CN110913903B - 聚糖相互作用化合物和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗癌症的方法，其包括给予聚糖相互作用抗体。本发明包括适合于实现所需生物活性、生物利用度和毒性水平的抗唾液酸基Tn抗原抗体以及相关组合物和配制品。

Description

聚糖相互作用化合物和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求对以下项的优先权：2017年3月3日提交的标题为GLYCAN-INTERACTINGCOMPOUNDS AND METHODS OF USE的美国临时申请号62/466,766、2017年3月31日提交的标题为GLYCAN-INTERACTING COMPOUNDS AND METHODS OF USE的美国临时申请号62/480,126、2017年4月18日提交的标题为GLYCAN-INTERACTING COMPOUNDS AND METHODS OF USE的美国临时申请号62/486,826、2017年9月27日提交的标题为GLYCAN-INTERACTINGCOMPOUNDS AND METHODS OF USE的美国临时申请号62/563,718和2017年10月27日提交的标题为GLYCAN-INTERACTING COMPOUNDS AND METHODS OF USE的美国临时申请号62/577,830，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体并入本文中的序列表。2018年3月2日创建的所述ASCII副本被命名为2033_1030PCT_SL.txt并且大小为24,876字节。
背景技术
异常糖基化伴随一些一般在癌瘤中观察到的其他突变。已经估计所有癌瘤中约80％表达截短的聚糖Tn抗原和唾液酸化形式唾液酸基Tn(Sialyl Tn，STn)。除了少数例外情况，Tn和STn在正常的健康组织中不表达。此外，非人免疫原性唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)似乎在癌瘤(如乳腺癌)上以Neu5Gc-STn(GcSTn)的形式差异性表达。
已经在人类癌症中描述多种异常糖基化形式，从而将特定聚糖鉴定为一类适合于特异性肿瘤靶向的细胞表面分子(Cheever,M.A.等人,Clin Cancer Res.2009年9月1日；15(17):5323-37)。例如，多种人类癌症类型(尤其如膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌)显示STn抗原的高表达，这在正常人类组织中是罕见的(Karlen,P.等人,Gastroenterology.1998年12月；115(6):1395-404；Ohno,S.等人,Anticancer Res.2006年11月-12月；26(6A):4047-53)。另外，STn在肿瘤相关粘蛋白上的存在与具有较差预后的癌症有关，并且以此被视为癌症检测和靶向疗法的有吸引力的表位(Cao,Y.等人,VirchowsArch.1997年9月；431(3):159-66；Julien,S.等人,Br J Cancer.2009年6月2日；100(11):1746-54；Itzkowitz,S.H.等人,Cancer.1990年11月1日；66(9):1960-6；Motoo,Y.等人,Oncology.1991年；48(4):321-6；Kobayashi,H.等人,J Clin Oncol.1992年1月；10(1):95-101)。Tn和STn形成与基因Cosmc中的体细胞突变相关，所述基因编码形成活性T-合酶所需的分子伴侣(Ju,T.等人,Nature.2005年10月27日；437(7063):1252；Ju,T.等人,CancerRes.2008年3月15日；68(6):1636-46)。其还可以从增加的唾液酸转移酶ST6GalNAc I表达产生(Ikehara,Y.等人,Glycobiology.1999年11月；9(11):1213-24；Brockhausen,I.等人,Biol Chem.2001年2月；382(2):219-32)。STn的从头表达可以调节癌瘤细胞，改变恶性表型，并导致侵袭性更强的细胞行为(Pinho,S.等人,Cancer Lett.2007年5月8日；249(2):157-70)。虽然STn在恶性组织中高度表达，但是在健康的人类细胞中也发现了低水平(Jass,J.R.等人,J Pathol.1995年6月；176(2):143-9；Kirkeby,S.等人,Arch OralBiol.2010年11月；55(11):830-41)。单独的STn作为癌症检测和疗法的靶标已经吸引人们的注意(Cheever,M.A.等人,Clin Cancer Res.2009年9月1日；15(17):5323-37)。STn还存在于与癌症干细胞相关的粘蛋白中(Engelmann等人,Cancer research,2008,68,2419-2426)，并且STn牵涉在免疫抑制中(Carrascal,M.A.等人,Molecular Oncology.2014.8(3):753-65)。
除了STn的存在以外，其他糖基化变化已经描述于癌症中。其中一种变化涉及Neu5Gc。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和Neu5Gc是哺乳动物细胞表面上的两种主要唾液酸。Neu5Ac和Neu5Gc的差别仅在于，Neu5Gc包括与附接至碳5的化学基团相连的额外氧原子。由于功能基因的损失，人类只能合成呈Neu5Ac形式而不是Neu5Gc形式的唾液酸。然而，Neu5Gc可以从动物衍生的饮食来源(如红肉)以代谢方式并入人体中(Tangvoranuntakul,P.等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2003年10月14日；100(21):12045-50；Nguyen,D.H.等人,JImmunol.2005年7月1日；175(1):228-36；US 7,682,794、US 8,084,219、US 2012/0142903、WO 2010030666和WO 2010030666)。Neu5Gc在人肿瘤中非常丰富(Higashi,H.等人,CancerRes.1985年8月；45(8):3796-802；Miyoshi I.等人,Mol Immunol.1986.23:631-638；Hirabayashi,Y.等人,Jpn J Cancer Res.1987.78:614-620；Kawachi.S等人,Int ArchAllergy Appl Immunol.1988.85:381-383；Devine,P.L.等人,Cancer Res.1991.51:5826-5836；Malykh,Y.N.等人,Biochimie.2001.83:623-634和Inoue,S.等人,2010.Glycobiology.20(6):752-762)并且在正常人组织中极低，这在数十年来都被人忽视(Diaz,S.L.等人,PLoS One.2009.4:e4241；Tangvoranuntakul,P.等人,Proc Natl AcadSci U S A.2003.100:12045-12050；Varki,A.等人,Glycoconj J.2009.26:231-245)。与健康人组织相比，饮食衍生的Neu5Gc在癌症组织中增加的代谢积累可能通过至少三种因素来解释：快速生长伴随竞争性内源Neu5Ac的产生不足，由生长因子诱导的增强的巨胞饮作用(Dharmawardhane,S.等人,Mol Biol Cell.2000年10月；11(10):3341-52；Simonsen,A.等人,Curr Opin Cell Biol.2001年8月；13(4):485-92；Johannes,L.等人,Traffic.2002年7月；3(7):443-51；Amyere,M.等人,Int J Med Microbiol.2002年2月；291(6-7):487-94)，和溶酶体唾液酸转运蛋白基因sialin的基因表达因缺氧而上调(Yin,J.等人,CancerRes.2006年3月15日；66(6):2937-45)。另外，迄今所测试的所有人类包含针对非人Neu5Gc的多克隆抗体库，这使其成为异种-自身抗原的第一个例子(Padler-Karavani,V.等人,Glycobiology.2008年10月；18(10):818-30；Varki,N.M.等人,Annu Rev Pathol.2011；6:365-93)。显示饮食Neu5Gc面对抗Neu5Gc反应在恶性肿瘤中的积累通过诱导低级慢性炎症促进肿瘤进展(Hedlund,M.等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2008年12月2日；105(48):18936-41)。因此，人肿瘤上含有Neu5Gc的聚糖表位代表有价值的药物靶向可能性。近期研究表明癌症患者中存在针对含有Neu5Gc的STn(GcSTn)而不是Neu5Ac-STn(AcSTn)的抗体，并探索其作为癌症检测的特异性生物标记物的潜力(Padler-Karavani,V.等人,CancerRes.2011年5月1日；71(9):3352-63)。
本领域中存在对能结合聚糖的治疗性抗体的需要，所述聚糖包括与疾病以及患病细胞和组织相关的聚糖。另外，存在对研发此类抗体的更佳方法和使用这些抗体靶向患病细胞和组织的方法的需要。本公开文本通过提供相关的化合物和方法满足这些需要。
发明内容
在一些实施方案中，本公开文本提供了通过给予抗体来治疗受试者的癌症的方法，其中所述抗体是以约1mg/kg至约10mg/kg的剂量给予的，其中所述抗体具有约50小时至约200小时的终末半衰期，并且其中所述抗体结合唾液酸基Tn抗原(STn)。所述抗体可以包括具有选自SEQ ID NO:7和9的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)；以及具有选自SEQ IDNO:8和10的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)。所述抗体可以是抗体-药物缀合物。所述抗体可以与单甲基澳瑞他汀E(MMAE)缀合。可以静脉内给予所述抗体。
在一些实施方案中，本公开文本提供通过将抗STn抗体给予至患有结直肠癌的受试者来治疗结直肠癌的方法，其中所述抗STn抗体包括具有选自SEQ ID NO:7、9和11的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)；以及具有选自SEQ ID NO:8、10和12的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)。结直肠癌可对用以下中的至少一种进行的治疗有抗性：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、普纳替尼(ponatinib)、索拉非尼(sorafenib)、5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛(docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、伊立替康、紫杉醇(paclitaxel)和奥沙利铂(oxaliplatin)。抗STn抗体可以包括抗体药物缀合物(ADC)。ADC可以包括至少一种缀合物，其中所述至少一种缀合物选自以下中的一种或多种：澳瑞他汀(auristatin)、美坦辛(maytansine)、微管溶素、长春花生物碱、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、喜树碱、倍癌霉素(duocarmycin)、鹅膏蕈碱(amanitin)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂和丝裂原激活蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂。ADC可以包括一种或多种聚合物，其中所述一种或多种聚合物连接抗STn抗体与所述至少一种缀合物。所述一种或多种聚合物可以包括以下中的一种或多种：聚(乙二醇)(PEG)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(聚HPMA)、聚(α-氨基酸)、碳水化合物聚合物、糖多糖、糖脂、糖缀合物、聚甘油、聚乙烯醇、聚(丙烯酸)、聚缩酮和聚缩醛。所述一种或多种聚合物可以包括聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基甲醛)(PHF)。所述抗STn抗体可以约0.1nM至约50nM的半最大抑制浓度杀伤表达STn的细胞。
给予抗STn抗体可以与至少一种其他治疗性治疗组合实施。其他治疗性治疗可以包括护理标准治疗性治疗。其他治疗性治疗可以选自以下中的一种或多种：西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐珠单抗、雷莫芦单抗、曲妥珠单抗、普纳替尼、索拉非尼、5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨、伊立替康、紫杉醇和奥沙利铂。其他治疗性治疗还可以包括给予至少一种细胞周期抑制剂。细胞周期抑制剂可以是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。CDK抑制剂可以抑制CDK4和/或CDK6。CDK抑制剂可以选自帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)和阿贝西尼(abemaciclib)。抗STn抗体可以与其他治疗性治疗并行进行治疗。抗STn抗体可以与其他治疗性治疗依序进行治疗。
在一些实施方案中，本公开文本提供治疗癌症的方法，所述方法包括将抗STn抗体给予至患有癌症的受试者，其中抗STn抗体包括具有选自SEQ ID NO:7、9和11的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)；以及具有选自SEQ ID NO:8、10和12的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)，其中给予抗STn抗体是与至少一种细胞周期抑制剂组合实施的。细胞周期抑制剂可以是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。CDK抑制剂可以抑制CDK4和/或CDK6。CDK抑制剂可以选自帕博西尼、瑞博西尼和阿贝西尼。抗STn抗体可以与细胞周期抑制剂并行给予。抗STn抗体可以与细胞周期抑制剂依序给予。
在一些实施方案中，本公开文本提供ADC，所述ADC包括抗STn抗体，所述抗STn抗体具有具有选自SEQ ID NO:7、9和11氨基酸序列的VH；具有选自SEQ ID NO:8、10和12的氨基酸序列的VL；以及一种或多种细胞毒性剂。细胞毒性剂可以选自以下中的至少一种：澳瑞他汀、美坦辛、微管溶素、长春花生物碱、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、喜树碱、倍癌霉素、鹅膏蕈碱、PI3K抑制剂和MEK抑制剂。抗STn抗体可以通过接头与一种或多种细胞毒性剂缀合。ADC可以包括连接抗STn抗体与一种或多种细胞毒性剂的一种或多种聚合物。一种或多种聚合物可以包括以下中的一种或多种：PEG、聚HPMA、聚(α-氨基酸)、碳水化合物聚合物、糖多糖、糖脂、糖缀合物、聚甘油、聚乙烯醇、聚(丙烯酸)、聚缩酮和聚缩醛。所述一种或多种聚合物可以包括PHF。所述一种或多种聚合物可以通过接头附接至抗STn抗体。所述一种或多种细胞毒性剂可以通过接头附接至一种或多种聚合物。接头可以是可裂解接头。
在一些实施方案中，本公开文本提供治疗受试者的癌症的方法，其中所述受试者具有至少一种表达STn的癌细胞，所述方法包括给予本文所述的抗STn抗体药物缀合物。所述至少一种癌细胞可以是卵巢癌细胞。所述至少一种癌细胞可对用至少一种化学治疗剂进行的治疗有抗性。所述化学治疗剂可以是顺铂。所述抗STn抗体药物缀合物可以按约0.1mg/kg至约25mg/kg的剂量给予。给予可以通过静脉内注射来进行。抗STn抗体药物缀合物可以每天、每周或每月给予。
本公开文本的一些方法包括通过将ADC给予至受试者来治疗癌症的方法，所述ADC包括：包括SEQ ID NO:7的VH；包括SEQ ID NO:8的VL；至少一个人IgG恒定区；和细胞毒性缀合物，其中所述细胞毒性缀合物通过接头缀合至至少一个人IgG恒定区。至少一个人IgG恒定区可以选自以下中的一种或多种：SEQ ID NO:15和16。细胞毒性缀合物可以包括MMAE。ADC可以按约1mg/kg至约6mg/kg的剂量给予。ADC可以通过静脉内推注来给予。ADC可以作为组合物的一部分来给予，其中所述组合物包括至少一种赋形剂。所述组合物可以按约0.1ml/kg至约10ml/kg的体积来给予。所述组合物可以按约1.2ml/kg的体积来给予。所述组合物可以包括约0.5mg/ml至约10mg/ml的ADC浓度。ADC可以展现约2天至约8天的表观终末消除半衰期。ADC可以展现约10ml/kg/天至约20ml/kg/天的表观清除速率。ADC可以展现约50ml/kg至约100ml/kg的稳态下表观分布容积。ADC可以展现约10μg/ml至约200μg/ml的最大观察浓度。ADC可以展现约50天*μg/ml至约500天*μg/ml的从给予开始到最后一次观察到可定量浓度的浓度-时间曲线下面积(AUC)。
附图说明
根据本发明的特定实施方案的以下描述，将了解前述和其他目标、特征和优势，如在附图中所示，其中在所有不同视图中，相似的参考符号是指相同的部分。所述图不一定按比例；而是强调说明本发明的各个实施方案的原理。
图1A是描绘α2,6-唾液酸化N-乙酰半乳糖胺(STn)的示意图，其中最大椭圆形指示由第1组抗体识别的STn的特定区域。
图1B是描绘α2,6-唾液酸化N-乙酰半乳糖胺(STn)的示意图，其中最大椭圆形指示由第2组抗体识别的STn的特定区域。
图1C是描绘α2,6-唾液酸化N-乙酰半乳糖胺(STn)的示意图，其中最大椭圆形指示由第3组抗体识别的STn的特定区域。
图1D是描绘α2,6-唾液酸化N-乙酰半乳糖胺(STn)的示意图，其中最大椭圆形指示由第4组抗体识别的STn的特定区域。
图2是显示在食蟹猴中在初始剂量的hSIA101-MMAE后，随时间的平均血清抗体浓度的图表。
图3是显示在食蟹猴中在第二剂量(在治疗的第22天)的hSIA101-MMAE后，随时间的平均血清抗体浓度的图表。
图4是一组图表，其显示与其他治疗相比，在用hSIA101-ADC进行的治疗的过程中，患者衍生的异种移植肿瘤体积。上图中的肿瘤是以来自未接受化学治疗的患者的卵巢瘤起始，并且下图中的是以来自先前已经用化学治疗剂治疗的患者的卵巢瘤起始。
具体实施方式
引言
根据本发明提供了对包括碳水化合物基团(本文中称为聚糖)的表位具有特异性或者与所述表位相互作用的抗体。本文所述的一些聚糖相互作用抗体可以用作生物治疗药。其他实施方案提供产生此类聚糖相互作用抗体的方法。
在自然界中，STn可以被N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)唾液酸化。根据本发明的聚糖相互作用抗体可以针对具有任何STn的聚糖(泛STn抗体)、具有明确包括Neu5Ac的聚糖(AcSTn)或具有明确包括Neu5Gc的STn的聚糖(GcSTn)。在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体靶向癌症相关的聚糖抗原，如α2,6-唾液酸化N-乙酰半乳糖胺(STn)。
在一些实施方案中，本公开文本提供产生聚糖相互作用抗体的方法。此类方法可以包括使用小鼠产生针对一种或多种抗原的免疫应答，所述抗原包括STn(例如，AcSTn和/或GcSTn)。如本文所述，可以利用多种方法操纵通过小鼠免疫产生的所得抗体。此类方法可以包括改变所免疫小鼠的品系和/或性别，改变所用抗原，改变抗原给予中所包括的佐剂的类型和剂量以及杂交瘤融合起始前免疫的时程。
在一些实施方案中，本公开文本提供使用聚糖相互作用抗体治疗癌症的方法。此类方法可以包括使用抗体药物缀合物(ADC)。ADC可以包括直接地或通过接头附接至聚糖相互作用抗体的细胞毒性缀合物。聚糖相互作用抗体可以结合STn。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括消除癌症干细胞。在一些方面中，聚糖相互作用抗体可以单独使用。在其他方面中，聚糖相互作用抗体是与化学治疗剂组合使用。可以将聚糖相互作用抗体制备为包括一种或多种赋形剂的组合物用于给予至受试者。组合物和给予途径可以按适于实现有效治疗所需的生物利用度、治疗窗和/或分布容积的浓度和剂量提供聚糖相互作用抗体。
另外提供本文所公开的聚糖相互作用抗体的优化、人源化和缀合形式。另外，呈现包括本发明的抗体和/或方法的试剂盒、测定和试剂。
定义
相邻的：如本文所用，术语“相邻的”是指与给定实体毗连、邻近或接近的事物。在一些实施方案中，“相邻残基”是聚糖链内彼此连接的糖残基。在一些实施方案中，“相邻聚糖”是彼此接近的聚糖链，其直接接触或非常靠近并且二者之间不存在另一聚糖。
组合给予：如本文所用，术语“组合给予”或“组合给药”意指受试者同时暴露于在同一时间或在某一时间间隔内给予的两种或更多种药剂，使得受试者在某一时间点同时暴露于两种药剂，和/或使得每种药剂对患者的效应可能存在重叠。在一些实施方案中，至少一个剂量的一种或多种药剂是在至少一个剂量的一种或多种其他药剂的约24小时、12小时、6小时、3小时、1小时、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟或1分钟内给予。在一些实施方案中，以重叠剂量方案进行给予。如本文所用，术语“剂量方案”是指时间上间隔开的多个剂量。此类剂量可以以规则间隔进行，或者给予中可以包括一个或多个间隙。在一些实施方案中，如本文所述的一种或多种聚糖相互作用抗体的各个剂量的给予在一起足够紧密地间隔，使得实现组合(例如，协同)效应。
氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”和“多个氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸以及非天然存在的氨基酸。氨基酸是通过单字母或三字母命名法来标识，如下：天冬氨酸(Asp:D)、异亮氨酸(Ile:I)、苏氨酸(Thr:T)、亮氨酸(Leu:L)、丝氨酸(Ser:S)、酪氨酸(Tyr:Y)、谷氨酸(Glu:E)、苯丙氨酸(Phe:F)、脯氨酸(Pro:P)、组氨酸(His:H)、甘氨酸(Gly:G)、赖氨酸(Lys:K)、丙氨酸(Ala:A)、精氨酸(Arg:R)、半胱氨酸(Cys:C)、色氨酸(Trp:W)、缬氨酸(Val:V)、谷氨酰胺(Gln:Q)、甲硫氨酸(Met:M)、天冬酰胺(Asn:N)，其中首先列出氨基酸，之后在括号中分别列出三字母和单字母代码。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和虫。在一些实施方案中，动物是转基因动物、遗传工程化的动物或克隆。
抗体：如本文所用，术语“抗体”是以最广泛的含义使用，并且明确涵盖多个实施方案，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，从至少两种完整抗体形成的双特异性抗体)和抗体片段，如双抗体，只要其展现所需生物活性即可。抗体是主要基于氨基酸的分子，但是还可以包括一个或多个修饰，如使用糖部分的修饰。
抗体片段：如本文所用，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，优选地包括其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自具有单一抗原结合位点。还产生残留的“Fc”片段，其名称反映其易于结晶化的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。聚糖相互作用抗体可以包括这些片段中的一种或多种。出于本文的目的，抗体可以包括重和轻可变结构域以及Fc区。
抗原结合区：如本文所用，术语“抗原结合区”是指与靶分子或表位直接相互作用的抗体的部分、抗体片段或相关分子。抗原结合区典型地包括可变结构域对，如在抗体的Fab区中或如scFv中连接在一起。
大约：如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所陈述的参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另外陈述或者上下文另有明确含义，否则术语“大约”或“约”是指落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围(这个数字会超过可能值的100％的情况除外)。
与……缔合：如本文所用，术语“与……缔合”、“缀合”、“连接”、“附接”和“栓系”在关于两个或更多个部分使用时意指所述部分直接地或者通过一个或多个用作连接剂的其他部分在物理上彼此缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得所述部分在使用所述结构的条件(例如，生理条件)下保持物理缔合。“缔合”无需严格地通过直接共价化学键合来进行。其还可以暗示离子或氢键合或基于杂化的连接性，其足够稳定以使得“所缔合的”实体保持物理缔合。
双功能：如本文所用，术语“双功能”是指能够发挥或者维持至少两种功能的任何物质、分子或部分。所述功能可能影响相同结果或不同结果。产生所述功能的结构可能相同或不同。
