CN1307195C - 蛋白的高水平表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码在哺乳动物细胞中正常表达的蛋白的合成基因，其中编码该蛋白质的天然基因中的至少一个非优选的或较不优选的密码子被编码同一氨基酸的优选的密码子所置换。

Description

蛋白的高水平表达
发明领域
本发明涉及在真核细胞中，高水平表达真核生物蛋白和病毒蛋白的基因和方法。
发明背景
在原核生物中表达真核基因产物，有时因存在在大肠杆菌中不常使用的密码子而受到限制。上述基因的表达，可用高表达原核基因的密码子系统地替换内源密码子的方法而增强(Robinson等，核酸研究12：6663，1984)。一般认为，稀有密码子引起核糖体暂停，导致不能完成新生的多肽链和转录及翻译的解偶联。核糖体的暂停被认为引起mRNA的3′末端与细胞的核糖核酸酶的接触。
发明概述
本发明涉及一种合成的基因，该基因编码在哺乳动物细胞或其它真核生物细胞中正常地表达的蛋白，其中在编码该蛋白的天然基因中，至少一个非优选的或较不优选的密码子已被编码相同氨基酸的优选密码子所置换。
优选的密码子是：Ala(gcc)；Arg(cgc)；Asn(aac)；Asp(gac)；Cys(tgc)’Gln(cag)；Gly(ggc)；His(cac)；Ile(atc)；Leu(ctg)；Lys(aag)；Pro(ccc)；Phe(ttc)；Ser(agc)；Thr(acc)；Tyr(tac)；和Val(gtg)。较不优选的密码子是：Gly(ggg)；Ile(att)；Leu(ctc)；Ser(tcc)；Val(gtc)和Arg(agg)。所有不符合优选密码子和较不优选的密码子说明的密码子为非优选密码子。一般来说，特殊密码子的优选程度由在高表达的人类基因中密码子的使用程度来表示，如在表1中标题“高”下所列出。例如，在高表达的哺乳动物基因中，“atc”代表77％的Ile密码子、是优选的Ile密码子。在高表达的哺乳动物基因中，“att”代表18％的Ile密码子，为较不优选的Ile密码子。在高表达的人类基因中，“ata”序列仅代表5％的Ile密码子，称为非优选的Ile密码子。用在高表达的人类基因中更常出现的另一个密码子置换密码子，一般来说会增加基因在哺乳动物细胞中表达。相应地，本发明包括用优选的密码子取代较不优选的密码子，以及用优选或较不优选的密码子置换非优选的密码子。
“在哺乳动物细胞中正常表达的蛋白”指的是自然条件下在哺乳动物中表述的蛋白。该术语包括在哺乳动物基因组中的基因，如编码因子VIII、因子IX、白细胞介素和其它蛋白的基因。该术语也包括在疾病条件下哺乳动物细胞中表达的基因，如癌基因及在感染后哺乳动物细胞表达的由病毒(包括逆转录病毒)所编码的基因。术语“在真核细胞中正常表达的蛋白”，指的是自然条件下在真核生物中表达的蛋白。该术语也包括疾病条件下在哺乳动物细胞中表达的基因。
在优选的实施方案中，在体外哺乳动物细胞培养系统中，在相同的条件下(即，同样细胞类型、同样的培养条件、同样的表达载体)，合成的基因能够表达哺乳动物或真核生物蛋白的水平至少为“天然的”(或“天生的”)基因所表达的110％、150％、200％、500％、1,000％、5,000％，或甚至为10,000％。
如下描述了用于测定合成的基因和相应的天然基因表达的合适的细胞培养系统。其它合适的采用哺乳动物细胞的表达系统，在本领域的技术人员中是众所用知的，并在下面注明的标准的分子生物学参考书中有描述。下面和如下所述的标准参考书中描述了适于表达合成基因和天然基因的载体。术语“表达”意指蛋白表达。用对目的蛋白特异的抗体测定表述。上述抗体和测定技术在本领域的技术人员中众所周知。术语
“天然基因”和“天生基因”，意指天然地编码蛋白的基因序列(包括天然发生的等位变异体)，即天生或天然的编码序列。
其他优选的实施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的密码子是非优选的密码子。
在其他优选的实施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的非优选密码子被优选密码子或较不优选的密码子所置换。
在其他优选的实施方案中，天然基因中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的非优选密码子可以用优选密码子所置换。
在一优选的实施方案中，蛋白是逆转录病毒蛋白。在一更优选的实施方案中，蛋白是慢病毒蛋白。在进一步更优选的实施方案中，蛋白是HIV蛋白。在其他优选的实施方案中，蛋白是gag、pol、env、gp120或gp160。在其他优选的实施方案中，蛋白是人蛋白。在更优选的实施方案中，蛋白是人因子VIII和B区缺失的人因子VIII的蛋白。在另一优选的实施方案中，蛋白是绿色荧光蛋白。
在各种优选的实施方案中，合成基因中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和95％的密码子是优选的或较不优选的密码子。
本发明也涉及包含合成基因的表达载体。
在另一方面，本发明涉及包含合成基因的细胞。在各种优选的实施方案中，细胞是原核细胞，以及细胞是哺乳动物细胞。
在优选的实施方案中，合成基因包括比50更少、比40更少、比30更少、比20更少、比10更少、比5更少或没有“cg”的序列。
本发明也涉及提供一种制备合成基因的方法，该合成基因编码，由哺乳动物细胞或其它真核细胞正常表达的蛋白。该方法包括，在编码蛋白的天然基因中鉴别非优选的和较不优选的密码子，并且用编码相同氨基酸的优选密码子作为置换密码子，置换一个或多个非优选和较不优选的密码子。
在某些情况下(例如，允许引入限制性位点)，可能需要用较不优选的密码子而不是优选密码子置换非优选密码子。
没有必要用优选的密码子置换所有较不优选的或非优选的密码子。甚至用优选的密码子部分置换较不优选或非优选的密码子就可实现表达的增加。在某些情况下，为了获得中等水平的表达，用优选的或较不优选的密码子仅仅部分置换非优选密码子，就可合乎要求。
在其他优选的实施方案中，本发明涉及包含一种或多种合成基因的载体(包括表达载体)。
术语“载体”意指一种如来源于质粒、噬菌体、或哺乳动物或昆虫病毒的DNA分子，DNA片段可插入或克隆进载体之中。载体可含有一个或多个唯一的限制性位点，能在确定的宿主或载体生物自主复制，这样克隆序列是可以重复产生的。因此，术语“表达载体”意指任何能指导蛋白合成的自主元件。上述DNA表达载体包括哺乳动物质粒和病毒。
本发明也涉及编码蛋白所需部分的合成基因片段。除了它们仅编码蛋白的一部分外，上述合成基因片段与本发明的合成基因相似。优选的上述合成基因片段，至少编码蛋白50、100、150或500个邻近的氨基酸。
在构建本发明的合成基因中，避免CpG序列合乎要求。因为这些序列可引起基因沉默。因此，在一优选的实施方案中，合成基因的编码区不包括“cg”序列。
在HIV gp120env基因中存在的密码子偏倚，也在gag和pol基因中存在。因而，在这些基因中找到的非优选和较不优选的一部分密码子，用优选的密码子置换应该产生能较高水平表达的基因。在编码因子VIII和因子IX的人基因中，大部分密码子是非优选的密码子或较不优选的密码子。用优选的密码子置换一部分这些密码子，应该产生能在哺乳动物细胞培养中更高水平表达的基因。
本发明的合成基因能导入到活生物的细胞中。例如，载体(病毒或非病毒)能用于把合成基因导入到活生物的细胞中，以进行基因治疗。
反之，作为一种降低表达的方法用较不优选的密码子置换天然产生的基因中的优选密码子是合乎需要的。
描述重组DNA技术一般原理的标准参考书包括，Watson等，基因的分子生物学，第I和II卷，the Benjamin/cummings出版公司，Inc，出版者，Menlo Park，CA(1987)；Darnell等，分子细胞生物学，科学美国人图书公司，Inc.，出版者，纽约，N.Y.(1986)；Old等，基因操作的原理：基因工程导论，第2版，加利福尼亚大学出版社，出版者，Berkeley，CA(1981)；Maniatis等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室，出版者，冷泉港，NY(1989)；和分子生物学的当代技术方案，Ausubel等，Wiley出版者，纽约，NY(1992)。
术语“转化细胞”意指，通过重组DNA技术，已经用所选的DNA分子如合成基因导入的细胞(或导入其祖细胞中)。
术语“定位表达”意指将DNA分子如合成基因，定位在指导序列转录和翻译的DNA序列附近(即，有利于合成基因所编码的蛋白产生)。
附图描述
图1描述合成的gp120和合成的gp160基因的序列，其中密码子已由在高表达的人基因中找到的那些密码子置换。
图2是合成的gp120(HIV-MN)基因的简图。标记的V1～V5阴影部分表示超变区。填黑的框表示CD4结合位点。显示了有限数目的单一限制性位点：H(Hind 3)、Nh(Nhe 1)、P(Pst 1)、Na(Nae 1)、M(Mlu 1)、R(EcoR 1)、A(Age 1)和No(Not 1)。用作PCR模板化学合成的DNA片段显示于gp120序列下，并伴随用于扩增的引物的位置。
图3是用于测定gp120表达的瞬时转染测定结果的照片。用表达gp120的质粒转染293 T细胞免疫沉淀的上清的凝胶电泳图，gp120由HIV-1的IIIB分离体(gp120 IIIb)、HIV-1的MN分离体(gp120mn)、用CD5抗原置换内源前导肽修饰过的HIV-1的MN分离体(gp120mn CD5L)或具有人CD5前导序列并编码HIV-1的MN变异体的化学合成基因(syngp120mn)所编码。转染后60小时接着标记12小时，收集上清，用CD4：IgG1融合蛋白和蛋白A琼脂糖免疫沉淀。
图4描述ELISA测定法用于测定在瞬时转染293T细胞的上清中蛋白水平，所得到的结果图。4天后收集用表达gp120的质粒转染的293T细胞的上清，在gp120/CD4  ELISA中测定。gp120由HIV-1的IIIB分离体(gp120IIIb)、HIV-1的MN分离体(gp120mn)、用CD5抗原置换内源前导肽而修饰过的HIV-1的MN分离体(gp120mnCD5L)、或具有人CD5前导序列并编码HIV-1的MN变异体的化学合成基因(syngp120mn)所编码。gp120的水平用ng/ml表示。
图5是凝胶照片，说明用于测定在反式rev和顺式RRE的存在下天然和合成的gp120表达的免疫沉淀法结果。在该实验中，通过磷酸钙与10μg质粒共沉淀瞬时转染293T细胞。这些质粒在存在和缺乏rev表达的情况下，表达：(A)合成的gp120MN序列和顺式RRE，(B)HIV-1 IIIB的gp120部分，(C)HIV-1 IIIB的gp120部分和在顺式RRE。用通过PCR从HIV-1 HXB2前病毒克隆中克隆而来的Eag1/Hpa1 RRE片段产生RRE构建体gp120IIIbRRE和syngp120mnRRE。每种gp120表达质粒和10μg的pCMVrev或CDM7质粒DNA共转染。转染后60小时收集上清，用CD4:IgG融合蛋白和蛋白A琼脂糖免疫沉淀，在7％还原的SDS-PAGE胶上电泳。延长凝胶曝光时间以允许说明由rev所产生的gp120IIIbrre的诱导。
图5B是类似实验的较短曝光，其中syngp120mnrre和或不与pCMVrev共转染。
图5C是图5A所用的构建体的简图。
图6是野生型大鼠THY-1基因(wt)和合成的大鼠THY-1基因(env)的序列比较，合成的大鼠THY-1基因通过化学合成法构建并具有在HIV-lenv基因中找到的使用最多的密码子。
图7是合成的大鼠THY-1基因的纲要图。实黑框表示信号肽。阴暗框表示在前体中的序列，该序列能指导磷脂酰肌醇聚糖锚定子附着。用作THY-1构建体装配的单一限制性位点标记为H(Hind 3)、M(Mlu 1)、S(Sac 1)和No(Not 1)。在构建中使用的合成寡核苷酸的位置在图的底部显示。
图8中描述流式细胞术分析结果的图形。在这个实验中，通过磷酸钙共沉淀法，293T细胞用野生型大鼠THY-1表达质粒(粗线)，具有包膜密码子的大鼠THY-1表达质粒(细线)或仅为载体(点线)瞬时转染。转染后3天细胞用抗大鼠THY-1的单克隆抗体OX7染色，然后用与FITC偶联的抗小鼠IgG的多克隆抗体染色。
图9A是凝胶照片，说明用syngp120mn(A)或构建体syngp120mn.rTHY-lenv(B)转染的人293T细胞的上清免疫沉淀分析的结果，syngp120mn.rTHY-lenv在syngp120mn基因的3′非翻译区有rTHY-lenv基因。syngp120mn.rTHY-lenv构建体通过把Not1衔接子插入到rTHY-lenv质粒钝化的Hind 3位点而产生。然后，含有rTHY-lenv基因的0.5kb Not 1片段被克隆到syngp120mn质粒的Not 1位点上，并检测其正确的插入方向。在转染后72小时收集35S标记过细胞上清，用CD4:IgG融合蛋白和蛋白A琼脂糖沉淀，在7％还原SDS-PAGE胶上电泳。
图9B是在图9A所描述的实验中使用的构建体的简图。
图10A是仅用载体转染的COS细胞的照片，显示没有GFP荧光。
图10B是用CDM7表达质粒转染的COS细胞的照片，CDM7表达质粒编码工程化包括共有的翻译起始序列的天然GFP。
图10C是用表达质粒转染COS细胞的照片，该质粒具有在图10B中相同的侧翼序列和起始共有序列，但含有密码子优化的基因序列。
图10D是用图10C所述的表达质粒转染COS细胞的照片，但在65位残基Ser部位置换为Thr。
图11描述编码绿色荧光蛋白合成基因的序列(SEQ ID NO：40)
图12描述缺乏中心B结构域(包括氨基酸760-1639位)的天然人因子VIII基因的序列(SEQ ID NO：41)。
图13描述缺乏中心B结构域(包括氨基酸760-1639位)的合成人因子VIII基因的序列(SEQ ID NO：42)。
优选实施方案的描述
实施例1
具有在高表达的人基因中找到的密码子的合成gp120基因的构建
用Wisconsin大学遗传学计算机组开发的软件产生。针对HIV-1LAV亚型的包膜前体的密码频度表，在表1中，列表的结果与收集的高表达人基因密码子使用的模式相对比。对任一个由简并密码子编码的氨基酸来说，高表达基因的最常用密码子与HIV包膜前体的最常用的密码子是不同的。而且当使用时一条简单的规则描述常用包膜密码子的类型：优选的密码子使病毒RNA中的腺嘌呤残基的数目最大化。在所有情况中，只有这种情况意味着第三位为A的密码是最常使用的。在丝氨酸的特殊情况下，三个密码子对mRNA都贡献一个A残基，这三个密码子的总和值包括在mRNA中的作用是相等的，85％对A偏倚的尤其惊人实例是在精氨酸的密码子选择中发现的，其中AGA三联体包括了精氨酸密码子的88％。除了A残基的优势使用外，对简并密码子中尿苷可见明显的优选使用，其第三位残基必定是嘧啶。最后，根据如下的观察可以解释在较不常用的变异体中的不一致性，即双核苷酸CpG很少出现；因此，如在丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸的密码子中，只要第二位是C、第三位就不太可能是G；并且编码精氨酸的CGX三联体几乎不用。
表1 在HIV-1 IIIb env基因和高表达的人基因中密码子使用频率
     高    Env                       高    Env
Ala                              Cys
GC  C    53    27               TG  C    68    16
    T    17    18                   T    32    84
    A    13    50
    G    17    5                 Gln
                                CA  A    12    55
Arg G    88    45
CG  C    37    0
    T    7     4                 Glu
    A    6     0                GA  A    25    67
    G    21    0                    G    75    33
AG  A    10    88
    G    18    8                 Glv
                                GG  C    50    6
Asn T    12    13
AA  C    78    30                   A    14    53
    T    22    70                   G    24    28
Asp                              His
GA  C    75    33               CA  C    79    25
    T    25    67                   T    21    75
                                 Ile
                                AT  C    77    25
                                    T    18    31
                                    A    5     44
Leu                              Ser
CT  C    26    10               TC  C    28    8
    T    5     7                    T    13    8
    A    3     1                    A    5     22
    G    58    17                   G    9     0
TT  A    2     30               AG  C    34    22
    G    6     20                   T    10    41
Lys                     Thr
AA    A  18  68        AC  C    57  20
      G  82  32            T    14  22
                           A    14  51
                           G    15  7
Pro                     Tyr
CC    C   48  27       TA  C    74  8
      T   19  14           T    26  92
