偏爱性（http://gcua.schoedl.de/seqoverall_v2.html）优化设计。

本发明第二方面提供一种重组含锰过氧化氢酶，由所述的多核苷酸序列编码。

本发明第三方面提供一种重组含锰过氧化氢酶表达载体（pET28a-MnCAT），包含所述重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列。

优选的，所述表达载体为pET系列表达载体。

更优选的，所述pET系列表达载体为pET28a(+)。所述pET28a(+)购自Novagen公司。

本发明第四方面提供一种工程菌（BL21(DE3)/pET28a-MnCAT），所述工程菌由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体（pET28a-MnCAT）转化获得。

优选的，所述工程菌由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体转化大肠杆菌获得。

更优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明第五方面提供所述重组含锰过氧化氢酶的制备方法，包括如下步骤：

将所述工程菌在LB培养基中活化过夜后，转接至TB培养基中，当菌浓OD600达到0.7-0.8时，添加MnCl₂和IPTG，再诱导培养。

所得培养液的菌体破碎上清液中的酶活力可达120U/ml。

进一步的，由于pET28a(+)上含有6-His纯化标签，因此选择常用的Ni-NTA树脂亲和层析法进行蛋白纯化。

优选的，转接时按1%转接。

优选的，转接至含有50μg/ml Kan的TB培养基中。

优选的，所述IPTG的终浓度为0.2mmol/L，所述MnCl₂的终浓度14mmol/L。优选的，所述诱导培养的具体条件为：在42℃条件下诱导2h。

本发明第六方面提供锰离子转运蛋白Mnt H（ACCESSION U00096REGION:2509490..2510728）在提高重组含锰过氧化氢酶的诱导表达中的用途。

优选的，所述重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明第七方面提供一种工程菌，所述工程菌（BL21(DE3)/pET28a-MnCAT/pACYC-MntH）由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体（pET28a-MnCAT）和锰离子转运蛋白Mnt H表达载体（pACYC-Mnt H）转化获得。

优选的，所述锰离子转运蛋白Mnt H表达载体采用pACYCDuet-1。

优选的，所述工程菌由所述重组含锰过氧化氢酶表达载体和锰离子转运蛋白Mnt H表达载体转化大肠杆菌获得。所述锰离子转运蛋白Mnt H表达载体可与pET系列载体共存于一个原核细胞中。

更优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明第八方面提供所述重组含锰过氧化氢酶的另一种诱导表达方法，包括如下步骤：

将所述工程菌在LB培养基中活化过夜后，转接至含有Kan和Cm的TB培养基中，当菌浓OD600达到0.7-0.8时，添加IPTG，同时添加MnCl₂，再诱导培养。

所得培养液的菌体破碎上清液中的过氧化氢酶酶活可达约1300U/ml。

进一步的，由于pET28a(+)上含有6-His纯化标签，因此选择常用的Ni-NTA树脂亲和层析法进行蛋白纯化。

优选的，转接时按1%转接。

优选的，转接至含有30-35μg/ml Kan和18-20μg/ml Cm的TB培养基中。

优选的，所述IPTG的终浓度为0.2mmol/L，所述Mncl₂的终浓度2mmol/L。

优选的，所述诱导培养的具体条件为：37℃下诱导培养30-32h。

本发明根据大肠杆菌密码子使用偏爱性，对Thermus thermophilus HB27来源的锰过氧化氢酶基因序列进行密码子优化，当优化后的MnCAT在大肠杆菌中表达时，摇瓶发酵液中最高可检测到CAT酶活为120U/mL；而当该MnCAT与Mn离子转运蛋白Mnt H共表达时，摇瓶发酵培养液中CAT发酵酶活可达1300U/mL，本发明不仅通过基因密码子优化及发酵优化首次实现了Thermus thermophilus HB27来源的MnCAT在大肠杆菌中的活性表达，且其发酵酶活值达到约1300U/mL，远高于文献报道的此类酶发酵最高酶活力约20U/ml，为该酶的进一步应用开发奠定了基础。