生物分子：如本文所用，术语“生物分子”是任何天然分子，其是基于氨基酸，基于核酸，基于碳水化合物或基于脂质等。
双特异性抗体：如本文所用，术语“双特异性抗体”是指能够结合两种不同抗原的抗体。此类抗体典型地包括来自至少两种不同抗体的区域。双特异性抗体可以包括以下文献中所述的那些抗体中的任一种：Riethmuller,G.2012.Cancer Immunity.12:12-18,Marvin,J.S.等人,2005.Acta Pharmacologica Sinica.26(6):649-58以及Schaefer,W.等人,2011.PNAS.108(27):11187-92，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文。
分支：如本文所用，术语“分支”是指从主要实体或来源连接或伸出的实体、部分或附件。在一些实施方案中，“分支链(branch chain)”或“分支链(branching chain)”包括从母链伸出的一个或多个残基(包括但不限于糖残基)。如本文所用，“母链”用于指分支链所连接的残基链(包括但不限于糖残基)。在具有多个分支的聚糖的情况下，母链还可以指所有此类分支直接或间接附接的源链。在具有己糖残基链的多糖的情况下，母链连接典型地发生在相邻残基的碳1与碳4之间，而分支链通过分支残基的碳1与伸出分支的母残基的碳3之间的连接附接至母链。如本文所用，术语“分支残基”是指附接至分支链中的母链的残基。
癌症干细胞：如本文所用，癌症干细胞(CSC)是指具有自我更新能力的肿瘤细胞子集。CSC可能能够再生多种细胞类型。在一些情况下，这些细胞难以或者不可能通过对肿瘤的手术或者化学治疗来去除。
化合物：如本文所用，术语“化合物”是指独特的化学实体。在一些实施方案中，特定化合物可以以一种或多种异构或同位素形式(包括但不限于立体异构体、几何异构体和同位素)存在。在一些实施方案中，化合物仅以单一的这种形式来提供或利用。在一些实施方案中，化合物是作为两种或更多种此类形式的混合物(包括但不限于立体异构体的外消旋混合物)来提供或利用。本领域技术人员了解，一些化合物以不同的此类形式存在，显示不同特性和/或活性(包括但不限于生物活性)。在此类情况下，本领域普通技术人员熟知选择或避免特定形式的化合物用于根据本发明使用。例如，含有不对称取代碳原子的化合物可以以光学活性或外消旋形式分离。关于如何从光学活性起始材料制备光学活性形式的方法是本领域已知的，如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性合成来制备。
环状或环化的：如本文所用，术语“环状”是指存在连续环。环状分子无需是环形，仅接合以形成不断裂的亚单元链。
胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶：如本文所用，术语“胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶”或“CMAH”是指在人类中不存在，但是在大多数其他哺乳动物(包括但不限于小鼠、猪和黑猩猩)中存在的酶，其催化从N-乙酰神经氨酸形成N-羟乙酰神经氨酸。所述酶在人类中不存在是由于移码突变所致，其导致CMAH转录的过早终止和无功能蛋白的产生。
细胞毒性：如本文所用，术语“细胞毒性”用于指杀伤细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或引起对细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合的有害、毒性或致死效应的药剂。
递送：如本文所用，“递送”是指将化合物、物质、实体、部分、负荷或有效负载运输至预期目的地的动作或方式。
递送剂：如本文所用，“递送剂”是指至少部分促进化合物、物质、实体、部分、负荷或有效负载的体内递送的任何物质。
可检测标记：如本文所用，“可检测标记”是指一种或多种与另一实体附接、合并或缔合的标记物、信号或部分，所述标记物、信号或部分易于通过本领域已知的方法来检测，所述方法包括放射摄影术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等。可检测标记包括放射性同位素、荧光团、生色团、酶、染料、金属离子、配体(如生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素和半抗原)、量子点等。可检测标记可以位于其所附接、合并或缔合的实体中的任何位置。例如，在与肽或蛋白质附接、合并或缔合时，其可以位于氨基酸、肽或蛋白质内，或者位于N末端或C末端。
展示文库：如本文所用，术语“展示文库”是指用于科学发现以鉴定生物分子相互作用的工具。展示文库存在不同变化，包括利用噬菌体、酵母和核糖体。在每种情况下，给定文库内的蛋白质(本文中也称为“文库成员”)连接(物理地或通过与宿主缔合)至编码蛋白质的核酸。在将靶分子与展示文库的成员一起孵育时，可以分离结合至靶标的任何文库成员，并且可以通过分析所连接的核酸来确定编码所结合蛋白的序列。在一些实施方案中，展示文库是“噬菌体展示文库”，其中展示文库是由噬菌体病毒粒子(本文中也称为“噬菌体粒子”)构成，其中已经将核酸并入噬菌体基因组中，导致产生病毒外壳蛋白，所述外壳蛋白融合至由已经引入的核酸编码的蛋白质。此类融合蛋白“展示”于组装噬菌体粒子的外表面上，其中其可以与给定靶标相互作用。
远端：如本文所用，术语“远端”意指远离中心或者远离目的点或目的区域定位。
工程化的：如本文所用，在将本发明的实施方案设计为具有从起始点、野生型或天然分子变化的特征或特性(结构的或化学的)时，所述实施方案是“工程化的”。因此，工程化的药剂或实体是设计和/或产生包括人工动作的那些。
表位：如本文所用，“表位”是指分子上能够与免疫系统的组分(包括但不限于抗体)相互作用的表面或区域。在一些实施方案中，表位可以包括靶位点。表位可以包括抗原上或者两个或更多个抗原之间由相应抗体特异性识别并结合的区域。一些表位可以包括沿着一个或多个聚糖的一个或多个糖残基。此类表位可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10个糖残基。表位还可以包括实体之间的一个或多个相互作用区域。在一些实施方案中，表位可以包括两个糖残基之间、分支链与母链之间或聚糖与蛋白质之间的接合处。
醚键：如本文所用，“醚键”是指包括在两个碳原子之间键合的氧的化学键。在一些实施方案中，醚键将糖残基连接至其他实体，所述实体包括但不限于其他糖残基以形成聚糖链。此类键还被称为“糖苷键”或“糖苷连接”。在至少一个糖残基的情况下，在本文中提及糖苷连接时也使用术语“连接(link)”和/或“连接(linkage)”。在一些实施方案中，连接可以将聚糖连接至其他实体，所述实体包括但不限于蛋白质、脂质、磷脂和鞘酯。在一些实施方案中，糖残基可以连接至蛋白质，典型地形成糖残基与氨基酸残基之间的连接。此类氨基酸残基包括丝氨酸和苏氨酸。在一些实施方案中，醚键通过参与键形成的碳水化合物接头将聚糖连接至聚糖阵列。糖苷连接的立体化学特性可以不同。在一些实施方案中，α取向的糖苷连接(本文中也称为“α连接”)导致醚键的键合氧与糖残基的环己烷环之间的轴向取向。在一些实施方案中，β取向的糖苷连接(本文中也称为“β连接”)导致醚键的键合氧与糖残基的环己烷环之间的赤道取向(equatorial orientation)。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；(4)多肽或蛋白质的折叠；和(5)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
特征：如本文所用，“特征(feature)”是指特征(characteristic)、特性或独特的元素。
配制品：如本文所用，“配制品”是指根据配方制备的材料或混合物，并且其可以包括至少一种抗体、化合物、物质、实体、部分、负荷或有效负载以及递送剂、载体或赋形剂。
功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是具有结构和形式的生物实体，在所述结构和形式中所述生物实体展现其特征性的特性和/或活性。如本文所用，“官能团”或“化学基团”是指作为较大分子的一部分的特征性原子团或化学键。在一些实施方案中，官能团可以与不同分子缔合，但是不论官能团是何种分子的一部分，可以参与类似的化学反应。常见官能团包括但不限于羧基(-COOH)、乙酰基(-COH)、氨基(-NH2)、甲基(-CH3)、硫酸基(-SO3H)和酰基。在一些实施方案中，将一个或多个官能团添加至分子可以使用以词尾“-基化”修饰官能团名称的术语来表达，例如，乙酰基化、甲基化和硫酸化。
聚糖：如本文所用，术语“聚糖”、“寡糖”和“多糖”可以互换使用，并且是指由典型地通过糖苷键(本文中也称为糖苷连接)接合的糖单体构成的聚合物。在一些实施方案中，术语“聚糖”、“寡糖”和“多糖”可以用于指糖缀合物(例如，糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖)的碳水化合物部分。
聚糖链：如本文所用，术语“聚糖链”是指包括两个或更多个糖的糖聚合物。在一些实施方案中，聚糖链通过蛋白质上的丝氨酸或苏氨酸残基共价连接至蛋白质。
富含聚糖的组合物：如本文所用，术语“富含聚糖的组合物”是指包括大比例的聚糖的混合物。在一些实施方案中，富含聚糖的组合物内的聚糖可以占组合物总重量的约1％至约10％、约5％至约15％、约20％至约40％、约30％至约50％、约60％至约80％、约70％至约90％或至少100％。
糖苷键：如本文所用，术语“糖苷键”是指在碳水化合物与另一化学基团之间形成的共价键。在一些实施方案中，糖苷键是在一个糖分子的还原端与第二糖分子或多糖链的非还原端之间形成。此类糖苷键由于所接合糖之间的氧(或醚键)而还被称为O-糖苷键。在一些实施方案中，两个糖之间或者糖与接头之间的糖苷键还可以被称为“连接”。
在体外：如本文所用，术语“在体外”是指在人造环境中(例如，在试管或反应器皿中、在细胞培养中、在培养皿(Petri dish)中等)，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内发生的事件。
在体内：如本文所用，术语“在体内”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的(isolated)”与“分开的(separated)”同义，但是有以下推论：分开是通过人工进行的。在一个实施方案中，分离的物质或实体是已经与至少一些其先前缔合(在自然界中或者在实验环境中)的组分分开的物质或实体。参考曾经缔合的物质，分离的物质可以具有不同纯度水平。分离的物质和/或实体可以从至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其最初所缔合的其他组分分开。在一些实施方案中，分离的药剂是超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则这种物质是“纯的”。
试剂盒：如本文所用，术语“试剂盒”是指包括一种或多种适合于协作目的的组分和其使用说明书的套组。
敲除：如本文所用，术语“敲除”是指生物体，其中现有基因已经通过典型地涉及人工的过程而失活。在敲除生物体中，将已经失活的基因称为已经被“敲除”。在一些实施方案中，敲除基因可以通过将核苷酸序列插入所述基因中或者通过完全替代所述基因而失活。
接头：如本文所用，“接头”是指连接两个或更多个结构域、部分或实体的部分。在一个实施方案中，接头可以包括10、11、12、13、14、15或更多个原子。在另一实施方案中，接头可以包括例如10-1,000个原子的原子团。此类原子或其原子团可以包括但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺。在一些实施方案中，接头可以包括氨基酸、肽、多肽或蛋白质。在一些实施方案中，接头所结合的部分可以包括但不限于原子、化学基团、核苷、核苷酸、核碱基、糖、核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、蛋白质复合物、有效负载(例如，治疗剂)或标记物(包括但不限于化学、荧光、放射性或生物发光标记物)。接头可以用于任何有用目的，如形成多聚体或缀合物，以及给予有效负载，如本文所述。可以并入接头中的化学基团的例子包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、亚杂烷基、芳基或杂环基，其各自可任选地被取代，如本文所述。接头的例子包括但不限于不饱和烷烃、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单元，例如，二乙二醇、二丙二醇、三乙二醇、三丙二醇、四乙二醇或四乙二醇)和葡聚糖聚合物。其他例子包括但不限于接头内的可裂解部分，如例如二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)，其可以使用还原剂或光解来裂解。选择性可裂解键的非限制性例子包括可以例如通过使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其他还原剂和/或光解裂解的酰胺键，以及可以例如通过酸性或碱性水解裂解的酯键。在一些实施方案中，接头是用于将聚糖连接至衬底的碳水化合物部分，如在聚糖阵列中。此类碳水化合物接头包括但不限于-O(CH2)2CH2HN2和-O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2。
mRNA：如本文所用，术语“mRNA”是指由于基因转录和所产生的转录物的加工而产生的信使RNA。在一些实施方案中，可以从细胞或细胞集提取已经离开细胞核的mRNA，并分析以确定在给定时间或在给定的一组情况下哪些基因已经经历转录。
粘蛋白：如本文所用，术语“粘蛋白”是指高度糖基化的蛋白质家族。在一些实施方案中，粘蛋白是由颌下腺产生并且发现于唾液和粘液中。
负向选择：如本文所用，术语“负向选择”是指基于结合不包括靶抗原的实体和/或组合物组分的能力从展示文库选择文库成员。在一些实施方案中，在正向选择之前使用负向选择去除可能非特异性结合至靶标的元素。
脱靶：如本文所用，“脱靶”是指对任何一种或多种靶标、基因或细胞转录物的任何非预期效应。
患者：如本文所用，“患者”是指可能寻求或可能需要治疗、需要治疗、正在接受治疗、将要接受治疗的受试者，或者由受过训练的(例如，得到许可的)职业人员针对特定疾病或病症进行护理的受试者。
肽：如本文所用，“肽”是长度小于或等于50个氨基酸，例如长度为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的蛋白质或多肽。
药学上可接受的：短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类或动物的组织接触，而不产生过多毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指存在于药物组合物中的除了活性剂(例如，如本文所述)以外的任何成分，并且具有在患者中基本上无毒并且非炎症性的特性。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是能够悬浮或溶解活性剂的媒介物。赋形剂可以包括例如：抗粘附剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(颜料)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、风味剂、芳香剂、助流剂(流动促进剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸着剂、悬浮或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁羟甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱式)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、紫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉羟乙酸钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
药学上可接受的盐：本文所述化合物的药学上可接受的盐是所公开化合物的形式，其中酸或碱部分呈其盐形式(例如，如通过使游离碱基团与适宜有机酸反应而产生)。药学上可接受的盐的例子包括但不限于诸如胺等碱性残基的矿物酸盐或有机酸盐；诸如羧酸等酸性残基的碱盐或有机盐等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、十二烷酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒性的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。药学上可接受的盐包括例如来自无毒性无机酸或有机酸的常规无毒盐。在一些实施方案中，药学上可接受的盐是通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物制备。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在水与有机溶剂的混合物中反应来制备；通常，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水性介质是优选的。适宜盐的列表参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑),Wiley-VCH,2008，和Berge等人,Journal of PharmaceuticalScience,66,1-19(1977)，所述文献各自通过引用以其整体并入本文。药学上可接受的溶剂化物：如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂化物”是指化合物的结晶型，其中适宜溶剂的分子并入晶格中。例如，溶剂化物可以通过结晶、重结晶或沉淀从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液中制备。适宜溶剂的例子是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。在水是溶剂时，溶剂化物被称为“水合物”。在一些实施方案中，并入溶剂化物中的溶剂的类型或水平对于被给予溶剂化物的生物体是生理上可耐受的(例如，呈药物组合物的单位剂型)。
药物代谢动力学：如本文所用，“药物代谢动力学”是指分子或化合物的任何一种或多种特性，因为其与给予至活生物体的物质的命运的确定相关。药物代谢动力学被分为若干个领域，包括吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。这一般被称为ADME，其中：(A)吸收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是物质在身体的全部体液和组织中的分散或散布；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物不可逆地转化为子体代谢物；并且(E)排泄(或消除)是指从身体消除物质。在极少情况下，一些药物在身体组织中不可逆地积累。
物理化学：如本文所用，“物理化学”意指或者是关于物理和/或化学特性。
正向选择：如本文所用，术语“正向选择”是指从一组独特实体选择给定实体。此类实体和其组可以是例如抗体。在一些情况下，其可以是抗体片段，或者所表达的抗体片段与能够表达此类片段的药剂(例如，来自展示文库的文库成员)相关。选择可以是基于所选实体结合至所需靶标或表位的能力。在一些实施方案中，正向选择可以与噬菌体展示文库一起用于鉴定表达结合至所需靶标的scFv的噬菌体粒子。在其他实施方案中，正向选择可以是指从抗体池中选择抗体候选者。在其他情况下，实体可以是细胞、细胞系或克隆，如在杂交瘤选择期间克隆的选择中。在此类情况下，正向选择可以是指基于由此类克隆产生的抗体的一种或多种特征(例如，对一种或多种所需表位的特异性)进行的克隆选择。在一些情况下，正向选择方法中的所需表位可以包括STn(例如，AcSTn和/或GcSTn)。
相反，如本文所用的“负向选择”包括针对正向选择所述的相同原理和例子，但是区别特征在于，其用于从一组独特实体去除不需要的实体。
预防：如本文所用，术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、障碍和/或病症的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟从感染、特定疾病、障碍和/或病症的进展；和/或降低发展与感染、疾病、障碍和/或病症相关的病状的风险。
前药：本公开文本还包括本文所述化合物的前药。如本文所用，“前药”是指任何物质、分子或实体，其呈断定所述物质、分子或实体在化学或物理改变后用作治疗剂的形式。前药可以以某种方式进行共价键合或隔离，并且其在被给予至哺乳动物受试者之前、在所述给予时或在所述给予之后释放或转化为活性药物部分。前药可以通过修饰存在于化合物中的官能团来制备，所述修饰的方式使得在常规操纵中或在体内将修饰裂解为母体化合物。前药包括化合物，其中羟基、氨基、巯基或羧基键合至任何基团，所述化合物在给予至哺乳动物受试者时裂解以分别形成游离的羟基、氨基、巯基或羧基。前药的制备和使用论述于以下文献中：T.Higuchi和V.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,”A.C.S.Symposium Series的第14卷；和Bioreversible Carriers in Drug Design,EdwardB.Roche编辑,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987，这两篇参考文献都通过引用以其整体并入本文。
近端：如本文所用，术语“近端”意指更靠近中心或者目的点或区域定位。
相互作用区域：如本文所用，术语“相互作用区域”是指沿着两个或更多个实体中的任一个的区域，其中此类实体相互作用或重叠。在一些实施方案中，相互作用区域可以包括沿着接触第二聚糖链的聚糖链的一个或多个糖残基。在一些实施方案中，聚糖链是来自同一母链的分支链。在一些实施方案中，相互作用区域可以存在于两条聚糖链之间，其中一条链是分支链并且第二链是母链。在聚糖链的情况下，相互作用区域可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10个糖残基。在一些实施方案中，相互作用区域还可以存在于聚糖与蛋白质之间或者聚糖与脂质之间。
残基：如本文所用，术语“残基”是指与聚合物缔合或者能够与聚合物缔合的单体。在一些实施方案中，残基包括糖分子，包括但不限于葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸。在一些实施方案中，残基包括氨基酸。
样品：如本文所用，术语“样品”是指取自来源和/或被提供用于分析或加工的等分试样或部分。在一些实施方案中，样品来自生物来源(本文中也称为“生物样品”)，如组织、细胞或组成部分(例如，体液，包括但不限于血液、血浆、血清、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。在一些实施方案中，样品可以是或包括由完整生物体或其组织、细胞或组成部分的子集、或其碎片或部分(包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官)制备的匀浆液、裂解物或提取物。在一些实施方案中，样品包括培养基，如营养肉汤或凝胶，其可以含有细胞组分，如蛋白质或核酸分子。在一些实施方案中，“初级”样品是所述来源的等分试样。在一些实施方案中，使初级样品经历一种或多种加工(例如，分离、纯化等)步骤以制备用于分析或其他用途的样品。
唾液酸基(Sialyl)：如本文所用，前缀“唾液酸基”以及术语“唾液酸化的”描述包括唾液酸的化合物。
单一单位剂量：如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/以一次/单一途径/单一接触点(即，单一给予事件)给予的任何治疗药的剂量。在一些实施方案中，单一单位剂量是作为离散剂型(例如，片剂、胶囊、贴剂、载药注射器、小瓶等)来提供。
分割剂量：如本文所用，“分割剂量”是将单一单位剂量或总日剂量划分为两个或更多个剂量。
稳定的：如本文所用“稳定的”是指足够稳健以经受从反应混合物分离至有用纯度，并且优选地能够配制为有效治疗剂的化合物或实体。
稳定化：如本文所用，术语“稳定化(stabilize/stabilized)”、“稳定化区域”意指使得或变得稳定。在一些实施方案中，稳定性是相对于绝对值来测量。在一些实施方案中，稳定性是相对于参考化合物或实体来测量。
护理标准：如本文所用，短语“护理标准”是指治疗性治疗的方法，其与大多数熟练提供这种治疗的技术人员所实践的方法一致。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指可以给予根据本发明的组合物的任何生物体，例如，用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)和/或植物。
颌下腺：如本文所用，术语“颌下腺”或“下颌下腺”是指位于口底下方的粘液产生腺。这些腺体能够产生粘蛋白，并且在一些实施方案中，可以作为粘蛋白的来源从哺乳动物提取。
患有：“患有”疾病、障碍和/或病症的个体已经被诊断具有或者展示疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状。
