CN113150080A - 一种新型指环状病毒AV-Chengdu1-ORF1蛋白及其制备与应用 - Google Patents

一种新型指环状病毒AV-Chengdu1-ORF1蛋白及其制备与应用 Download PDF

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    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

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Abstract

本发明提供表达从小熊猫粪便样品中分离到的一种新型的指环状病毒AV‑Chengdu1(GenBank KX611132)ORF1蛋白的重组载体，重组菌及其应用，属于生物技术领域。表达AV‑Chengdu1‑ORF1蛋白的重组载体，是将AV‑Chengdu1‑ORF1蛋白编码基因插入原核表达载体pColdⅡ后得到。本发明还提供表达AV‑Chengdu1‑ORF1蛋白的重组菌pTf16/BL21(DE3)，是将所述重组载体导入大肠杆菌后获得。本发明表达新型的指环状病毒AV‑Chengdu1ORF1蛋白的重组载体，导入大肠杆菌后，能够高效表达AV‑Chengdu1ORF1蛋白，本发明的蛋白具有很好的免疫原性，可用于流行病学诊断方法的建立。

Description

一种新型指环状病毒AV-Chengdu1-ORF1蛋白及其制备与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新型指环状病毒AV-Chengdu1-ORF1蛋白及其制备与应用。
背景技术
指环状病毒(anelloviruses)是一种小型单股负链环状DNA病毒，并被进一步细分为细环病毒(TTV)，细小环病毒(TTMV)，torque teno midivirus(TTMDV)和smallanellovirus(SAV)。指环状病毒长度约为2 100～3 900nt，其基因组碱基的GC含量较高，一般包含3～4个开放阅读框(ORF)。目前，指环状病毒已经从人和很多其他动物，如黑猩猩等灵长类动物、猫、狗、猪、海豹的体内样品中检测到，说明它在动物群体中分布广泛。其中猪的致病性指环状病毒呈现超感染现象，其病毒滴度随着免疫能力的下降而升高。指环状病毒呈现非常高的遗传多样性。
小熊猫是国家二级保护动物，数量稀少，主要分布在喜马拉雅山脉和我国南部大熊猫自然保护区。为保护小熊猫，国家设立大熊猫保护中心圈养和繁殖小熊猫。但目前以小熊猫为对象的病毒研究较少，并且主要针对一些已知的致病性病毒，例如犬瘟热病毒(CMD)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)等。2018年，有学者从2份小熊猫粪便样品中检测到了一种新型的指环状病毒，命名为AV-Chengdu-1(GenBank KX611132)。全基因组测序结果表明，其基因组全长约2 900nt，GC含量为49.8％；基因组结构分析表明其含3个开放阅读框(ORFl：1 743nt，ORF2：393nt，ORF3：399nt)，其中ORFl编码产物的氨基酸序列与一株来自松貂的指环状病毒的氨基酸序列(JN704611)同源性为56.4％。但目前，关于新型的指环状病毒AV-Chengdu-1(GenBank KX611132)在野生动物中的分布及其致病力尚不清楚，因此研究AV-Chengdu-1(GenBank KX611132)的分子流行病学及建立对这种新型的指环状病毒的快速检测方法已成为当务之急。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型指环状病毒AV-Chengdu1-ORF1蛋白及其制备与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种新型的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供所述的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的编码基因。
作为本发明所述编码基因的优选实施方式，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供表达所述指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的重组载体，所述重组载体是将SEQ ID NO:1所示的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的编码基因插入到出发载体中获得的。
作为本发明所述重组载体的优选实施方式，所述出发载体为pColdⅡ。
本发明还提供表达指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的工程菌，所述工程菌是将所述重组载体导入大肠杆菌感受态，筛选得到的表达指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的重组菌。
作为本发明所述工程菌的优选实施方式，所述大肠杆菌为pTf16/BL21(DE3)。
本发明还提供一种新型的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的制备方法，包括下述步骤：
S1.将所述的重组载体转化大肠杆菌感受态，得到表达新型的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1重组蛋白的重组菌；
S2.将步骤S1获得的重组菌诱导表达，收集菌体并破碎，收集包涵体；