      A   16  55
      G   17  5
Phe                     Val
TT    C   80  26       GT  C    25  12
      T   20  74           T    7   9
                           A    5   62
                           G    64  18
表注：使用由Wisconsin大学遗传学计算机课题组建立的GCG程序计算密码子使用频率。数值代表在具体的密码子使用情况的百分率。其它HIV-1病毒分离体的包膜基因的密码子使用频率是相似的，显示了相似的偏倚。
为产生在哺乳动物细胞中能高水平表达的gp120基因，根据最普遍的北美亚型，HIV-1 MN的序列(Shaw等，科学226：1165，1984；Gallo等，自然321：119，1986)，构建了编码HIV-1的gp120片段的合成基因(syngp120mn)。在该合成的gp120基因中，可以用高表达的人基因中最常用的密码子有序地置换几乎所有天然的密码子(图1)。该合成基因是用化学合成的，长为150～200个碱基的寡核苷酸装配而成的。如果化学合成超过120-150个碱基的寡核苷酸，全长产物的百分率是低的，绝大部分过量的原料由较短的寡核苷酸组成。因这些较短的片段抑制克隆和PCR的扩增过程，使用超过某种长度的寡核苷酸是非常困难的。为了使用粗制的合成原料而不用预先纯化，克隆前用PCR扩增了单链寡核苷酸库。PCR产物在琼脂糖凝胶中纯化，在下一步PCR中用作模板。二个邻近的片段可以一起扩增，因为两个片段的末端有相互重叠的序列。这些片段，大小在350-400bp之间，被亚克隆到来源于pCDM-7的质粒中，该质粒含有CD5表面分子的前导序列，接着为Nhe 1/Pst 1/Mlu 1/EcoR1/BamH1多连接子的序列。在该多连接子中，每一种限制性酶表示一个存在于PCR产生的片段的5′或3′端的位点。因而通过4个长片段的每一个顺序亚克隆、装配成了整个gp120基因。对每种片段来说，装配前，可以亚克隆3～6个不同的克隆，并测序。在图2显示用于构建合成的gp120的方法的简图。图1展示了合成gp120基因的(及用相同的方法，创造的合成gp160基因)序列。
可以考虑突变率。最通常找到的突变是短缺失(1个核苷酸)和长缺失(多达30个核苷酸)。在某些情况下，有必要用合成衍接子或从其它克隆来源的片段交换部分，而不是用在那个特定区域突变。制造一些严格遵守最优化密码子使用规则衍生物，适于限制性位点导入所得到的基因，以便于不同片段的置换(图2)。这些单一的限制性位点，以大约100bp间隔，被导入到基因中。天然HIV前导序列，和人CD5抗原高效前导肽交换，以便于分泌(Aruffo等， 细胞61：1303，1990)。用于构建的质粒是哺乳动物表达载体pCDM7的衍生物，该质粒在人强CMV立早启动子的控制下，转录插入的基因。
为比较野生型和合成gp120编码序列，合成的gp120编码序列插入到哺乳动物表达载体中，在瞬时转染实验中测定。几种不同的天然gp120基因用作对照，以排除不同的病毒分离体和由不同前导序列诱导的人工产物之间在表达水平上的变异。用Sal 1/Xho 1 HIV-1 HXB2包膜片段作为模板通过PCR产生用作对照的gp120 HIV IIIb构建体。为排除PCR诱导的突变，基因的含大约1.2kb Kpn 1/Ear 1片段，与来自前病毒克隆的各个片段交换。从HIV-1 MN感染的C8166细胞(AIDA保藏所，Rockville，MD)用作对照的野生型gp120mn构建体，并用天然的包膜或CD5前导序列表达gp120。因为在这种情况下，不能得到前病毒克隆，检测了每种构建体的2个克隆，以避免PCR人工产物。为半定量确定分泌的gp120的数量，用可溶的CD4：免疫球蛋白融合蛋白和蛋白A琼脂糖免疫沉淀通过磷酸钙共沉淀法瞬时转染的293T细胞的上清。
该分析的结果(图3)显示，与天然gp120对照的量相比较，合成基因产物在非常高的水平上表达。合成gp120基因的分子量与对照蛋白类似(图3)，大约在100～110kd的范围内。稍快的迁移率可用如下事实解释，即在某些肿瘤细胞系如293T中，糖基化不完全或有某种程度的改变。
为更精确地比较表达，用有分散期(demobilized phase)中CD4的gp120 ELISA定量gp120蛋白水平。该分析显示(图4)，ELISA资料可与免疫沉淀资料相类似，对合成的gp120基因来说，gp120浓度大约为125ng/ml，对所有的天然gp120基因来说，其浓度比本底设定值(5ng/ml)更少。因此，合成gp120基因的表达比野生型gp120基因至少高出一个数量级。在实验中显示其增加值至少为25倍。
rev在gp120表达中的作用
由于rev在病毒转录体表达中的几个步骤起作用，在合成gp120基因增强的表达中，检测了非翻译影响的可能作用。首先，为排除如下可能性，即通过改变核苷酸序列消除或增加mRNA降解或核阻留的负性信号元件赋予，检测了细胞质mRNA的水平。通过瞬时转染的293T细胞的NP40裂解然后通过离心法排除细胞核来制备细胞质RNA。随后，从裂解液中由多步苯酚抽提和沉淀制备细胞质RNA，用狭缝印迹装置点在硝酸纤维素膜上，最后用包膜特异的探针杂交。
简言之，在转染后36小时分离用CDM&，gp120 IIIB、或syngp120转染的293细胞的细胞质mRNA。Hela细胞的细胞质RNA在转染后16小时后。其中Hela细胞用野生型痘苗病毒或在7.5启动子控制下表达gp120 IIIb或合成gp120基因的重组病毒转染，用狭缝印迹装置将相等数量的RNA点在硝酸纤维素膜上，用随机标记的1.5kb gp120 IIIb和syngp120片段或人β-肌动蛋白探针杂交。用图像扫描仪phospoimager扫描杂交膜定量RNA表达水平。所用的操作过程在下面更详细地描述。
本实验说明用天然或合成gp120基因转染的细胞的mRNA水平，没有明显的差异。事实上，在一些实验中，合成gp120基因的细胞质mRNA水平，甚至低于天然gp120基因的水平。
这些数据可通过测定来自重组的痘苗病毒的表达证实。感染用表达野生型gp120 IIIb或syngp120mn的痘苗病毒，以至少为10的感染倍数人293细胞或Hela细胞。感染后24小时收集上清并用CD4：免疫球蛋白融合蛋白和蛋白A琼脂糖免疫沉淀。在本实验中所用的操作程序下面有更详细的描述。
本实验显示，在强的混合早期和晚期7.5k启动子的控制下，当内源基因产物和合成基因基因产物表达从痘苗病毒重组体中时，仍可观察到合成基因表达增加。因为痘苗病毒mRNAs在细胞质中转染和翻译，在本实验中合成包膜基因增加的表达量，不能归功于从细胞核输出的增强。本实验在2种另外的人细胞类型，肾癌细胞系293和Hela细胞中重复。任一种重组痘苗病毒转染的293细胞中。mRNA的水平和转染的293T细胞相似。
在慢病毒中密码子的使用
由于密码子使用对哺乳动物细胞中表达有明显的影响，检查了其它逆转录病毒的包膜基因中的密码子频率。该研究发现，一般来说在逆转录病毒中没有明显的密码子优选性的类型。然而，如果单独分析来自慢病毒属的病毒，HIV-1也属于慢病毒属，可找到几乎与HIV-1相同的密码子偏倚。制备了排除慢病毒的各种(优势为C型)逆转录病毒的包膜糖蛋白的密码子频率表，并与从4种不与HIV-1紧密相关的慢病毒(公山羊关节炎大脑炎病毒、马感染贫血病毒、猫免疫缺陷病毒、绵羊髓鞘脱落病毒)的包膜蛋白序列所制得的密码子频率表相比较(表2)。除一种情况外的所有情况下，慢病毒属的密码子使用类型与HIV-1惊人地相似，HIV-1优选的密码子与其它慢病毒的优选密码子相同。例外的情况是脯氨酸，在非HIV慢病毒包膜蛋白残基中41％由CCT编码，40％的残基由CCA编码，该情形也清楚地反映了以A结尾的密码子三联体的明显优先性。非慢病毒包膜蛋白的密码子使用类型并不显示为相似的A残基优势性，也不象如高表达人基因的密码子使用性那样，向第三位C和G残基偏斜。一般而言，非慢病毒逆转录病毒似乎更均等地使用不同的密码子，它们与较不高表达的人基因共享一种类型。
表2：慢病毒和非慢病毒逆转录病毒(其它)的包膜蛋白基因中的密码子频率
其它病毒慢病毒         其它病毒慢病毒
Ala                     Cys
GC    C    45    13    TG  C    53     21
      T    26    37        T    47     79
      A    20    46
      G    9     3      Gln
                       CA  A    52     69
Arg   G    48    31
CG    C    14    2
      T    6     3      Glu
      A    16    5     GA  A    57     68
      G    17    3         G    43     32
AG    A    31    51
      G    15    26     Glv
                       GG  C    21     8
Asn   T    13    9
AA    C    49    31        A    37     56
      T    51    69        G    29     26
Asp                     His
GA    C    55    33    CA  C    51     38
      T    51    69        T    49     62
                        Ile
                       AT  C    38     16
                           T    31     22
                           A    31     61
Leu                     Ser
CT    C    22    8     TC  C    38     10
      T    14    9         T    17     16
      A    21    16        A    18     24
      G    19    11        G    6      5
TT    A    15    41    AG  C    13     20
      G    10    16        T    7      25
Lys                        Thr
AA    A    60   63        AC   C    44    18
      G    40   37             T    27    20
                               A    19    55
Pro   G    10   8
CC    C    42   14
      T    30   41         Tyr
      A    20   40         TA   C    48    28
      G    7    5               T    52    72
Phe                        Val
TT    C    52   25        GT    C    36    9
      T    48   75              T    17    10
                                A    22    54
                                G    25    27
表注：使用Wisconsin大学遗传学计算机组建立的GCG程序计算密码子频率。数字表示所用的具体密码子的百分率。非慢病毒逆转录病毒的密码子使用根据下列病毒的包膜蛋白前体序列编制，这些病毒是牛白血病病毒、猫白血病病毒、人T-细胞白血病病毒I型、人T-细胞嗜淋巴细胞，病毒II型、鼠白血病病毒的水貂细胞病灶形成分离株(MuLV)、Rauscher脾病灶形成分离株、10Al分离株、4070A兼嗜性分离株和骨髓增殖白血病病毒分离株以及大鼠白血病病毒、猿猴肉瘤病毒、猿猴T-细胞白血病病毒、致白血病逆转录病毒T1223/B和长臂猿白血病病毒。非HIV、非-SIV、慢病毒的密码子频率表根据下列病毒的包膜前体序列编制、这些病毒为公山羊关节炎大脑炎病毒、马感染贫血病毒、猫免疫缺陷病毒和绵羊髓鞘脱落病毒。
除了含有A的密码子优势外，慢病毒也坚持强CpG不出现的HIV类型，所以丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸三联体的第三位很少为G。逆转录病毒包膜三联体显示相似的CpG不出现的情况，但更不明显。在CpG优势方面慢病毒和其它逆转录病毒之间，最明显的差异，在于使用精氨酸三联体的CGX变异体，该变异体在逆转录病毒包膜编码序列中合理地经常出现，但绝不在类似的慢病毒序列中存在。
在天然和合成gp120中rev依赖性的差异
为检测是否由rev的调节与HIV-1密码子的使用有关，研究了rev对天然和合成基因表达的影响。由于由rev引起的调节需要在顺式中的rev结合位点RRE，制备构建体，其中该结合位点克隆到天然和合成基因的3′非翻译区。这些质粒和rev或在反式情况下的对照质粒，共转染到293T细胞中，通过免疫沉淀法半定量测定在上清中的gp120表达水平。在该实验中所用的操作程序在下面有更详细地描述。
如在图5A和图5B所示，rev上调了天然gp120基因的表达，但对合成的gp120基因的表达没有影响。因而，对缺乏内源病毒包膜序列的编码序列的底物来说，rev的作用不明显。
具有HIV包膜密码子的合成大鼠THY-1基因的表达
上述的实验暗示，事实上为rev的调节“包膜序列”不得不存在。为检验该假说，制备了编码小型的、典型高表达的细胞表面蛋白，大鼠THY-1抗原的基因的合成版。大鼠THY-1基因的合成版设计为具有和HIV gp120一样的密码子使用性。在设计该合成基因时避免采用AUUUA序列因该序列和mRNA的不稳定有关，此外，引入了2个限制性位点，以简化产生的基因的操作(图6)。用3个150～170聚体的寡核苷酸产生具有HIV包膜密码子使用的这种合成基因(rTHY-lenv)，(图7)。与syngp120mn基因相反PCR产物直接克隆，在pUC12中装配，然后克隆进pCDM7中。
通过瞬时转染293T细胞的免疫荧光定量天然rTHY-1和具有HIV包膜密码子的rTHY-1的表达水平。图8显示，天然THY-1基因的表达，几乎比对照转染细胞(pCDM7)的背景水平高出2个数量级强度。相反，合成大鼠THY-1的表达基本上低于天然基因的表达(通过峰值移到更低的通道数显示)。
为证明没有因操作疏忽而导入促进mRNA降解的负性序列元件，产生构建体，其中rTHY-lenv基因被克隆到合成gp120基因的3′末端(图9B)。在本实验中，293T细胞用syngp120mn基因或syngp120/ratTHY-lenv融合基因(syngp120mn.rTHY-lenv)转染。用CD4:IgG融合蛋白和蛋白A琼脂糖免疫沉淀测定表达。本实验所用的操作程序，在下面有更详细的描述。
由于合成gp120基因有UAG终止密码子，rTHY-lenv从该转录体不能翻译。如果在该序列中存在赋予增强降解的负性元件，与没有rTHY-lenv的syngp120mn构建体相比较，从该构建体表达的gp120蛋白水平就应降低。图9A显示2个构建体的表达水平相似，表明低水平表达一定与翻译相关。
具有包膜密码子的合成大鼠THY-1基因依赖Rev的表达
为探测是否rev能调节具有env密码子的大鼠THY-1基因的表达，制备了在rTHY-lenv开放阅读框架的3′端有rev结合位点的构建体。为测定具有3′RRE的大鼠THY-lenv构建体的rev反应性，人293T细胞用大鼠THY-lenvrre和CDM7或pCMVrev共转染。转染后60小时，用含1mM EDTA的PBS分离细胞，用OX-7抗rTHY-1小鼠单克隆抗体和FITC-偶联的第二抗体染色。用EPICS XL细胞荧光测定仪测定荧光强度。这些操作程序在下面有更详细的描述。
在重复实验中，如果rev和rTHY-lenv基因共转染，可检出rTHY-lenv表达轻微增加。为进一步增加测定体系的敏感性，产生了表达rTHY-lenv分泌形式的构建体。该构建体应产生更可靠的数据，因为与表面表达蛋白相比，在上清中分泌蛋白的积累量反映在延长周期中蛋白合成的结果，该量似乎更紧密地反映现时合成率。通过PCR制备用正向和反向引物分别与内源前导序列的3′端、及磷脂酰肌醇聚糖锚定需要的序列结构域的5′端退火能表达分泌形式的基因。PCR产物被克隆到已经含有CD5前导序列的质粒中，因而产生了这样的一种构建体，其中膜锚定性已缺失，前导序列通过异源(也许更有效)的前导肽交换。
通过人293T细胞的上清免疫沉淀测定分泌形式的大鼠THY-lenvrev反应性，该细胞用表达大鼠THY-lenv和顺式RRE序列(rTHY-lenvPI-rre)分泌形式的质粒，和CDM7或pCMVrev共转染。用寡核苷酸通过PCR制得rTHY-lenvPI-RRE构建体：cgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaac(SEQ ID NO：38)作正向引物，寡核苷酸：cgcggatcccttgtattttgtactaata(SEQ ID NO：39)作反向引物，以及合成rTHY-lenv构建体作为模板。用Nhe 1和Not 1消化后，PCR片段克隆到含有CD5前导和RRE序列的质粒中。转染后72h收获35S标记细胞的上清，用抗rTHY-1的小鼠单克隆抗体OX7和抗小鼠IgG琼脂糖沉淀，在12％还原的SDS-PAGE胶上电泳。
在本实验中，由rev所产生的rTHY-lenv诱导与上面描述的实验结果更明显和清楚，有力地表明rev能翻译调节由低使用密码子抑制的转录体。
rTHY-lenv：免疫球蛋白融合蛋白的Rev非依赖的表达
为检测是否低使用率的密码子必须在整个编码序列中存在，或是否短区域足以赋予rev-反应性，产生了rTHY-lenv：免疫球蛋白融合蛋白。在该构建体中，rTHY-lenv基因(没有负责磷脂酰肌醇聚糖的锚定性的序列结构域与人IgG1绞链区，CH2和CH3结构域连接。该构建体通过锚定PCR产生，用具有Nhe 1和BamHI限制性位点的引物并用rTHY-lenv作为模板。PCR片段被克隆到质粒中，该质粒含有CD5表面分子的前导序列和人IgG1免疫球蛋白的绞链区，CH2和CH3部分。含有rTHY-lenveg1插入子的Hind 3/Eag 1片段，接着被克隆到具有RRE序列的pCDM7来源的质粒中。