易患：“易患”疾病、障碍和/或病症的个体尚未被诊断具有和/或可能不展现所述疾病、障碍和/或病症的症状，但是具有发展疾病或其症状的倾向。在一些实施方案中，易患疾病、障碍和/或病症(例如，癌症)的个体的特征可以是以下中的一种或多种：(1)与疾病、障碍和/或病症的发展相关的基因突变；(2)与疾病、障碍和/或病症的发展相关的遗传多态性；(3)与疾病、障碍和/或病症相关的蛋白质和/或核酸的增加和/或降低的表达和/或活性；(4)与疾病、障碍和/或病症的发展相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、障碍和/或病症的家族史；和(6)暴露于与疾病、障碍和/或病症的发展相关的微生物和/或被所述微生物感染。在一些实施方案中，易患疾病、障碍和/或病症的个体将发展疾病、障碍和/或病症。在一些实施方案中，易患疾病、障碍和/或病症的个体不会发展疾病、障碍和/或病症。
合成的：术语“合成的”意指通过人工产生的、制备的和/或制造的。本发明的多核苷酸或多肽或其他分子的合成可以是化学合成或酶促合成。
靶标：如本文所用，术语“靶标”是指要受作用影响的对象或实体。在一些实施方案中，靶标是指抗原，其要用于发展特异性结合所述抗原的抗体。
靶标筛选：如本文所用，术语“靶标筛选”是指使用靶物质来鉴定所述物质的结合配偶体。
靶位点：如本文所用，术语“靶位点”是指在细胞、细胞外隙、组织、器官和/或生物体上或其内，在一种或多种聚糖、糖蛋白、生物分子和/或生物结构上或其内，由结合剂或效应分子(例如，抗体)识别的区域。在一些实施方案中，聚糖靶位点可以仅位于一个糖残基上，可以由两个或更多个残基形成，或者可以同时包括聚糖和非聚糖组分。在一些实施方案中，靶位点是在两个或更多个聚糖或糖蛋白之间形成。在一些实施方案中，靶位点是在同一聚糖的分支链之间或者在一个或多个分支链与母链之间形成。
所靶向细胞：如本文所用，“所靶向细胞”是指一个或多个目的细胞中的任一个。所述细胞可以在任何生物体的体外、体内、原位或者组织或器官中发现。所述生物体可以是动物、哺乳动物或人(例如，人类患者)。
末端残基：如本文所用，术语“末端残基”是指聚合链中的最后一个残基。在一些实施方案中，末端残基是位于多糖链的非还原端的糖残基。
治疗性：如本文所用，术语“治疗性”是指涉及治愈疾病、障碍或病症的任何物质或程序。例如，治疗性治疗是指涉及治愈疾病、障碍或病症的任何治疗。
治疗剂：术语“治疗剂”是指在给予至受试者时具有治疗、诊断和/或预防效应和/或引发所需的生物和/或药理学效应的任何物质。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指要递送的药剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)在给予至患有或易患感染、疾病、障碍和/或病症的受试者时，足以治疗所述感染、疾病、障碍和/或病症，改善所述感染、疾病、障碍和/或病症的症状，诊断所述感染、疾病、障碍和/或病症，预防所述感染、疾病、障碍和/或病症，和/或延迟所述感染、疾病、障碍和/或病症的发作的量。在一些实施方案中，治疗有效量是以单一剂量提供。在一些实施方案中，治疗有效量是以包括多次剂量的剂量方案来给予。本领域技术人员将认识到，在一些实施方案中，如果单位剂型包括在作为这个剂量方案的一部分给予时有效的量，则可以认为所述单位剂型包括特定药剂或实体的治疗有效量。
治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、障碍和/或病症的受试者中足以治疗所述感染、疾病、障碍和/或病症，改善所述感染、疾病、障碍和/或病症的症状，诊断所述感染、疾病、障碍和/或病症，预防所述感染、疾病、障碍和/或病症，和/或延迟所述感染、疾病、障碍和/或病症的发作的结果。
总日剂量：如本文所用，“总日剂量”是在24小时时段中给予或指定的量。其可以作为单一单位剂量给予。
转基因的：如本文所用，术语“转基因的”是指包括一个或多个并入生物体基因组内的并非天然在所述生物体中发现的基因的生物体。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、治愈、减轻、改善、解除特定感染、疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征，延迟所述症状或特征的发作，抑制所述症状或特征的进展，降低所述症状或特征的严重程度，和/或降低所述症状或特征的发病率。例如，“治疗”癌症可以是指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。可以将治疗给予至没有展现疾病、障碍和/或病症的体征的受试者，和/或给予至仅展现疾病、障碍和/或病症的早期体征的受试者，用于降低发展与所述疾病、障碍和/或病症相关的病状的风险的目的。
可变区：如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”是指特定抗体结构域，其只有序列在抗体之间不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。
全IgG：如本文所用，术语“全IgG”是指完全IgG分子。在一些实施方案中，全IgG分子包括在两种或更多种其他生物体中天然发现的区域。
野生型：如本文所用，术语“野生型”是指包括天然基因组(不含衍生自其他生物体的基因)的生物体。
I.化合物和组合物
在一些实施方案中，本发明提供包括至少一种聚糖相互作用抗体的化合物以及组合物。在聚糖内，单糖单体可以都相同或者其可以不同。常见单体包括但不限于丙糖、丁糖、戊糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、核糖、甘露庚酮糖、景天庚酮糖和塔罗糖。氨基糖也可以是聚糖内的单体。包括此类糖的聚糖在本文中被称作氨基聚糖。如本文所用，氨基糖是包括氨基代替羟基的糖分子，或者在一些实施方案中，是衍生自这种糖的糖。氨基糖的例子包括但不限于葡糖胺、半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸(包括但不限于N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸)和L-柔胺。
如本文所用，术语“聚糖相互作用抗体”是指可以与聚糖部分相互作用的抗体。此类抗体可以结合至单独的聚糖部分，结合至多个聚糖部分，或结合至同时包括聚糖和非聚糖组分的表位。非聚糖组分可以包括但不限于蛋白质、蛋白质相关部分(如翻译后修饰)、细胞和细胞相关分子/结构。聚糖相互作用抗体可以发挥功能以结合至、改变、激活、抑制、稳定化、降解和/或调节聚糖或聚糖相关分子或实体。在这个过程中，聚糖相互作用抗体可以用作治疗药(无论是否是姑息性的)、预防药或作为持续的治疗组合物。在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体可以包括与其他分子的缀合物或组合。在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体是针对具有一个或多个氨基糖的聚糖。在另一实施方案中，一个或多个氨基糖是唾液酸。在另一实施方案中，一个或多个唾液酸是N-乙酰神经氨酸和/或N-羟乙酰神经氨酸。
抗体
聚糖相互作用抗体可以包括整个抗体或其片段。如本文所用，术语“抗体”是以最广泛含义使用并且包含各种形式，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，从至少两种完整抗体形成的双特异性抗体)、抗体缀合物(包括但不限于抗体-药物缀合物)、抗体变体[包括但不限于抗体模拟物、嵌合抗体(例如，具有衍生自多于一种物种的氨基酸序列的抗体)和合成变体]和抗体片段，只要其展现所需生物活性(例如，结合、激活、抑制、稳定化、降解和/或调节一个或多个靶标)即可。抗体是主要基于氨基酸的分子，但是可以包括一种或多种翻译后修饰或合成修饰。翻译后修饰可以包括糖基化。
如本文所用，术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分或其融合蛋白，在一些情况下包括至少一个抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链可变片段(scFv)；双抗体；三抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自具有单一抗原结合位点。还产生残留的“Fc”片段，其名称反映其易于结晶化的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。聚糖相互作用抗体可以包括这些片段中的一种或多种，并且可以例如通过全抗体的酶促消化或通过重组表达来产生。
“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。编码抗体重链和轻链的基因是已知的并且构成每个基因的区段已经被充分表征和描述(Matsuda,F.等人,1998.The Journal of ExperimentalMedicine.188(11)；2151-62和Li,A.等人,2004.Blood.103(12:4602-9，上述各文献的内容都是通过引用以其整体并入本文)。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，并在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。
如本文所用，术语“可变结构域”是指同时在抗体重链和轻链上发现的特定抗体结构域，其只有序列在抗体之间不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变结构域包括超变区。如本文所用，术语“超变区”是指可变结构域内包括负责抗原结合的氨基酸残基的区域。存在于超变区内的氨基酸决定互补决定区(CDR)的结构，所述互补决定区成为抗体的抗原结合位点的一部分。如本文所用，术语“CDR”是指抗体中包括与其靶抗原或表位互补的结构的区域。可变结构域中不与抗原相互作用的其他部分被称为框架(FW)区。抗原结合位点(也称为抗原组合位点或互补位)包括与特定抗原相互作用所需的氨基酸残基。构成抗原结合位点的确切残基典型地通过所结合抗原的共结晶学来阐明，但是还可以基于与其他抗体的比较使用计算评估(Strohl,W.R.Therapeutic AntibodyEngineering.Woodhead Publishing,Philadelphia PA.2012.第3章,第47-54页，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。确定构成CDR的残基可以包括使用编号方案，包括但不限于由以下文献所教示的那些Kabat[Wu,T.T.等人,1970,JEM,132(2):211-50和Johnson,G.等人,2000,Nucleic Acids Res.28(1):214-8，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文]，Chothia[Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196,901(1987)，Chothia等人,Nature 342,877(1989)和Al-Lazikani,B.等人,1997,J.Mol.Biol.273(4):927-48，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文]，Lefranc(Lefranc,M.P.等人,2005,ImmunomeRes.1:3)和Honegger(Honegger,A.和Pluckthun,A.2001.J.Mol.Biol.309(3):657-70，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
VH和VL结构域各自具有三个CDR。在沿着可变结构域多肽从N末端至C末端移动时，按出现顺序，VL CDR在本文中被称作CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在沿着可变结构域多肽从N末端至C末端移动时，按出现顺序，VH CDR在本文中被称作CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。每个CDR具有有利的规范结构，但CDR-H3除外，其包括序列和长度在抗体之间可能高度可变的氨基酸序列，导致抗原结合结构域中的多种三维结构(Nikoloudis,D.等人,2014.PeerJ.2:e456)。在一些情况下，可以在一组相关抗体中分析CDR-H3以评估抗体多样性。各种确定CDR序列的方法是本领域已知的，并且可以应用于已知的抗体序列(Strohl,W.R.TherapeuticAntibody Engineering.Woodhead Publishing,Philadelphia PA.2012.第3章,第47-54页，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
如本文所用，术语“Fv”是指包括抗体上形成完全抗原结合位点所需的最小片段的抗体片段。这些区域是由一个重链和一个轻链可变结构域的紧密非共价缔合的二聚体组成。Fv片段可以通过溶蛋白性裂解来产生，但是大多不稳定。本领域中已知重组方法用于产生稳定的Fv片段，典型地通过在轻链可变结构域与重链可变结构域之间插入柔性接头[以形成单链Fv(scFv)]或通过在重链与轻链可变结构域之间引入二硫桥来进行(Strohl,W.R.Therapeutic Antibody Engineering.Woodhead Publishing,PhiladelphiaPA.2012.第3章,第46-47页，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
可以将来自任何脊椎动物物种的抗体“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列分配至两种明显不同的类型(称为κ和λ)中之一。根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分配至不同类别。完整抗体存在五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可以将这些类别中的若干种进一步分为子类(同种型)，例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。
如本文所用，术语“单链Fv”或“scFv”是指VH和VL抗体结构域的融合蛋白，其中这些结构域通过柔性肽接头连接在一起成为单一多肽链。在一些实施方案中，Fv多肽接头使得scFv能形成抗原结合的所需结构。在一些实施方案中，scFv是与噬菌体展示、酵母展示或其他展示方法结合使用，其中scFv可以与表面成员(例如，噬菌体外壳蛋白)结合表达，并且用于鉴定给定抗原的高亲和性肽。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括连接至同一多肽链中的轻链可变结构域VL的重链可变结构域VH。通过使用过短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如以下文献中：EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)，上述各项的内容都是通过引用以其整体并入本文。
术语“胞内抗体”是指不从产生其的细胞分泌，而是靶向一种或多种细胞内蛋白的抗体形式。胞内抗体可以用于影响多种细胞过程，包括但不限于细胞内运输、转录、翻译、代谢过程、增殖信号传导和细胞分裂。在一些实施方案中，本发明的方法可以包括基于胞内抗体的疗法。在一些此类实施方案中，本文所公开的可变结构域序列和/或CDR序列可以并入一个或多个构建体中用于基于胞内抗体的疗法。在一些情况下，本发明的胞内抗体可以靶向一种或多种糖化细胞内蛋白或者可以调节一种或多种糖化细胞内蛋白与替代性蛋白之间的相互作用。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程化以在免疫效应细胞的表面上表达的人工受体，其导致此类免疫效应细胞特异性靶向表达以高亲和性与所述人工受体结合的实体的细胞。CAR可以被设计为包括抗体、抗体可变结构域和/或抗体CDR的一个或多个区段，使得在此类CAR于免疫效应细胞上表达时，免疫效应细胞结合并清除由CAR的抗体部分识别的任何细胞。在一些情况下，CAR被设计为特异性结合癌细胞，导致癌细胞的免疫相关的清除。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的细胞(或克隆)的群体获得的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，但是在单克隆抗体产生期间出现的可能的变体除外，此类变体通常以少量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
修饰语“单克隆”指示抗体的特征为，是从基本上同质的抗体群获得，并且不应视为需要通过任何特定方法产生抗体。本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段。
非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者抗体的超变区的残基由来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的抗体(供者抗体)的超变区的残基替代，所述人源化抗体具有所需的特异性、亲和性和能力。人源化抗体可以包括一种或多种回复突变，包括一个或多个氨基酸逆转变回在供者抗体中发现的氨基酸。相反，人源化抗体中所包括的来自供者抗体的残基可以突变以匹配存于人类受者抗体中的残基。
在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体可以是抗体模拟物。术语“抗体模拟物”是指模拟抗体的功能或效应的任何分子，并且其以高亲和性特异性结合至其分子靶标。在一些实施方案中，抗体模拟物可以是单抗体，其被设计为并入纤连蛋白III型结构域(Fn3)作为蛋白质支架(US 6,673,901；US 6,348,584)。在一些实施方案中，抗体模拟物可以是本领域中已知的那些，包括但不限于亲和体(affibody)分子、人泛蛋白(affilin)、affitin、抗运载蛋白、avimer、DARPin、Fynomer和Kunitz以及结构域肽。在其他实施方案中，抗体模拟物可以包括一个或多个非肽区。
如本文所用，术语“抗体变体”是指结构、序列和/或功能与抗体类似，但是其氨基酸序列、组成或结构如与另一种抗体或天然抗体相比包括一些差异的生物分子。
抗体研发
研发本发明的聚糖相互作用抗体以结合抗原，如本文所述的那些。如本文所用，“抗原”是诱导或唤起生物体中的免疫应答的实体。免疫应答的特征为生物体的细胞、组织和/或器官与外来实体的存在反应。这种免疫应答典型地导致生物体产生一种或多种针对外来实体(例如，抗原或抗原的一部分)的抗体。在一些情况下，可以基于一种或多种所需免疫结果改变免疫方法。如本文所用，术语“免疫结果”是指免疫的一种或多种所需效应。例子包括高抗体效价和/或增加的对目的靶标的抗体特异性。
本发明抗原可以包括聚糖、糖缀合物(包括但不限于糖蛋白和糖脂)、肽、多肽、融合蛋白或前述中的任一种，并且可以与一种或多种单独的佐剂或异源蛋白缀合或复合。在一些实施方案中，根据本发明方法使用的抗原可以包括唾液酸化聚糖，如STn。具有STn的抗原可以包括粘蛋白。粘蛋白是高度糖基化的蛋白质家族。其是源自上皮细胞的许多种肿瘤的组分(Ishida,A.等人,2008.Proteomics.8:3342-9，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。其由颌下腺高度表达并且可以以高水平发现于唾液和粘液中。动物衍生的颌下腺粘蛋白可以用作抗原以在免疫原性宿主中产生抗STn抗体。关于AcSTn与GcSTn形式，来自不同物种的颌下腺粘蛋白的STn含量不同。猪颌下腺粘蛋白(PSM)特别富含GcSTn，GcSTn占总STn的约90％。来自牛颌下腺粘蛋白(BSM)的STn包括百分比大致相等的GcSTn和AcSTn。绵羊颌下腺粘蛋白(OSM)特别富含AcSTn，AcSTn占总STn的约90％。在一些情况下，可以根据从免疫获得的抗体的所需靶标，修饰所制备用于这种免疫的溶液，以包括PSM、BSM和OSM中的一种或多种。PSM可以用于免疫以在免疫原性宿主中产生更有可能对GcSTn具有特异性的抗体。PSM富含用GcSTn修饰的含有Neu5Gc的粘蛋白型糖蛋白。目前已知的高Neu5Gc含量的来源是红肉；先前尤其将颌下腺描述为Neu5Gc的丰富来源，这是因为CMAH酶的高表达，所述酶催化反应以产生Neu5Gc前体CMP-Neu5Ac。在一些情况下，PSM可以用于预防泛抗Neu5Gc反应并诱导特异性更强的针对GcSTn的免疫应答。OSM可以用于免疫以在免疫原性宿主中产生更有可能对AcSTn具有特异性的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供具有GcSTn特异性的聚糖相互作用抗体。所述抗体对Neu5Ac-STn或Tn具有极少交叉反应性。所述抗体可以结合GcSTn，但是对AcSTn的亲和性下降。
在一些实施方案中，可以在免疫之前使抗原经历酶促消化，以调节免疫原性宿主中的所得免疫应答。在一个例子中，可以在免疫之前用胰蛋白酶或蛋白水解酶K酶处理颌下腺粘蛋白。此类酶的活性可以有助于裂解除去非STn表位，并由此降低非STn表位的百分比和可变性。聚糖部分可以保护其所附接的肽区域免受酶促蛋白质水解，并由此保持完整。
根据在此类免疫中使用的抗原的类型和量，免疫所得的抗体效价可以具有不同抗体水平。在一些情况下，可以基于预期的效价选择某些抗原用于免疫。
如本文所用，“佐剂”是药理学或免疫学药剂，其修饰其他药剂的效应。根据本发明的佐剂包括但不限于化学组合物、生物分子、治疗药和/或治疗方案。佐剂可以包括Freund佐剂(完全和/或不完全)、免疫刺激性寡核苷酸[例如，CpG寡脱氧核苷酸(ODN)]、含矿物组合物、细菌ADP核糖基化毒素、生物粘合剂、粘膜粘合剂、微粒、脂质、脂质体、胞壁酰肽、N-氧化聚乙烯-哌嗪衍生物、皂苷和/或免疫刺激复合物(ISCO)。在一些实施方案中，佐剂可以包括水包油乳液(例如，亚微米水包油乳液)。根据本发明的佐剂还可以包括美国专利公开号US 20120027813和/或美国专利号US 8506966中所披露的那些中的任一种，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文。
本发明的抗体可以是多克隆或单克隆或重组的，通过本领域中已知的方法产生或者如本申请中所述。在一些实施方案中，为了检测的目的，可以用本领域技术人员已知的可检测标记对本发明的抗体进行标记。标记可以是放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、酶或酶辅因子，或者本领域中已知的任何其他标记。在一些方面中，结合至所需抗原的抗体未经标记，但是可以通过特异性结合至一级抗体的经标记二级抗体的结合来检测。
本发明的抗体(例如，聚糖相互作用抗体)包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、通过Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明抗体的抗Id抗体)、细胞内产生的抗体(即，胞内抗体)和上述任一种的表位结合片段。本发明的抗体(例如，聚糖相互作用抗体)可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物。优选地，此类抗体具有人、鼠类(例如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、荷兰猪、骆驼、马或鸡来源。本发明的抗体可以具有单特异性或多特异性(例如，双特异性、三特异性或更高多特异性)。多特异性抗体可以对本发明的靶抗原的不同表位具有特异性，或者可以对本发明的靶抗原和异源表位(如异源聚糖、肽或固体支持材料)二者都具有特异性。(参见，例如，WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt,A.等人,Trispecific F(ab')3derivatives that use cooperative signaling viathe TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic Tcells.J Immunol.1991年7月1日；147(1):60-9；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；和Kostelny,S.A.等人,Formation of a bispecificantibody by the use of leucine zippers.J Immunol.1992年3月1日；148(5):1547-53)。