S3.将步骤S2获得的包涵体溶解复性获得新型的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述包涵体溶解复性具体为：用包涵体溶解液溶解包涵体，将溶解后的包涵体缓慢加入包涵体复性液进行稀释复性。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述复性液的配方为：50mM Tris-HCl，400mM L-精氨酸，pH调至8.0。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用大肠杆菌表达系统表达新型的指环状病毒AV-Chengdu-1(GenBankKX611132)ORFl重组蛋白，蛋白表达量大，纯化方法简单，极大降低了生产成本，有利于推进之后的大批量生产。
(2)本发明利用大肠杆菌原核表达系统，以包涵体的形式表达了新型的指环状病毒AV-Chengdu-1(GenBank KX611132)ORFl蛋白，该蛋白具有较好的生物活性和免疫原性，极大降低了生产成本，为新型的指环状病毒AV-Chengdu-1(GenBank KX611132)的检测试剂盒的研制奠定了基础。
附图说明
图1：小熊猫指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白纯化后SDS-PAGE胶染色图片。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商提供说明书条件。
实施例中用到的材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组载体的构建
将AV-Chengdu-1(GenBank KX611132)ORFl基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)插入到pColdⅡ，得到表达重组后的AV-Chengdu-1(GenBank KX611132)ORFl蛋白的重组载体，将其命名为pColdⅡ-ORF1。重组载体的具体构建方法为：
委托广州艾基生物技术有限公司合成SEQ ID NO:1序列，并在SEQ ID NO:1序列的5’端加XhoI酶切后序列(CTCGAG)，3’端加EcoRI酶切后序列(GAATTC)，得到的序列如SEQ IDNO:3所示。随后用XhoI酶(TaKaRa)和EcoRI酶(TaKaRa)双酶切pColdⅡ质粒，用PCR产物纯化回收试剂盒回收双酶切产物。回收后用T4 DNA连接酶将合成的基因序列和酶切产物，16℃连接过夜，连接产物转化感受态E.coli DH5a。提取质粒经测序鉴定正确后将重组质粒命名为pColdⅡ-ORF1。
实施例2蛋白的表达与纯化
(1)将实施例1中构建得到的重组载体pColdⅡ-ORF1转化大肠杆菌pTf16/BL21(DE3)感受态，获得表达新型的指环状病毒AV-Chengdu-1(GenBank KX611132)ORFl重组蛋白的工程菌株，将其命名为E.coli-AV-Chengdu-1-ORF1；
(2)重组菌诱导表达：将步骤(1)获得的菌株E.coli-AV-Chengdu-1-ORF1进行培养，利用IPTG诱导表达蛋白；
(3)包涵体纯化：离心收集步骤(2)获得的重组菌，超声破碎菌体，离心弃上清，刮去沉淀上层的菌泥，收集包涵体；
(4)包涵体变性及复性：用包涵体溶解液溶解包涵体，将溶解后的包涵体缓慢加入包涵体复性液进行稀释复性，4℃搅拌48h；复性液的配方为：50mM Tris-HCl，400mM L-精氨酸，pH调至8.0；
(5)浓缩纯化：将置换液缓慢加入复性液中，4℃浓缩，最后得到浓缩的ORF1蛋白；置换液的配方为：20mM Tris-HCL，50mM NaCl，pH调至8.0。
实施例3动物实验验证
(1)小鼠实验
初免将80μg ORF1重组蛋白与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下四点注射Balb/C小鼠，三周后用100μg ORF1重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合后同法进行第二次免疫，以后每两周免疫一次，免疫4次后，血清效价达到1：1280000以上。
(2)兔实验
初免将600μg ORF1重组蛋白与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下四点和腿弯胭淋巴结两点注射大白兔，三周后用800μg ORF1重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合后同法进行第二次免疫，以后每两周免疫一次，共免疫5次，5免后血清效价达到1：1280000以上。
综上，经动物实验验证，用本发明制备的新型的指环状病毒AV-Chengdu-1 ORF1重组蛋白免疫小鼠和兔，均可产生高水平抗体，为检测方法的建立奠定了基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州优迪生物科技股份有限公司
<120> 一种新型指环状病毒AV-Chengdu1-ORF1蛋白及其制备与应用
<130> 2021.01.27
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1152
<212> DNA
<213> 指环状病毒
<400> 1
aggaggccta gaagggtcag acctaaaaaa ataatccagt ggcagcctca acaccaggcg 60
aaatgtatta ttcgcggctg gtttcctgcc atgtgggcac attcagcttt tgtgacttat 120
cctatgtata agtggatacc tgcaaaacaa ggagagtacg gacacttctt cactatggaa 180
ggttgtgtga ctctcatgca ttttactttg ggactcttat acaaggaatg gctcaaaatg 240