为测定rTHY-lenv/免疫球蛋白融合基因(rTHY-lenveglrre)对rev的反应性，人293T细胞用rTHY-lenveglrre和pCDM7或pCMVrev共转染。分别用具有Nhe 1和BamHI限制性位点的正向和反向引物通过锚定PCR制得，PCR片段克隆到含有CD5前导序列和人IgG1绞链区，CH2和CH3结构域的质粒中。转染后72小时收获35S标记细胞的上清，用抗rTHY-1的小鼠单克隆抗体OX7和抗小鼠IgG琼脂糖沉淀，在12％还原SDS-PAGE上电泳。所用的操作程序在下面有更详细的描述。
至于rTHY-lenvPI基因的产物，该rTHY-lenv/免疫球蛋白融合蛋白分泌到上清中。因而该基因应对rev诱导有反应性。然而，与rTHY-lenvPI相反，反式的rev共转染对rTHY-lenveg1表达无诱导增加，或仅诱导微弱增加。
具有天然rTHY-1或HIV包膜密码子的rTHY-1：免疫球蛋白融合蛋白的表达，通过免疫沉淀法测定。简言之，人293T细胞用rTHY-lenv eg1(env密码子)或rTHY-lwteg1(天然密码子)转染。rTHY-1wteg1构建体以与rTHY-lenveg1构建体所用相似的方式产生，例外的是含有天然rTHY-1基因的质粒用作模板。转染后72小时，收获35S标记细胞的上清，用抗rTHY-1的小鼠单克隆抗体OX7和抗小鼠IgG琼脂糖沉淀。在12％还原SDS-PAGE胶上电泳。在本实验中所用的操作程序，在下面有更详细的描述。
和以野生型rTHY-1作融合配对体的相似构建体相比较，rTHY-lenveg1的表达水平降低，但仍然显著高于rTHY-lenv。因此，融合蛋白的2个部分都影响表达水平。添加rTHY-lenv并不限制表达至rTHY-lenv单独所观察到的相等水平。因而如果蛋白表达并不完全抑制，由rev引起的调节似乎是无效的。
在HIV-1包膜基因中的密码子优选性
对所有20个氨基酸来说，HIV包膜和高表达人基因的密码子使用频率的直接比较，显示惊人的差异。该密码子优选性的统计学显著性的一个简单方法是如下发现，即在具有2倍密码子简并性的9个氨基酸中，偏爱使用的第3个残基在所有9个中为A或U。所有9种的2个同等选择会相同的可能性大约为0.004，因此通过任何常规方法，第3倍残基的选择不能认为是随机的。在更简并的密码子中找到偏向密码子优选性的进一步证据，其中可观察到对含有腺嘌呤的三联体的强选择性。这可与高表达的基因类型相反，在具有3或更高倍简并性的密码子的第3位中，偏爱使用含有C或较不常见G的密码子。
用高表达人基因的密码子和天然密码子的系统交换，明显地增加gp120的表达。通过ELISA的数量分析显示，瞬时转染进入293细胞后，与天然gp120相比较，合成基因的表达至少高25倍。在ELISA实验中所显示的浓度水平相当低。由于ELISA用于定量是基于gp120与CD4结合，只有天然非变性的物质可以检出。这可解释明显的低表达结果。细胞质mRNA水平的测定说明，蛋白表达的差异是由于翻译差异，而不是mRNA稳定性的关系。
一般来说，逆转染病毒并不显示，如对HIV中发现的对A和T相似的优选性。但是，如果该家族分为2个亚组，慢病毒和非慢病毒逆转录病毒，可检出慢病毒的密码子第三位，对A有相似的优选性，对T较少出现。因此，有用的证据表明，慢病毒保留包膜密码子的特有类型，不是因为上述残基的逆转录或复制的内在优势，而在于某种原因对该类病毒的生理学的特殊性。慢病毒和非复杂的逆转录病毒的之间的主要差异，如已经提及的在慢病毒中的额外调节基因和非必需的辅助基因。因此，对包膜表达限制的一个简单解释可能是，基于这种限制是这些额外分子的一种重要调节机制。事实上，已经知道这些蛋白之一rev，在所有慢病毒中，最有可能具有同源物。因此病毒mRNA的密码子使用可用于创造一类对rev刺激作用敏感的转录体。用如上述相似的策略证明该假说，但这次密码子的使用变成相反方向。用在HIV包膜中最常用的密码子置换高表达细胞基因的密码子使用。如假设的那样，当使用表面表达分子的免疫荧光分析时，表达水平显著低于天然分子，几乎为2个数量级。如果rev反式共表达，RRE元件以顺式存在，仅发现对表面分子轻微的诱导作用。然而，如果THY-1以分泌分子表达，由rev引起的诱导作用要明显的多，该结果支持以上假说。这可能通过在上清中分泌蛋白的积累来解释，因而显著地扩大rev的效应。如果rev仅一般诱导表面微弱增加，由rev所引导的HIV包膜蛋白诱导不可能是增加表达量的目的，而是增加细胞内gp160水平。在此时间为什么应该是这处情形是完全不清楚的。
为检验是否基因的小亚整体元件足以限制表达和进行表达，产生了依赖rev的rTHY-lenv：免疫球蛋白融合蛋白，其中仅约整个基因的三分之一有包膜密码子使用。该构建体的表达水平为中等水平，表明rTHY-lenv负性序列元件对免疫球蛋白部分不显性。该融合蛋白不是或仅轻微的rev反应性，表明仅几乎完全抑制的基因是rev反应的。
在密码子频率表中找到的另一个特征是CpG三联体令人惊奇的少出现。对大肠杆菌、酵母、果蝇和灵长类的密码子使用性的比较研究中显示，在大量分析过的灵长类基因中，8个最少使用的密码子都是含有且CpG二核苷酸序列的密码子。含有该二核苷酸基序的密码子的避免使用，在其它逆转录病毒的序列中也能找到。显然有可能是含有CpG三联体的较少出现的原因，与CpG的胞嘧啶甲基化引起基因沉默而避免使用有关。对整个HIV而言，CpG二核苷酸的预期数目约为依据碱基组成所预期的五分之一。这可能表明恢复高表达的可能性，并且事实上在病毒病理形成过程中某些时间点必须高表达。
在此清楚展示的结果表明，密码子优选性对蛋白水平有严重影响，暗示翻译的延伸作用恰是控制哺乳动物基因表达。然而，其它因素也起作用。在真核细胞中不是最大负载的mRNAs量表明，至少在某些情况下起始是翻译的速率限制因素，因为否则所有转录体会被核糖体完全覆盖。此外，如果核糖体阻滞和接着的mRNA降解是机理，通过稀有密码子的抑制，就最不可能由任何象在此展现的调节机制所逆转。对起始和延伸影响翻译活性的一个可能解释是，起始速率或与核糖体的接近部分由分布在整个RNA上的未知因素所控制，结果慢病毒密码子倾向于使RNA在难以起始的RNAs库中积累。然而，该限制因素并不需要是动力学的，例如密码子的选择会影响一旦起始给定的翻译产物，就可恰当地完成的可能性。在这种机制下，较少偏爱使用密码子的量会产生不能完成新生多肽链的显著积累的可能性。然后，隔离的RNA将由rev的作用给出增强的起始速率。由于腺嘌呤残基在rev反应的转录体中很丰富，有可能RNA腺嘌呤的甲基化介导该翻译抑制作用。
详细的操作程序
下列的操作程序用在上述的实验中。
序列分析
序列分析使用由Wisconsin大学计算机课题组开发的软件。
质粒构建
质粒构建采用下列方法。载体和插入DNA在合适的限制性缓冲液中，以0.5μg/10μl浓度消化1-4小时(总反应体积大约30μl)。消化过的载体在凝胶电泳前，用10％(v/v)的1μg/ml小牛小肠碱性磷酸酶处理30分钟。载体和插入子消化物(每种5～10μl)，在1.5％低熔点琼脂糖凝胶上用TAE缓冲液电泳。含有目的泳带的凝胶条转移到1.5ml反应管中，在65℃下熔化，不移去琼脂糖，直接加连接液。典型的连接反应在总体积25μl中进行，用1×低浓度缓冲液，1×含有200～400U连接酶的连接添加液，1μl载体和4μl插入片段。当有必要时，通过将1/10体积的250μM dNTPs和2-5U Klenow聚合酶加到热失活或苯酚抽提的消化物中，室温温育大约20min补齐5′突出端。当有必要时，通过加1/10体积的2.5mM dNTP和5-10U的T4 DNA聚合酶到热失活或苯酚抽提的消化液中，接着在37℃下温育30min补齐3′突出端在这些反应中使用下列缓冲液：10×低浓度缓冲液(60mM Tris HCl，pH 7.5，60mM MgCl2，50mM NaCl2，4mg/ml BSA，70mM β-巯基乙醇，0.02％NaN3)；10×中等缓冲液(60mM Tris HCl，pH 7.5，60mM MgCl2，50mM NaCl2，4mg/ml BSA，70mM β-巯基乙醇，0.02％NaN3)；10×高浓度缓中液(60mM Tris HCl，pH 7.5，60mM MgCl2，50mM NaCl2，4mg/ml BSA，70mM β-巯基乙醇，0.02％NaN3)；10×连接添加液(1mM ATP，20mM DDT，1mg/ml BSA，10mM亚精胺)；50×TAE(2M Tris乙酸盐，50mM EDTA)。
寡核苷酸合成和纯化
寡核苷酸在Milligen 8750合成仪(Millipore)上产生。样品柱用1ml 30％的氢氧化铵洗脱，被洗脱的寡核苷酸在55℃下，去封闭6～12小时。去封闭后，150μl的寡核苷酸用10×体积的非饱和正丁醇在1.5ml反应管中沉淀，接着在微量离心机中以15,000rpm离心。沉淀用70％乙醇清洗，重新悬浮在50μl水中，通过在1∶333稀释比测定260nM光密度值，浓度(1OD260＝30μg/ml)。
下列寡核苷酸用于合成gp120基因的构建(在本文中显示所有序列为5′至3′方向)。
寡核苷酸1正向(Nhe1)：cgc ggg cta gcc acc gag aag ctg(SEQ IDNO：1).
寡核苷酸1：acc gag aag ctg tgg gtg acc gtg tac tac ggc gtg ccc gtg tggaag ag ag gcc acc acc acc ctg ttc tgc gcc agc gac gcc aag gcg tac gac acc gaggtg cac aac gtg tgg gcc acc cag gcg tgc gtg ccc acc gac ccc aac ccc cag gag gtggag ctc gtg aac gtg acc gag aAc ttc aac at(SEQ ID NO：2).
其核苷酸1反向：cca cca tgt tgt tct tcc aca tgt tga agt tct c(SEQ IDNO：3).
寡核苷酸2正向：gac cga gaa ctt caa cat gtg gaa gaa caa cat(SEQ IDNO：4)
寡核苷酸2：tgg aag aac aac atg gtg gag cag atg catgag gac atc atc agcctg tgg gac cag agc ctg aag ccc tgc gtg aag ctg acc cc ctg tgc gtg acc tg aac tgcacc gac ctg agg aac acc acc aac acc aac ac agc acc gcc aac aac aac agc aac agcgag ggc acc atc aag ggc ggc gag atg(SEQ ID NO：5).
寡核苷酸2反向(Pst1)：gtt gaa gct gca gtt ctt cat ctc gcc gcc ctt(SEQID NO：6).
寡核苷酸3正向(Pst1)：gaa gaa ctg cag ctt caa cat cac cac cag c(SEQID NO：7).
寡核苷酸3：aac atc acc acc agc atc cgc gac aag atg cag aag gag tac gccctg ctg tac aag ctg gat atc gtg agc atc gac aac gac agc acc agc tac cgc ctg atc tcctgc aac acc agc gtg atc acc cag gcc tgc ccc aag atc agc ttc gag ccc atc ccc atccac tac tgc gcc ccc gcc ggc ttc gcc(SEQ ID NO：8).
寡核苷酸3反向：gaa ctt ctt gtc ggc ggc gaa gcc ggc ggg(SEQ IDNO：9).
寡核苷酸4正向：gcg ccc ccg ccg gct tcg cca tcc tga agt gca acg acaaga agt tc(SEQ ID NO：10)
寡核苷酸4：gcc gac aag aag ttc agc ggc aag ggc agc tgc aag aac gtg agcacc gtg cag tgc acc cac ggc atc cgg ccg gtg gtg agc acc cag ctc ctg ctg aacggc agc ctg gcc gag gag gag gtg gtg atc cgc agc gag aac ttc acc gac aac gcc aagacc atc atc gtg cac ctg aat gag agc gtg cag atc(SEQ ID NO：11)
寡核苷酸4反向(Mlu1)：agt tgg gac gcg tgc agt tga tct gcacgc tct c(SEQ ID NO：12).
寡核苷酸5正向(Mlu1)：gag agc gtg cag atc aac tgc acg cgt ccc(SEQ ID NO：13).
寡核苷酸5：aac tgc acg cgt ccc aac tac aac aag cgc aag cgc atc cac atcggc ccc ggg cgc gcc ttc tac acc acc aag aac atc atc ggc acc atc ctc cag gcc cactgc aac atc tct aga(SEQ ID NO：14).
寡核苷酸5反向：gtc gtt cca ctt ggc tct aga gat gtt gca(SEQ IDNO：15).
寡核苷酸6正向：gca aca tct cta gag cca agt gga acg ac(SEQ IDNO：16).
寡核苷酸6：gcc aag tgg aac gac acc ctg cgc cag atc gtg agc aag ctg aaggag cag ttc aag aac aag acc atc gtg ttc ac cag agc agc ggc ggc gac ccc gag atcgtg atg cac agc ttc aac tgc ggc ggc(SEQ ID NO：17).
寡核苷酸6反向(EcoR1)：gca gta gaa gaa ttc gcc gcc gca gtt ga(SEQID NO：18).
寡核苷酸7正向(EcoR1)：tca act gcg gcg gcg aat tct tct act gc(SEQID NO：19).
寡核苷酸7：ggc gaa ttc ttc tac tgc aac acc agc ccc ctg ttc aac agc acc tggaac ggc aac aac acc tgg aac aac acc acc ggc agc aac aac aat att acc ctc cag tgcaag atc aag cag atc atc aac atg tgg cag gag gtg ggc aag gcc atg tac gcc ccc cccatc gag ggc cag atc cgg tgc agc agc(SEQ ID NO：20)
寡核苷酸7反向：gca gac cgg tga tgt tgc tgc tgc acc gga tct ggc cct c(SEQ ID NO：21).
寡核苷酸8正向：cga ggg cca gat ccg gtg cag cag caa cat cac cgg tctg(SEQ ID NO：22).
寡核苷酸8：aac atc acc ggt ctg ctg ctg acc cgc gac ggc ggc aag gac accgac acc aac gac acc gaa atc ttc cgc ccc ggc ggc ggc gac atg cgc gac aac tgg agatct gag ctg tac aag tac aag gtg gtg acg atc gag ccc ctg ggc gtg gcc ccc acc aaggcc aag cgc cgc gtg gtg cag cgc gag aag cgc(SEQ ID NO：23).
寡核苷酸8反向(Not1)：cgc ggg cgg ccg ctt tag cgc ttc tcg cgc tgcacc ac(SEQ ID NO：24).
下列寡核苷酸用于大鼠THY-1 env基因的构建。
寡核苷酸1正向(BamH1/Hind3)：cgc ggg gga tcc aag ctt acc atg attcca gta ata agt(SEQ ID NO：25).
寡核苷酸1：atg aat cca gta ata agt ata aca tta tta tta agt gta tta caa atgagt aga gga caa aga gta ata agt tta aca gca tct tta gta aat caa aar ttg aga tta gat tgtaga cat gaa aat aat aca aat ttg cca ata caa cat gaa ttt tca tta acg(SEQ ID NO：26).
寡核苷酸1反向(EcoR1/Mlu1)：cgc ggg gaa ttc acg cgt taa tga aaa ttcatg ttg(SEQ ID NO：27).
寡核苷酸2正向(BamH1/Mlu1)：cgc gga tcc acg cgt gaa aaa aaa aaacat(SEQ ID NO：28).
寡核苷酸2：cgt gaa aaaaaa aaa cat gta tta agt gga aca tta gga gta cca gaacat aca tat aga agt aga gta aat ttg ttt agt gat aga ttc ata aaa gta tta aca tta gca aatttt aca aca aaa gat gaa gga gat tat atg tgt gag(SEQ ID NO：29).
寡核苷酸2反向(EcoR1/Sac1)：cgc gaa ttc gag ctc aca cat ata atc tcc(SEQ ID NO：30).
寡核苷酸3正向(BamH1/Sac1)：cgc gga tcc gag ctc aga gta agt ggacaa(SEQ ID NO：31).
寡核苷酸3：ctc aga gta agt gga caa aat cca aca agt agt aat aaa aca ata aatgta ata aga gat aaa tta gta aaa tgt ga gga ata agt tta tta gta caa aat aca agt tgg ttatta tta tta tta tta agt tta agt ttt tta caa gca aca gat ttt ata agt tta tga(SEQ IDNO：32).
寡核苷酸3反向(EcoR1/Not1)：cgc gaa ttc gcg gcc gct tca taa act tataaa atc(SEQ ID NO：33).