本公开文本的聚糖相互作用抗体可以使用本领域中已知的用于研发单克隆抗体的完善方法来制备。在一个实施方案中，单克隆抗体是使用杂交瘤技术来制备(Kohler,G.等人,Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity.Nature.1975年8月7日；256(5517):495-7)。对于杂交瘤形成，首先，将小鼠、仓鼠或其他适当宿主动物典型地用免疫剂(例如，本发明的靶抗原)进行免疫，以引发产生或能够产生将特异性结合至免疫剂的抗体的淋巴细胞。可替代地，淋巴细胞可以在体外进行免疫。然后使用适宜融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,J.W.,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice.AcademicPress.1986；59-1031)。永生化细胞系通常是经转化哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、兔、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可以将杂交瘤细胞在适宜培养基中培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺少酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT缺陷型细胞生长。
优选的永生化细胞系是如下的那些：有效融合，支持所选抗体产生细胞中抗体的稳定高水平表达，并且对诸如HAT培养基等培养基敏感。更优选的永生化细胞系是鼠类骨髓瘤系，其可以例如从索尔克研究所细胞配送中心(Salk Institute Cell DistributionCenter，圣地亚哥，加利福尼亚州)和美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection，马纳萨斯，维吉尼亚州)获得。也已经描述人骨髓瘤和小鼠-人种间骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor,D.等人,A human hybrid myeloma for production ofhuman monoclonal antibodies.J Immunol.1984年12月；133(6):3001-5；Brodeur,B.等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications.Marcel Dekker,Inc.,纽约.1987；33:51-63)。
在一些实施方案中，可以使骨髓瘤细胞经历基因操纵。这种操纵可以使用如本文所述的锌指核酸酶(ZFN)诱变来实施。可替代地，可以使用本领域中已知的转染方法。可以使用NS0骨髓瘤细胞或其他小鼠骨髓瘤细胞系。例如，Sp2/0-Ag14可以是杂交瘤研发的替代性细胞系。
转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)诱导的基因编辑提供替代性基因敲除方法。TALEN是通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合产生的人工限制性酶。与ZFN类似，TALEN诱导所需基因座处的双链断裂，这可以通过易错NHEJ修复以在断裂位点产生插入/缺失(Wood,A.J.等人,Targeted genome editing across species using ZFNsand TALEN.Science.2011年7月15日；333(6040):307)。Cellectis Bioresearch(剑桥，马萨诸塞州)提供TALEN设计和质粒构建的服务。然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中单克隆抗体的存在。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性(即，特异性免疫反应性)是通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。此类技术和测定是本领域技术人员已知的。单克隆抗体的结合特异性可以例如通过Scatchard分析来确定(Munson,P.J.等人,Ligand:a versatile computerizedapproach for characterization of ligand-binding systems.Anal Biochem.1980年9月1日；107(1):220-39)。在一些情况下，对给定抗原的区域的抗体特异性可以通过在测定抗体结合之前对抗原进行化学修饰来表征。在一个例子中，可以使用高碘酸盐处理来破坏唾液酸的C6侧链。测定可以使用和不使用高碘酸盐处理来实施，以揭示未处理样品中的结合是否具有唾液酸特异性。在一些情况下，可以使具有9-O-乙酰化唾液酸的抗原经历温和碱处理(例如，使用0.1M NaOH)以破坏9-O-乙酰基。测定可以使用和不使用温和碱处理来实施，以揭示未处理样品中的结合是否依赖于唾液酸的9-O-乙酰化。
在鉴定所需的杂交瘤细胞后，可以将克隆通过有限稀释程序进行亚克隆，并且通过标准方法生长。用于这个目的的适宜培养基包括例如达尔伯克改良伊格尔培养基或RPMI-1640培养基。可替代地，杂交瘤细胞可以作为哺乳动物中的腹水在体内生长。
克隆杂交瘤的替代性方法可以包括由来自STEMCELL Technologies(温哥华，BC，加拿大)的试剂盒(例如，ClonaCellTM-HY试剂盒)提供的那些，所述试剂盒含有基于甲基纤维素的半固体培养基以及其他培养基和试剂，以支持杂交瘤克隆的选择和生长。然而，这个试剂盒中的培养基含有FCS，其提供用于Neu5Gc并入的外部来源。虽然内源Neu5Gc合成的机构在Cmah-/-杂交瘤中被破坏，但是从培养基并入的Neu5Gc在一些情况下也会造成问题(Bardor,M.等人,Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialicacid N-glycolylneuraminic acid into human cells.J Biol Chem.2005.280:4228-4237)。在此类情况下，培养基可以补充有Neu5Ac以通过代谢竞争消除Neu5Gc并入(Ghaderi,D.等人,Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid inrecombinant therapeutic glycoproteins.Nat Biotechnol.2010.28:863-867)。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序从培养基或腹水液体分离或纯化，所述纯化程序如例如蛋白A-琼脂糖、氢氧磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体还可以通过重组DNA方法来制造，如美国专利号4,816,567中所述的那些，所述专利通过引用以其整体并入本文。编码本发明的单克隆抗体的DNA可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序。本发明的杂交瘤细胞用作DNA的优选来源。在分离后，可将DNA置入表达载体中，然后将其转染至宿主细胞中。宿主细胞可以包括但不限于HEK293细胞、HEK293T细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和骨髓瘤细胞，所述细胞不以其他方式产生免疫球蛋白，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠类序列(美国专利号4,816,567)或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价接合至免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本发明的抗体的恒定结构域，或者可以取代本发明的抗体的一个抗原组合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体(例如，聚糖相互作用抗体)可以通过本领域技术人员已知的各种程序产生。对于多克隆抗体在体内的产生，用游离的或与载体偶合的抗原，例如通过腹膜内和/或真皮内注射对宿主动物(如兔、大鼠、小鼠、母牛、马、驴s、鸡、猴子、绵羊或山羊)进行免疫。在一些实施方案中，注射材料可以是含有约100μg抗原或载体蛋白的乳液。在一些实施方案中，注射材料可以包括溶液中的富含聚糖的组合物(如非人哺乳动物颌下腺粘蛋白)。还可以根据宿主物种使用各种佐剂增加免疫应答。佐剂包括但不限于Freund(完全和不完全)、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、普朗尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、(CytRx Corp，洛杉矶，加利福尼亚州))、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人佐剂(如BCG(卡介苗，bacilleCalmette-Guerin))和小棒杆菌(corynebacterium parvum)。此类佐剂也是本领域中所熟知的。可能需要例如以约两周的间隔进行若干次加强注射，以提供可以例如通过ELISA测定使用聚糖和/或吸附到固体表面的游离肽检测的有用抗体效价。来自经免疫动物的血清中的抗体效价可以通过抗体的选择来增加，例如，根据本领域所熟知的方法通过将抗原吸附至固体支持物上并洗脱所选抗体来进行选择。
可以使用高通量发现方法选择并产生聚糖相互作用抗体、其变体和片段。在一个实施方案中，通过使用展示文库来产生包括合成抗体的聚糖相互作用抗体、其变体和片段。如本文所用，术语“展示”是指蛋白质或肽在给定宿主的表面上的表达或“展示”。如本文所用，术语“文库”是指独特cDNA序列和/或其所编码的蛋白质的集合。文库可以含有从少至两个独特cDNA至数千亿个独特cDNA。在一些实施方案中，是合成抗体的聚糖相互作用抗体是使用抗体展示文库或抗体片段展示文库来产生。如本文所用，术语“抗体片段展示文库”是指展示文库，其中每个成员编码含有抗体的至少一个可变区的抗体片段。此类抗体片段优选地是Fab片段，但是也考虑其他抗体片段，如单链可变片段(scFv)。在Fab抗体片段文库中，每个所编码的Fab可以相同，但是含在Fab片段的互补决定区(CDR)的可变环内的氨基酸序列除外。在替代性或其他实施方案中，各个VH和/或VL区域内的氨基酸序列也可以不同。
展示文库可以在多种可能的宿主中表达，包括但不限于酵母、噬菌体、细菌和反转录病毒。可以使用的其他展示技术包括核糖体展示、微珠展示和蛋白质-DNA连接技术。在优选实施方案中，Fab展示文库在酵母中或在噬菌体(bacteriophage)(本文中也称为“噬菌体(phage)”或“噬菌体粒子”)中表达。在表达时，Fab修饰噬菌体或酵母的表面，其中所述Fab可以与给定抗原相互作用。包括聚糖的抗原或来自所需靶标的其他抗原可以用于选择表达对所述抗原具有最高亲和性的抗体片段的噬菌体粒子或酵母细胞。然后可以通过使用所结合颗粒或细胞进行测序来确定编码所结合抗体片段的CDR的DNA序列。在一个实施方案中，在抗体研发中使用正向选择。在一些实施方案中，在抗体研发中利用负向选择。在一些实施方案中，在使用展示文库的抗体研发中的多轮选择期间，同时利用正向和负向选择方法。
在酵母展示中，将编码不同抗体片段的cDNA引入酵母细胞中，其中所述cDNA表达并且抗体片段在细胞表面上“展示”，如以下文献中所述：Chao等人(Chao,G.等人,Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display.NatProtoc.2006；1(2):755-68)。在酵母表面展示中，所表达的抗体片段可以含有包括酵母凝集素蛋白Aga2p的额外结构域。这个结构域允许抗体片段融合蛋白通过与表面表达的Aga1p形成二硫键来附接至酵母细胞的外表面。产生包被于特定抗体片段中的酵母细胞。最初利用编码这些抗体片段的cDNA的展示文库，其中抗体片段各自具有独特序列。这些融合蛋白是在数百万个酵母细胞的细胞表面上表达，其中所述融合蛋白可以与所需抗原性靶抗原相互作用，与所述细胞一起孵育。可以以共价方式或其他方式用化学或磁性基团修饰靶抗原，以允许在与适宜抗体片段成功结合后进行有效细胞分选。回收可以借助磁性激活的细胞分选(MACS)、荧光激活的细胞分选(FACS)或本领域中已知的其他细胞分选方法来进行。一旦选择了酵母细胞的子群体，可以分析相应质粒以确定CDR序列。
噬菌体展示技术典型地利用丝状噬菌体，包括但不限于fd、F1和M13病毒粒子。此类毒株是非溶解的，允许宿主继续繁殖和增加病毒效价。可以用于制造本发明的抗体的噬菌体展示方法的例子包括以下文献中所披露的那些：Miersch等人(Miersch,S.等人,Synthetic antibodies:Concepts,potential and practicalconsiderations.Methods.2012年8月；57(4):486-98)，Bradbury等人(Bradbury,A.R.等人,Beyond natural antibodies:the power of in vitro display technologies.NatBiotechnol.2011年3月；29(3):245-54)，Brinkman等人(Brinkmann,U.等人,Phagedisplay of disulfide-stabilized Fv fragments.J Immunol Methods.1995年5月11日；182(1):41-50)；Ames等人(Ames,R.S.等人,Conversion of murine Fabs isolated froma combinatorial phage display library to full length immunoglobulins.JImmunol Methods.1995年8月18日；184(2):177-86)；Kettleborough等人(Kettleborough,C.A.等人,Isolation of tumor cell-specific single-chain Fv from immunized miceusing phage-antibody libraries and the re-construction of whole antibodiesfrom these antibody fragments.Eur J Immunol.1994年4月；24(4):952-8)；Persic等人(Persic,L.等人,An integrated vector system for the eukaryotic expression ofantibodies or their fragments after selection from phage displaylibraries.Gene.1997年3月10日；187(1):9-18)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开案WO90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108，上述各文献通过引用以其整体并入本文。噬菌体上的抗体片段表达可以通过将编码所述片段的cDNA插入表达病毒外壳蛋白的基因中来实施。丝状噬菌体的病毒外壳是由五种外壳蛋白构成，所述外壳蛋白由单链基因组编码。外壳蛋白pIII是抗体片段表达的优选蛋白，典型地位于N末端。如果抗体片段表达影响pIII的功能，则可以通过野生型pIII的共表达恢复病毒功能，但是这种表达将减少在病毒外壳上表达的抗体片段的数目，但是可以促进靶抗原到达抗体片段。病毒蛋白以及抗体片段蛋白的表达可以替代地在多个质粒上编码。这种方法可以用于减小感染性质粒的总体大小并增强转化效率。
如上所述，在选择表达高亲和性抗体或抗体片段(例如，聚糖相互作用抗体)的宿主后，可以分离来自抗体或抗体片段的编码区并用于产生全抗体(包括人抗体)或任何其他所需抗原结合片段，并且在任何所需宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述。
在称为亲和性成熟的过程中，编码高亲和性抗体的DNA序列可以突变用于其他轮选择。如本文所用，术语“亲和性成熟”是指通过编码抗体或抗体片段的cDNA序列的连续几轮突变和选择，产生具有增加的对给定抗原的亲和性的抗体的方法。在一些情况下，这个过程是在体外实施。为了完成这个过程，可以使用易错PCR实施CDR编码序列的扩增，以产生数百万个含有突变的拷贝，所述突变包括但不限于点突变、区域突变、插入突变和缺失突变。如本文所用，术语“点突变”是指核酸突变，其中核苷酸序列内的一个核苷酸变为不同的核苷酸。如本文所用，术语“区域突变”是指核酸突变，其中两个或更多个连续核苷酸变为不同的核苷酸。如本文所用，术语“插入突变”是指核酸突变，其中将一个或多个核苷酸插入核苷酸序列中。如本文所用，术语“缺失突变”是指核酸突变，其中从核苷酸序列去除一个或多个核苷酸。插入或缺失突变可以包括完全替代整个密码子或者通过改变起始密码子的一个或两个核苷酸使一个密码子变为另一个密码子。
可以对CDR编码cDNA序列实施诱变以产生数百万个在CDR重链和轻链区域中具有单一突变的突变体。在另一种方法中，仅在最有可能改善亲和性的CDR残基处引入随机突变。这些新产生的诱变文库可以用于重复所述过程以筛选编码对靶抗原具有甚至更高亲和性的抗体片段的克隆。连续几轮突变和选择促进具有越来越高亲和性的克隆的合成(Chao,G.等人,Isolating and engineering human antibodies using yeast surfacedisplay.Nat Protoc.2006；1(2):755-68)。
可以用于产生抗体和抗体片段(如Fab和scFv)的技术的例子包括以下文献中所述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Miersch等人(Miersch,S.等人,Syntheticantibodies:Concepts,potential and practical considerations.Methods.2012年8月；57(4):486-98)，Chao等人(Chao,G.等人,Isolating and engineering human antibodiesusing yeast surface display.Nat Protoc.2006；1(2):755-68)，Huston等人(Huston,J.S.等人,Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusionproteins.Methods Enzymol.1991；203:46-88)；Shu等人(Shu,L.等人,Secretion of asingle-gene-encoded immunoglobulin from myeloma cells.Proc Natl Acad Sci U SA.1993年9月1日；90(17):7995-9)；和Skerra等人(Skerra,A.等人,Assembly of afunctional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli.Science.1988年5月20日；240(4855):1038-41)，上述各文献通过引用以其整体并入本文。
对于一些用途，包括抗体(例如，聚糖相互作用抗体)在人体中的体内使用和在体外检测测定中的使用，可以优选地使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，如具有衍生自鼠类单克隆免疫球蛋白的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域中已知的。(Morrison,S.L.,Transfectomas provide novel chimeric antibodies.Science.1985年9月20日；229(4719):1202-7；Gillies,S.D.等人,High-level expression of chimeric antibodiesusing adapted cDNA variable region cassettes.J Immunol Methods.1989年12月20日；125(1-2):191-202.；和美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397，所述文献通过引用以其整体并入本文)。
人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其结合至所需抗原并且具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，人框架区中的框架残基被来自供者抗体的CDR和框架区的相应残基取代，以改变(优选地改善)抗原结合。这些框架取代是通过本领域中熟知的方法来鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较来鉴定在特定位置的罕见框架残基。(美国专利号5,693,762和5,585,089；Riechmann,L.等人,Reshaping humanantibodies for therapy.Nature.1988年3月24日；332(6162):323-7，上述文献通过引用以其整体并入本文)。抗体可以使用本领域中已知的多种技术来人源化，包括例如CDR移植(EP 239,400；PCT公开案WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)；镶饰或表面重修(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,E.A.,A possible procedure forreducing the immunogenicity of antibody variable domains while preservingtheir ligand-binding properties.Mol Immunol.1991年4月-5月；28(4-5):489-98；Studnicka,G.M.等人,Human-engineered monoclonal antibodies retain fullspecific binding activity by preserving non-CDR complementarity-modulatingresidues.Protein Eng.1994年6月；7(6):805-14；Roguska,M.A.等人,Humanization ofmurine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing.Proc NatlAcad Sci U S A.1994年2月1日；91(3):969-73)；和链改组(美国专利号5,565,332)；上述各文献通过引用以其整体并入本文。本发明的人源化抗体可以针对所需的结合特异性、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性等来研发。
在一些情况下，人框架是通过比对供者抗体序列与人框架序列以发现具有最高同源性水平的人框架候选者来选择。在一些情况下，框架区可以选自多于一个人框架候选者(例如，框架区1-3可以选自一个候选者，并且框架区4可以选自一个替代性候选者)。在一些情况下，框架区可以选自人共有序列以避免包括通过体细胞突变产生的免疫原性表位的风险。共有序列是通过比较许多个序列并在每个位置采用最常出现的残基而形成的序列。在一些情况下，人框架可以选自人种系序列。这些框架可以通过数据库搜索(例如，使用NCBI蛋白质数据库或其他数据库)来鉴定。
轻链和重链人框架可以选自相同的或不同的克隆。衍生自相同克隆的轻链和重链具有缔合形成功能性结合位点的更大可能性；然而，重链与轻链之间的界面的保守性典型地允许来自不同克隆的轻链和重链缔合并且是功能性的。人轻链与重链框架之间配对的频率可能综述于例如以下文献中：Tiller等人,2013.MAbs.5(3):445-70，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文。
人源化抗体序列中的残基可以被认为用于“回复突变”以改善或恢复在人源化期间损失的抗体亲和性。回复突变涉及将在人源化期间改变的残基变回初始非人抗体序列中存在的那些残基。是回复突变候选者的残基可以例如通过与在规范抗体结构中发现的标准构象比较来鉴定(参见Al-Lazikani等人,1997.J.Mol.Biol.273:927-48，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。可以针对回复突变鉴定并靶向罕见的规范残基。在一些情况下，是回复突变候选者的残基可以是“游标残基”，这个术语用于指与CDR接触的残基。这些残基具有较高的影响CDR定位和构象，并且因此影响抗体亲和性和/或特异性的可能性(Strohl,W.R.Therapeutic Antibody Engineering.Woodhead Publishing,PhiladelphiaPA.2012.第6章,第117页)。在一些情况下，使人框架区保持恒定并使来自供者抗体的CDR回复突变以在通过经验方法维持结合的同时配合人CDR区域。
人抗体(例如，聚糖相互作用抗体)完全是人患者的治疗性治疗特别合意的，以避免或减轻对外来蛋白的免疫反应。人抗体可以通过本领域中已知的多种方法来制造，包括上述抗体展示方法，使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开案WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；上述各文献通过引用以其整体并入本文。