cggaatacgt ggtcgagatc aaatgacggt tttgatctcg cgaagtattc cggaacaaaa 300
ctaacattca gacctcatcc gttcgtttca tatatggtat ggtgggagag aaactttgga 360
gaagtgcatc ctattcaata tagaagcata catccggccg ttattatgca tcaacctaac 420
cacatatttg taccatcact attggtcaat cctrgaggca gaaagaggaa ggtgtggata 480
ccgccacctt ccactttaac gtctacttgg agttttatga aatactggtg tgaagttgca 540
ctgtttagag taggaattac tcccattaac ttaaagtctc aatttttaca tattggaact 600
gtatccaccg gatggtggat aggatatcaa cctaaaaata actataatca cttttcagat 660
ccagatatgc tgccacaaat gaacagtgaa caatattgtg ttggagaagg aaataaaata 720
ttttacaagt ggtggtggga tgatggaaca gataataaat ggggagccaa aaatagaacc 780
gaccaatata acaatgaaac tggagtatta cctccggtag cccaaaagac tagcacagac 840
aatattgtac ctatcaatgt tccttactgg ttagcttttt ggggagcagg aaccactttt 900
ctcgaatggg acaaaaatga cctttacatt tggtggtact atgatgataa cagtaaaact 960
aatatagacg aactagatgg agcagcaaaa aaaaagagat ggattaacgt tagctgcgga 1020
caaatgctca atggtattgg catacaaaat ataatacaag gtggtccatt tgtactaaac 1080
cctaatgaca tctttcctga aaagaacata aacctatctt tctggtatca gagcttctgg 1140
cggtggggag gc 1152
<210> 2
<211> 383
<212> PRT
<213> 指环状病毒
<400> 2
Arg Arg Pro Arg Arg Val Arg Pro Lys Lys Ile Ile Gln Trp Gln Pro
1 5 10 15
Gln His Gln Ala Lys Cys Ile Ile Arg Gly Trp Phe Pro Ala Met Trp
20 25 30
Ala His Ser Ala Phe Val Thr Tyr Pro Met Tyr Lys Trp Ile Pro Ala
35 40 45
Lys Gln Gly Glu Tyr Gly His Phe Phe Thr Met Glu Gly Cys Val Thr
50 55 60
Leu Met His Phe Thr Leu Gly Leu Leu Tyr Lys Glu Trp Leu Lys Met
65 70 75 80
Arg Asn Thr Trp Ser Arg Ser Asn Asp Gly Phe Asp Leu Ala Lys Tyr
85 90 95
Ser Gly Thr Lys Leu Thr Phe Arg Pro His Pro Phe Val Ser Tyr Met
100 105 110
Val Trp Trp Glu Arg Asn Phe Gly Glu Val His Pro Ile Gln Tyr Arg
115 120 125
Ser Ile His Pro Ala Val Ile Met His Gln Pro Asn His Ile Phe Val
130 135 140
Pro Ser Leu Leu Val Asn Pro Gly Arg Lys Arg Lys Val Trp Ile Pro
145 150 155 160
Pro Pro Ser Thr Leu Thr Ser Thr Trp Ser Phe Met Lys Tyr Trp Cys
165 170 175
Glu Val Ala Leu Phe Arg Val Gly Ile Thr Pro Ile Asn Leu Lys Ser
180 185 190
Gln Phe Leu His Ile Gly Thr Val Ser Thr Gly Trp Trp Ile Gly Tyr
195 200 205
Gln Pro Lys Asn Asn Tyr Asn His Phe Ser Asp Pro Asp Met Leu Pro
210 215 220
Gln Met Asn Ser Glu Gln Tyr Cys Val Gly Glu Gly Asn Lys Ile Phe
225 230 235 240
Tyr Lys Trp Trp Trp Asp Asp Gly Thr Asp Asn Lys Trp Gly Ala Lys
245 250 255
Asn Arg Thr Asp Gln Tyr Asn Asn Glu Thr Gly Val Leu Pro Pro Val
260 265 270
Ala Gln Lys Thr Ser Thr Asp Asn Ile Val Pro Ile Asn Val Pro Tyr
275 280 285
Trp Leu Ala Phe Trp Gly Ala Gly Thr Thr Phe Leu Glu Trp Asp Lys
290 295 300
Asn Asp Leu Tyr Ile Trp Trp Tyr Tyr Asp Asp Asn Ser Lys Thr Asn