寡核苷酸3反向(EcoR1/Not1)：cgc gaa ttc gcg gcc gct tca taa act tataaa atc(SEQ ID NO：33)
聚合酶链式反应
通过聚合酶链式反应(PCR)使用两端退火短的，互相重叠的15～25聚体寡核苷酸扩增长寡核苷酸。典型的PCR条件为：35个循环，55℃退火温度，0.2秒延伸时间。PCR产物用凝胶纯化，苯酚抽提，用在随后的PCR中，以产生含有2个邻近的小片段的较长片段。这些较长片段克隆到来源于CDM7的质粒中，该质粒含有CD5表面分子的前导序列，后接Nhe1/Pst 1/Mlu 1/EcoR1/BamH1多连接子。
下列溶液用于这些反应中：10×PCR缓冲液(50mM KCl，100mM Tris HCl，pH 7.5，8mM MgCl2，2mM每种dNTP)。最终缓中液补加10％的DMSO，以增加Taq聚合酶的保真性。
小规模制备DNA
转化细菌生长在3ml LB培养液中，达6小时以上或过夜。大约1.5ml培养物倾倒在1.5ml微量离心管中，离心20秒以沉淀细胞，然后重悬在200μl溶液I中。接着加400μl溶液II和300μl溶液III。盖上离心管，混匀，离心＞30秒。上清被转移到新的管中，用苯酚抽提一次。将异丙醇加入管中，混匀，在微量离心机中旋转＞2min沉淀DNA。沉淀用70％乙醇清洗，重悬在含10μl RNAseA的50μl dH2O中。下列培养基和溶液用在这些操作程序中：LB培养基(1.0％NaCl，0.5％酵母提取物，1.0％蛋白胨)；溶液I(10mM EDTA pH 8.0)；溶液II(0.2M NaOH，1.0％SDS)；溶液III(2.5M KOAc，2.5M冰乙酸)；苯酚(pH调整至6.0，上层覆盖TE)；TE(10mM TrisHCl，pH 7.5，1mM EDTA pH 8.0)。
大规模制备DNA
一升转化细菌培养液，37℃在M9细菌培养基(pCDM衍生物)或LB(pUC衍生物)中，生长24～36小时(用pCDM衍生物转化的MC1061p3)，或12～16小时(用pUC衍生物转化的MC1061)。细菌在一升瓶中用Beckman J6离心机，4,200rpm离心20min。沉淀重新悬浮在40ml的溶液I中。接着加80ml溶液II和40ml溶液III，离心瓶半用力旋涡振荡，直到出现2～3mm大小的凝块。离心瓶以4,200rpm离心5min，上清过干酪包布，注入到250ml离心瓶中。
把异丙醇加到溶液顶部，离心瓶以4,200rpm旋转10min。沉淀重新悬浮在4.1ml溶液I中，加入4.5g氧化铯，0.3ml的10mg/ml溴化乙锭和0.1ml 1％Triton X100溶液。离心管在Beckman J2高速离心机中以10,000rpm旋转5min。上清转移到Beckman快速封闭超离心管中，然后封闭，用NVT90固定角转子在Beckman超离心机中，以80,000rpm旋转＞2.5小时。用1ml注射器和20号规格针头，在可见光下吸取离心带。等体积的dH2O加到吸取的材料中。DNA用1M氯化钠饱和的正丁醇抽提一次，然后加等体积的10M乙酸铵/1mM EDTA。以上材料注入到13ml快速管中，然后加无水乙醇至管的顶部，混匀，在Beckman J2离心机中以10,000rpm旋转10min。沉淀用70％乙醇清洗，重新悬浮在0.5～1ml的H2O中。在1∶200稀释率下测定在260nm的光密度，确定DNA浓度(1OD260＝50μg/ml)。
下列培养基和缓冲液用在这些操作程序中：M9细菌培养基(10gM9盐类，10g酪蛋白氨基酸(水解型)，10ml M9添加液，7.5μg/ml四环素(500μl的15mg/ml贮存液)，12.5μg/ml氨苄青霉素(125μl的10mg/ml贮存液)；M9添加液(10mM CaCl2，100mM MgSO4，200μg/ml硫胺素，70％甘油)；LB培养基(1.0％NaCl，0.5％酵母提取物，1.0％蛋白胨)；溶液I(10mM EDTA pH 8.0)；溶液II(0.2M NaOH，1.0％SDS)；溶液III(2.5M KOAc，2.5MHOAc)。
测序
合成基因通过Sanger双脱氧核苷酸法测序。简言之，20～50μg双链质粒DNA，在0.5M NaOH中变性5min。接着DNA用1/10体积的乙酸钠(pH 5.2)和2倍体积的乙醇沉淀，并离心5min。沉淀用70％乙醇清洗，重新以1μg/μl的浓度悬浮。用4μg模板DNA和40ng引物，在1×退火缓冲液，终体积10μl中进行退火反应。反应液加热到65℃，然后缓慢冷却至37℃。
在另一管中，对每个反应加1μl的0.1M DTT，2μl标记混合液，0.75μl的dH2O，1μl〔35S〕dATP(10μCi)和0.25μl测序酶TM(12U/μl)。5μl该混合液加到每个退火的引物模板管中。室温下温育5min。对每个标记反应，每个2.5μl 4个终止混合液中到Terasaki板上，37℃预温育。在温育期结束时，加3.5μl标记反应液到4个终止混合物的每一个中。5min后，4μl终止液被加到每个反应中，Terasaki板在炉上80℃温育10min。测序反应液在5％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。加200ml 10×TBE缓中液和957ml的dH2O到100g丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺(29∶1)中，制备丙烯酰胺溶液。通过混合38ml的丙烯酰胺溶液和28g尿素制备5％聚丙烯酰胺46％尿素1×TBE的凝胶。聚合反应通过加400μl 10％的过硫酸铵和60μl的TEMED启动。凝胶用硅烷化玻璃板和鲨齿梳灌注，在1×TBE缓冲液中，60～100W电泳2～4小时(根据读胶的区域)。凝胶被转移到Whatman印迹纸上，80℃干燥约1小时，室温对X-光片曝光。典型的曝光时间为12小时。下列溶液用于这些操作程序中：5×退火缓冲液(200mM TrisHCl，pH 7.5，100mM MgCl2，250mM NaCl)；标记混合液(dCTP、dGTP和dTTP每种7.5μM)；终止混合液(80μM每种dNTP，50mM NaCl，8μM ddNTP(每一种))；终止液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯青)；5×TBE(0.9M Tris硼酸盐，20mM EDTA)；聚丙烯酰胺溶液(96.7g丙烯酰胺，3.3g双丙烯酰胺，200μl 1×TBE，957ml dH2O)。
RNA分离
从转染后36小时的磷酸钙转染293T细胞中，和转染后16小时的牛痘病毒感染Hela细胞中，分离细胞质RNA，基本上按Gilmanrn所描述的方法进行(Gilman，从组织培养细胞中制备细胞质RNA，引自分子生物学的当代技术方案一书，Ausubel等编辑，Wiley &Sons，纽约，1992)。简单地说，细胞在400μl裂解缓冲液中裂解，旋转去细胞核，分别加SDS和蛋白酶K至0.2％和0.2mg/ml。细胞质抽提液在37℃温育20min，苯酚/氯仿抽提2次，然后沉淀，RNA溶解在100μl缓冲液I中，37℃温育20min。加25μl终止缓冲液终止反应，重新沉淀。
下列溶液用在本操作程序中：裂解缓冲液(TRUSTEE含50mMTris pH 8.0，100mM NaCl，5mM MgCl2，0.5％NP40)；缓冲液I(TRUSTEE缓冲液含10mM MgCl2，1mM DTT，0.5U/ml胎盘RNAse抑制剂，0.1U/μl无RNAse的DNAseI)；终止缓冲液(50mM EDTA，1.5M NaOAc，1.0％SDS)。
狭缝印迹分析
进行狭缝印迹分析，10μg细胞质RNA溶在50μl dH2O中，其中加有150μl 10×SSC/18％甲醛。然后，溶解的DNA在65℃温育15min，用狭缝印迹装置点样。放射性标记的1.5kb gp120 IIIb和syngp120mn片段的探针，用作杂交。2种片段的每一种在加有10μl5×寡核苷酸标记缓冲液，8μl 2.5mg/ml BSA，4μl〔32αP〕-dCTP(20μCi/μl，6000Ci/mmol)和5U Klenow片段50μl反应液中。随机标记在37℃温育1～3小时后，加100μl TRUSTEE，未掺入的〔32αP〕-dCTP用G50离心柱去除。在Beckman β-计数仪中测定活性，等量的比活性用于杂交。膜预杂交2小时，用每ml杂交液0.5×106cpm探针在42℃杂交12～24小时。膜用清洗缓冲液I，在室温下洗2次(5min)，在清洗缓中液II中65℃洗1小时，然后用X-光片曝光。用1.1 kb含3′非翻译区的pCDM7 Not 1/Sfi 1片段得到相似的结果。用随机标记的人β肌动蛋白探针平行进行对照杂交，通过用磁动力phosphorimager扫描硝酸纤维素膜，定量RNA表达。
下列溶液用在本操作程序中：5×寡核苷酸标记缓中液(250mMTris HCl pH 8.0，25mM MgCl2，5mM β-巯基乙醇，2mMdATP，2mM dGTP，mM dTTP，1M Hepes pH 6.6，1mg/ml六核苷酸〔dNTP〕6)；杂交溶液(.05M磷酸钠，250mM NaCl，7％SDS，1mM EDTA，5％葡聚糖硫酸酯，50％甲酰胺，100μg/ml变性鲑精DNA)；清洗缓冲液I(2×SSC，0.1％SDS)；清洗缓中液II(0.5×SSC，0.1％SDS)；20×SSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸三钠，pH调至7.0)。
痘苗病毒重组
痘苗病毒重组用Romeo和Seed所述方法(Romeo和Seed，细胞，64：1037，1991)略作修改。简言之，处70～90％汇合度的CV1细胞在无小牛血清的培养基中，用1～3μl野生型痘苗病毒原种WR(2×108pfu/ml)感染1小时。24小时后，用每皿含25μg TKG质粒DNA，通过磷酸钙转染细胞。另外24～48小时后，细胞从板上刮下，离心，重新悬浮在1ml的体积中。经3次冻/融循环，加胰蛋白酶至0.05mg/ml，裂解液温育20min。以10、1和0.1μl系列稀释的裂解液，用于感染小皿(6cm)中的CV1细胞，该细胞已用125μg/ml霉酚酸、0.25mg/ml花黄质和1.36mg/ml次黄嘌呤预处理6小时。感染的细胞培养2～3天，接着用抗gp120的单克隆抗体NEA9301和碱性磷酸酶偶联的第二抗体染色。细胞与在AP缓冲液中的0.33mg/ml NBT和0.16mg/ml BCIP温育，最后用在PBS中的1％琼脂糖覆盖。挑出阳性斑，重新悬浮在100μl Tris pH 9.0中。重复一次斑纯化。为产生高滴度的痘苗种，感染缓慢地按比例增加。最后，用前一轮病毒的一半感染一大平板Hela细胞。感染的细胞在3ml的PBS中分离，用Dounce匀浆器裂解，通过离心清除较大的碎块。VPE-8重组痘苗病毒原种由AIDS贮藏所Rockville，MD惠赠，该病毒在7.5混合型早期/晚期启动子下表达HIV-1 IIIB gp120(Earl，病毒学杂志，65：31，1991)。在所有用重组痘苗病毒的实验中，细胞被感染的感染倍数至少为10。
下列溶液用于本操作程序中：AP缓冲液(100mM Tris HCl，pH9.5，100mM NaCl，5mM MgCl2)。
细胞培养
猴肾癌细胞系CV1和Cos7，人肾癌细胞系293T和人子宫颈癌细胞系Hela从美国典型培养物保藏中心获得，在补充IMDM培养基中维持。它们培养在10cm组织培养板上，每3-4天，一般以1∶5～1∶20分离传代。下列培养基用在本操作程序中：补充的IMDM(90％Iscove’s修饰的Dulbecco培养基，10％补铁56℃热灭活30min的小牛血清，0.3mg/ml L-谷氨酰胺，25μg/ml庆大霉素，0.5mM β-巯基乙醇(pH用0.5ml 5M NaOH调整)。
转染
把在250μl0.25M CaCl2中的10μg质粒DNA旋涡振荡下缓慢地加到等体积的2×HEBS缓中液中，一边加一边旋涡振荡，进行磷酸钙转染293T细胞。在室温下温育10～30min后，DNA沉淀加到50～70％汇合率细胞的小皿中。在和rev共转染的实验中，细胞用10μggp120IIIb，gp120IIIbrre，syngp120mnrre或rTHY-1enveglrre和10μg pCMVrev或CDM7质粒DNA转染。
下列溶液用在本操作程序中：2×HEBS缓冲液(280mMNaCl，10mM KCl，1.5mM灭菌过滤)；0.25mM CaCl2(高压灭菌)。
免疫沉淀
48～60小时后，更换培养基，在含200μCi 35S反式标记物无Cys/Met的培养基中，再将细胞温育12小时。收集上清，3000rpm旋转15min，以去除碎片。分别加蛋白酶抑制剂亮抑蛋白酶肽、抑酶肽和PMSF至2.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml后，1ml上清单独和10μl包装的蛋白A琼脂糖(rTHY-lenveglrre)或蛋白A琼脂糖及3μg纯化的CD4/免疫球蛋白融合蛋白(由Behring惠赠(所有的gp120构建体))，在旋转仪上4℃温育12小时。接着清洗蛋白A珠5次，每次5～15min。最后一次清洗后，加10μl上样缓冲液，样品煮3min，上样到7％(所有gp120构建体)和10％(rTHY-lenreglrre)的SDS聚丙烯酰胺凝胶上(在分离凝胶中Tris pH 8.8的缓冲液，在堆积凝胶中TRIS pH 6.8的缓冲液，TRIS-甘氨酸电泳缓中液，Maniatis等，同上1989)。凝胶在10％乙酸和10％甲醇中固定，和Amplify温育20min，干燥并曝光12小时。
下列缓中液和溶液用在本操作程序：清洗缓冲液(100mM TrispH 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl2，1％NP-40)；5×电泳缓冲液(125mM Tris，1.25M甘氨酸，0.5％SDS)；上样缓冲液(10％甘油，4％SDS，4％β-巯基乙醇，0.02％溴酚蓝)。
免疫荧光
293T细胞通过磷酸钙共沉淀转染，3天后分析表面THY-1的表达。用1mM EDTA/PBS分离后，细胞用单克隆抗体OX-7，以1∶250稀释比4℃染色20min，用PBS清洗，然后和1∶500稀释比的FITC偶联山羊抗小鼠免疫球蛋白抗血清温育。细胞再次清洗，重新悬浮在0.5ml的固定液中，在EPICS XL细胞荧光测定仪(Coulter)上分析。
下列溶液用在本操作程序中：PBS(137mM NaCl，2.7mMKCl，4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，pH调至7.4)；固定液(在PBS中2％甲醛)。
ELISA
用CD4包被的ELISA板和在可溶相中山羊抗gp120的抗血清，测定在培养物上清中的gp120浓度。在4天后收集用磷酸钙转染的293T细胞的上清，3000rpm旋转10min以移去碎片，然后在板上4℃温育12小时。用PBS洗6次后，加以1∶200稀释的100μl山羊抗-gp120抗血清，温育2小时。板再次清洗，和1∶1000稀释过氧化酶偶联兔抗山羊IgG抗血清，温育2小时。接着板被清洗，用100μl在柠檬酸钠缓冲液中含2mg/ml邻苯二胺的底物溶液，温育30min。最后，反应用100μl4M的硫酸终止。用Coulter微量板读数仪在490nm处读板中数值。纯化的重组gp120 IIIb用作对照。下列缓中液和溶液用在本操作程序中：清洗缓冲液(在PBS中0.1％NP40)；底物溶液(在柠檬酸钠缓冲液中2mg/ml邻苯二胺)。
实施例2
合成的绿色荧光蛋白基因
对gp120密码子置换的效能表明，用较不优选的密码子或优选的密码子置换非优选密码子(和用优选密码子取代较不优选密码子)，会增加其它蛋白，如其它真核蛋白在哺乳动物细胞中表达。
最近，维多利亚多管水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)(Ward光化学和光生物学4：1，1979；Prasher等，基因111：229，1992；Cody等，生物化学32：1212，1993)已引起注意，因为其可能作为转染和谱系研究的标记分子或报道分子(Chatfie等，科学263：802，1994)。
检查构建自GFP天然编码序列的密码子使用表显示，GFP密码子在第三位偏爱使用A或U。在这种情况下喜用A的偏倚，比gp120的偏倚较小，但基本上为该偏倚。创造一个合成基因，其中用对gp120十分相同的方式，对天然GFP序列重新工程改造(图11，SEQ ID NO：40)。此外，用与翻译起动共有序列相应的序列取代GFP的翻译起动序列。产生的蛋白的表达与野生型序列的表达相比较，相似地是工程改造以含有最优化的翻译起始共有序列(图10B和图10C)。另外，检查了包括突变Ser65→Thr的效果(图10D)，据报道，该突变改善在GFP在490nm的激发效率，因而优选于荧光显微镜观察(Heim等，自然373：663，1995)。密码子工程改造赋予表达效率明显增加(明显地与转染阳性细胞伴随的百分率)，Ser65→Thr突变和密码子优化的结合，产生了编码高度可见的哺乳动物标记蛋白的DNA片段(图10D)。
以如对gp120相似的方式，从大约每个120bp的6个片段中组装上述合成的绿色荧光蛋白编码序列，所用的组装策略是依据限制性酶BsaI和BbsI具有切割它们识别序列的外面的能力。合成的长寡核苷酸，含有GFP编码序列的部分，包埋在一端编码EcoRI和BsaI，在另一端编码BamHI和BbsI的侧翼序列。因此，每个寡核苷酸有EcoRI/BsaI/GFP片段/BbsI/BamHI的构型。设计由BsaI和BbsI位点产生的限制性位点末端，以产生匹配末端，可用于连接邻近的GFP片段。设计每个匹配末端为单一的，非自身互补性。粗制的合成DNA片段通过PCR扩增，插入在pUC9的EcoRI和BamHI之间，然后测序。接着，用BsaI和BbsI制备的插入片段，在6个片段连接反应中组装完整的编码序列。来自连接反应的6个质粒的2个含有正确大小的插入片段，和一个含有所需的全长序列。使用在合成的GFP中有重叠的单一BssSI位点的引物根据突变通过标准PCR完成Ser65→Thr的突变。
密码子优化作为一种改善哺乳动物细胞表达策略
在此展示的数据表明：编码序列的重新工程改造，对改善哺乳动物和非哺乳动物真核基因在哺乳动物细胞中的表达，可能具有普遍的适用性。在此用三种不相关的蛋白：HIVgp120，大鼠细胞表面抗原Thy-1和来自维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白和人因子VIII(见下面)所获得的结果表明，对改善大量各种真核基因在哺乳动物细胞中表达来说，密码子优化可以证明为一种富有成果的策略。
实例施3
表达缺乏中心B结构域的人因子VIII的密码子优化基因的设计
设计了一合成基因，该基因编码缺乏包括氨基酸残基760～1639，(前体中包括残基779～1658)成熟人因子VIII。通过选择与由高表达人基因偏爱使用的那些密码子相对应的密码子，产生合成基因。制造一些来自严格遵守喜用残基类型的衍生物，可允许导入单一的限制性酶切割位点到整个基因中，以便于将来的操作。为制备合成基因，那么序列分为150个残基对的28个片段和161个碱基对的第29个片段。
按下列方法构建表达缺乏中心B结构域的人因子VIII的合成基因，合对29对寡核苷酸模板(见下面)。5′模板寡核苷酸长为105个碱基，3′寡核苷酸长为104个碱基(除了最后的3′寡核苷酸，长为125个残基)。设计模板寡核苷酸，以使含有一个5′寡核苷酸和一个3′寡核苷酸的每个退火配对，产生19个碱基对的双链区。
为便于PCR和随后的操作，寡核苷酸对的5′端设计为起始的18个残基是固定不变的，这样可用普通的PCR引物对用于扩增，使相同的PCR条件用于所有寡核苷酸对。每个模板对5′成员的起始18个残基为cgc gaa ttc gga aga ccc(SEQ ID NO：110)，每个模板对的3′成员的起始18个残在为：ggg gat cct cac gtc tca(SEQ ID NO：43)。
通过PCR，按下列方法在反应混合物中进行寡核苷酸对退火，然后延伸和扩增：在PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，1.5mMMgCl2，50mM KCl，100μg/ml明胶，pH 8.3)中，模板以每种200μg/ml退火。PCR反应含2ng退火的模板寡核苷酸，0.5μg 2个18-mer引物的每一种(如下描述)，200μM每种脱氧核苷三磷酸，10％体积的DMSO，由Boehringer Mannheim生物化学公司提供的PCR缓冲液，反应的最终体积为50μl。加Taq聚合酶(2.5单位，0.5μl；Boehringer Mannheim生物化学公司)后，在Perkin-Elmer热循环仪上进行扩增反应，共25个循环(94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec)。最后一次循环后接着72℃延伸反应10分钟。
扩增的片段用EcoRI和BamHI消化(分别切割片段的5′和3′端)，连接到用EcoRI和BamHI切割的pUC9衍生体上。
各个克隆被测序，鉴别出与全长所需序列相符合的一群质粒。然后，利用紧邻着扩增序列的PCR引物3′端的限制性位点，利用多片段连接反应组装克隆。5′PCR引物含有BbsI位点和3′PCR引物含有BsmBI位点，其被定位，结果由各个酶的切割反应在扩增部分的第一个核苷酸前进行，并留下由扩增部分的起始4个碱基产生的4碱基5′突出端。用BbsI和BsmBI同时消化释放扩增部分，该部分在每个末端具有单一的4碱基5′突出端，不含有引物序列。一般来说这些突出端不是自身互补的，可允许多片段连接反应，以高效率地产生所需的产物。因此，起始28个扩增的寡核苷酸对单一部分为154个碱基对，消化后，每个产生具有单一末端的150bp片段。然而，第一和最后片段不用这种方法操作，因为它们有其它的限制性位点，在片段中设计这些位点便于组装的序列插入到合适的哺乳动物表达载体中。实际组装过程按下列方法进行。
合成因子VIII基因的组装
步骤1：29个片段组装以形成10个片段
下面描述当碱基配对时形成片段1～29的29对寡核苷酸。
携带区段1、5、9、12、16、20、24和27的质粒用EcoRI和BsmBI消化，分离出170bp片段；含有区段2、3、6、7、10、13、17、18、21、25和28的质粒用BbsI和BsmBI消化，分离出170bp片段；含有区段4、8、11、14、19、22、26和29的质粒用EcoRI和BbsI消化，分离出2440bp的载体片段。然后，含有区段1、2、3、4的片段连接产生区段“A”；含有区段5、6、7和8的片段连接产生区段“B”；含有区段9、10和11的片段连接产生区段“C”；含有区段12、13和14的片段连接产生区段“D”；含有区段16、17、18和19的片段连接产生区段“F”；含有区段20、21和22的片段连接产生区段“G”；含有24、25和26的片段连接产生区段“I”；以及含有27、28和29的片段连接产生区段“J”。
步骤2：把来自步骤1的10个产生片段组装成3个片段