附图说明

图1表达载体pET28a-MnCAT的物理图谱；

图2表达载体pET28a-MnCAT的酶切鉴定；

M:DNA Mark DL5000；1-2：Nco I和Hind III双酶切后的DNA片段；

图3重组大肠杆菌E.coli PB-01的SDS-PAGE图；

M:Protein Marker PR1600；1-3：PB-01；

图4表达载体pACYC-Mnt H物理图谱；

图5表达载体pACYC-Mnt H的酶切鉴定；

M:DNA Mark DL5000；1-2：Nde I和Xho I双酶切后的DNA片段；

图6重组大肠杆菌E.coli PB-02的SDS-PAGE图；

M:Protein Marker PR1600；1-3：PB-02。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

所述重组含锰过氧化氢酶表达载体（pET28a-MnCAT）的构建方法为：将所述重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列两端设计限制性内切酶Nco I和Hind III酶切位点，重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列经Nco I和Hind III双酶切后克隆至经相同酶切后的胞内表达载体pET28a（+）上，构建重组含锰过氧化氢酶表达载体。所述表达载体经测序验证后保存在大肠杆菌DH5α中。

重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列中不具备但载体pET28a（+）多克隆位点上具有限制性内切酶Nco I和Hind III酶切位点。

所述表达载体pET28a-MnCAT的物理图谱如图1。

所述表达载体pET28a-MnCAT的Nco I和Hind III双酶切图谱如图2所示。

所述工程菌（BL21(DE3)/pET28a-MnCAT）的构建方法为：将重组含锰过氧化氢酶表达载体化学转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含卡那霉素（Kan）的LB平板，于37℃培养至出现重组单菌落，挑取单菌落，验证正确后即得所述工程菌，标记为工程菌PB-01。所述卡那霉素（Kan）的LB平板优选为50μg/ml。

工程菌E.coli PB-01（BL21(DE3)/pET28a-MnCAT）在LB培养基中活化过夜后，按1%转接至含有50μg/ml Kan的TB培养基中，当菌浓OD600达到0.7-0.8时，添加终浓度14mmol/L的Mncl₂和0.2mmol/L的IPTG，在42℃条件下诱导2h的情况下，菌体破碎上清液中的酶活力可达120U/ml。

所述锰离子转运蛋白Mnt H表达载体（pACYC-Mnt H）的构建方法为：以E.coli W3110（E.coli Genetic Stock Center,Yale University）的基因组为模板，在基因mnt H两端设计mnt H基因中不具备但载体pACYCDuet-1多克隆位点上具有的限制性内切酶Nde I和Xho I酶切位点，通过PCR扩增mnt H基因。扩增得到的mnt H基因片段经Nde I和Xho I双酶切后克隆至经相同酶切后的胞内表达载体pACYCDuet-1上，构建重组表达载体pACYC-Mnt H。所述表达载体经测序验证后保存在大肠杆菌DH5α中。

所述表达载体pACYC-Mnt H的物理图谱如图4。

所述表达载体pACYC-Mnt H的Nde I和Xho I双酶切图谱如图5所示。

所述工程菌（BL21(DE3)/pET28a-MnCAT/pACYC-Mnt H）的构建方法为：重组表达载体pACYC-Mnt H化转至大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-MnCAT感受态细胞，涂布于含卡那霉素（Kan）和氯霉素（Cm）的LB平板，于37℃培养至出现重组单菌落，挑取单菌落，培养后提取质粒进行Nde I和Xho I双酶切验证正确后，验证正确后即得所述工程菌，标记为工程菌PB-02。优选的，涂布于含30-35μg/ml卡那霉素（Kan）和18-20μg/ml氯霉素（Cm）的LB平板。