305 310 315 320
Ile Asp Glu Leu Asp Gly Ala Ala Lys Lys Lys Arg Trp Ile Asn Val
325 330 335
Ser Cys Gly Gln Met Leu Asn Gly Ile Gly Ile Gln Asn Ile Ile Gln
340 345 350
Gly Gly Pro Phe Val Leu Asn Pro Asn Asp Ile Phe Pro Glu Lys Asn
355 360 365
Ile Asn Leu Ser Phe Trp Tyr Gln Ser Phe Trp Arg Trp Gly Gly
370 375 380
<210> 3
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ctcgagatgg cgttcttcta ccggaggtgg agaccgtact ggagaagaag gtggtgtccc 60
agacgaggtg gccgttcatt tcgacctcgg attttcagaa gaagacgata cacgtaccgg 120
agaaaggtga ggaggcgaag gcggaggagg aggcctagaa gggtcagacc taaaaaaata 180
atccagtggc agcctcaaca ccaggcgaaa tgtattattc gcggctggtt tcctgccatg 240
tgggcacatt cagcttttgt gacttatcct atgtataagt ggatacctgc aaaacaagga 300
gagtacggac acttcttcac tatggaaggt tgtgtgactc tcatgcattt tactttggga 360
ctcttataca aggaatggct caaaatgcgg aatacgtggt cgagatcaaa tgacggtttt 420
gatctcgcga agtattccgg aacaaaacta acattcagac ctcatccgtt cgtttcatat 480
atggtatggt gggagagaaa ctttggagaa gtgcatccta ttcaatatag aagcatacat 540
ccggccgtta ttatgcatca acctaaccac atatttgtac catcactatt ggtcaatcct 600
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ccggtagccc aaaagactag cacagacaat attgtaccta tcaatgttcc ttactggtta 1020
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aagagatgga ttaacgttag ctgcggacaa atgctcaatg gtattggcat acaaaatata 1200
atacaaggtg gtccatttgt actaaaccct aatgacatct ttcctgaaaa gaacataaac 1260
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cagcggatcg agcgagagcg agacttcagg cacaagctgc ggaagcgaat cagagactgg 1740
ctgactgaat tc 1752

Claims (10)

1.一种新型的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.表达权利要求1所述指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将SEQ ID NO:1所示的指环状病毒AV-Chengdu1ORF1蛋白的编码基因插入到出发载体中获得的。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述出发载体为pColdⅡ。
6.表达指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的工程菌，其特征在于：所述工程菌是将权利要求4-5任一所述重组载体导入大肠杆菌感受态，筛选得到的表达指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的重组菌。
7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为pTf16/BL21(DE3)。
8.一种新型的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1蛋白的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
S1.将权利要求4-5任一所述的重组载体转化大肠杆菌感受态，得到表达新型的指环状病毒AV-Chengdu1 ORF1重组蛋白的重组菌；
S2.将步骤S1获得的重组菌诱导表达，收集菌体并破碎，收集包涵体；
S3.将步骤S2获得的包涵体溶解复性获得新型的指环状病毒AV-Chengdu1ORF1蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述包涵体溶解复性具体为：用包涵体溶解液溶解包涵体，将溶解后的包涵体缓慢加入包涵体复性液进行稀释复性。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述复性液的配方为：50mM Tris-HCl，400mM L-精氨酸，pH调至8.0。
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