含有区段“A”、“D”和“G”的质粒用EcoRI和BsmBI消化，以及携带有区段C、F和J的质粒用EcoRI和BbsI消化。含有区段A、B和C的片段连接产生区段“K”；含有区段D、15和F的片段连接产生区段“O”；含有区段G、23、I和J的片段连接产生区段“P”。
步骤3：最后3个片段的组装
含有区段K的质粒用EcoRI和BsmBI消化，含有区段O的质粒用BbsI和BsmBI消化，含有区段P的质粒用EcoRI和BbsI消化。产生的3个片段连接产生区段。
步骤4：合成基因插入到哺乳动物表达载体中
含有区段S的质粒用Nhe I和Not I消化，插入在质粒CD51NEg1的Nhe I和Eag I位点之间，而产生质粒cd51sf86-。
合成的因子VIII基因的测序和校正
合成基因组装后，发现在序列中有2个不想要的残基编码。一个是在749位的Arg残基，它在来源于Genentech的GenBark序列登记中存在，但在文献中由Genentech报道的序列中不存在。另一个是在146位的Ala残基，应该为Pro。该突变出现在29个组成片段的测序后的未确认步骤，出现该突变。Pro749Arg突变通过下列方法校正，即在PCR引物(ctg ctt ctg acg cgt gct ggg gtg gcg gga gtt；SEQ ID NO：44)掺入所需的变化，该引物包括以下序列(Hind III至Nor I区段的序列)2235位的Mln I。然后在该引物和另一引物(ctg ctg aaa gtc tcc ac tgc；SEQ ID NO：44)5′至2225位的SgrAI位点之间扩增。然后SgrAI至Mlu I片段在该载体的同种位点之间插入到表达载体中，产生的校正序列变化通过测序证实。pro146Ala突变由下列方法校正，该方法包括在残基504位含有Af III位点的寡核苷酸(ggc agg tgc tta agg aga acggcc ata tgg cca；SEQ ID NO：46)掺入所需的序列变化，在该寡核苷酸和具有序列cgt tgt tct tca tac gcg tct ggg gct cct cgg ggc(SEQ IDNO：109)的引物之间扩增来自PCR反应的片段，用在(残基989)位的Af III和Avr II切下产生的PCR片段，把校正过的片段插入到表达载体中，并通过测序证实构建体。
表达缺乏中心B结构域的人因子VIII的匹配的天然基因的构建
具有天然密码子序列，缺失B结构域的配合性因子VIII表达质粒，通过下列方法构建。该方法包括用引物cgc caa ggg cta gcc gcc acc agaaga tac tac ctg ggt(SEQ ID NO：47)，在成熟编码序列的5′端引入Nhe I，在该引物和引物att cgt agt tgg ggt tcc tct gga cag(相当于下列所示的序列1067～1093位残基)之间扩增，用Nhe I和Af III(见下面所示的序列中345位残基)切割，然后把产生的片段插入到含有天然因子VIII的合适切割的质粒中。用ctg tat ttg atg aga acc g，(相当于以下1813～1831位残基)和caa gac tgg tgg ggt ggc att aaa ttg ctt t(SEQID NO：48)(见下面与2342～2372互补)作为重叠的5′末端，以及aat gcc acc cca cca gtc ttg aaa cgc ca(SEQ  ID  NO：49)(见下面的序列2352～2380)和cat ctg gat att gca ggg ag(SEQ ID NO：50)3145～3164通过重叠PCR产生B结构域缺失。然后2个单独的PCR反应产物混合，使用最外面的引物重新扩增，通过Asp718(Kpn I同切点酶，见下面序列1837位)和Pfl MI(见下面序列3100位)切割产生的片段，并插入到含有天然因子VIII合适切割的表达质粒中。
缺乏中心B区的天然人因子VIII基因的完全序列(SEQ ID NO：41)在图12展示。缺失中心B区的合成因子VIII基因的完全序列(SEQID NO：42)在图13展示。
表达质粒的制备和测定
2个独立的天然质粒分离体和4个独立的合成因子VIII表达质粒的分离体，分别在细菌中增殖，并通过CsCl浮力密度离心，然后苯酚抽提的方法制备它们的DNA。对用质粒转染的COS细胞的上清分析显示，合成基因产生的因子VIII的量，大约为天然基因的4倍。
然后，用DEAE-葡聚糖法，COS细胞以每6cm皿5μg每处因子VIII构建体转染。转染后72小时，4ml含10％小牛血清的新鲜培养液加至每板中。12hr后从每板取出培养液样品。用小鼠抗人因子VIII轻锭的单克隆抗体和过氧化酶偶联的山羊抗人因子VIII多克隆抗体通过ELISA测定样品。纯化的人血浆因子VIII用作标准。用合成因子VIII基因构建体转染的细胞表达因子VIII为138±20.2ng/ml(等于ng/ml的非缺失因子VIII)(n＝4)，而用天然因子VIII基因转染的细胞表达因子VIII为33.5±0.7ng/ml(等于ng/ml的非缺失因子VIII)(n＝2)。
下列模板寡核苷酸用作合成因子VIII基因的构建。
用于(gcta)的r1 bbs 1
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ctt cga cga gac taa gag ctg gta ctt cac
cga gaa cat gga gcg caa ctg ccg cgc ccc
ctg caa cat cca gat(SEQ ID NO：91)
ggg gat cct cac gtc tca cag ggt gtc cat    21bam
gat gta gcc gtt gat ggc gtg gaa gcg gta
gtt ctc ctt gaa ggt ggg atc ttc cat ctg
gat gtt gca ggg gg(SEQ ID NO：92)
用于(cctg)的rl bbs 22
cgc gaa ttc gga aga ccc cct gcc cgg cct    22rl
ggt gat ggc cca gga cca gcg cat ccg ctg
gta cct gct gtc tat ggg cag caa cga gaa
cat cca cag cat cca(SEQ ID NO：93)
ggg gat cct cac gtc tca gta cag gtt gta    22bam
cag ggc cat ctt gta ctc ctc ctt ctt gcg
cac ggt gaa aac gtg gcc gct gaa gtg gat
gct gtg gat gtt ct(SEQ ID NO：94)
用于(gtac)的rl bbs 23
cgc gaa ttc gga aga ccc gta ccc cgg cgt    23rl
gtt cga gac tgt gga gat gct gcc cag caa
ggc cgg gat ctg gcg cgt gga gtg cct gat
cgg cga gca cct gca(SEQ ID NO：95)
ggg gat cct cac gtc tca gct ggc cat gcc    23bam
cag ggg ggt ctg gca ctt gtt gct gta cac
cag gaa cag ggt gct catgcc ggc gtg cag
gtg ctc gcc gat ca(SEQ ID NO：96)
用于(cagc)的rl bbs 24
cgc gaa ttc gga aga ccc cag cgg cca cat    24rl
ccg cga ctt cca gat cac cgc cag cgg cca
gta cgg cca gtg ggc tcc caa gct ggc ccg
cct gca cta cag cgg(SEQ ID NO：97)
ggg gat cct cac gtc tca cat ggg ggc cag    24bam
cag gtc cac ctt gat cca gga gaa ggg ctc
ctt ggt cga cca ggc gtt gat gct gcc gct
gta gtg cag gcg gg(SEQ ID NO：98)
用于(catg)的rl bbs 25
cgc gaa ttc gga aga ccc cat gat cat cca    25rl
cgg cat caa gac cca ggg cgc ccg cca gaa
gtt cag cag cct gta cat cag cca gtt cat
cat cat gta ctc tct(SEQ ID NO：99)
ggg gat cct cac gtc tca gct gcc gaa gaa    25bam
cac cat cag ggt gcc ggt gct gtt gcc gcg
gta ggt ctg cca ctt ctt gcc gtc tag aga
gta cat gat gat ga(SEQ ID NO：100)
用于(caac)的rl bbs 26
cgc gaa ttc gga aga ccc caa cgt gga cag    26rl
cag cgg cat caa gca caa cat ctt caa ccc
ccc cat cat cgc ccg cta cat ccg cct gca
ccc cac cca cta cag(SEQ ID NO：101)
ggg gat cct cac gtc tca gcc cag ggg cat     26bam
gct gca gct gtt cag gtc gca gcc cat cag
ctc cat gcg cag ggt gct gcg gat gct gta
gtg ggt ggg gtg ca(SEQ ID NO：102)
用于(gggc)的rl bbs 27
cgc gaa ttc gga aga ccc ggg cat gga gag    27rl
caa ggc cat cag cga cgc cca gat cac cgc
ctc cag cta ctt cac caa cat gtt cgc cac
ctg gag ccc cag caa(SEQ ID NO：103)
ggg gat cct cac gtc tca cca ctc ctt ggg    27bam
gtt gtt cac ctg ggg gcg cca ggc gtt gct
gcg gcc ctg cag gtg cag gcg ggc ctt gct
ggg gct cca ggt gg(SEQ ID NO：104)
用于(gtgg)的rl bbs 28
cgc gaa ttc gga aga ccc gtg gct gca ggt    28rl
gga ctt cca gaa aac cat gaa ggt gac tgg
cgt gac cac cca ggg cgt caa gag cct gct
gac cag cat gta cgt(SEQ ID NO：105)
ggg gat cct cac gtc tca ctt gcc gtt ttg    28bam
gaa gaa cag ggt cca ctg gtg gcc gtc ctg
gct gct gct gat cag gaa ctc ctt cac gta
cat gct ggt cag ca(SEQ ID NO：106)
用于(caag)的rl bbs 29
cgc gaa ttc gga aga ccc caa ggt gaa ggt    29rl
gtt cca ggg caa cca gga cag ctt cac acc
ggt cgt gaa cag cct gga ccc ccc cct gct
gac ccg cta cct gcg(SEQ ID NO：107)
ggg gat cct cac gtc tca gcg gcc gct tca    29bam
gta cag gtc ctg ggc ctc gca gcc cag cac
ctc cat gcg cag ggc gat ctg gtg cac cca
gct ctg ggg gtg gat gcg cag gta gcg ggt
cag ca(SEQ ID NO：108)
上面所述的天然和合成基因的密码子使用分别在表3和表4展示。
表3：缺失B结构域的合成因子VIII基因的密码子频率表
AA 密码子   数值   /1000  比率
GlyGlyGlyGly GGGGGAGGTGGC   7.001.000.0074.00   4.820.690.0050.93  0.090.010.000.90
GluGluAspAsp GAGGAAGATGAC   81.003.004.0078.00   55.752.062.7553.68  0.960.040.050.95
ValValValVal GTGGTAGTTGTC   77.002.002.007.00   52.991.381.384.82  0.880.020.020.08
AlaAlaAlaAla GCGGCAGCTGCC   0.000.003.0067.00   0.000.002.0646.11  0.000.000.040.96
ArgArgSerSer AGGAGAAGTAGC   2.000.000.0097.00   1.380.000.0066.76  0.030.000.000.81
LysLysAsnAsn AAGAAAAATAAC   75.005.000.0063.00   51.623.440.0043.36  0.940.060.001.00
 MetIleIleIle  ATGATAATTATC   43.000.002.0072.00   29.590.001.3849.55  1.000.000.030.97
 ThrThrThrThr  ACGACAACTACC   2.001.0010.0070.00   1.380.696.8848.18  0.020.010.120.84
 TrpEndCysCys  TGGTGATGTTGC   28.001.001.0018.00   19.270.690.6912.39  1.001.000.050.95
 EndEndTyrTyr  TAGTAATATTAC   0.000.002.0066.00   0.000.001.3845.42  0.000.000.030.97
 LeuLeuPhePhe  TTGTTATTTTTC   0.000.001.0076.00   0.000.000.6952.31  0.000.000.010.99
 SerSerSerSer  TCGTCATCTTCC   1.000.003.0019.00   0.690.002.0613.08  0.010.000.030.16
 ArgArgArgArg  CGGCGACGTCGC   1.000.001.0069.00   0.690.000.6947.49  0.010.000.010.95
 GlnGlnHisHis  CAGCAACATCAC   62.005.001.0050.00   42.673.440.6934.41  0.930.070.020.98
  LeuLeuLeuLeu   CTGCTACTTCTC   118.003.001.003.00     81.212.060.692.06   0.940.020.010.02
  ProProProPro   CCGCCACCTCCC   4.000.003.0068.00     2.750.002.0646.80   0.050.000.040.91
表4：缺失B结构域的天然因子VIII基因的密码子频率表
  AA   密码子     数值   /1000   比率
  GlyGlyGlyGly   GGGGGAGGTGGC     12.0034.0016.0020.00   8.2623.4011.0113.76   0.150.410.200.24
  GluGluAspAsp   GAGGAAGATGAC     33.0051.0055.0027.00   22.7135.1037.8518.58   0.390.610.670.33
  ValValValVal   GTGGTAGTTGTC     29.0019.0017.0023.00   19.9613.0811.7015.83   0.330.220.190.26
  AlaAlaAlaAla   GCGGCAGCTGCC     2.0018.0031.0020.00   1.3812.3921.3413.76   0.030.250.440.28
 ArgArgSerSer  AGGAGAAGTAGC     18.0022.0022.0024.00   12.3915.1415.1416.52   0.250.300.180.20
 LysLysAsnAsn  AAGAAAAATAAC     32.0048.0038.0025.00   22.0233.0426.1517.21   0.400.600.600.40
 MetIleIleIle  ATGATAATTATC     43.0013.0036.0025.00   29.598.9524.7817.21   1.000.180.490.34
 ThrThrThrThr  ACGACAACTACC     1.0023.0036.0023.00   0.6915.8324.7815.83   0.010.280.430.28
 TrpEndCysCys  TGGTGATGTTGC     28.001.007.0012.00   19.270.694.828.26   1.001.000.370.63
 EndEndTyrTyr  TAGTAATATTAC     0.000.0041.0027.00   0.000.0028.2218.58   0.000.000.600.40
 LeuLeuPhePhe  TTGTTATTTTTC     20.0010.0045.0032.00   13.766.8830.9722.02   0.160.080.580.42
 SerSerSerSer  TCGTCATCTTCC     2.0027.0027.0018.00   1.3818.5818.5812.39   0.020.220.220.15
  ArgArgArgArg  CGGCGACGTCGC  6.0010.007.0010.00   4.136.884.826.88  0.080.140.100.14
  GlnGlnHisHis  CAGCAACATCAC  42.0025.0028.0023.00   28.9117.2119.2715.83  0.630.370.550.45
  LeuLeuLeuLeu  CTGCTACTTCTC  36.0015.0024.0020.00   24.7810.3216.5213.76  0.290.120.190.16
  ProProProPro  CCGCCACCTCCC  1.0032.0026.0015.00   0.6922.0217.8910.32  0.010.430.350.20
应用
本发明的合成基因用于表示在细胞培养中在哺乳动物细胞中正常表达的蛋白(如人蛋白的商业生产如hGH、TPA、因子VIII和因子IX)。本发明的合成基因也用于基因治疗。例如，编码所选择蛋白的合成基因，能导入到能表达该蛋白的细胞中，以产生能给需要该蛋白的病人施用的细胞。上述基于细胞的基因治疗技术，在本领域熟练的技术人员中众所周知，如见Anderson等，美国专利号No.5,399,349；Mulligan和Wilson，美国专利号No.5,460,959。
序列表
(1)一般信息
(i)申请人：综合医院公司
(ii)发明名称：蛋白的高水平表达
(iii)序列数目：110
(iv)联系地址：
(A)ADDRESSEE：Clark & Elbing LLP
(B)STREET：176 Federal Street
(C)CITY：Boston
(D)STATE：MA
(E)COUNTRY：USA
(F)ZIP：02110
(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：磁盘
(B)计算机：IBM Compatible
(C)操作系统：DOS
(D)软件：FastSEQ for Windows Version 2.0
(vi)本申请信息：
(A)申请号：PCT/US97/16639
(B)提交日：18-SEP-1997
(C)分类：
(vii)优先权信息：
(A)申请号：08/717,294
(B)提交日：20-SEP-1996
(viii)代理人/代理公司信息：
(A)名称：Elbing，Karen L
(B)登记号：35，238
(C)参考/摘要号：00786/345WO1
(ix)通讯信息：
(A)电话：617-428-0200
(B)传真：617-428-7045
(2)SEQ ID NO：1：信息
(i)序列特征：
(A)长度：24碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
CGCGGGCTAG CCACCGAGAA GCTG                                             24
(2)序列信息SEQ ID NO：2：
(i)序列特征：
(A)长度：195碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
ACCGAGAAGC TGTGGGTGAC CGTGTACTAC GGCGTGCCCG TGTGGAAGAG AGGCCACCAC     60
CACCCTGTTC TGCGCCAGCG ACGCCAAGGC GTACGACACC GAGGTGCACA ACGTGTGGGC     120
CACCCAGGCG TGCGTGCCCA CCGACCCCAA CCCCCAGGAG GTGGAGCTCG TGAACGTGAC     180
CGAGAACTTC AACAT                                                      195
(2)序列信息SEQ ID NO：3：
(i)序列特征：
(A)长度：34碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
CCACCATGTT GTTCTTCCAC ATGTTGAAGT TCTC                                 34
(2)序列信息SEQ ID NO：4：
(i)序列特征：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
GACCGAGAAC TTCAACATGT GGAAGAACAA CAT                                 33
(2)序列信息SEQ ID NO：5：
(i)序列特征：
(A)长度：192碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