人抗体(例如，聚糖相互作用抗体)还可以使用转基因小鼠来产生，所述转基因小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但是可以表达人免疫球蛋白多核苷酸。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白多核苷酸复合物随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。可替代地，除了人重链和轻链多核苷酸以外，可以将人可变区、恒定区和多变区引入小鼠胚胎干细胞中。可以通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座分开或同时地使小鼠重链和轻链免疫球蛋白多核苷酸无功能。特别地，JH区域的纯合缺失防止内源抗体产生。将经修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射至胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。将转基因小鼠以正常方式用所选抗原进行免疫，所述抗原例如本发明的聚糖、糖缀合物和/或多肽的全部或一部分。
因此，使用这种技术，可能产生有用的人IgG、IgA、IgM、IgD和IgE抗体。对于产生人抗体的技术的概述，参见Lonberg和Huszar(Lonberg,N.等人,Human antibodies fromtransgenic mice.Int Rev Immunol.1995；13(1):65-93)。对于产生人抗体和人单克隆抗体的技术和产生此类抗体的方案的详细论述，参见，例如，PCT公开案WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181；和6,114,598，上述各文献通过引用以其整体并入本文。另外，诸如Abgenix,Inc.(菲蒙，加利福尼亚州)、Protein Design Labs,Inc.(山景城，加利福尼亚州)和Genpharm(圣何塞，加利福尼亚州)等公司可以从事于使用与上述技术类似的技术提供针对所选抗原的人抗体。
一旦本发明的抗体分子已经通过动物、细胞系产生，化学合成或重组表达，可以通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白或多肽分子的任何方法将其纯化(即，分离)，例如，通过色谱(例如，离子交换、亲和色谱(特别是通过用于特定抗原的亲和色谱)、蛋白A和尺寸柱色谱)、离心、差示溶解度或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术来纯化。另外，本发明的抗体或其片段可以融合至本文所述或者本领域中以其他方式已知的异源多肽序列，以促进纯化。
抗体与靶标或配体(如用于产生给定抗体的抗原)之间的亲和性可以使用如本文所述的一种或多种结合测定根据KD来测量。根据给定抗体的合意应用，可能需要变化的KD值。高亲和性抗体典型地以以下KD形成配体键：约10-5M或更低，例如约10-6M或更低、约10-7M或更低、约10-8M或更低、约10-9M或更低、约10-10M或更低、约10-11M或更低或约10-12M或更低。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以根据其半最大有效或抑制浓度(分别是EC50或IC50)来表征。在一些情况下，这个值可以代表以等于使用最高抗体浓度时观察到的最大抑制的一半的水平抑制表达STn的细胞(例如，杀伤、降低增殖和/或降低一种或多种细胞功能)所需的抗体浓度。此类IC50值可以为约0.001nM至约0.01nM、约0.005nM至约0.05nM、约0.01nM至约1nM、约0.05nM至约5nM、约0.1nM至约10nM、约0.5nM至约25nM、约1nM至约50nM、约5nM至约75nM、约10nM至约100nM、约25nM至约250nM、约200nM至约1000nM或大于1000nM。
在一些实施方案中，可以测试本公开文本中教示的抗体靶向患者衍生的癌细胞和/或癌症干细胞(CSC)的能力。根据此类实施方案，可以在体外培养患者衍生的癌细胞，并且可以使用本公开文本的抗体靶向此类细胞。
在其他实施方案中，患者衍生的肿瘤细胞或肿瘤片段可以用于产生患者衍生的异种移植(PDX)肿瘤。在一些情况下，可以通过手术或活组织检查程序收集维持为组织结构的原发或转移性实体瘤的碎片。在一些情况下，可以使用从恶性腹水或胸腔积液排出的流体。肿瘤可以作为碎片或单细胞悬浮液植入，其是单独的或在一些研究中包被有(Corning Life Sciences，康宁，纽约州)或与人成纤维细胞或间充质干细胞混合。植入位点可以包括小鼠背侧区域(皮下植入)，但是可以选择在与初始肿瘤相同的器官中植入(原位植入，即胰腺、口腔、卵巢、乳房脂肪垫、脑等)。另外，与肿瘤来源无关，一些方法可以包括在肾囊中植入原发性肿瘤以致力于提高移植物植入的成功率。具有不同免疫抑制程度的多个小鼠品系可以用于此类研究中。对于激素敏感性肿瘤，一些研究可以使用激素补充，意图增加移植物植入率。在一些实施方案中，PDX肿瘤可以在非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中产生。可以将抗体给予至患有PDX肿瘤的小鼠并且可以分析对肿瘤体积的效应。在一些情况下，可以将PDX肿瘤解剖，使其经历细胞解离，并使所得细胞在培养中生长。可以在体外评估本公开文本的抗体靶向这些细胞的能力。
单克隆或多克隆的抗体的制备是本领域中已知的。产生抗体的技术是本领域中所熟知的，并且描述于例如以下文献中：Harlow和Lane“Antibodies,A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988，以及Harlow和Lane“Using Antibodies:ALaboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999。
靶标
本发明的聚糖相互作用抗体可以通过结合(可逆地或不可逆地)至一种或多种聚糖或聚糖相连或聚糖相关靶标来发挥其效应。在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体可以从本文所教示的靶标的任何区域制备。在一些实施方案中，本发明的靶标包括聚糖。用于产生抗体的聚糖可以包括具有至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个残基的糖链。一些用于产生抗体的聚糖可以包括约2个残基至约5个残基。
在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体靶抗原包括唾液酸。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)是哺乳动物细胞表面上的主要唾液酸。在这些之中，Neu5Ac在人体中天然产生。Neu5Gc在大多数哺乳动物中天然产生，但是人除外，因为负责从CMP-Neu5Ac产生CMP-Neu5Gc的胞苷一磷酸(CMP)-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)基因中的突变所致。人中的Neu5Gc实际上对几乎所有人表达的抗Neu5Gc抗体具有免疫原性。虽然缺少产生，但大多数人系统由于饮食摄入而包括一定水平的Neu5Gc。这些外来产物随后被并入人糖蛋白中。预期此类糖蛋白作为本发明的靶标。
本发明的聚糖靶抗原可以包括但不限于表1中所列的那些。所用缩写包括：Glc–葡萄糖，Gal–半乳糖，GlcNAc–N-乙酰葡糖胺，GalNAc–N-乙酰半乳糖胺，GlcNAc6S–6-磺基-N-乙酰葡糖胺，KDN–2-酮基-3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬糖酸，Neu5,9Ac2–N-乙酰基-9-O-乙酰神经氨酸，Fuc–岩藻糖，和Neu5GcOMe–2-O-甲基-N-羟乙酰神经氨酸。O-糖苷键存在于所列聚糖中的每个残基之间，且α和β指示通过所述键接合的两个残基之间的相对化学计量学，其中α指示轴向取向并且β指示赤道取向。在格式x,x中，α和/或β后的数字指示参与键形成的每个毗连残基中每个碳的碳编号。虽然所列的聚糖代表所预期的各个聚糖靶抗原，但是本发明还包括如下实施方案，其中上文所呈现的聚糖包括α和β取向O-糖苷键与所呈现组合不同的组合。“R”代表聚糖可以偶合的实体。在一些实施方案中，R是蛋白质，其中聚糖典型地连接至丝氨酸或苏氨酸残基。在一些实施方案中，R是用于将聚糖接合至衬底(如在聚糖阵列中)的接头分子。在一些实施方案中，R可以是具有式-(CH2)2CH2NH2或-(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2的接头。在一些实施方案中，R可以是生物素、白蛋白、ProNH2、-CH-、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-H、氢基、羟基、烷氧基、氧、碳、硫、氮、聚丙烯酰胺、磷、NH2、ProNH2＝O(CH2)2CH2NH2、(OCH2CH2)6NH2、O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2、荧光标记2-氨基苯甲酰胺(AB)和/或2-氨基苯甲酸(AA)、含有烷基胺的2-氨基苯甲酰胺类似物(AEAB)、氨氧基-基团、甲基氨氧基、酰肼基、氨基脂质1,2-双十六烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE)、氨氧基(AO)官能化DHPE和糖基磷脂酰肌醇(GPI)。不旨在限制R的来源或性质，这可以包括影响聚糖残基的物理间隔的结构。在一些实施方案中，R基可以包括本文所呈现的R基的组合，例如生物素化聚丙烯酰胺。在一些实施方案中，与底层衬底组合的R基可以影响聚糖残基间隔。
表1.聚糖靶抗原
本发明的聚糖靶标可以包括一个或多个抗体识别区。如本文所用，术语“抗体识别区”是指位于分子任一部分、附接基团上或位于聚糖与另一分子(包括但不限于另一聚糖、蛋白质、膜、细胞表面结构或细胞外基质组分)之间的相互作用区域上的区段。在一些实施方案中，抗体识别区位于链间靶位点处，其中术语“链间”意指在本发明聚合链内。链间靶位点可以包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10个残基、残基之间的键或残基与键的组合的抗体识别区。在一些实施方案中，抗体识别区位于一条或多条聚糖链之间的相互作用区域。此类区域可以位于2、3、4或至少5条聚糖链之间。
在一些实施方案中，抗体识别区位于连接至共同母链的聚糖分支链之间的相互作用区域。在一些实施方案中，抗体识别区位于聚糖分支链与母链之间的相互作用区域。在一些实施方案中，抗体识别区位于聚糖与蛋白质之间的相互作用区域。此类相互作用区域可以包括聚糖与蛋白质之间的化学键，包括但不限于共价键、离子键、流体静力学键、疏水键和氢键。在一些实施方案中，抗体识别区位于聚糖与其他生物分子(包括但不限于脂质和核酸)之间的相互作用区域。此类相互作用区域可以包括聚糖与生物分子之间的化学键，包括但不限于共价键、离子键、流体静力学键、疏水键和氢键。
在一些实施方案中，本发明的聚糖靶标是糖缀合物的组分。如本文所用，术语“糖缀合物”是指与聚糖部分接合的任何实体。在一些实施方案中，糖缀合物是糖脂。如本文所用，术语“糖脂”是指一类脂质，其中碳水化合物部分共价附接。在一些实施方案中，存在于糖脂上的碳水化合物部分可以是聚糖。在一些实施方案中，糖脂的脂质组分包括神经酰胺部分。预期作为本发明的靶标的糖脂的例子包括但不限于甘油糖脂(包括但不限于半乳糖脂和硫脂)、鞘糖脂(包括但不限于脑苷脂(例如，半乳糖脑苷脂、葡糖脑苷脂和硫脑苷脂)、神经节苷脂、红细胞糖苷脂和糖磷酸鞘脂)和糖基磷脂酰肌醇。在位于细胞膜内时，糖脂的聚糖部分位于膜的细胞外侧上，其中其可以与其他细胞以及细胞信号传导配体相互作用(Maccioni,H.J.等人,Organization of the synthesis of glycolipidoligosaccharides in the Golgi complex.FEBS Lett.2011年6月6日；585(11):1691-8)。
在一些实施方案中，本发明的糖缀合物靶标是糖蛋白和/或蛋白聚糖。糖蛋白是指与聚糖共价键合的任何蛋白质。蛋白聚糖是一类用通常携带负电荷的聚糖高度糖基化的蛋白质。这种特性使得其极为亲水并且是结缔组织的重要组分。
癌症相关的靶标
在一些实施方案中，本发明的靶标是癌症相关的抗原或表位。如本文所用，术语“癌症相关的”用于描述可以以某一方式与癌症、癌细胞和/或癌性组织相关的实体。已经鉴定许多包括聚糖的癌症相关的抗原或表位，其与肿瘤细胞相关表达(Heimburg-Molinaro,J.等人,Cancer vaccines and carbohydrate epitopes.Vaccine.2011年11月8日；29(48):8802-26)。这些在本文中被称作“肿瘤相关碳水化合物抗原”或“TACA”。TACA包括但不限于粘蛋白相关的抗原[包括但不限于Tn、唾液酸基Tn(STn)和Thomsen-Friedenreich抗原]、血型Lewis相关抗原[包括但不限于LewisY(LeY)、LewisX(LeX)、唾液酸基LewisX(SLeX)和唾液酸基LewisA(SLeA)]、鞘糖脂相关的抗原[包括但不限于Globo H、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)和包括唾液酸的鞘糖脂]、神经节苷脂相关的抗原[包括但不限于神经节苷脂GD2、GD3、GM2、岩藻糖基GM1和Neu5GcGM3]和聚唾液酸相关的抗原。许多此类抗原描述于国际公开号WO 2015054600中，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本发明的TACA靶标包括Lewis血型抗原。Lewis血型抗原包括通过α1-3连接或α1-4连接连接至GlcNAc的岩藻糖残基。其可以发现于糖脂和糖蛋白二者上。Lewis血型抗原可以发现于是这些抗原的分泌者的个体的体液中。其在红细胞上的出现是由于红细胞从血清吸收Lewis抗原所致。
在一些实施方案中，本发明的TACA靶标包括LeY。LeY(也称为CD174)是由具有α1,2连接的以及α1,3连接的岩藻糖残基的Galβ1,4GlcNAC构成，产生Fucα(1,2)Galβ(1,4)Fucα(1,3)GlcNAc表位。其是通过α1,3岩藻糖基转移酶从H抗原合成，所述酶将α1,3岩藻糖附接至母链的GlcNAc残基。LeY可以在多种癌症中表达，包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌和上皮癌。由于其在正常组织中的低表达水平和在许多癌症中升高的表达水平，LeY抗原是有吸引力的治疗性抗体的靶标。
在一些实施方案中，本发明的TACA靶标包括LeX。LeX包括表位Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-R。其还被称为CD15和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)。这种抗原最初被认为与取自经历用F9畸胎癌细胞免疫的小鼠的血清具有免疫反应性。还发现LeX与特定阶段的胚胎发育相关。其还在存在和不存在癌症的两种情况下在多种组织中表达，但是也可以发现于乳腺癌和卵巢癌中，其中其仅由癌细胞表达。
在一些实施方案中，本发明的TACA靶标包括SLeA和/或SLeX。SLeA和SLeX分别由结构Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ-R和Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-R构成。其表达在癌细胞中上调。这些抗原在血清中的存在与恶性肿瘤和较差预后相关。SLeX主要作为粘蛋白末端表位而被发现。其在多种不同癌症中表达，包括乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠癌、肝癌、肺癌和前列腺癌。在本发明的一些实施方案中，SLeA和SLeX靶标包括Neu5Gc(在本文中分别被称为GcSLeA和GcSLeX)。
在一些情况下，本发明的癌症相关的靶标可以包括粘蛋白。Ishida等人证明，MUC2与树突细胞(具有抗肿瘤活性)的相互作用导致树突细胞的细胞凋亡(Ishida,A.等人,2008.Proteomics.8:3342-9，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在一些方面中，本发明提供抗粘蛋白抗体以防止树突细胞的细胞凋亡并支持抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，本发明的TACA靶标包括糖脂和/或存在于糖脂上的表位，包括但不限于鞘糖脂。鞘糖脂包括通过神经酰胺羟基连接至聚糖的脂质神经酰胺。在细胞膜上，鞘糖脂形成被称为“脂筏(lipid raft)”的簇。
在一些实施方案中，本发明的TACA靶标包括Globo H。Globo H是最初在乳腺癌细胞中鉴定的癌症相关的鞘糖脂。Globo H的聚糖部分包括Fucα(1-2)Galβ(1-3)GalNAcβ(1-3)Galα(1-4)Galβ(1-4)Glcβ(1)。虽然在许多种正常上皮组织中发现，但是已经鉴定GloboH与许多肿瘤组织相关，包括但不限于小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫内膜瘤。
在一些实施方案中，本发明的癌症相关的鞘糖脂靶标包括神经节苷脂。神经节苷脂是具有一个或多个唾液酸的鞘糖脂。根据神经节苷脂命名法，使用G作为神经节苷脂的缩写。这个缩写后跟着指代所附接的唾液酸残基数目的字母M、D或T(分别是1、2或3)。最后，使用数字1、2或3指代在通过薄层色谱分析时每次移行的距离级别(其中3行进最远距离，其次是2，再次是1)。已知神经节苷脂参与癌症相关的生长和转移，并且可以在肿瘤细胞的细胞表面上表达。在肿瘤细胞上表达的神经节苷脂可以包括但不限于GD2、GD3、GM2和岩藻糖基GM1(本文中也称为Fuc-GM1)。在本发明的一些实施方案中，聚糖相互作用抗体是针对GD3。GD3是细胞生长调节剂。在一些实施方案中，使用针对GD3的抗体来调节细胞生长和/或血管发生。在一些实施方案中，使用针对GD3的抗体来调节细胞附着。与一些肿瘤细胞相关的GD3可以包括9-O-乙酰化唾液酸残基(Mukherjee,K.等人,2008.J Cell Biochem.105:724-34，和Mukherjee,K.等人,2009.Biol Chem.390:325-35，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文)。在一些情况下，本发明抗体对9-O-乙酰化唾液酸残基具有选择性。一些抗体可以对9-O-乙酰化GD3具有特异性。此类抗体可以用于靶向表达9-O-乙酰化GD3的肿瘤细胞。在本发明的一些实施方案中，聚糖相互作用抗体是针对GM2。在一些实施方案中，针对GM2的抗体用于调节细胞间接触。在一些实施方案中，本发明的神经节苷脂靶标包括Neu5Gc。在一些实施方案中，此类靶标可以包括具有Neu5Gc的GM3变体(在本文中被称为GcGM3)。GcGM3的聚糖组分是Neu5Gcα2-3Galβ1-4Glc。GcGM3是肿瘤细胞的已知组分(Casadesus,A.V.等人,2013.Glycoconj J.30(7):687-99，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开文本的TACA包括至少一个Neu5Gc残基。
重组抗体
本发明的重组抗体(例如，聚糖相互作用抗体)可以使用本领域中已知的标准技术来产生。在一些实施方案中，重组抗体可以是抗聚糖抗体。其他抗体可以是抗STn抗体(例如，抗GcSTn或抗AcSTn抗体)。本发明的重组抗体可以使用从根据本文所述方法产生的杂交瘤细胞衍生抗体获得的可变结构域来产生。抗体的重链和轻链可变区cDNA序列可以使用标准生物化学技术来确定。总RNA可以从产生抗体的杂交瘤细胞提取并通过逆转录酶(RT)聚合酶链式反应(PCR)转化为cDNA。可以对所得cDNA实施PCR扩增以扩增可变区基因。这种扩增可以包括使用对重链和轻链序列的扩增具有特异性的引物。在其他实施方案中，重组抗体可以使用从其他来源获得的可变结构域来产生。这包括使用选自一个或多个抗体片段文库(如用于抗原淘选的scFv文库)的可变结构域。然后可以将所得PCR产物亚克隆至质粒中用于序列分析。一旦进行测序，可以将抗体编码序列置入表达载体中。对于人源化，可以使用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠类序列。然后可以将所得构建体转染至哺乳动物细胞中用于大规模翻译。
抗Tn抗体
在一些实施方案中，本发明的重组抗体(例如，聚糖相互作用抗体)可以是抗Tn抗体。此类抗体可以结合至具有Tn的靶标。抗Tn抗体可以对Tn具有特异性，或者可以结合Tn的其他经修饰形式，如连接至其他部分(包括但不限于其他碳水化合物残基)的Tn。在一些情况下，抗Tn抗体可以是抗唾液酸基-Tn抗体。此类抗体可以结合至包括Neu5Ac的唾液酸化Tn和/或包括Neu5Gc的唾液酸化Tn。一些抗Tn抗体可以特异性结合至Tn抗原簇。
抗STn抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体(例如，聚糖相互作用抗体)可以特异性结合至STn。本发明的抗STn抗体可以依据其与STn抗原的特定部分的结合和/或依据其对AcSTn相对于GcSTn的特异性来分类。在一些情况下，本发明的抗STn抗体是第1组抗体。根据本发明的“第1组”抗体是能够结合AcSTn和GcSTn的抗体。由于此类抗体与较广范围的STn结构缔合的能力，在本文中还可以被称为泛STn抗体。在一些实施方案中，第1组抗体可以与由图1A中的最大椭圆形指示的STn的部分缔合。在一些情况下，本发明的抗STn抗体是第2组抗体。根据本发明的“第2组”抗体是能够结合STn以及一些相关结构(包括与丝氨酸或苏氨酸的O连接)的抗体。在一些实施方案中，第2组抗体可以与包括唾液酸化半乳糖残基的聚糖缔合。在一些情况下，第2组抗体可以与由图1B中的最大椭圆形指示的STn的部分缔合。相对于具有GcSTn的结构，一些第2组抗体优选地结合至具有AcSTn的结构。其他抗STn抗体可以是第3组抗体。如本文所提及，“第3组”抗体是能够结合STn，但是也可以结合相关结构的较宽集合的抗体。与第2组抗体不同，第3组抗体不需要此类结构具有与丝氨酸或苏氨酸的O-连接。在一些实施方案中，第3组抗体可以与由图1C中的最大椭圆形指示的STn的部分缔合。最后，本发明的一些抗STn抗体可以是第4组抗体。如本文所提及，“第4组”抗体能够结合至AcSTn和GcSTn二者以及未唾液酸化的Tn抗原，并且因此具有较宽特异性。在一些实施方案中，第4组抗体可以与由图1D中的最大椭圆形指示的STn的部分缔合。
在一些情况下，本发明的抗STn抗体可以特异性结合至特定抗原或细胞表面上的STn簇。一些此类抗体可以识别通过STn聚簇形成的表位，包括包含邻近STn结构之间的接触区的表位。此类表位可以通过2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个STn结构的聚簇来形成。
在一些实施方案中，本公开文本的抗STn抗体可以用于结合携带STn的细胞蛋白。此类抗体可以用于靶向与癌细胞相关的细胞蛋白，所述细胞蛋白可以通过STn表达与非癌细胞中的类似蛋白质相区分。在一些情况下，此类蛋白质可以包括细胞表面蛋白。在癌症治疗和/或诊断期间，抗STn抗体可以靶向携带STn的癌细胞表面蛋白。携带STn的细胞表面蛋白可以使用质谱和/或使用免疫学方法(例如，FACS分析、免疫沉淀、免疫印迹法、ELISA等)来鉴定。在一些情况下，携带STn的细胞蛋白可以包括癌细胞标记物、癌症干细胞标记物和/或癌症干细胞信号传导蛋白。在一些实施方案中，携带STn的细胞蛋白可以包括但不限于CD44、CD133、CD117、整联蛋白、Notch和Hedgehog。
抗体组分
在一些情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包括本文提供的可变结构域和/或CDR氨基酸序列。在一些情况下，抗体可以包括国际公开号WO 2017083582(其全部内容通过引用并入本文)中呈现的任何抗体或抗体片段序列，包括：其中表2中呈现的任何可变结构域序列；其中表3中呈现的任何CDR序列；其中表4中呈现的任何VH CDR序列组；其中表5中呈现的任何VL CDR序列组；其中表6中呈现的任何可变结构域核苷酸序列；或其中表11中呈现的任何人源化可变结构域序列。一些抗体或抗原结合片段可以包括具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％序列同一性的此类序列或变体的不同组合。在一些情况下，本发明的抗体或抗原结合片段可以包括下文表2中所列可变结构域序列中的一个或多个。所呈现的轻链可变结构域可以经表达具有或不具有C末端精氨酸残基。这个残基典型地连接轻链可变结构域与轻链恒定结构域，并且可以表达为轻链恒定结构域而不是轻链可变结构域的一部分。在一些情况下，抗体或其抗原结合片段可以包括与表2中所列的可变结构域序列中的一个或多个具有约50％至约99.9％序列同一性(例如，约50％至约60％、约55％至约65％、约60％至约70％、约65％至约75％、约70％至约80％、约75％至约85％、约80％至约90％、约85％至约95％、约90％至约99.9％、约95％至约99.9％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％或约99.8％)的氨基酸序列。在一些情况下，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包括具有任一所列序列的一个或多个片段的氨基酸序列。
表2.可变结构域序列