工程菌E.coli PB-02（BL21(DE3)/pET28a-MnCAT/pACYC-Mnt H）在LB培养基中活化过夜后，按1%转接至含有30-35μg/ml Kan和18-20μg/ml Cm的TB培养基中，当菌浓OD600达到0.7-0.8时，添加终浓度0.2mmol/L IPTG，同时添加终浓度2mmol/L Mncl₂，37℃下诱导培养30-32h的情况下，菌体破碎上清液中的过氧化氢酶酶活可达约1300U/ml。锰过氧化氢酶酶活的测定方法具体如下：采用分光光度法37℃测定CAT的酶活力，反应体积为3mL，包括0.1mL的酶液样品和2.9mL含10mmol/L H₂O₂的50mmol/L pH8.0Tris-HCl缓冲液，H₂O₂的分解速率用紫外分光光度计在240nm下测定。酶活活力单位（U/mL）的定义为：在37℃、pH8.0的条件下每分钟分解1μmol H₂O₂所需的CAT酶量为一个酶活单位。

实施例1锰过氧化氢酶MnCAT原核表达基因工程菌的构建

1.1基于大肠杆菌密码子使用偏爱性优化设计的MnCAT基因

根据大肠杆菌（Escherichia coli）密码子使用的偏爱性（http://gcua.schoedl.de/seqoverall_v2.html）优化设计，所得密码子优化后的MnCAT基因具有如序列SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

1.2MnCAT原核表达载体pET28a-MnCAT的构建

在MnCAT基因的5’-端和3’-端分别设计该基因中不具备但载体pET28a(+)多克隆位点上具有的限制性内切酶Nco I和Hind III酶切位点（由于直接在基因N末端添加内切酶Nco I核苷酸序列CCATGG，会造成MnCAT基因翻译时发生移码突变，因此为了防止移码突变，在Nco I的核苷酸序列CCATGG后加了GT两个核苷酸，即在原基因序列起始密码子ATG后面添加了一个甘氨酸的密码子GGT序列；另外在基因的C末端，为纯化方便去掉了终止密码子TAA，后再加上内切酶Hind III核苷酸序列AAGCTT），由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，MnCAT基因片段经Nco I和Hind III双酶切后克隆至经相同酶切后的表达载体pET28a（+）上，构建重组表达载体pET28a-MnCAT（图1），经测序验证后保存在大肠杆菌DH5α中。

1.3重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-MnCAT的构建

重组表达质粒pET28a-MnCAT转化经氯化钙制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于LB平板（Kan，50μg/ml），倒置、于37℃培养至出现重组单菌落，挑取重组单菌落，LB液体培养基（Kan，50μg/ml）中培养10-12h后，提取质粒进行Nco I和Hind III双酶切验证正确后（图2），获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-MnCAT，标记为基因工程菌PB-01。

实施例2锰过氧化氢酶MnCAT的诱导表达

2.1种子培养

将基因工程菌PB-01，接入含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，50ml培养基放入250ml的培养瓶中，37℃，转速为200rpm，培养时间为10～12小时，培养后OD600吸光值在4～5之间。

注：LB培养基（g/L）组分为：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。

2.2摇瓶发酵培养：

将种子培养液按1%转接至含有50mg/L卡那霉素（Kan）的TB培养基中，当重组菌E.coli PB-01生长至OD₆₀₀0.7-0.8时，添加终浓度0.2mmol/L IPTG，同时添加终浓度14mmol/L MnCl₂，42℃下诱导培养2h，收集菌体、破碎细胞后对上清液进行SDS-PAGE分析，发现在33Kda处存在明显的蛋白条带，与文献报道的MnCAT蛋白分子量一致（图3），对所获蛋白进行N端测序，结果符合预期。酶活测定结果显示，破碎上清液中CAT酶活力达到120U/ml。

注：TB培养基（g/L）组分为：甘油5，蛋白胨12，酵母粉24，K₂HPO₄12.54，KH₂PO₄2.31。

实施例3锰过氧化氢酶MnCAT与Mnt H共表达基因工程菌的构建

3.1锰离子转运蛋白Mnt H原核表达载体pACYCDuet-Mnt H的构建

以E.coli W3110（E.coli Genetic Stock Center,Yale University）的基因组为模板，设计引物PCR扩增得到锰离子转运蛋白Mnt H的基因DNA片段。所用的上游引物为：