TGGAAGAACA ACATGGTGGA GCAGATGCAT GAGGACATCA TCAGCCTGTG GGACCAGAGC    60
CTGAAGCCCT GCGTGAAGCT GACCCCCTGT GCGTGACCTG AACTGCACCG ACCTGAGGAA    120
CACCACCAAC ACCAACACAG CACCGCCAAC AACAACAGCA ACAGCGAGGG CACCATCAAG    180
GGCGGCGAGA TG                                                        192
(2)序列信息SEQ ID NO：6：
(i)序列特征：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
GTTGAAGCTG CAGTTCTTCA TCTCGCCGCC CTT                                 33
(2)序列信息SEQ ID NO：7：
(i)序列特征：
(A)长度：31碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
GAAGAACTGC AGCTTCAACA TCACCACCAG C                                     31
(2)序列信息SEQ ID NO：8：
(i)序列特征：
(A)长度：195碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
AACATCACCA CCAGCATCCG CGACAAGATG CAGAAGGAGT ACGCCCTGCT GTACAAGCTG      60
GATATCGTGA GCATCGACAA CGACAGCACC AGCTACCGCC TGATCTCCTG CAACACCAGC      120
GTGATCACCC AGGCCTGCCC CAAGATCAGC TTCGAGCCCA TCCCCATCCA CTACTGCGCC      180
CCCGCCGGCT TCGCC                                                       195
(2)序列信息SEQ ID NO：9：
(i)序列特征：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
GAACTTCTTG TCGGCGGCGA AGCCGGCGGG                                       30
(2)序列信息SEQ ID NO：10：
(i)序列特征：
(A)长度：47碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
GCGCCCCCGC CGGCTTCGCC ATCCTGAAGT GCAACGACAA GAAGTTC                   47
(2)序列信息SEQ ID NO：11：
(i)序列特征：
(A)长度：198碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
GCCGACAAGA AGTTCAGCGG CAAGGGCAGC TGCAAGAACG TGAGCACCGT GCAGTGCACC    60
CACGGCATCC GGCCGGTGGT GAGCACCCAG CTCCTGCTGA ACGGCAGCCT GGCCGAGGAG    120
GAGGTGGTGA TCCGCAGCGA GAACTTCACC GACAACGCCA AGACCATCAT CGTGCACCTG    180
AATGAGAGCG TGCAGATC                                                  198
(2)序列信息SEQ ID NO：12：
(i)序列特征：
(A)长度：34碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
AGTTGGGACG CGTGCAGTTG ATCTGCACGC TCTC                               34
(2)序列信息SEQ ID NO：13：
(i)序列特征：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
GAGAGCGTGC AGATCAACTG CACGCGTCCC                                     30
(2)序列信息SEQ ID NO：14：
(i)序列特征：
(A)长度：120碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
AACTGCACGC GTCCCAACTA CAACAAGCGC AAGCGCATCC ACATCGGCCC CGGGCGCGCC    60
TTCTACACCA CCAAGAACAT CATCGGCACC ATCCTCCAGG CCCACTGCAA CATCTCTAGA    120
(2)序列信息SEQ ID NO：15：
(i)序列特征：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
GTCGTTCCAC TTGGCTCTAG AGATGTTGCA                                     30
(2)序列信息SEQ ID NO：16：
(i)序列特征：
(A)长度：29碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
GCAACATCTC TAGAGCCAAG TGGAACGAC                                       29
(2)序列信息SEQ ID NO：17：
(i)序列特征：
(A)长度：131碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
GCCAAGTGGA ACGACACCCT GCGCCAGATC GTGAGCAAGC TGAAGGAGCA GTTCAAGAAC    60
AAGACCATCG TGTTCACCAG AGCAGCGGCG GCGACCCCGA GATCGTGATG CACAGCTTCA    120
ACTGCGGCGG C                                                         131
(2)序列信息SEQ ID NO：18：
(i)序列特征：
(A)长度：29碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
GCAGTAGAAG AATTCGCCGC CGCAGTTGA                                      29
(2)序列信息SEQ ID NO：19：
(i)序列特征：
(A)长度：29碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
TCAACTGCGG CGGCGAATTC TTCTACTGC                                       29
(2)序列信息SEQ ID NO：20：
(i)序列特征：
(A)长度：195碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
GGCGAATTCT TCTACTGCAA CACCAGCCCC CTGTTCAACA GCACCTGGAA CGGCAACAAC    60
ACCTGGAACA ACACCACCGG CAGCAACAAC AATATTACCC TCCAGTGCAA GATCAAGCAG    120
ATCATCAACA TGTGGCAGGA GGTGGGCAAG GCCATGTACG CCCCCCCCAT CGAGGGCCAG    180
ATCCGGTGCA GCAGC                                                     195
(2)序列信息SEQ ID NO：21：
(i)序列特征：
(A)长度：40碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
GCAGACCGGT GATGTTGCTG CTGCACCGGA TCTGGCCCTC                          40
(2)序列信息SEQ ID NO：22：
(i)序列特征：
(A)长度：40碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
CGAGGGCCAG ATCCGGTGCA GCAGCAACAT CACCGGTCTG                           40
(2)序列信息SEQ ID NO：23：
(i)序列特征：
(A)长度：198碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
AACATCACCG GTCTGCTGCT GACCCGCGAC GGCGGCAAGG ACACCGACAC CAACGACACC    60
GAAATCTTCC GCCCCGGCGG CGGCGACATG CGCGACAACT GGAGATCTGA GCTGTACAAG    120
TACAAGGTGG TGACGATCGA GCCCCTGGGC GTGGCCCCCA CCAAGGCCAA GCGCCGCGTG    180
GTGCAGCGCG AGAAGCGC                                                  198
(2)序列信息SEQ ID NO：24：
(i)序列特征：
(A)长度：38碱基对
(B)类型：核酸
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CGCGGGCGGC CGCTTTAGCG CTTCTCGCGC TGCACCAC                          38
(2)序列信息SEQ ID NO：25：
(i)序列特征：
(A)长度：39碱基对
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CGCGGGGGAT CCAAGCTTAC CATGATTCCA GTAATAAGT                          39
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(i)序列特征：
(A)长度：165碱基对
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ATGAATCCAG TAATAAGTAT AACATTATTA TTAAGTGTAT TACAAATGAG TAGAGGACAA  60
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GAAAATAATA CAAATTTGCC AATACAACAT GAATTTTCAT TAACG                  165
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(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
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CGTGAAAAAA AAAAACATGT ATTAAGTGGA ACATTAGGAG TACCAGAACA TACATATAGA    60
AGTAGAGTAA ATTTGTTTAG TGATAGATTC ATAAAAGTAT TAACATTAGC AAATTTTACA    120
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(i)序列特征：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
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CGCGAATTCG AGCTCACACA TATAATCTCC                                      30
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(A)长度：30碱基对
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CGCGGATCCG AGCTCAGAGT AAGTGGACAA                                      30
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CTCAGAGTAA GTGGACAAAA TCCAACAAGT AGTAATAAAA CAATAAATGT AATAAGAGAT    60
AAATTAGTAA AATGTGAGGA ATAAGTTTAT TAGTACAAAA TACAAGTTGG TTATTATTAT    120
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(2)序列信息SEQ ID NO：33：
(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
(B)类型：核酸
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CGCGAATTCG CGGCCGCTTC ATAAACTTAT AAAATC                            36
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(i)序列特征：
(A)长度：1632碱基对
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(ii)MOLECULE类型：cDNA
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CTCGAGATCC ATTGTGCTCT AAAGGAGATA CCCGGCCAGA CACCCTCACC TGCGGTGCCC  60
AGCTGCCCAG GCTGAGGCAA GAGAAGGCCA GAAACCATGC CCATGGGGTC TCTGCAACCG  120
CTGGCCACCT TGTACCTGCT GGGGATGCTG GTCGCTTCCG TGCTAGCCAC CGAGAAGCTG  180
TGGGTGACCG TGTACTACGG CGTGCCCGTG TGGAAGGAGG CCACCACCAC CCTGTTCTGC  240
GCCAGCGACG CCAAGGCGTA CGACACCGAG GTGCACAACG TGTGGGCCAC CCAGGCGTGC  300
GTGCCCACCG ACCCCAACCC CCAGGAGGTG GAGCTCGTGA ACGTGACCGA GAACTTCAAC  360
ATGTGGAAGA ACAACATGGT GGAGCAGATG CATGAGGACA TCATCAGCCT GTGGGACCAG  420
AGCCTGAAGC CCTGCGTGAA GCTGACCCCC CTGTGCGTGA CCCTGAACTG CACCGACCTG  480
AGGAACACCA CCAACACCAA CAACAGCACC GCCAACAACA ACAGCAACAG CGAGGGCACC  540
ATCAAGGGCG GCGAGATGAA CAACTGCAGC TTCAACATCA CCACCAGCAT CCGCGACAAG  600
ATGCAGAAGG AGTACGCCCT GCTGTACAAG CTGGATATCG TGAGCATCGA CAACGACAGC  660
ACCAGCTACC GCCTGATCTC CTGCAACACC AGCGTGATCA CCCAGGCCTG GCCCAAGATC  720
AGCTTCGAGC CCATCCCCAT CCACTACTGC GCCCCCGCCG GCTTCGCCAT CCTGAAGTGC  780
AACGACAAGA AGTTCAGCGG CAAGGGCAGC TGCAAGAACG TGAGCACCGT GCAGTGCACC  840
CACGGCATCC GGCCGGTGGT GAGCACCCAG CTCCTGCTGA ACGGCAGCCT GGCCGAGGAG  900
GAGGTGGTGA TCCGCAGCGA GAACTTCACC GACAACGCCA AGACCATCAT CGTGCACCTG  960
AATGAGAGCG TGCAGATCAA CTGCACGCGT CCCAACTACA ACAAGCGCAA GCGCATCCAC  1020
ATCGGCCCCG GGCGCGCCTT CTACACCACC AAGAACATCA TCGGCACCAT CCGCCAGGCC  1080
CACTGCAACA TCTCTAGAGC CAAGTGGAAC GACACCCTGC GCCAGATCGT GAGCAAGCTG  1140
AAGGAGCAGT TCAAGAACAA GACCATCGTG TTCAACCAGA GCAGCGGCGG CGACCCCGAG  1200
ATCGTGATGC ACAGCTTCAA CTGCGGCGGC GAATTCTTCT ACTGCAACAC CAGCCCCCTG  1260
TTCAACAGCA CCTGGAACGG CAACAACACC TGGAACAACA CCACCGGCAG CAACAACAAT  1320
ATTACCCTCC AGTGCAAGAT CAAGCAGATC ATCAACATGT GGCAGGAGGT GGGCAAGGCC  1380
ATGTACGCCC CCCCCATCGA GGGCCAGATC CGGTGCAGCA GCAACATCAC CGGTCTGCTG  1440
CTGACCCGCG ACGGCGGCAA GGACACCGAC ACCAACGACA CCGAAATCTT CCGCCCCGGC  1500
GGCGGCGACA TGCGCGACAA CTGGAGATCT GAGCTGTACA AGTACAAGGT GGTGACGATC  1560
GAGCCCCTGG GCGTGGCCCC CACCAAGGCC AAGCGCCGCG TGGTGCAGCG CGAGAAGCGC  1620
TAAAGCGGCC GC                                                      1632
(2)序列信息SEQ ID NO：35：
(i)序列特征：
(A)长度：2481碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：双链
(D)拓扑类型：线性
(ii)MOLECULE类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：
ACCGAGAAGC TGTGGGTGAC CGTGTACTAC GGCGTGCCCG TGTGGAAGGA GGCCACCACC  60
ACCCTGTTCT GCGCCAGCGA CGCCAAGGCG TACGACACCG AGGTGCACAA CGTGTGGGCC  120
ACCCAGGCGT GCGTGCCCAC CGACCCCAAC CCCCAGGAGG TGGAGCTCGT GAACGTGACC  180
GAGAACTTCA ACATGTGGAA GAACAACATG CTGGAGCAGA TGCATGAGGA CATCATCAGC  240
CTGTGGGACC AGAGCCTGAA GCCCTGCGTG AAGCTGACCC CCCTGTGCGT GACCCTGAAC  300
TGCACCGACC TGAGGAACAC CACCAACACC AACAACAGCA CCGCCAACAA CAACAGCAAC  360
AGCGAGGGCA CCATCAAGGG CGGCGAGATG AAGAACTGCA GCTTCAACAT CACCACCAGC  420
ATCCGCGACA AGATGCAGAA GGAGTACGCC CTGCTGTACA AGCTGGATAT CGTGAGCATC  480
CACAACGACA GCACCAGCTA CCGCCTGATC TCCTGCAACA CCAGCGTGAT CACCCAGGCC  540
TGCCCCAAGA TCAGCTTCGA GCCCATCCCC ATCCACTACT GCGCCCCCGC CGGCTTCGCC  600
ATCCTGAAGT GCAACGACAA GAAGTTCAGC GGCAAGGGCA GCTGCAAGAA CGTGACCACC  660
GTGCAGTGCA CCCACGGCAT CCGGCCGGTG GTGAGCACCC AGCTCCTGCT GAACGGCAGC  720
CTGGCCGAGG AGGAGGTGGT GATCCGCAGC GAGAACTTCA CCGACAACGC CAAGACCATC  780
ATCGTGCACC TGAATGAGAG CGTGCAGATC AACTGCACGC GTCCCAACTA CAACAAGCGC  840
AAGCGCATCC ACATCGGCCC CGGGCGCGCC TTCTACACCA CCAAGAACAT CATCGGCACC  900
ATCCGCCAGG CCCACTGCAA CATCTCTAGA GCCAAGTGGA ACGACACCCT GCGCCAGATC  960
GTGAGCAAGC TGAAGGAGCA GTTCAAGAAC AAGACCATCG TGTTCAACCA GAGCAGCGGC  1020
GGCGACCCCG AGATCGTGAT GCACAGCTTC AACTGCGGCG GCGAATTCTT CTACTGCAAC  1080
ACCAGCCCCC TGTTCAACAG CACCTGGAAC GGCAACAACA CCTGGAACAA CACCACCGGC  1140
AGCAACAACA ATATTACCCT CCAGTGCAAG ATCAAGCAGA TCATCAACAT GTGGCAGGAG  1200
GTGGGCAAGG CCATGTACGC CCCCCCCATC GAGGGCCAGA TCCGGTGCAG CAGCAACATC  1260