在一些情况下，本发明的抗体或抗原结合片段可以包括表3中所呈现的任何IgG序列。在一些情况下，抗体或其片段可以包括与所列恒定结构域序列中的一个或多个具有约50％至约99.9％序列同一性(例如，约50％至约60％、约55％至约65％、约60％至约70％、约65％至约75％、约70％至约80％、约75％至约85％、约80％至约90％、约85％至约95％、约90％至约99.9％、约95％至约99.9％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％或约99.8％)的氨基酸序列。在一些情况下，本发明的抗体或其片段可以包括具有任一所列序列的一个或多个片段的氨基酸序列。
表3.IgG恒定结构域序列
在一些实施方案中，本公开文本包括使用上述一个或多个抗体序列或相关变体产生的抗体片段。此类抗体片段可以包括scFv、Fab片段或任何其他抗体片段，包括本文所述的那些片段中的任一个，
人源化抗体
非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者抗体的超变区的残基由来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的抗体(供者抗体)的超变区的残基替代，所述人源化抗体具有所需的特异性、亲和性和能力。
对于编码具有人恒定区的完全人源化抗体的表达质粒的构建，可以将编码抗体可变区的DNA序列插入表达载体(例如，哺乳动物表达载体)中的上游启动子/增强子(例如，巨细胞病毒立即/早期启动子/增强子(CMV IE)加免疫球蛋白信号序列与下游免疫球蛋白恒定区基因之间。然后可以制备DNA样品用于转染至哺乳动物细胞中。
对于细胞系的产生和完全人源化抗体的选择，可以将重链和轻链质粒DNA对转染至细胞中用于表达。在一些实施方案中，可以使用哺乳动物NS0细胞。可以扩增产生人源化抗体的细胞系用于表达抗体，可以从细胞培养基收获并纯化所述抗体。
在一些实施方案中，人源化抗体可以与非人物种具有交叉反应性。物种交叉反应性可以允许抗体出于多种目的用于不同动物中。例如，交叉反应性抗体可以用于临床前动物研究中，以提供关于抗体效率和/或毒性的信息。非人物种可以包括小鼠、大鼠、兔、犬、猪、山羊、绵羊或非人灵长类动物(如食蟹猴)。
IgG合成
可以合成本文所呈现的包括一个或多个可变结构域和/或CDR氨基酸序列的IgG抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)(或其片段或变体)用于进一步测试和/或产品研发。此类抗体可以通过将编码所需氨基酸序列的cDNA的一个或多个区段插入适合于IgG产生的表达载体中来产生。表达载体可以包括适于哺乳动物细胞中的IgG表达的哺乳动物表达载体。可以实施IgG的哺乳动物表达以确保所产生的抗体包括哺乳动物蛋白特有的修饰(例如，糖基化)，和/或确保抗体制剂缺少内毒素和/或来自细菌表达系统的蛋白质制剂中可能存在的其他污染物。
免疫原性宿主
在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体可以通过使用非人动物作为免疫宿主(在本文中称为“免疫原性宿主”)来研发。在一些实施方案中，免疫原性宿主是哺乳动物。在一些实施方案中，免疫原性宿主是转基因敲除小鼠。可以使用具有聚糖相互作用抗体的靶位点和/或表位靶标的抗原接触免疫原性宿主，以在免疫原性宿主中刺激免疫应答并产生抗体，所述抗体特异性结合所引入抗原上存在的靶位点和/或表位靶标。
可以从免疫原性宿主的血清分离通过免疫产生的抗体。还可以使用来自免疫原性宿主的产生抗体的细胞来生成产生所需抗体的细胞系。在一些实施方案中，可以通过使用酶联免疫吸附测定(ELISA)和/或聚糖阵列实施针对来自免疫原性宿主的抗体和/或产生抗体的细胞的筛选。
抗体序列和结构分析及优化
在一些实施方案中，可以使本发明的抗体经历序列分析和/或结构分析，其中分析所述抗体的可能影响抗体化学、亲和性、特异性、蛋白质折叠、稳定性、制造、表达和/或免疫原性(即，在用此类抗体治疗的受试者中的免疫反应)的特征。这种分析可以包括结合至相同或类似表位的抗体之间的比较。
可以分析结合至相同表位的抗体的抗体序列在轻链和/或重链序列中的变异。这种分析可以包括种系序列和/或CDR序列。可以使用从这种分析获得的信息来鉴定(并且任选地修饰、缺失、替代或修复)保守氨基酸残基；氨基酸的保守区段；具有保守侧链特征的氨基酸位置；保守CDR长度；和在结合至相同表位的抗体之间保守的其他特征。可以使用这种信息来设计变体或通知抗体优化程序以改善抗体亲和性、特异性、蛋白质折叠、稳定性、制造、表达和/或免疫原性。
序列分析可以包括比对两个或更多个结合至相同或类似表位的抗体以鉴定相似性。这种分析可以比较抗体区域(例如，CDR、可变结构域、种系区段)的序列和/或长度。可以鉴定并评估氨基酸插入、氨基酸缺失和取代。可以针对抗体亲和性和/或特异性来比较序列差异。
在一些情况下，实施序列分析以鉴定(并且任选地修饰、缺失、替代或修复)以下中的一种或多种：不成对半胱氨酸或不规则二硫化物；糖基化位点(例如，N连接的NXS/T位点)；酸裂解位点、氨基酸氧化位点、与小鼠种系序列的一致性；天冬酰胺脱酰胺位点；天冬氨酸异构化位点；N末端焦谷氨酸形成位点；和CDR中的易聚集斑片。
在一些情况下，本发明提供本文所呈现抗体的序列分析通知的变体。如本文所用，术语“序列分析通知的变体”是指已经基于衍生自抗体序列分析的一个或多个结论进行修饰的抗体变体。在一些情况下，可以对本发明的抗体进行修饰以产生抗体变体，所述抗体变体包括对抗体亲和性、特异性、蛋白质折叠、稳定性、制造、表达和/或免疫原性中的一种或多种的修饰。
一些序列分析通知的变体包括一个或多个CDR长度修饰。CDR长度修饰的抗体可以在一个或多个CDR中相对于初始抗体序列包括一个或多个添加的或缺失的氨基酸。在一些情况下，序列分析通知的变体可以包括用衍生自另一种抗体(例如，结合至相同或类似表位的抗体)的一个或多个CDR取代一个或多个CDR。在一些情况下，序列分析通知的变体可以包括来自另一种抗体(例如，结合至相同或类似表位的抗体)的重链或轻链可变结构域的取代。序列分析通知的变体可以包括对一种或多种种系基因的修饰，抗体是从所述种系基因表达。此类修饰可以包括点突变、区域突变、插入突变或缺失突变。在一些情况下，实施种系基因修饰以将CDR从一种已知的种系基因移动至另一种种系基因。序列分析通知的变体可以包括本文所述的其他变体，包括但不限于scFv、单抗体、双抗体、胞内抗体、CAR、抗体模拟物等。
在一些实施方案中，可以使用序列和/或结构分析来通知抗体片段展示文库(包括但不限于scFv文库、噬菌体展示文库和酵母展示文库)的构建。在一个例子中，可以实施序列比对以比对两种或更多种具有共同抗原或表位的抗体，并且可以鉴定在所比对抗体之间保守或者在所比对抗体之间可变的氨基酸残基。在此类情况下，可以构建抗体片段展示文库使得文库成员之间的可变性主要受限于序列分析中鉴定的可变氨基酸。在一些情况下，可以使用此类文库来鉴定具有改变的对靶抗原(例如，STn)或靶抗原的特定表位(例如，由第1组、第2组、第3组和第4组抗体识别的表位，如下文实施例1中所述)的亲和性和/或特异性的变体。
在一些实施方案中，可以修饰本发明的抗体以去除、替代或以其他方式消除一个或多个不成对半胱氨酸残基。在一些情况下，不成对半胱氨酸残基可以是反应性的，并且在一些情况下可以影响抗体亲和性和/或特异性。因此，本发明的一些抗体已经进行修饰以消除不成对半胱氨酸残基。在一些情况下，此类变体可以具有经修饰的表位特异性和/或亲和性。在一些情况下，对不成对半胱氨酸残基的修饰可以改变抗体折叠。在一些情况下，这些变体包括一个或多个半胱氨酸残基的取代或缺失。在一些情况下，这些变体包括一个或多个额外氨基酸残基(包括但不限于添加一或多个半胱氨酸残基)，以防止或降低来自不成对半胱氨酸残基的不期望效应。在一些情况下，用具有疏水侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸)替代半胱氨酸残基。
抗体测试和表征
可以使用多种方法对本文所述抗体进行测试和/或表征。此类方法可以用于确定多种特征，所述特征可以包括但不限于抗体亲和性；特异性；和活性(例如，细胞信号传导途径或其他细胞或生物活性的激活或抑制)。抗体测试可以进一步包括在体内(例如，在动物和/或人研究中)测试以下中的一种或多种：毒性、治疗效应、药效学、药物代谢动力学、吸收、沉积、代谢和排泄。在动物中测试可以包括但不限于在小鼠、大鼠、兔、荷兰猪、猪、灵长类动物(例如，食蟹猴)、绵羊、山羊、马和牛中测试。
基于细胞的测定
在一些实施方案中，可以通过使用一种或多种基于细胞的测定对本发明的抗体进行测试或表征。此类基于细胞的测定可以在体外用培养中的细胞来实施。在一些情况下，基于细胞的测定可以在体内实施。基于细胞的体内测定的例子包括肿瘤模型，其中将肿瘤细胞注射至或以其他方式引入宿主中。
在一些情况下，基于细胞的测定中所用的细胞可以表达一种或多种由本发明的一种或多种抗体识别的靶聚糖。此类聚糖可以由此类细胞天然地表达，或者可替代地，可以诱导细胞表达特定测定的目的所需的一种或多种聚糖。所诱导表达可以通过一种或多种处理进行，所述处理上调调节糖基化的糖基化蛋白或酶的表达。在其他情况下，所诱导表达可以包括一种或多种基因或转录物的转染、转导或其他形式的引入，用于一种或多种参与糖基化调节的糖基化蛋白或酶的内源表达。
在一些情况下，本文所用的基于细胞的测定可以包括使用癌细胞。许多癌细胞系可用于实验以测试本发明的抗体。此类细胞可以表达靶聚糖或者可以被诱导表达靶聚糖。另外，可以使用癌细胞系来测试本发明的抗体，其中癌细胞系代表癌症干细胞。癌症干细胞(CSC)细胞系可以从培养中生长的癌细胞分离或分化(例如，通过基于对癌症干细胞具有特异性的标记物的分选)。基于细胞的测定中所用的细胞系可以包括但不限于乳房、结肠、卵巢、淋巴细胞、骨髓和皮肤细胞系。特定细胞系可以包括但不限于SNU-16细胞、LS-174T细胞、MC38细胞、TOV-112D细胞、TOV-21G细胞、Jurkat E6.1细胞、K-562细胞、B16-F0细胞、B16-F10细胞、LS180细胞、COLO205细胞、TB4细胞、HT29细胞、Panc1细胞、HPAC细胞、HPAFII细胞、RKO细胞、SW480细胞和SNU-C2A细胞。
在一些实施方案中，可以使用卵巢癌细胞系。此类细胞系可以包括但不限于SKOV3、OVCAR3、OV90和A2870细胞系。在一些情况下，可以通过分离表达CD44和/或CD133细胞标记物的细胞从这些细胞系分离CSC细胞。
首先使用从患有进行性卵巢腺癌的患者获得的恶性腹水确立OVCAR3细胞(Hamilton,T.C.等人,1983.Cancer Res.43:5379-89)。癌症干细胞群可以通过基于特定细胞表面标记物(如CD44(参与细胞粘附和迁移)、CD133和CD117)的选择从OVCAR3细胞培养物分离(Liang,D.等人,2012.BMC Cancer.12:201，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。OV90细胞是类似地衍生自人腹水的上皮卵巢癌细胞(参见美国专利号5,710,038)。OV-90细胞还可以在激活时表达CD44(Meunier,L.等人,2010.Transl Oncol.3(4):230-8)。
聚糖阵列
在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体可以通过使用聚糖阵列来研发。如本文所用，术语“聚糖阵列”是指用于鉴定与连接至阵列衬底的多种不同聚糖中的任一种相互作用的药剂的工具。在一些实施方案中，聚糖阵列包括多种化学合成的聚糖，在本文中被称为“聚糖探针”。在一些实施方案中，聚糖阵列包括至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少350、至少1000或至少1500个聚糖探针。在一些实施方案中，可以定制聚糖阵列以存在所需的聚糖探针集合。在一些实施方案中，聚糖探针可以通过接头分子附接至阵列衬底。此类接头可以包括多种分子，包括但不限于-O(CH2)2CH2)NH2和O(CH2)3NHCOCH2(OCH2CH2)6NH2。
在一些实施方案中，聚糖阵列具有超过70个化学合成的聚糖，其中大多是作为含有Neu5Ac和Neu5Gc的聚糖对存在。聚糖探针的一些例子可以包括：Neu5Ac-α-2-6-GalNAc(AcSTn)；Neu5Gc-α-2-6-GalNAc(GcSTn)；Neu5,9Ac2-α-2,6-GalNAc；Neu9Ac5Gc-α-2,6-GalNAc；和GalNAc(Tn)。对AcSTn与GcSTn的抗体结合特异性可以使用所述阵列或本领域中已知的确定特异性的其他方法来确定。另外，可以确定抗体与O-乙酰化STn的结合谱。STn上的O-乙酰化的损失与癌症相关，因为癌症相关的表达与增加的抗体的STn识别相关(Ogata,S.等人,Tumor-associated sialylated antigens are constitutively expressed innormal human colonic mucosa.Cancer Res.1995年5月1日；55(9):1869-74)。在一些情况下，聚糖阵列可以用于确定STn与Tn的识别。
抗体片段展示文库筛选技术
在一些实施方案中，可以使用高通量发现方法产生和/或优化本发明的抗体。此类方法可以包括国际专利申请号WO 2014074532中披露的任一种展示技术(例如，展示文库筛选技术)，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，可以通过使用展示技术(例如，噬菌体展示技术)筛选靶抗原来设计、选择或优化合成抗体。噬菌体展示文库可以包括数百万至数十亿个噬菌体粒子，每个噬菌体粒子在其病毒外壳上表达独特的抗体片段。此类文库可以提供多种多样的资源，所述资源可以用于选择可能数百个对一种或多种目的抗原具有不同亲和性水平的抗体片段(McCafferty等人,1990.Nature.348:552-4；Edwards,B.M.等人,2003.JMB.334:103-18；Schofield,D.等人,2007.Genome Biol.8,R254和Pershad,K.等人,2010.Protein Engineering Design and Selection.23:279-88；上述各项的内容通过引用以其整体并入本文)。通常，此类文库中存在的抗体片段包括scFv抗体片段，所述scFv抗体片段包括通过柔性接头接合的VH和VL抗体结构域的融合蛋白。在一些情况下，scFv可以含有相同序列，但是编码互补决定区(CDR)的可变环的独特序列除外。在一些情况下，scFv是作为连接至病毒外壳蛋白(例如，病毒pIII外壳蛋白的N末端)的融合蛋白来表达。VL链可以分别表达，以与VH链在周质中组装，之后将复合物并入病毒外壳中。可以从所结合的噬菌体对沉淀的文库成员进行测序，以获得编码所需scFv的cDNA。可以将此类序列直接并入抗体序列中用于重组抗体产生，或者通过体外亲和性成熟使其突变并用于进一步优化。
细胞毒性抗体的研发
在一些实施方案中，本发明的抗体可以能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。ADCC是免疫机制，其中由于免疫细胞攻击而裂解细胞。此类免疫细胞可以包括CD56+细胞、CD3天然杀伤(NK)细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞(Strohl,W.R.Therapeutic Antibody Engineering.Woodhead Publishing,Philadelphia PA.2012.第8章,第186页，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些情况下，根据在抗体结合时是否需要ADCC或ADCP，可以将本发明的抗体工程化以包括给定同种型。此类抗体例如可以根据Alderson,K.L.等人,J BiomedBiotechnol.2011.2011:379123)所披露的任一种方法进行工程化。在小鼠抗体的情况下，抗体的不同同种型在促进ADCC方面更有效。例如，IgG2a在诱导ADCC方面比IgG2b更有效。本发明的一些抗体(包括小鼠IgG2b抗体)可以进行重工程化以成为IgG2a抗体。此类重工程化抗体可以在结合细胞相关抗原后诱导ADCC方面更有效。在一些实施方案中，通过修饰或引入一个或多个翻译后修饰将抗体重工程化，以改善ADCC和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)生物活性。
在一些实施方案中，可以将编码根据本发明方法研发的抗体的可变区的基因克隆至编码人Fc区域的哺乳动物表达载体中。此类Fc区域可以是来自人IgG1κ的Fc区域。IgG1κFc区域可以包括已知会增强Fc-受体结合和ADCC的氨基酸突变。
抗体药物缀合物
在一些实施方案中，可以研发本发明的抗体用于抗体药物缀合物(ADC)治疗应用。ADC是其中附接[例如，直接地或通过接头(例如，可裂解接头或不可裂解接头)]一种或多种负荷(例如，治疗剂)的抗体。ADC可以用于将治疗剂(例如，药物或细胞毒性剂)递送至一个或多个靶细胞或组织(Panowski,S.等人,2014.mAbs 6:1,34-45)。在一些情况下，可以将ADC设计为结合至所靶向细胞上的表面抗原。在结合后，整个抗体-抗原复合物可以被内化并被引导至细胞溶酶体。然后ADC可以降解，释放所结合的负荷。如果负荷是细胞毒性剂，则靶细胞将被杀伤或以其他方式失能。细胞毒性剂可以包括但不限于细胞支架抑制剂[例如，微管蛋白聚合抑制剂和纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂]、DNA损伤剂(例如，卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素和吡咯并苯并二氮杂卓二聚体，如塔利林(talirine)和特西林(tesirine))、拓扑异构酶抑制剂[例如，喜树碱化合物或衍生物，如7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)和依沙替康(exatecan)衍生物DXd]、转录抑制剂(例如，RNA聚合酶抑制剂，如鹅膏蕈碱)和激酶抑制剂[例如，磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂或丝裂原激活蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂]。
微管蛋白聚合抑制剂可以包括但不限于美坦辛(例如，艾坦辛(emtansine)[DM1]和拉夫坦辛(ravtansine)[DM4])、澳瑞他汀、微管溶素和长春花生物碱或其衍生物。示例性澳瑞他汀包括澳瑞他汀E(也称为多拉司他汀-10(dolastatin-10)的衍生物)、澳瑞他汀EB(AEB)、澳瑞他汀EFP(AEFP)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、澳瑞他汀F和多拉司他汀。示例性微管溶素化合物包括天然存在的微管溶素A、B、C、D、E、F、G、H、I、U和V，以及微管溶素类似物，如前微管溶素D(PTb-D43)和N14-脱乙酰氧基微管溶素H(Tb1)。示例性长春花生物碱包括长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和诺维本(navelbine，长春瑞滨(vinorelbine))。在一些实施方案中，细胞毒性剂可以包括澳瑞他汀衍生物[例如，1-氨基丙烷-2-基-澳瑞他汀F、澳瑞他汀F-羟丙酰胺、澳瑞他汀F-丙酰胺、澳瑞他汀F苯二胺(AFP)]；微管溶素衍生物；长春花生物碱衍生物[例如，N-(3-羟丙基)长春地辛(HPV)]，以及以下文献中所述的那些中的任一种：美国专利号8,524,214；8,685,383；8,808,679；和9,254,339；美国专利申请公开案US 20150314008 A1、US 20160220696 A1和US 20160022829 A1；上述各项的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，本发明的抗体-药物缀合物(ADC)可以进一步包含一种或多种连接抗体与治疗剂的聚合载体(例如，抗体-聚合物-药物缀合物)。如本文所用，术语“聚合载体”是指聚合物或经修饰聚合物，其可以共价附接至一种或多种治疗剂和/或抗体。聚合载体可以提供治疗剂的额外缀合位点，增加药物与抗体的比率并增强ADC的治疗效应。在一些实施方案中，本发明中所用的聚合载体可以是水溶性的和/或生物可降解的。此类聚合载体可以包括但不限于聚(乙二醇)(PEG)、聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(聚HPMA)、聚(α-氨基酸)[例如，聚(L-赖氨酸)、聚(L-谷氨酸)和聚((N-羟基烷基)谷氨酰胺)]、碳水化合物聚合物[例如，糊精、羟乙基淀粉(HES)和聚唾液酸]、糖多糖(例如，同多糖，如纤维素、直链淀粉、葡聚糖、果聚糖、褐藻糖胶、角叉菜胶、菊糖、果胶、支链淀粉、糖原和lixenan；或同多糖，如琼脂糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、海藻酸和肝素)、糖脂、糖缀合物、聚甘油、聚乙烯醇、聚(丙烯酸)、聚缩酮和聚缩醛[例如，聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基甲醛)，也被称为PHF或描述于美国专利号5,811,510；5,863,990；和5,958,398中；上述各项的内容通过引用以其整体并入本文]，以及其衍生物、树枝状聚合物、共聚物和混合物。例如，聚合载体可以包括聚缩醛/聚缩酮(例如，PHF)与亲水聚合物(如聚丙烯酸酯、聚乙烯聚合物、聚酯、聚原酸酯、聚酰胺、多肽和其衍生物)的共聚物。
在一些实施方案中，治疗剂直接地或通过接头附接(例如，共价键合)至本发明的抗体。在一些实施方案中，治疗剂直接地或通过接头附接至聚合载体，并且聚合载体直接地或通过接头附接至抗体。在一些实施方案中，接头可以包含草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、肥酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、苯二甲酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、二羟乙酸、酒石酸、谷氨酸、延胡索酸或天冬氨酸部分，包括其各自的酰胺、酰亚胺或环状酰亚胺衍生物，并且各自任选地经取代。示例性接头可以包括以下文献中所披露的那些中的任一种：美国专利号8,524,214；8,685,383；8,808,679；9,254,339；和/或9,555,112，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，接头可以是可裂解接头。可裂解接头可以在某些条件下(如pH、温度的变化或还原)断裂，或由酶(例如，蛋白酶和葡糖醛酸糖苷酶)裂解，以允许从ADC释放治疗剂。此类接头可以包括不稳定键，如酯键、酰胺键或二硫键。非限制性可裂解接头可以包括pH敏感性接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺、硫醚、原酸酯、缩醛或缩酮)；还原敏感性接头[例如，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)和N-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯或2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(1-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基)苯甲酸酯(SMPT)]；光敏性接头；和可酶促裂解的接头[例如，肽接头，如缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苯甲酰氧基羰基(vc-PAB)、马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苯甲酰氧基羰基(MC-vc-PAB)；可由葡糖醛酸糖苷酶裂解的接头，如葡糖苷酸-MABC；或可由酯酶裂解的接头]。
在其他实施方案中，接头可以是不可裂解接头。与可裂解接头相比，不可裂解接头可以增加ADC的血浆稳定性。示例性不可裂解接头包括马来酰亚胺烷烃和马来酰亚胺环己烷(MCC)。
本发明的抗体-药物缀合物(ADC)可以使用本领域中已知的任何方法来制备。例如，可以修饰治疗剂以含有可以与抗体上的官能团反应的官能团。抗体-药物缀合物(ADC)可以通过使两个官能团反应形成缀合物来制备。在一些情况下，可以修饰聚合载体以含有可以与治疗剂上的官能团和抗体上的官能团在不同化学条件下反应的官能团。可以通过连续化学反应连接抗体、聚合载体和治疗剂以形成抗体-聚合物-药物缀合物。与抗体缀合可以采用赖氨酸或半胱氨酸残基作为缀合位点。在一些实施方案中，可以使抗体工程化以具有额外的赖氨酸或半胱氨酸残基。此类方法可以避免破坏抗体结构(例如，链间二硫键)并维持抗体稳定性和/或活性。
如本文所述，药物与抗体的比率(DAR)是与抗体缀合的治疗剂(例如，药物或细胞毒性剂)的平均数。在一些实施方案中，本发明的ADC的药物与抗体的比率是至少1:1、至少2:1、至少4:1、至少6:1、至少8:1、至少10:1、至少12:1、至少15:1、至少20:1或至少25:1。
在一些实施方案中，可以测试本发明的抗体在作为ADC研发时促进细胞死亡的能力。可以在二级抗体-药物缀合物存在和不存在下进行细胞生存力测定。然后可以使用具有有效细胞生长抑制的抗体设计直接抗体-药物缀合物(ADC)。在基于细胞的细胞毒性测定中使用此类二级抗体-药物缀合物可以允许快速预筛选许多ADC候选者。基于此类测定，在与一种或多种细胞毒性剂缀合的二级抗体(在本文中被称为2°ADC)存在下将非缀合抗体候选者直接添加至细胞。将抗体/2°ADC复合物内化至表达高密度的所靶向抗原的细胞中可以在所述细胞内实现剂量依赖性药物释放，引发细胞毒性效应以杀伤所述细胞(例如，肿瘤细胞)，而表达低密度的所靶向抗原的细胞不受影响(例如，正常细胞)。