P1：5’-CATATGACGAACTATCGCGTTGAGAGTAGC-3’（下划线Nde I酶切位点）。

下游引物为：

P2：5’-CTCGAGCTACAATCCCAGCGCCGTC-3’（下划线Xho I酶切位点）。

PCR产物经胶回收、PstI/PvuII双酶切后，克隆至经相同酶切后的胞内表达载体pACYCDuet-1上，构建重组表达质粒pACYCDuet-Mnt H，经测序验证后保存在大肠杆菌DH5α中（图4，图5）。

3.2重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-MnCAT/pACYCDuet-Mnt H的构建

重组表达质粒pACYCDuet-Mnt H转化经氯化钙制备大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-MnCAT感受态细胞，涂布于LB平板（Kan，35μg/ml；Cm，18μg/ml），倒置、于37℃培养至出现重组单菌落，挑取重组单菌落，培养后提取质粒进行Nde I和XhoI双酶切验证正确后，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-MnCAT/pACYC-Mnt H，标记为工程菌PB-02。

实施例4锰过氧化氢酶MnCAT和Mnt H的诱导表达

4.1种子培养

将基因工程菌PB-02，接入含35μg/ml Kan和18μg/ml Cm的LB培养基中，50ml培养基放入250ml的培养瓶中，37℃，转速为200rpm，培养时间为10～12小时，培养后OD600吸光值在4～5之间。

注：LB培养基（g/L）组分为：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。

4.2摇瓶发酵培养：

将种子培养液按1%转接至含有Kan，35μg/ml和Cm，18μg/ml的TB培养基中，当重组菌E.coli PB-02生长至OD₆₀₀0.7-0.8时，添加终浓度0.2mmol/L IPTG，同时添加终浓度2mmol/L MnCl₂，37℃下诱导培养30-32h，收集菌体、破碎细胞后对上清液进行SDS-PAGE分析，发现除在33Kda处存在MnCAT的蛋白电泳条带外，在43.6Kda附近出现与文献报道的MntH蛋白分子量大小一致电泳条带（图6），对所获蛋白进行N端测序，结果符合预期。酶活测定结果显示，破碎上清液中CAT酶活力达到约1300U/ml。

注：TB培养基（g/L）组分为：甘油5，蛋白胨12，酵母粉24，K₂HPO₄12.54，KH₂PO₄2.31。

综上所述，通过本发明所提供的重组含锰过氧化氢酶的序列所表达的CAT酶活力达到约1300U/ml，远高于文献报道的此类酶发酵最高酶活力约20U/ml，有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值，具备很好的应用开发潜力。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (14)

1.一种重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸，其序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种重组含锰过氧化氢酶，由权利要求1所述的多核苷酸序列编码。

3.一种重组含锰过氧化氢酶表达载体，包含如权利要求1所述的重组含锰过氧化氢酶的多核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列表达载体。

5.如权利要求4所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体，其特征在于，所述pET系列表达载体为pET28a(+)。

6.一种工程菌，所述工程菌由权利要求3-5任一权利要求所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体转化获得。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌由权利要求3-5任一权利要求所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体转化大肠杆菌获得。

8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

9.一种重组含锰过氧化氢酶的制备方法，包括如下步骤：将权利要求6-8任一权利要求所述的工程菌在LB培养基中活化过夜后，转接至TB培养基中，添加MnCl₂和IPTG，再诱导培养。

10.一种工程菌，所述工程菌由权利要求3-5任一权利要求所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体和锰离子转运蛋白Mnt H表达载体转化获得。

11.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述锰离子转运蛋白Mnt H表达载体采用pACYCDuet-1。

12.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌由权利要求3-5任一权利要求所述的重组含锰过氧化氢酶表达载体和锰离子转运蛋白Mnt H表达载体转化大肠杆菌获得。

13.如权利要求12所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

14.一种重组含锰过氧化氢酶的制备方法，包括如下步骤：将权利要求10-13任一权利要求所述的工程菌在LB培养基中活化过夜后，转接至含有Kan和Cm的TB培养基中，添加IPTG，同时添加MnCl₂，再诱导培养。

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