ACCGGTCTGC TGCTGACCCG CGACGGCGGC AAGGACACCG ACACCAACGA CACCGAAATC  1320
TTCCGCCCCG GCGGCGGCGA CATGCGCGAC AACTGGAGAT CTGAGCTGTA CAAGTACAAG  1380
GTGGTGACGA TCGAGCCCCT GGGCGTGGCC CCCACCAAGG CCAAGCGCCG CGTGGTGCAG  1440
CGCGAGAAGC GGGCCGCCAT CGGCGCCCTG TTCCTGGGCT TCCTGGGGGC GGCGGGCAGC  1500
ACCATGGGGG CCGCCAGCGT GACCCTGACC GTGCAGGCCC GCCTGCTCCT GAGCGGCATC  1560
GTGCAGCAGC AGAACAACCT CCTCCGCGCC ATCGAGGCCC AGCAGCATAT GCTCCAGCTC  1620
ACCGTGTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCC CGCGTGCTGG CCGTGGAGCG CTACCTGAAG  1680
GACCAGCAGC TCCTGGGCTT CTGGGGCTGC TCCGGCAAGC TGATCTGCAC CACCACGGTA  1740
CCCTGGAACG CCTCCTGGAG CAACAAGAGC CTGGACGACA TCTGGAACAA CATGACCTGG  1800
ATGCAGTGGG AGCGCGAGAT CGATAACTAC ACCAGCCTGA TCTACAGCCT GCTGGAGAAG  1860
AGCCAGACCC AGCAGGAGAA GAACGAGCAG GAGCTGCTGG AGCTGGACAA CTGGGCGAGC  1920
CTGTGGAACT GGTTCGACAT CACCAACTGG CTGTGGTACA TCAAAATCTT CATCATGATT  1980
GTGGGCGGCC TGGTGGGCCT CCGCATCGTG TTCGCCGTGC TGAGCATCGT GAACCGCGTG  2040
CGCCAGGGCT ACAGCCCCCT GAGCCTCCAG ACCCGGCCCC CCGTGCCGCG CGGGCCCGAC  2100
CGCCCCGAGG GCATCGAGGA GGAGGGCGGC GAGCGCGACC GCGACACCAG CGGCAGGCTC  2160
GTGCACGGCT TCCTGGCGAT CATCTGGGTC GACCTCCGCA GCCTGTTCCT GTTCAGCTAC  2220
CACCACCGCG ACCTGCTGCT GATCGCCGCC CGCATCGTGG AACTCCTAGG CCGCCGCGGC  2280
TGGGAGGTGC TGAAGTACTG GTGGAACCTC CTCCAGTATT GGAGCCAGGA GCTGAAGTCC  2340
AGCGCCGTGA GCCTGCTGAA CGCCACCGCC ATCGCCGTGG CCGAGGGCAC CGACCGCGTG  2400
ATCGAGGTGC TCCAGAGGGC CGGGAGGGCG ATCCTGCACA TCCCCACCCG CATCCGCCAG  2460
GGGCTCGAGA GGGCGCTGCT G                                            2481
(2)序列信息SEQ ID NO：36：
(i)序列特征：
(A)长度：486碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：双链
(D)拓扑类型：线性
(ii)MOLECULE类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
ATGAATCCAG TAATAAGTAT AACATTATTA TTAAGTGTAT TACAAATGAG TAGAGGACAA  60
AGAGTAATAA GTTTAACAGC ATGTTTAGTA AATCAAAATT TGAGATTAGA TTGTAGACAT  120
GAAAATAATA CACCTTTGCC AATACAACAT GAATTTTCAT TAACGCGTGA AAAAAAAAAA  180
CATGTATTAA GTGGAACATT AGGAGTACCA GAACATACAT ATAGAAGTAG AGTAAATTTG  240
TTTAGTGATA GATTCATAAA AGTATTAACA TTAGCAAATT TTACAACAAA AGATGAAGGA  300
GATTATATGT GTGAGCTCAG AGTAAGTGGA CAAAATCCAA CAAGTAGTAA TAAAACAATA  360
AATGTAATAA GAGATAAATT AGTAAAATGT GGAGGAATAA GTTTATTAGT ACAAAATACA  420
AGTTGGTTAT TATTATTATT ATTAAGTTTA AGTTTTTTAC AAGCAACAGA TTTTATAAGT  480
TTATGA                                                             486
(2)序列信息SEQ ID NO：37：
(i)序列特征：
(A)长度：485碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：双链
(D)拓扑类型：线性
(ii)MOLECULE类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
ATGAACCCAG TCATCAGCAT CACTCTCCTG CTTTCAGTCT TGCAGATGTC CCGAGGACAG    60
AGGGTGATCA GCCTGACAGC CTGCCTGGTG AACAGAACCT TCGACTGGAC TGCCGTCATG    120
AGAATAACAC CAACTTGCCC ATCCAGCATG AGTTCAGCCT GACCCGAGAG AAGAAGAAGC    180
ACGTGCTGTC AGGCACCCTG GGGGTTCCCG AGCACACTTA CCGCTCCCGC GTCAACCTTT    240
TCAGTGACCG CTTTATCAAG GTCCTTACTC TAGCCAACTT GACCACCAAG GATGAGGGCG    300
ACTACATGTG TGAACTTCGA GTCTCGGGCC AGAATCCCAC AAGCTCCAAT AAAACTATCA    360
ATGTGATCAG AGACAAGCTG GTCAAGTGTG GTGGCATAAG CCTGCTGGTT CAAAACACTT    420
CCTGGCTGCT GCTGCTCCTG CTTTCCCTCT CCTTCCTCCA AGCCACGGAC TTCATTTCTC    480
TGTGA                                                                485
(2)序列信息SEQ ID NO：38：
(i)序列特征：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：
CGCGGGGCTA GCGCAAAGAG TAATAAGTTT AAC                                 33
(2)序列信息SEQ ID NO：39：
(i)序列特征：
(A)长度：28碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：
CGCGGATCCC TTGTATTTTG TACTAATA                                        28
(2)序列信息SEQ ID NO：40：
(i)序列特征：
(A)长度：762碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：
GAATTCACGC GTAAGCTTGC CGCCACCATG GTGAGCAAGG GCGAGGAGCT GTTCACCGGG    60
GTGGTGCCCA TCCTGGTCGA GCTGGACGGC GACGTGAACG GCCACAAGTT CAGCGTGTCC    120
GGCGAGGGCG AGGGCGATGC CACCTACGGC AAGCTGACCC TGAAGTTCAT CTGCACCACC    180
GGCAAGCTGC CCGTGCCCTG GCCCACCCTC GTGACCACCT TCAGCTACGG CGTGCAGTGC    240
TTCAGCCGCT ACCCCGACCA CATGAAGCAG CACGACTTCT TCAAGTCCGC CATGCCCGAA    300
GGCTACGTCC AGGAGCGCAC CATCTTCTTC AAGGACGACG GCAACTACAA GACCCGCGCC    360
GAGGTGAAGT TCGAGGGCGA CACCCTGGTG AACCGCATCG AGCTGAAGGG CATCGACTTC    420
AAGGAGGACG GCAACATCCT GGGGCACAAG CTGGAGTACA ACTACAACAG CCACAACGTC    480
TATATCATGG CCGACAAGCA GAAGAACGGC ATCAAGGTGA ACTTCAAGAT CCGCCACAAC    540
ATCGAGGACG GCAGCGTGCA GCTCGCCGAC CACTACCAGC AGAACACCCC CATCGGCGAC    600
GGCCCCGTGC TGCTGCCCGA CAACCACTAC CTGAGCACCC AGTCCGCCCT GAGCAAAGAC    660
CCCAACGAGA AGCGCGATCA CATGGTCCTG CTGGAGTTCG TGACCGCCGC CGGGATCACT    720
CACGGCATGG ACGAGCTGTA CAAGTAAAGC GGCCGCGGAT CC                       762
(2)序列信息SEQ ID NO：41：
(i)序列特征：
(A)长度：4670碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：双链
(D)拓扑类型：线性
(ii)MOLECULE类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：
AAGCTTAAAC CATGCCCATG GGGTCTCTGC AACCGCTGGC CACCTTGTAC CTGCTGGGGA    60
TGCTGGTCGC TTCCGTGCTA GCCGCCACCA GAAGATACTA CCTGGGTGCA GTGGAACTGT    120
CATGGGACTA TATGCAAAGT GATCTCGGTG AGCTGCCTGT GGACGCAAGA TTTCCTCCTA    180
GAGTGCCAAA ATCTTTTCCA TTCAACACCT CAGTCGTGTA CAAAAAGACT CTGTTTGTAG    240
AATTCACGGA TCACCTTTTC AACATCGCTA AGCCAAGGCC ACCCTGGATG GGTCTGCTAG    300
GTCCTACCAT CCAGGCTGAG GTTTATGATA CAGTGGTCAT TACACTTAAG AACATGGCTT    360
CCCATCCTGT CAGTCTTCAT GCTGTTGGTG TATCCTACTG GAAAGCTTCT GAGGGAGCTG    420
AATATGATGA TCAGACCAGT CAAAGGGAGA AAGAAGATGA TAAAGTCTTC CCTGGTGGAA    480
GCCATACATA TGTCTGGCAG GTCCTGAAAG AGAATGGTCC AATGGCCTCT GACCCACTGT    540
GCCTTACCTA CTCATATCTT TCTCATGTGG ACCTGGTAAA AGACTTGAAT TCAGGCCTCA    600
TTGGAGCCCT ACTAGTATGT AGAGAAGGGA GTCTGGCCAA GGAAAAGACA CAGACCTTGC    660
ACAAATTTAT ACTACTTTTT GCTGTATTTG ATGAAGGGAA AAGTTGGCAC TCAGAAACAA  720
AGAACTCCTT GATGCAGGAT AGGGATGCTG CATCTGCTCG GGCCTGGCCT AAAATGCACA  780
CAGTCAATGG TTATGTAAAC AGGTCTCTGC CAGGTCTGAT TGGATGCCAC AGGAAATCAG  840
TCTATTGGCA TGTGATTGGA ATGGGCACCA CTCCTGAAGT GCACTCAATA TTCCTCGAAG  900
GTCACACATT TCTTGTGAGG AACCATCGCC AGGCGTCCTT GGAAATCTCG CCAATAACTT  960
TCCTTACTGC TCAAACACTC TTGATGGACC TTGGACAGTT TCTACTGTTT TGTCATATCT  1020
CTTCCCACCA ACATGATGGC ATGGAAGCTT ATGTCAAAGT AGACAGCTGT CCAGAGGAAC  1080
CCCAACTACG AATGAAAAAT AATGAAGAAG CGGAAGACTA TGATGATGAT CTTACTGATT  1140
CTGAAATGGA TGTGGTCAGG TTTGATGATG ACAACTCTCC TTCCTTTATC CAAATTCGCT  1200
CAGTTGCCAA GAAGCATCCT AAAACTTGGG TACATTACAT TGCTGCTGAA GAGGAGGACT  1260
GGGACTATGC TCCCTTAGTC CTCGCCCCCG ATGACAGAAG TTATAAAAGT CAATATTTGA  1320
ACAATGGCCC TCAGCGGATT GGTAGGAAGT ACAAAAAAGT CCGATTTATG GCATACACAG  1380
ATGAAACCTT TAAGACTCGT GAAGCTATTC AGCATGAATC AGGAATCTTG GGACCTTTAC  1440
TTTATGGGGA AGTTGGAGAC ACACTGTTGA TTATATTTAA GAATCAAGCA AGCAGACCAT  1500
ATAACATCTA CCCTCACGGA ATCACTGATG TCCGTCCTTT GTATTCAAGG AGATTACCAA  1560
AAGGTGTAAA ACATTTGAAG GATTTTCCAA TTCTGCCAGG AGAAATATTC AAATATAAAT  1620
GGACAGTGAC TGTAGAAGAT GGGCCAACTA AATCAGATCC TCGGTGCCTG ACCCGCTATT  1680
ACTCTAGTTT CGTTAATATG GAGAGAGATC TAGCTTCAGG ACTCATTGGC CCTCTCCTCA  1740
TCTGCTACAA AGAATCTGTA GATCAAAGAG GAAACCAGAT AATGTCAGAC AAGAGGAATG  1800
TCATCCTGTT TTCTGTATTT GATGAGAACC GAAGCTGGTA CCTCACAGAG AATATACAAC  1860
GCTTTCTCCC CAATCCAGCT GGAGTGCAGC TTGAGGATCC AGAGTTCCAA GCCTCCAACA  1920
TCATGCACAG CATCAATGGC TATGTTTTTG ATAGTTTGCA GTTGTCAGTT TGTTTGCATG  1980
AGGTGGCATA CTGGTACATT CTAAGCATTG GAGCACAGAC TGACTTCCTT TCTGTCTTCT  2040
TCTCTGGATA TACCTTCAAA CACAAAATGG TCTATGAAGA CACACTCACC CTATTCCCAT  2100
TCTCAGGAGA AACTGTCTTC ATGTCGATGG AAAACCCAGG TCTATGGATT CTGGGGTGCC  2160
ACAACTCAGA CTTTCGGAAC AGAGGCATGA CCGCCTTACT GAAGGTTTCT AGTTGTGACA  2220
AGAACACTGG TGATTATTAC GAGGACAGTT ATGAAGATAT TTCAGCATAC TTGCTGAGTA  2280
AAAACAATGC CATTGAACCA AGAAGCTTCT CCCAGAATTC AAGACACCCT AGCACTAGGC  2340
AAAAGCAATT TAATGCCACC CCACCAGTCT TGAAACGCCA TCAACGGGAA ATAACTCGTA  2400
CTACTCTTCA GTCAGATCAA GAGGAAATTG ACTATGATGA TACCATATCA GTTGAAATGA  2460
AGAAGGAAGA TTTTGACATT TATGATGAGG ATGAAAATCA GAGCCCCCGC AGCTTTCAAA  2520
AGAAAACACG ACACTATTTT ATTGCTGCAG TGGAGAGGCT CTGGGATTAT GGGATGAGTA  2580
GCTCCCCACA TGTTCTAAGA AACAGGGCTC AGAGTGGCAG TGTCCCTCAG TTCAAGAAAG  2640
TTGTTTTCCA GGAATTTACT GATGGCTCCT TTACTCAGCC CTTATACCGT GGAGAACTAA  2700
ATGAACATTT GGGACTCCTG GGGCCATATA TAAGAGCAGA AGTTGAAGAT AATATCATGG  2760
TAACTTTCAG AAATCAGGCC TCTCGTCCCT ATTCCTTCTA TTCTAGCCTT ATTTCTTATG  2820
AGGAAGATCA GAGGCAAGGA GCAGAACCTA GAAAAAACTT TGTCAAGCCT AATGAAACCA  2880
AAACTTACTT TTGGAAAGTG CAACATCATA TGGCACCCAC TAAAGATGAG TTTGACTGCA  2940
AAGCCTGGGC TTATTTCTCT GATGTTGACC TGGAAAAAGA TGTGCACTCA GGCCTGATTG  3000
GACCCCTTCT GGTCTGCCAC ACTAACACAC TGAACCCTGC TCATGGGAGA CAAGTGACAG  3060
TACAGGAATT TGCTCTGTTT TTCACCATCT TTGATGAGAC CAAAAGCTGG TACTTCACTG  3120
AAAATATGGA AAGAAACTGC AGGGCTCCCT GCAATATCCA GATGGAAGAT CCCACTTTTA  3180
AAGAGAATTA TCGCTTCCAT GCAATCAATG GCTACATAAT GGATACACTA CCTGGCTTAG  3240
TAATGGCTCA GGATCAAAGG ATTCGATGGT ATCTGCTCAG CATGGGCAGC AATGAAAACA  3300
TCCATTCTAT TCATTTCAGT GGACATGTGT TCACTGTACG AAAAAAAGAG GAGTATAAAA  3360
TGGCACTGTA CAATCTCTAT CCAGGTGTTT TTGAGACAGT GGAAATGTTA CCATCCAAAG  3420
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TGATGGCCCA GGACCAGCGC ATCCGCTGGT ACCTGCTGTC TATGGGCAGC AACGAGAACA 3300
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GGGGATCCTC ACGTCTCACT TCAGGTGCTT CACGCCCTTG GGCAGGCGGC GGCTGTACAG  60
GGGGCGCACG TCGGTGATGC CGTGGGGGTA GATGTTGTAG GGCC                   104
(2)序列信息SEQ ID NO：71：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：
CGCGAATTCG GAAGACCCGA AGGACTTCCC CATCCTGCCC GGCGAGATCT TCAAGTACAA    60
GTGGACCGTG ACCGTGGAGG ACGGCCCCAC CAAGAGCGAC CCCCG                    105
(2)序列信息SEQ ID NO：72：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGC CGATCAGTCC GGAGGCCAGG TCGCGCTCCA TGTTCACGAA    60
GCTGCTGTAG TAGCGGGTCA GGCAGCGGGG GTCGCTCTTG GTGG                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：73：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：
CGCGAATTCG GAAGACCCCG GCCCCCTGCT GATCTGCTAC AAGGAGAGCG TGGACCAGCG   60
CGGCAACCAG ATCATGAGCG ACAAGCGCAA CGTGATCCTG TTCAG                   105
(2)序列信息SEQ ID NO：74：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：
GGGGATCCTC ACGTCTCAAG CGGGGTTGGG CAGGAAGCGC TGGATGTTCT CGGTCAGATA    60