本发明的ADC可以设计为靶向癌细胞。此类ADC可以包括针对一种或多种肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗体。在一些情况下，本发明的ADC是抗STn抗体。在一些实施方案中，ADC包括表2中所呈现的可变结构域中的一种或多种。这种ADC还可以包括至少一个人IgG恒定区，包括但不限于表3中所呈现的那些中的任一个。
嵌合抗原受体的研发
在一些实施方案中，本发明的抗体序列可以用于研发嵌合抗原受体(CAR)。CAR是在免疫细胞上表达的跨膜受体，促进靶细胞(例如，肿瘤细胞)的识别和杀伤。CAR典型地包括三个基础部分。这些基础部分包括胞外结构域(也称为识别结构域)、跨膜结构域和细胞内(信号传导)结构域。胞外结构域促进结合至靶细胞上的细胞抗原，而细胞内结构域典型地包括细胞信号传导功能以促进所结合靶细胞的杀伤。另外，其可以具有细胞外结构域，所述细胞外结构域具有一个或多个本文所述的抗体可变结构域或其片段。本发明的CAR还包括跨膜结构域和胞质尾区。CAR可以被设计为包括抗体、抗体可变结构域和/或抗体CDR的一个或多个区段，使得在此类CAR于免疫效应细胞上表达时，免疫效应细胞结合并清除由CAR的抗体部分识别的任何细胞。
CAR的特征包括其利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非MHC限制性方式重引导针对所选靶标的T细胞特异性和反应性的能力。非MHC限制性抗原识别给予表达CAR的T细胞不依赖抗原加工而识别抗原的能力，由此绕过肿瘤逃逸的主要机制。另外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。
进行工程化以靶向肿瘤的CAR可对一种或多种肿瘤相关的碳水化合物抗原(TACA)具有特异性。在一些实施方案中，这些CAR的胞外结构域可以包括一个或多个抗体可变结构域或其片段。在一些实施方案中，CAR是在T细胞中表达，并且所述T细胞可以被称为“CAR工程化T细胞”或“CAR-T”。CAR-T可以用具有一个或多个抗体可变结构域的CAR胞外结构域工程化。
嵌合抗原受体的结构特征
使用基因转移技术，可以将T细胞工程化以在其表面上稳定表达抗体，从而赋予所需的抗原特异性。嵌合抗原受体(CAR)将特定抗体的抗原识别结构域与具有T细胞激活特性的CD3-ζ链或FcγRI蛋白的细胞内结构域组合为单一嵌合融合蛋白。CAR技术提供T细胞对靶细胞的MHC非限制性识别。去除T细胞的MHC限制促进这些分子在任何患者中的使用，以及在CD8+和CD4+T细胞二者中的使用，这两种T细胞通常分别受限于MHC I类或II类表位。使用Ab结合区允许T细胞不仅响应由蛋白质形成的表位，而且响应由碳水化合物和脂质形成的表位。这种嵌合受体方法尤其适合于癌症的免疫疗法，能够绕过肿瘤借以避开免疫识别的多种机制，如MHC下调、共刺激分子的表达的缺乏、CTL抗性和T细胞抑制的诱导，并且其中最佳地组合CD8+CTL与CD4+T细胞的使用以获得最佳抗肿瘤效率。已经证明除了诸如HIV等病毒以外，这种方法适用于众多种肿瘤抗原(Finney等人,J.Immunology,2004,172:104-113)。
虽然嵌合抗原受体可以以与内源T细胞受体类似的方式触发T细胞激活，在实践中，CAR技术的临床应用受到嵌合抗原受体T细胞的体内扩增不足的阻碍。例如，第一代CAR包括CD3ζ或Fc受体γ链的细胞质区域作为其信号传导结构域。在I期临床研究中在患有卵巢癌、肾癌、淋巴瘤和神经母细胞瘤的患者中测试这些第一代CAR，并且发现其诱导适度反应，有效重引导T细胞的细胞毒性，但未能使得T细胞在重复抗原暴露后增殖和存活。第二代CAR的原型涉及涵盖CD28和CD3ζ二者的受体，并且已经测试第二代CAR对B细胞恶性肿瘤和其他癌症的治疗(Sadelain等人,(2009)Current Opinion in Immunology,21(2):215-223)。因此，CAR已经快速扩展到具有不同功能特性的受体的各种阵列中。
更近地，发现CAR介导的T细胞应答可以通过添加共刺激结构域来增强。在临床前模型中，发现与仅包括CD3-ζ链相比，包括CD137(4-1BB)信号传导结构域显著增加嵌合抗原受体的抗肿瘤活性和体内持久性(Porter等人,N.Engl.J.Med.2011,365:725-733)。
因此，在本公开文本的一些实施方案中，本发明的抗体序列可以用于研发嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，CAR是在免疫细胞上表达的跨膜受体，其促进对靶细胞(例如，肿瘤细胞)的识别和杀伤。
在许多癌症中，尚未定义用于靶向的肿瘤特异性抗原，但是在B细胞肿瘤中，CD19是有吸引力的靶标。CD19的表达受限于正常和恶性B细胞以及B细胞前体。在患有晚期p53缺陷型慢性淋巴样白血病(CLL)的患者中用表达抗CD19嵌合抗原受体(CART19)的自体T细胞进行的治疗的试点临床试验。通过与嵌合抗原受体T细胞的峰值浸润一致的细胞因子的短暂释放和白血病细胞的消融来证明CD19特异性免疫应答在骨髓中的产生。(Porter等人,N.Engl.J.Med.2011,365:725-733)。
CAR的其他结构特征可以包括若干个转让给希望之城(City of Hope)并且具有共同的发明人Michael Jensen的PCT公开案中披露的那些中的任一种。例如，PCT公开案WO00/23573描述遗传工程化的CD20特异性重引导的表达细胞表面蛋白的T细胞，所述细胞表面蛋白具有包括对CD20具有特异性的受体的细胞外结构域、细胞内信号传导结构域和跨膜结构域。此类细胞用于CD20+恶性肿瘤的细胞免疫疗法和用于消除任何不利的B细胞功能的用途。在一个实施方案中，细胞表面蛋白是单链FvFc:ζ受体，其中Fv将单链单克隆抗体的VH和VL链指定至通过肽连接的CD20，Fc代表人IgG1的铰链-CH2-CH3区域，并且ζ代表人CD3的ζ链的细胞内信号传导结构域。通过电穿孔使用编码受体的裸DNA制造重引导的表达嵌合T细胞受体的T细胞的方法。类似地，PCT公开案WO 02/077029描述遗传工程化的CD19特异性重引导的表达细胞表面蛋白的免疫细胞，所述细胞表面蛋白具有包括对CD19具有特异性的受体的细胞外结构域、细胞内信号传导结构域和跨膜结构域。此类细胞用于CD19+恶性肿瘤的细胞免疫疗法和用于消除任何不利的B细胞功能的用途。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞并且细胞表面蛋白是scFvFc:ζ受体，其中Fv将单链单克隆抗体的VH和VL链指定至CD19，Fc代表IgG1的恒定区的至少一部分，并且ζ代表T细胞抗原受体复合物ζ链(人CD3的ζ链)的细胞内信号传导结构域。细胞外结构域scFvFc和细胞内结构域ζ是通过跨膜结构域(如CD4的跨膜结构域)连接。通过电穿孔使用编码受体的裸DNA制造重引导的表达嵌合T细胞受体的T细胞的方法。这些嵌合抗原受体具有在T细胞中表达时基于单克隆抗体的特异性重引导抗原识别的能力。对肿瘤细胞表面表位具有靶标特异性的scFvFc:受体的设计是产生用于过继性疗法的抗肿瘤免疫效应细胞的概念上有吸引力的策略，因为其不依赖于预先存在的抗肿瘤免疫力。这些受体的“通用性”在于，其以非MHC依赖性方式结合抗原，因此，可以使用一种受体构建体来治疗患有抗原阳性肿瘤的患者群体。希望之城的PCT公开案WO02/088334、WO 2007/059298和WO 2010/065818描述“zetakine”，其是由包括连接至能够将细胞外结构域栓系至细胞表面的支持区的可溶受体配体的细胞外结构域、跨膜区和细胞内信号传导结构域构成。zetakine当在T淋巴细胞的表面上表达时将T细胞活性引导至那些表达可溶受体配体对其具有特异性的受体的特定细胞。
CAR的其他特征可以包括转让给德克萨斯大学(University of Texas)并且具有共同的发明人Lawrence Cooper的两个PCT公开案中披露的那些中的任一种。PCT公开号WO2009/091826描述包括人CD19特异性嵌合T细胞受体(或嵌合抗原受体，CAR)多肽(命名为hCD19CAR)的组合物，所述多肽包括细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，所述细胞外结构域包括人CD19结合区。在另一个方面中，CD19结合区是F(ab')2、Fab'、Fab、Fv或scFv。细胞内结构域可以包括人CD3ζ的细胞内信号传导结构域并且可以进一步包括人CD28细胞内区段。在某些方面中，跨膜结构域是CD28跨膜结构域。PCT公开号WO 2013/074916描述用于免疫疗法的方法和组合物，所述免疫疗法采用经遗传修饰以消除T细胞受体和/或HLA的表达的CAR+T细胞。在特定实施方案中，例如，使用锌指核酸酶产生T细胞受体阴性和/或HLA阴性T细胞。可以将来自同种异体健康供者的CAR+T细胞给予至任何患者而不引发移植物抗宿主病(GVHD)，用作诸如癌症、自身免疫和感染等医学病症的现有(off-the-shelf)治疗的通用试剂。
转让给美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)的PCT公开案WO 2011/041093描述抗血管内皮生长因子受体-2嵌合抗原受体，其包括KDR-1121或DC101抗体的抗原结合结构域、细胞外铰链结构域、T细胞受体跨膜结构域和细胞内T细胞受体信号传导结构域，以及其在癌症治疗中的用途。
PCT公开案WO 2012/079000和WO 2013/040557(上述各项的内容通过引用以其整体并入本文)转让给宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)并且具有共同的发明人Carl H.June；这些公开案分别描述包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域的CAR，以及产生RNA CAR转染的T细胞的方法。
同样转让给宾夕法尼亚大学并且具有共同的发明人Carl H.June的PCT公开案WO2013/126712描述用于产生持久T细胞群的组合物和方法，所述T细胞展现在培养中延长的指数扩增，所述扩增是非配体依赖性的并且不依赖外源细胞因子或饲养细胞的添加，所述组合物和方法可以用于治疗癌症。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗cMet结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗CD19结合结构域。铰链结构域是IgG4，跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，共刺激信号传导区是CD28信号传导区。还提供载体，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，并且所述CAR包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
转让给宾夕法尼亚大学的PCT公开案WO 2014/039513描述抑制细胞中的一种或多种二酰甘油激酶(DGK)亚型以增强所述细胞的细胞溶解活性的组合物和方法。所述细胞可以用于过继性T细胞转移，其中所述细胞被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。对过继性T细胞转移中使用的T细胞中DGK的抑制增加所述T细胞的细胞溶解活性，并因此可以用于治疗多种病症，包括癌症、感染和免疫障碍。
转让给宾夕法尼亚大学的PCT公开案WO 2014/055771描述用于治疗卵巢癌的组合物和方法。具体地，本发明涉及给予具有α-叶酸受体(FR-α)结合结构域和CD27共刺激结构域的遗传修饰的T细胞来治疗卵巢癌。在一个实施方案中，据称FR-α结合结构域是完全人类的，由此防止宿主免疫应答。
在一些实施方案中，本发明的CAR可以进行工程化以靶向肿瘤。此类CAR可以对一种或多种TACA具有特异性。在一些情况下，这些CAR的胞外结构域可以包含一个或多个本文所呈现的抗体可变结构域或其片段。在一些实施方案中，本发明的CAR是在T细胞中表达，所述T细胞在本文中被称为“CAR工程化的T细胞”或“CAR-T”。CAR-T可以用具有一个或多个本文所呈现的抗体可变结构域的CAR胞外结构域工程化。
多特异性抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体可以结合多于一个表位。如本文所用，术语“多抗体”或“多特异性抗体”是指抗体，其中两个或更多个可变区结合至不同表位。所述表位可以位于相同或不同靶标上。在某些实施方案中，多特异性抗体是“双特异性抗体”，其识别相同或不同抗原上的两种不同表位。
双特异性抗体
双特异性抗体能够结合两种不同抗原。此类抗体典型地包含来自至少两种不同抗体的抗原结合区。例如，双特异性单克隆抗体(BsMAb，BsAb)是由两种不同单克隆抗体的片段构成的人工蛋白质，因此允许BsAb结合至两种不同类型的抗原。这种技术的一种常用应用是在癌症免疫疗法中，其中BsMAb进行工程化以同时结合至细胞毒性细胞(使用受体，如CD3)和要破坏的靶标(如肿瘤细胞)。
双特异性抗体可以包括以下文献中所述的那些中的任一种：Riethmuller,G.,2012.Cancer Immunity.12:12-18；Marvin,J.S.等人,2005.Acta PharmacologicaSinica.26(6):649-58；和Schaefer,W.等人,2011.PNAS.108(27):11187-92，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文。
已经研发出新世代的BsMAb，其被称为“三功能双特异性”抗体。这些抗体是由两条重链和两条轻链组成，每一个来自两种不同抗体，其中两个Fab区域(臂)针对两种抗原，并且Fc区域(足)包含两条重链并形成第三结合位点。
在形成双特异性抗体的可变结构域的顶部的两个互补位中，一个互补位可以针对靶抗原并且另一个互补位针对T淋巴细胞抗原，如CD3。在三功能抗体的情况下，Fc区域可以另外结合至表达Fc受体的细胞，如巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞或树突细胞。总之，所靶向细胞连接至免疫系统的一种或两种细胞，随后所述免疫系统细胞破坏所靶向细胞。
已经设计其他类型的双特异性抗体来克服某些问题，如短半衰期、免疫原性和由细胞因子释放引起的副作用。所述双特异性抗体包括仅由Fab区域组成的化学连接的Fab，以及各种类型的二价和三价单链可变片段(scFv)、模拟两种抗体的可变结构域的融合蛋白。这些较新形式中研发最深入的是双特异性T细胞衔接体(BiTE)和工程化以含有Fcab抗原结合片段代替Fc恒定区的mAb2抗体。
双特异性单链抗体Fv片段(Bs-scFv)已成功用于杀伤癌细胞。一些人类癌症是由p53的功能缺陷引起的，所述功能缺陷是通过用野生型p53进行的基因疗法来恢复。Weisbart等人描述双特异性单链抗体的构建和表达，所述抗体渗透活的结肠癌细胞，结合细胞内p53，并且靶向并恢复其野生型功能(Weisbart等人,Int.J.Oncol.2004年10月；25(4):1113-8；和Weisbart等人,Int.J.Oncol.2004年12月；25(6):1867-73)。在这些研究中，双特异性单链抗体Fv片段(Bs-scFv)是从以下构建：(i)mAb 3E10的单链Fv片段，其渗透活细胞并定位于核中，和(ii)非渗透性抗体mAb PAb421的单链Fv片段，其结合至p53的C末端。PAb421结合恢复一些p53突变体的野生型功能，包括SW480人结肠癌细胞的那些。Bs-scFv渗透SW480细胞并且具有细胞毒性，显露出恢复突变体p53的活性的能力。COS-7细胞(具有野生型p53的猴肾细胞)用作对照，因为其由于存在SV40大型T抗原抑制PAb421与p53的结合而不响应PAb421。Bs-scFv渗透COS-7细胞但是不具有细胞毒性，由此消除Bs-scFv的与结合p53无关的非特异性毒性。单独的Fv片段无细胞毒性，指示杀伤是由于p53的转导所致。PAb421 VH的CDR1中的单一突变在不改变细胞渗透的情况下消除Bs-scFv与p53的结合并消除对SW480细胞的细胞毒性，从而进一步支持细胞毒性对PAb421与p53结合的需要(Weisbart等人,Int.J.Oncol.2004年10月；25(4):1113-8；和Weisbart等人,Int.J.Oncol.2004年12月；25(6):1867-73)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是双抗体。双抗体是功能性双特异性单链抗体(bscAb)。这些二价抗原结合分子是由scFv的非共价二聚体构成，并且可以使用重组方法在哺乳动物细胞中产生。(参见，例如，Mack等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:7021-7025,1995)。极少双抗体已经进入临床研发。已经在由希望之城的贝克曼研究所(BeckmanResearch Institute)申办的研究(Clinicaltrials.gov NCT00647153)中，针对结直肠癌的手术前免疫闪烁成像检测，评价抗CEA嵌合抗体cT84.66的碘-123标记的双抗体形式(Nelson,A.L.,MAbs.2010年1月-2月；2(1):77–83)。
使用分子遗传学，可以将两个scFv串联工程化为单一多肽，由接头结构域隔开，称为“串联scFv”(tascFv)。已经发现TascFv不易溶解，并且在细菌中产生时需要再折叠，或者其可以在哺乳动物细胞培养系统中制造，这避免再折叠需求但是可能导致产率较低。用两种不同scFv的基因构建tascFv产生“双特异性单链可变片段”(双scFv)。已经由商业公司临床研发了仅两种tascFv；两种tascFv都是处于Micromet针对肿瘤学适应证的积极早期研发中的双特异性药剂，并且被描述为“双特异性T细胞衔接体(BiTE)”。布利莫单抗(Blinatumomab)是抗CD19/抗CD3双特异性tascFv，其使得针对2期B细胞非霍奇金淋巴瘤的T细胞应答成为可能。MT110是抗EP-CAM/抗CD3双特异性tascFv，其使得针对1期实体瘤的T细胞应答成为可能。双特异性四价“TandAb”也正在由Affimed进行研究(Nelson,A.L.,MAbs.2010年1月-2月；2(1):77–83)。
还包括大抗体(maxibody)(融合至IgG的Fc(CH2-CH3结构域)的氨基末端的二价scFV)。
双特异性T细胞衔接体(BiTE)抗体被设计为短暂衔接细胞毒性T细胞用于溶解所选靶细胞。这些抗体典型地包括两个scFv(一个结合至T细胞上的CD3，并且一个结合至所靶向用于破坏的细胞的表面上的靶抗原)。在一些实施方案中，两个scFv是通过接头接合。在其他实施方案中，两个scFv是抗体上的不同区域。BiTE抗体的临床活性确证以下发现：离体扩增的衍生自肿瘤组织或者用特定T细胞受体转染的自体T细胞已经在实体瘤的治疗中显示治疗潜力。虽然这些个人化方法证实，单独的T细胞即使在晚期癌症中也可以具有显著治疗活性，但是其广泛实施较麻烦。这对于细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抗体是不同的，其促进肿瘤特异性T细胞克隆的产生，并且对于直接衔接大多数患者的T细胞用于癌细胞溶解的双特异性和三特异性抗体也是不同的。人们正在积极研究T细胞衔接抗体的全面T细胞衔接对于人类癌症治疗的潜力(Baeuerle PA等人,Current Opinion in MolecularTherapeutics.2009,11(1):22-30，和Baeuerle PA和Reinhardt C,Cancer Res.2009,69(12):4941-4，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文)。
第三代分子包括“小型化”抗体。mAb小型化的最佳例子包括来自TrubionPharmaceuticals的小模块免疫药物(SMIP)。这些可以是单价或二价的分子是重组单链分子，其含有一个VL、一个VH抗原结合结构域以及一个或两个恒定“效应子”结构域，都是通过接头结构域连接。大概，这种分子可能提供片段所要求的增加组织或肿瘤渗透性的优势，同时保持恒定结构域所赋予的免疫效应子功能。至少三种“小型化”SMIP已经进入临床研发中。与Wyeth合作研发的TRU-015(抗CD20 SMIP)是最先进的项目，已经进展至2期用于类风湿性关节炎(RA)。在系统性红斑狼疮(SLE)和B细胞淋巴瘤中的早期尝试最终被停止。Trubion和Facet Biotechnology正在合作研发用于治疗CLL和其他淋巴样赘瘤的TRU-016(抗CD37 SMIP)，这个项目已经到达2期。Wyeth已经得到抗CD20 SMIP SBI-087用于治疗自身免疫病(包括RA、SLE和可能的多发性硬化症)的许可，但是这些项目仍然处于临床测试的最早期阶段。(Nelson,A.L.,MAbs.2010年1月-2月；2(1):77–83)。
Genmab正在研究其“单抗体(Unibody)”技术的应用，其中已经从IgG4分子去除铰链区。虽然IgG4分子不稳定并且可能彼此交换轻链-重链异二聚体，但是铰链区的缺失完全阻止重链-重链配对，从而留下高特异性的单价轻/重异二聚体，同时保留Fc区域以确保稳定性和延长的体内半衰期。这种配置可以使免疫激活或致癌性生长的风险降至最低，因为IgG4与FcR的相互作用较弱，并且单价单抗体未能促进细胞内信号传导复合物形成。然而，这些论点主要由实验室证据而不是临床证据支持。Biotecnol也正在研发“小型化”mAb，即CAB051，其是处于临床前研究中的“压缩的”100kDa抗HER2抗体(Nelson,A.L.,MAbs.2010年1月-2月；2(1):77–83)。
还已经研发由单一抗原结合结构域构成的重组治疗药，但是其目前仅占临床管道的4％。这些分子极小，分子量是针对全尺寸mAb所观察到的分子量的大约十分之一。Arana和Domantis工程化由人免疫球蛋白轻链或重链的抗原结合结构域构成的分子，但是只有Arana具有临床测试中的候选者ART-621，其为处于针对银屑病和类风湿性关节炎的治疗的2期研究中的抗TNFα分子。Ablynx生产衍生自重链抗体的抗原结合可变重链区(VHH)的“纳米抗体”，所述重链抗体发现于骆驼和骆马中且缺少轻链。两种Ablynx抗von Willebrand因子纳米抗体已经发展到临床研发，包括ALX-0081，其处于2期研发中，作为静脉内疗法在经历用于急性冠状动脉综合征的经皮冠状动脉介入的患者中预防血栓形成；和ALX-0681，其是用于皮下给予的1期分子，旨在用于患有急性冠状动脉综合征和血栓性血小板减少性紫癜的两种患者(Nelson,A.L.,MAbs.2010年1月-2月；2(1):77–83)。
多特异性抗体的研发
在一些实施方案中，本发明的抗体序列可以用于研发多特异性抗体(例如，双特异性、三特异性或更高多特异性)。多特异性抗体可以对本发明的靶抗原的不同表位具有特异性，或者可以对本发明的靶抗原和异源表位(如异源聚糖、肽或固体支持材料)二者都具有特异性。(参见，例如，WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt,A.等人,Trispecific F(ab')3derivatives that use cooperative signaling via the TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic Tcells.J.Immunol.1991年7月1日；147(1):60-9；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；和Kostelny,S.A.等人,Formation of a bispecificantibody by the use of leucine zippers.J.Immunol.1992年3月1日；148(5):1547-53)；美国专利号5,932,448。
授予Memorial Sloan-Kettering Cancer Center的PCT公开案WO 2014144573中披露并要求用于制造二聚多特异性结合剂(例如，包含抗体组分的融合蛋白)的多聚化技术，所述二聚多特异性结合剂相对于不具有二聚化能力的多特异性结合剂具有改善的特性。
授予Merck Patent GMBH的PCT公开案WO 2014144357中披露并要求四价双特异性抗体(TetBiAb)，以及制造TetBiAb的方法和使用TetBiAb诊断和治疗癌症或免疫障碍的方法。TetBiAb的特征为第二对Fab片段，其具有第二抗原特异性，附接至抗体C末端，由此提供对于两种抗原特异性中的每一种为二价的分子。所述四价抗体是通过基因工程方法，通过将抗体重链共价连接至Fab轻链来产生，所述Fab轻链与其同源的共表达Fab重链缔合。
授予IBC Pharmaceuticals,Inc.的PCT公开案WO 2014028560中披露并要求T细胞重引导双特异性抗体(bsAb)，其具有至少一个用于T细胞抗原的结合位点和至少一个用于患病细胞或病原体上的抗原的结合位点，所述抗体用于治疗疾病。优选地，这种bsAb是抗CD3 x抗CD19双特异性抗体，但是可以使用针对其他T细胞抗原和/或疾病相关抗原的抗体。所述复合物能够靶向效应子T细胞以诱导疾病(如癌症、自身免疫病或感染性疾病)相关细胞的T细胞介导的细胞毒性。细胞毒性免疫应答是通过基于干扰素的药剂的共给予来增强，所述药剂包含干扰素-α、干扰素-bgr；干扰素-λ1、干扰素-λ2或干扰素-λ3。