CCAGCTGCGG TTCTCGTCGA ACACGCTGAA CAGGATCACG TTGC                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：75：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：
CGCGAATTCG GAAGACCCCG CTGGCGTGCA GCTGGAAGAT CCCGAGTTCC AGGCCAGCAA   60
CATCATGCAC AGCATCAACG GCTACGTGTT CGACAGCCTG CAGCT                   105
(2)序列信息SEQ ID NO：76：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：
GGGGATCCTC ACGTCTCACA GGAAGTCGGT CTGGGCGCCG ATGCTCAGGA TGTACCAGTA   60
GGCCACCTCA TGCAGGCACA CGCTCAGCTG CAGGCTGTCG AACA                    104
(2)序列信息SEQ ID NO：77：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：
CGCGAATTCG GAAGACCCCC TGAGCGTGTT CTTCTCCGGG TATACCTTCA AGCACAAGAT    60
GGTGTACGAG GACACCCTGA CCCTGTTCCC CTTCTCCGGC GAGAC                    105
(2)序列信息SEQ ID NO：78：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：78：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGT TGCGGAAGTC GCTGTTGTGG CAGCCCAGAA TCCACAGGCC    60
GGGGTTCTCC ATAGACATGA ACACAGTCTC GCCGGAGAAG GGGA                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：79：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：79：
CGCGAATTCG GAAGACCCCA ACCGCGGCAT GACTGCCCTG CTGAAAGTCT CCAGCTGCGA   60
CAAGAACACC GGCGACTACT ACGAGGACAG CTACGAGGAC ATCTC                   105
(2)序列信息SEQ ID NO：80：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：80：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGC GGTGGCGGGA GTTTTGGGAG AAGGAGCGGG GCTCGATGGC    60
GTTGTTCTTG GACAGCAGGT AGGCGGAGAT GTCCTCGTAG CTGT                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：81：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：81：
CGCGAATTCG GAAGACCCCC GCAGCACGCG TCAGAAGCAG TTCAACGCCA CCCCCCCCGT    60
GCTGAAGCGC CACCAGCGCG AGATCACCCG CACCACCCTG CAAAG                    105
(2)序列信息SEQ ID NO：82：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：82：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGA TGTCGAAGTC CTCCTTCTTC ATCTCCACGC TGATGGTGTC    60
GTCGTAGTCG ATCTCCTCCT GGTCGCTTTG CAGGGTGGTG CGGG                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：83：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：83：
CGCGAATTCG GAAGACCCCA TCTACGACGA GGACGAGAAC CAGAGCCCCC GCTCCTTCCA    60
AAAGAAAACC CGCCACTACT TCATCGCCGC CGTGGAGCGC CTGTG                    105
(2)序列信息SEQ ID NO：84：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：84：
GGGGATCCTC ACGTCTCACT GGGGCACGCT GCCGCTCTGG GCGCGGTTGC GCAGGACGTG   60
GGGGCTGCTG CTCATGCCGT AGTCCCACAG GCGCTCCACG GCGG                    104
(2)序列信息SEQ ID NO：85：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：85：
CGCGAATTCG GAAGACCCCC AGTTCAAGAA GGTGGTGTTC CAGGAGTTCA CCGACGGCAG   60
CTTCACCCAG CCCCTGTACC GCGGCGAGCT GAACGAGCAC CTGGG                   105
(2)序列信息SEQ ID NO：86：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：86：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGG CTTGGTTGCG GAAGGTCACC ATGATGTTGT CCTCCACCTC    60
GGCGCGGATG TAGGGGCCGA GCAGGCCCAG GTGCTCGTTC AGCT                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：87：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：87：
CGCGAATTCG GAAGACCCAG CCTCCCGGCC CTACTCCTTC TACTCCTCCC TGATCAGCTA    60
CGAGGAGGAC CAGCGCCAGG GCGCCGAGCC CCGCAAGAAC TTCGT                    105
(2)序列信息SEQ ID NO：88：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：88：
GGGGATCCTC ACGTCTCACT CGTCCTTGGT GGGGGCCATG TGGTGCTGCA CCTTCCAGAA   60
GTAGGTCTTA GTCTCGTTGG GCTTCACGAA GTTCTTGCGG GGCT                   104
(2)序列信息SEQ ID NO：89：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：89：
CGCGAATTCG GAAGACCCCG AGTTCGACTG CAAGGCCTGG GCCTACTTCA GCGACGTGGA  60
CCTGGAGAAG GACGTGCACA GCGGCCTGAT CGGCCCCCTG CTGGT                  105
(2)序列信息SEQ ID NO：90：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：90：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGA ACAGGGCAAA TTCCTGCACA GTCACCTGCC TCCCGTGGGG  60
GGGGTTCAGG GTGTTGGTGT GGCACACCAG CAGGGGGCCG ATCA                   104
(2)序列信息SEQ ID NO：91：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：91：
CGCGAATTCG GAAGACCCGT TCTTCACCAT CTTCGACGAG ACTAAGAGCT GGTACTTCAC    60
CGAGAACATG GAGCGCAACT GCCGCGCCCC CTGCAACATC CAGAT                    105
(2)序列信息SEQ ID NO：92：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：92：
GGGGATCCTC ACGTCTCACA GGGTGTCCAT GATGTAGCCG TTGATGGCGT GGAAGCGGTA   60
GTTCTCCTTG AAGGTGGGAT CTTCCATCTG GATGTTGCAG GGGG                    104
(2)序列信息SEQ ID NO：93：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：93：
CGCGAATTCG GAAGACCCCC TGCCCGGCCT GGTGATGGCC CAGGACCAGC GCATCCGCTG   60
GTACCTGCTG TCTATGGGCA GCAACGAGAA CATCCACAGC ATCCA                   105
(2)序列信息SEQ ID NO：94：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：94：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGT ACAGGTTGTA CAGGGCCATC TTGTACTCCT CCTTCTTGCG    60
CACGGTGAAA ACGTGGCCGC TGAAGTGGAT GCTGTGGATG TTCT                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：95：
(i)序列特征：
(A)长度：106碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：95：
CGCGAATTCG GAAGACCCGT ACCCCGGCGT RGTTCGAGAC TGTGGAGATG CTGCCCAGCA    60
AGGCCGGGAT CTGGCGCGTG GAGTGCCTGA TCGGCGAGCA CCTGCA                   106
(2)序列信息SEQ ID NO：96：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：96：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGC TGGCCATGCC CAGGGGGGTC TGGCACTTGT TGCTGTACAC   60
CAGGAACAGG GTGCTCATGC CGGCGTGCAG GTGCTCGCCG ATCA                    104
(2)序列信息SEQ ID NO：97：
(i)序列特征：
(A)长度：106碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：97：
CGCGAATTCG GAAGACCCCA GCGGCCACAT RCCGCGACTT CCAGATCACC GCCAGCGGCC    60
AGTACGGCCA GTGGGCTCCC AAGCTGGCCC GCCTGCACTA CAGCGG                   106
(2)序列信息SEQ ID NO：98：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：98：
GGGGATCCTC ACGTCTCACA TGGGGGCCAG CAGGTCCACC TTGATCCAGG AGAAGGGCTC   60
CTTGGTCGAC CAGGCGTTGA TGCTGCCGCT GTAGTGCAGG CGGG                    104
(2)序列信息SEQ ID NO：99：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：99：
CGCGAATTCG GAAGACCCCA TGATCATCCA CGGCATCAAG ACCCAGGGCG CCCGCCAGAA   60
GTTCAGCAGC CTGTACATCA GCCAGTTCAT CATCATGTAC TCTCT                   105
(2)序列信息SEQ ID NO：100：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：100：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGT TGCCGAAGAA CACCATCAGG GTGCCGGTGC TGTTGCCGCG    60
GTAGGTCTGC CACTTCTTGC CGTCTAGAGA GTACATGATG ATGA                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：101：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：101：
CGCGAATTCG GAAGACCCCA ACGTGGACAG CAGCGGCATC AAGCACAACA TCTTCAACCC   60
CCCCATCATC GCCCGCTACA TCCGCCTGCA CCCCACCCAC TACAG                   105
(2)序列信息SEQ ID NO：102：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：102：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGC CCAGGGGCAT GCTGCAGCTG TTCAGGTCGC AGCCCATCAG   60
CTCCATGCGC AGGGTGCTGC GGATGCTGTA GTGGGTGGGG TGCA                    104
(2)序列信息SEQ ID NO：103：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：103：
CGCGAATTCG GAAGACCCGG GCATGGAGAG CAAGGCCATC AGCGACGCCC AGATCACCGC    60
CTCCAGCTAC TTCACCAACA TGTTCGCCAC CTGGAGCCCC AGCAA                    105
(2)序列信息SEQ ID NO：104：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：104：
GGGGATCCTC ACGTCTCACC ACTCCTTGGG GTTGTTCACC TGGGGGCGCC AGGCGTTGCT   60
GCGGCCCTGC AGGTGCAGGC GGGCCTTGCT GGGGCTCCAG GTGG                    104
(2)序列信息SEQ ID NO：105：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：105：
CGCGAATTCG GAAGACCCGT GGCTGCAGGT GGACTTCCAG AAAACCATGA AGGTGACTGG   60
CGTGACCACC CAGGGCGTCA AGAGCCTGCT GACCAGCATG TACGT                   105
(2)序列信息SEQ ID NO：106：
(i)序列特征：
(A)长度：104碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：106：
GGGGATCCTC ACGTCTCACT TGCCGTTTTG GAAGAACAGG GTCCACTGGT GGCCGTCCTG    60
GCTGCTGCTG ATCAGGAACT CCTTCACGTA CATGCTGGTC AGCA                     104
(2)序列信息SEQ ID NO：107：
(i)序列特征：
(A)长度：105碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：107：
CGCGAATTCG GAAGACCCCA AGGTGAAGGT GTTCCAGGGC AACCAGGACA GCTTCACACC    60
GGTCGTGAAC AGCCTGGACC CCCCCCTGCT GACCCGCTAC CTGCG                    105
(2)序列信息SEQ ID NO：108：
(i)序列特征：
(A)长度：125碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：108：
GGGGATCCTC ACGTCTCAGC GGCCGCTTCA GTACAGGTCC TGGGCCTCGC AGCCCAGCAC    60
CTCCATGCGC AGGGCGATCT GGTGCACCCA GCTCTGGGGG TGGATGCGCA GGTAGCGGGT    120
CAGCA                                                                125
(2)序列信息SEQ ID NO：109：
(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：109：
CGTTGTTCTT CATACGCGTC TGGGGCTCCT CGGGGC           36
(2)序列信息SEQ ID NO：110：
(i)序列特征：
(A)长度：18碱基对
(B)类型：核酸
(C)链的类型：单链
(D)拓扑类型：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)序列描述：SEQ ID NO：110：
CGCGAATTCG GAAGACCC                               18

Claims (20)

1.一种编码绿色荧光蛋白的合成基因，其中存在于编码所述蛋白的天然基因中至少40％的非优选密码子已被编码相同氨基酸的优选密码子或较不优选密码子所置换，所述优选的密码子选自于gcc、cgc、aac、gac、tgc、cag、ggc、cac、atc、ctg、aag、ccc、ttc、agc、acc、tac和gtg，所述较不优选的密码子选自于ggg、att、ctc、tcc、gtc和agg，所述非优选的密码子为除了所述优选的密码子和较不优选的密码子之外的所有密码子。
2.权利要求1的合成基因，其中在体外哺乳动物细胞培养系统中，在相等条件下，所述的合成基因能表达该蛋白的水平，至少为所述的天然基因表达水平的110％。
3.权利要求1的合成基因，其中在体外细胞培养系统中，在相等条件下，所述的合成基因能表达该蛋白的水平，至少为所述的天然基因表达水平的150％。
4.权利要求1的合成基因，其中在体外细胞培养系统中，在相等条件下，所述的合成基因能表达该蛋白的水平，至少为所述的天然基因表达水平的200％。
5.权利要求1的合成基因，其中在体外细胞培养系统中，在相等条件下，所述的合成基因能表达该蛋白的水平，至少为所述的天然基因表达水平的500％。
6.权利要求1的合成基因，其中在体外哺乳动物细胞培养系统中，在相等条件下，所述的合成基因能表达该蛋白的水平，至少为所述的天然基因表达水平的1000％。
7.权利要求1的合成基因，其中所述的合成基因包括出现率少于5次的序列CG。
8.权利要求1的合成基因，其中在所述的天然基因中，至少10％的密码子为非优选密码子。
9.权利要求1的合成基因，其中在所述的天然基因中，至少50％的密码子为非优选密码子。
10.权利要求1的合成基因，其中所述的天然基因中的至少50％非优选密码子，已由编码相同氨基酸的优选密码子或较不优选密码子置换。
11.权利要求1的合成基因，其中所述的天然基因中的至少60％非优选密码子，已由编码相同氨基酸的优选密码子或较不优选密码子置换。
12.权利要求1的合成基因，其中所述的天然基因中的至少70％非优选密码子，已由编码相同氨基酸的优选密码子或较不优选密码子置换。
13.权利要求1的合成基因，其中所述的天然基因中的至少80％非优选密码子，已由编码相同氨基酸的优选密码子或较不优选密码子置换。
14.权利要求1的合成基因，其中所述的天然基因中的至少90％非优选密码子，已由编码相同氨基酸的优选密码子或较不优选密码子置换。
15.权利要求1的合成基因，其中20％的密码子是优选的密码子。
16.权利要求1的合成基因，其中所述的基因具有SEQ ID NO：40中所示的编码序列。
17.一种包括权利要求1的合成基因的表达载体。
18.权利要求15的表达载体，所述的表达载体为哺乳动物表达载体。
19.一种含有权利要求1的合成基因的哺乳动物细胞。
20.一种制备合成的绿色荧光蛋白的方法，该方法包括在天然绿色荧光蛋白基因中确认非优选的密码子或较不优选密码子，并且用编码相同氨基酸的优选密码子或较不优选密码子作置换密码子，置换至少40％的所述的非优选密码子，所述优选的密码子选自于gcc、cgc、aac、gac、tgc、cag、ggc、cac、atc、ctg、aag、ccc、ttc、agc、acc、tac和gtg，所述较不优选的密码子选自于ggg、att、ctc、tcc、gtc和agg，所述非优选的密码子为除了所述优选的密码子和较不优选的密码子之外的所有密码子。
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