授予Synimmune GMBH的PCT公开案WO 2013092001中披露并要求双特异性抗体分子，以及其产生方法、其用途和编码所述双特异性抗体分子的核酸分子。特别地提供能够介导免疫细胞的靶细胞限制性激活的抗体分子。
PCT公开案WO 2012007167中披露并要求多特异性模块抗体，其特异性结合至至少肿瘤细胞表面上的erbB类别的糖表位和受体，由此交联所述糖表位与所述受体，所述抗体具有细胞凋亡活性，从而实现不依赖NK细胞的细胞溶解。
PCT公开案WO 2012048332和WO 2013055404中披露并要求中间表位(meditope)、中间表位结合抗体、中间表位递送系统，以及中间表位的单克隆抗体框架结合界面，和其使用方法。具体地，显示两种抗体结合肽具有新颖的mAb结合特性，这两种抗体结合肽是C-QFDLSTRRLK-C(“cQFD”；其中的序列识别号1；本文中的SEQ ID NO:17)和C-QYNLSSRALK-C(“cQYN”；其中的序列识别号2；本文中的SEQ ID NO:18)。同样被称为“中间表位”，显示cQFD和cQYN结合至抗EGFR mAb西妥昔单抗的Fab框架的区域，并且不结合结合抗原的互补决定区(CDR)。Fab框架上的结合区与其他框架结合抗原不同，所述框架结合抗原如超抗原葡萄球菌(Staphylococcal)蛋白A(SpA)(Graille等人,2000)和大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)蛋白L(PpL)(Graille等人,2001)。因此，所披露的一个实施方案是框架结合界面，其包含结合环状中间表位的独特鼠类-人抗体或其功能片段的框架区。
示例性目的专利和专利公开案是：都在1995年6月7日提交的美国专利号5,585,089；5,693,761；和5,693,762以及都转让给Protein Design Labs,Inc.的美国专利号6,180,370，上述专利描述产生人源化免疫球蛋白的方法和所述人源化免疫球蛋白的组合物，所述人源化免疫球蛋白具有来自供者免疫球蛋白的一个或多个互补决定区(CDR)和可能的其他氨基酸以及来自接受人免疫球蛋白的框架区。据称除了CDR，每条人源化免疫球蛋白链通常包含例如能够与CDR相互作用以实现结合亲和性的来自供者免疫球蛋白框架的氨基酸，如在供者免疫球蛋白中与CDR紧邻的一个或多个氨基酸，或者如通过分子建模所预测在约3内的那些氨基酸。重链和轻链可以各自通过使用多种位置标准中的任一种或全部来设计。在组合至完整抗体中时，据称本发明的人源化免疫球蛋白在人类中基本上是非免疫原性的，并保持与供者免疫球蛋白基本上相同的对抗原的亲和性，所述抗原如含有表位的蛋白质或其他化合物。
转让给Universite Catholique De Louvain和Bio Transplant,Inc.的美国专利号5,951,983描述针对T淋巴细胞的人源化抗体。来自命名为HUM5400的人Vκ基因(EMBL登录号X55400)和来自人抗体克隆Amu 5-3(GenBank登录号U00562)的框架区陈述于其中。
授予Creative Biomolecules,Inc.的美国专利号5,091,513描述对预先选择的抗原具有亲和性的合成蛋白质家族。所述蛋白质的特征为一个或多个氨基酸序列，所述序列构成作为生物合成抗体结合位点(BABS)作用的区域。所述位点包含1)非共价缔合或二硫键合的合成VH和VL二聚体，2)VH-VL或VL-VH单链，其中VH和VL是通过多肽接头附接，或3)个体VH或VL结构域。结合结构域包含连接的CDR和FR区域，其可以衍生自单独的免疫球蛋白。所述蛋白质还可以包括其他多肽序列，所述多肽序列用作例如酶、毒素、结合位点或者附接至固定化介质或放射性原子的位点。披露产生所述蛋白质的方法，设计具有可以通过抗体的体内产生引发的具有任何特异性的BABS的方法，以及产生其类似物的方法。
授予ESBATech(Alcon Biomedical Research Unit,LLC)的美国专利号8,399,625描述抗体受体框架和使用特别合适的抗体受体框架移植非人抗体(例如，兔抗体)的方法。
胞内抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是胞内抗体。胞内抗体是不从产生其的细胞分泌的抗体形式，而是靶向一种或多种细胞内蛋白。胞内抗体是在细胞内表达并发挥功能，并且可以用于影响多种细胞过程，包括但不限于细胞内运输、转录、翻译、代谢过程、增殖信号传导和细胞分裂。在一些实施方案中，本文所述方法包括基于胞内抗体的疗法。在一些此类实施方案中，将本文所公开的可变结构域序列和/或CDR序列并入一种或多种构建体中用于基于胞内抗体的疗法。例如，胞内抗体可以靶向一种或多种糖化细胞内蛋白或者可以调节一种或多种糖化细胞内蛋白与替代性蛋白之间的相互作用。
在二十多年前，首次描述针对细胞内靶标的细胞内抗体(Biocca,Neuberger和Cattaneo EMBO J.9:101-108,1990)。胞内抗体在哺乳动物细胞的不同区室中的细胞内表达允许阻断或调节内源分子的功能(Biocca等人,EMBO J.9:101-108,1990；Colby等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:17616-21,2004)。胞内抗体可以改变蛋白质折叠、蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用以及蛋白质修饰。其可以通过直接结合至靶抗原、通过使其细胞内运输转向或通过抑制其与结合配偶体的缔合，来诱导表型敲除并且用作中和剂。胞内抗体主要用作研究工具并且是作为用于治疗人类疾病的治疗性分子出现的，所述人类疾病如病毒性病状、癌症和错误折叠疾病。重组抗体的快速增长的生物市场为胞内抗体在治疗中的用途提供具有增强的结合特异性、稳定性和溶解度以及较低免疫原性的胞内抗体(Biocca,Antibody Expression and Production Cell Engineering第7卷的摘要,2011,第179-195页)。
在一些实施方案中，胞内抗体具有优于干扰RNA(iRNA)的优势；例如，已经显示iRNA发挥多种非特异性效应，而已经显示胞内抗体对靶抗原具有高特异性和亲和性。此外，作为蛋白质，胞内抗体具有比iRNA显著更长的活性半衰期。因此，在细胞内靶分子的活性半衰期较长时，通过iRNA进行基因沉默可能产生效应较慢，而胞内抗体表达可能几乎立即产生效应。最后，可能设计胞内抗体以阻断特定靶分子的某些结合相互作用，同时不阻断其他相互作用。
胞内抗体的研发
胞内抗体通常是从重组核酸分子表达并且工程化以保持在细胞内(例如，保持在细胞质、内质网或周质中)的单链可变片段(scFv)。胞内抗体可以用于例如消除胞内抗体所结合的蛋白质的功能。胞内抗体的表达还可以通过使用包含胞内抗体的核酸表达载体中的诱导型启动子来调节。胞内抗体可以使用本领域中已知的方法来产生，例如以下文献中披露和综述的那些：(Marasco等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893；Chen等人,1994,Hum.Gene Ther.5:595-601；Chen等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:5932-5936；Maciejewski等人,1995,Nature Med.,1:667-673；Marasco,1995,Immunotech,1:1-19；Mhashilkar等人,1995,EMBO J.14:1542-51；Chen等人,1996,Hum.Gene Therap.,7:1515-1525；Marasco,Gene Ther.4:11-15,1997；Rondon和Marasco,1997,Annu.Rev.Microbiol.51:257-283；Cohen等人,1998,Oncogene 17:2445-56；Proba等人,1998,J.Mol.Biol.275:245-253；Cohen等人,1998,Oncogene 17:2445-2456；Hassanzadeh等人,1998,FEBS Lett.437:81-6；Richardson等人,1998,Gene Ther.5:635-44；Ohage和Steipe,1999,J.Mol.Biol.291:1119-1128；Ohage等人,1999,J.Mol.Biol.291:1129-1134；Wirtz和Steipe,1999,Protein Sci.8:2245-2250；Zhu等人,1999,J.Immunol.Methods231:207-222；Arafat等人,2000,Cancer Gene Ther.7:1250-6；der Maur等人,2002,J.Biol.Chem.277:45075-85；Mhashilkar等人,2002,Gene Ther.9:307-19；和Wheeler等人,2003,FASEB J.17:1733-5；和其中引用的参考文献)。特别地，CCR5胞内抗体已经由Steinberger等人产生,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:805-810)。通常参见Marasco,WA,1998,“Intrabodies:Basic Research and Clinical Gene Therapy Applications”Springer:New York；并且关于scFv的综述，参见Pluckthun，“The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies”,1994,第113卷,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag,纽约,第269-315页。
在一些实施方案中，使用抗体序列来研发胞内抗体。胞内抗体通常是作为单一结构域片段(如分离的VH和VL结构域)或作为单链可变片段(scFv)抗体在细胞内重组表达。例如，胞内抗体通常是作为单一多肽表达，以形成包含通过柔性接头多肽接合的重链和轻链的可变结构域的单链抗体。胞内抗体典型地缺少二硫键并且能够通过其特异性结合活性调节靶基因的表达或活性。单链抗体还可以作为接合至轻链恒定区的单链可变区片段来表达。
如本领域中已知，可以将胞内抗体工程化至重组多核苷酸载体中以在其N或C末端编码亚细胞运输信号，以允许在靶蛋白所在的亚细胞区室中以高浓度表达。例如，将靶向内质网(ER)的胞内抗体工程化以并入前导肽和任选地C末端ER保持信号，如KDEL(SEQ ID NO:23)氨基酸基序。将旨在于核中发挥活性的胞内抗体工程化以包括核定位信号。将脂质部分接合至胞内抗体以将胞内抗体栓系至质膜的胞质溶胶侧。胞内抗体还可以被靶向以在胞质溶胶中发挥功能。例如，使用胞质溶胶胞内抗体隔离胞质溶胶内的因子，由此防止其被运输至其天然的细胞目的地。
对于胞内抗体表达存在某些技术困难。特别地，新合成的胞内抗体在细胞内的蛋白质构象折叠和结构稳定性受到细胞内环境的还原性条件影响。在人临床疗法中，存在关于经转染重组DNA的应用的安全性问题，所述经转染重组DNA用于实现胞内抗体在细胞内的表达。特别关注在基因操纵中常用的各种基于病毒的载体。因此，一种避免发生这些问题的方法是将蛋白质转导结构域(PTD)与scFv抗体融合，以产生‘可渗透细胞的’抗体或‘穿体(Transbody)’。穿体是可渗透细胞的抗体，其中蛋白质转导结构域(PTD)与单链可变片段(scFv)抗体融合(Heng和Cao,2005,Med Hypotheses.64:1105-8)。
在与靶基因相互作用后，胞内抗体通过诸如加速靶蛋白降解和将靶蛋白隔离在非生理亚细胞区室中等机制来调节靶蛋白功能和/或实现表型/功能敲除。胞内抗体介导的基因失活的其他机制可以依赖于胞内抗体所针对的表位，如结合至靶蛋白上的催化位点或结合至参与蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用的表位。
在一个实施方案中，使用胞内抗体捕获核中的靶标，由此防止所述靶标在核内的活性。将核靶向信号工程化至此类胞内抗体中以实现所需靶向。此类胞内抗体被设计为特异性结合至特定靶结构域。在另一个实施方案中，使用特异性结合至靶蛋白的胞质溶胶胞内抗体来防止靶标获得到达核的通路，由此防止所述靶标在核内发挥任何生物活性(例如，防治靶标与其他因子形成转录复合物)。
为了将此类胞内抗体的表达特异性引导至特定细胞，将胞内抗体的转录置于适当肿瘤特异性启动子和/或增强子的调节控制下。为了将胞内抗体表达特异性靶向至前列腺，例如，可以利用PSA启动子和/或启动子/增强子(参见，例如，1999年7月6日授权的美国专利号5,919,652)。
蛋白质转导结构域(PTD)是短肽序列，其使得蛋白质能够通过非典型的分泌和内化途径跨越细胞膜易位并且内化于胞质溶胶内。相对于在细胞内表达的常规胞内抗体，‘穿体’将具有多种不同的优点。首先，可以在引入靶细胞中之前进行‘正确’的构象折叠和二硫键形成。更重要的，使用可渗透细胞的抗体或‘穿体’可避免关于在人临床疗法中直接应用重组DNA技术的无法抵抗的安全性和伦理问题，所述重组DNA技术是胞内抗体在细胞内表达所需的。引入细胞中的‘穿体’将仅具有有限的活性半衰期，不导致任何永久性的遗传改变。这可以减少关于其在人临床疗法中的应用的任何安全性问题(Heng和Cao 2005,MedHypotheses.64:1105-8)。
由于胞内抗体实际上无限的特异性识别蛋白质的不同构象的能力(包括病理学亚型)，并且由于其可以靶向至潜在的聚集位点(细胞内和细胞外位点二者)，胞内抗体是有希望的用于治疗错误折叠疾病的治疗剂，所述疾病包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和朊病毒病。这些分子可以通过防止淀粉样蛋白生成性蛋白聚集来作为针对淀粉样蛋白生成性蛋白的中和剂起作用，和/或通过将蛋白质从其潜在聚集位点重选路径来作为细胞内运输的分子分路器起作用(Cardinale和Biocca,Curr.Mol.Med.2008,8:2-11)。
描述细胞内抗体或胞内抗体的示例性专利公开案陈述于下文中，其各自通过引用以其整体并入本文。
PCT公开案WO 03014960和授予Cattaneo等人的美国专利7,608,453描述鉴定细胞内抗体的至少一个共有序列的细胞内抗体捕获技术方法(ICS)，其包括以下步骤：创建包含已验证细胞内抗体的序列的数据库(VIDA数据库)并根据Kabat比对已验证细胞内抗体的序列；确定特定氨基酸在所比对抗体的每个位置中出现的频率；选择在70％至100％范围内的频率阈值(LP或共有阈值)；鉴定特定氨基酸的频率大于或等于LP值的比对位置；以及鉴定在所述比对的位置中最频繁的氨基酸。
都转让给Medical Research Council并且包括Cattaneo等发明人的PCT公开案WO0054057；WO 03077945；WO 2004046185；WO 2004046186；WO 2004046187；WO 2004046188；WO 2004046189；美国专利申请公开案US 2005272107；US 2005276800；US 2005288492；US2010143939；授权的美国专利7,569,390和7,897,347以及授权的欧洲专利EP1560853；以及EP1166121描述细胞内信号结构域免疫球蛋白，和确定免疫球蛋白单一结构域结合至细胞内环境中的靶标的能力的方法，以及产生细胞内抗体的方法。
以Catteneo作为发明人并转让给S.I.S.S.A.Scuola Internazionale Superiore的PCT公开案WO 0235237；美国专利申请公开案2003235850和授权的欧洲专利EP1328814描述在体内鉴定细胞内抗原的表位的方法。
转让给Lay Line Genomics SPA并以Catteneo作为发明人的PCT公开案WO2004046192和欧洲专利EP1565558描述分离细胞内抗体的方法，所述细胞内抗体破坏并中和细胞内的蛋白质配体x与蛋白质配体y之间的相互作用。还披露使用能够在x与y之间相互作用的细胞内抗体鉴定能够结合至已知y配体的蛋白质配体x的方法；以及分离一组抗体片段的方法，所述抗体片段针对给定细胞的相当大比例的蛋白质-蛋白质相互作用(相互作用组(interactome))或针对构成细胞内途径或网络的蛋白质相互作用。
标题为“Intrabody-mediated control of immune reactions”并且转让给达纳法伯癌症研究所有限公司(Dana Farber Cancer Institute Inc.)的以Marasco和Mhashilkar为发明人的美国专利申请公开案2006034834和PCT公开案WO 9914353涉及例如通过选择性靶向细胞上的各个免疫调节受体分子(IRM)或免疫调节受体分子类别来改变免疫系统的调节的方法，其包括用针对IRM的细胞内表达的抗体或胞内抗体转导细胞。在优选实施方案中，胞内抗体包含针对IRM(例如，MHC-1分子)的单链抗体。
转让给达纳法伯癌症研究所有限公司和怀特黑德生物医学研究所(WhiteheadBiomedical Institute)，并且以Bradner、Rahl和Young为发明人的PCT公开案WO2013033420描述方法和组合物，其可用于抑制溴结构域蛋白与免疫球蛋白(Ig)调节元件之间的相互作用，并下调与Ig基因座一起易位的癌基因的表达，以及用于治疗特征为增加的与Ig基因座一起易位的癌基因的表达的癌症(例如，血液学恶性肿瘤)。大体上描述了胞内抗体。
标题为“Methods of producing or identifying intrabodies in eukaryoticcells”的转让给罗彻斯特大学医学中心(University of Rochester Medical Center)并且以Zauderer、Wei和Smith为发明人的PCT公开案WO 02086096和美国专利申请公开案2003104402描述使用三分子重组方法在真核细胞中表达细胞内免疫球蛋白分子和细胞内免疫球蛋白文库的高效率方法。还提供了选择并筛选细胞内免疫球蛋白分子和其片段的方法，以及用于产生、筛选和选择细胞内免疫球蛋白分子的试剂盒，以及使用这些方法产生的细胞内免疫球蛋白分子和片段。
转让给Affinity Biosciences PTY LTD并且以Beasley、Niven和Kiefel为发明人的PCT公开案WO 2013023251描述多肽(如抗体分子)和编码此类多肽的多核苷酸，和其文库，其中所表达的多肽证明高稳定性和溶解度。特别地，描述在还原性或细胞内环境中证明可溶性表达和折叠的包含成对VL和VH结构域的多肽，其中筛选人scFv文库，导致可溶scFv基因的分离，所述可溶scFv基因具有与人种系序列相同的框架区以及显著热稳定性和对移植至scFv支架上的CDR3的耐受性。
转让给Esbatech AG和苏黎世大学(University of Zuerich)并且以Ewert、Huber、Honneger和Plueckthun为发明人的欧洲专利申请EP2314622以及PCT公开案WO03008451和WO 03097697描述人可变结构域的修饰并提供可作为框架用于产生极为稳定且可溶的单链Fv(scFv)抗体片段的组合物。这些框架已经针对细胞内表现加以选择，并且因此理想地适合于产生scFv抗体片段或scFv抗体文库，所述scFv抗体片段或scFv抗体文库用于其中稳定性和溶解度是抗体片段表现的限制因素的应用，如在细胞的还原性环境中。此类框架还可以用于鉴定证明增强的溶解度和稳定性的高度保守的残基和共有序列。
标题为“Systems devices and methods for intrabody targeted deliveryand reloading of therapeutic agents”的PCT公开案WO 02067849和美国专利申请公开案2004047891描述用于分子的胞内抗体靶向递送的系统、装置和方法。更特别地，一些实施方案涉及可重加载的药物递送系统，其使得能以集中且及时的方式将治疗剂靶向递送至受试者的组织区域中。
转让给Amgen Inc.并且以Zhou、Shen和Martin为发明人的PCT公开案WO2005063817和美国专利7,884,054描述鉴定功能抗体(包括胞内抗体)的方法。特别地，描述同二聚胞内抗体，其中同二聚体的每条多肽链包含Fc区域、scFv和细胞内定位序列。细胞内定位序列可以使胞内抗体定位至ER或高尔基体。任选地，每条多肽链包含不多于一个scFv。
Vogan等人的并且转让给Permeon Biologics Inc.的PCT公开案WO 2013138795描述用于递送细胞内抗体和抗体样部分的细胞渗透组合物和将其(在本文中被称为“AAM部分”或“AAM部分”)递送至细胞中的方法。不受理论束缚，本公开文本至少部分是基于以下发现：可以通过将AAM部分与具有表面正电荷的细胞渗透多肽(在本文中被称为“Surf+渗透性多肽”)复合而将AAM部分递送至细胞中。还提供趋内素(intraphilin)技术的一些应用的例子。
转让给巴斯德研究所(Pasteur Institute)的PCT公开案WO 2010004432描述来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、骆马和羊驼)的免疫球蛋白，其中约50％是全无轻链的抗体。这些重链抗体仅借助一个单一可变结构域与抗原相互作用，所述可变结构域被称为一个或多个VHH、一个或多个VHH结构域或者一种或多种VHH抗体。虽然不存在轻链，这些同二聚抗体通过放大其超变区来展现宽抗原结合谱，并且在所述VHH结构域针对细胞内靶标时，可以在体外以及在体内用作穿体和/或胞内抗体。
PCT公开案WO 2014106639描述通过鉴定可以修饰细胞表型的胞内抗体和鉴定所述胞内抗体的直接或间接细胞靶标来鉴定细胞表型中所涉及的细胞靶标的方法。特别地，胞内抗体3H2-1、3H2-VH和5H4能够抑制肥大细胞中由过敏性刺激触发的去粒反应；此外，胞内抗体3H2-1和5H4分别直接或间接地靶向ABCF1家族和C120RF4家族的蛋白质。据称这些ABCF1和C120RF4抑制剂可以用于疗法中，特别地用于治疗过敏性和/或炎症性病症。
转让给Urogenesis Inc.的PCT公开案WO 0140276大体上描述使用细胞内抗体(胞内抗体)抑制STEAP(前列腺的六次跨膜上皮抗原)蛋白的可能性。
转让给曼彻斯特大学(University of Manchester)的PCT公开案WO 02086505和以Simon和Benton为发明人的美国专利申请公开案US 2004115740描述用于细胞内分析靶分子的方法，其中据称胞内抗体是优选的。在一个实施方案中，描述能够表达与CFP偶合的抗MUC1胞内抗体的载体(命名为pScFv-ECFP)。
转让给Gene Therapy Systems Inc.的PCT公开案WO 03095641和WO 0143778描述用于细胞内蛋白递送的组合物和方法，并且大体上描述胞内抗体。
转让给Selective Genetics Inc.的PCT公开案WO 03086276描述用于治疗细胞内感染的平台技术。其中描述的组合物和方法包括非靶特异性载体，其通过所连接配体靶向可感染细胞，所述配体结合感染相关的细胞表面受体/部分并通过所述细胞表面受体/部分内化。所述载体包含在内化至靶细胞后表达的外源核酸序列。可以改变载体相关的配体和核酸分子以靶向不同的感染性因子。另外，本发明提供鉴定能够引导载体内化并且能够阻断病毒进入的表位和配体的方法。
转让给伊拉斯谟大学(Erasmus University)的PCT公开案WO 03062415描述转基因生物体，其包含编码细胞内抗体的多核苷酸构建体，所述细胞内抗体破坏对异种抗原半乳糖α1,3半乳糖的产生的催化，和/或编码细胞内抗体的多核苷酸构建体，所述细胞内抗体特异性结合至反转录病毒蛋白，如PERV粒子蛋白。转基因生物体的细胞、组织和器官可以用于异种移植。
标题为“Means for detecting protein conformation and applicationsthereof”的PCT公开案WO 2004099775描述scFv片段作为构象特异性抗体用于特异性检测构象蛋白质状态的用途，据称其具有作为传感器用于在活细胞中在细胞内表达后跟踪内源蛋白的行为的应用。
转让给Imclone Systems Inc.的PCT公开案WO 2008070363描述结合至细胞内蛋白或结合至细胞内蛋白的细胞内结构域的单一结构域胞内抗体，所述细胞内蛋白如Etk，其是内皮和上皮酪氨酸激酶，是非受体酪氨酸激酶的Tec家族的成员。还提供通过给予胞内抗体或表达胞内抗体的核酸来抑制细胞内酶并治疗患者的肿瘤的方法。
转让给Cornell Research Foundation Inc.的PCT公开案WO 2009018438描述鉴定结合至靶分子并且具有细胞内功能的蛋白质的方法，其是通过提供包含编码结合至靶分子的蛋白质的DNA分子的构建体来进行，且所述DNA分子与失速序列偶合。将宿主细胞用所述构建体转化，并且然后在有效于宿主细胞内形成其翻译已经失速的蛋白质、编码所述蛋白质的mRNA和核糖体的复合物的条件下进行培养。所述复合物中的蛋白质呈适当折叠的活性形式，并且从所述细胞回收所述复合物。这种方法可以用含有核糖体代替宿主细胞的无细胞提取物制剂来实施。本发明还涉及构建体，其包括编码结合至靶分子的蛋白质的DNA分子和与所述DNA分子偶合的SecM失速序列。DNA分子和SecM失速序列是以其之间的足够距离偶合，以容许在细胞内以适当折叠的活性形式表达其所编码的蛋白质。大体上描述胞内抗体的用途。
转让给摩根生物技术研究所(Mogam Biotech Research Institute)的PCT公开案WO 2014030780描述名为Tat相关蛋白质工程化(TAPE)的方法，其通过制备靶蛋白和抗生素抗性蛋白连接至Tat信号序列的基因构建体，并且然后在大肠杆菌(E.coli)内表达这种基因构建体，来筛选具有较高溶解度和极佳热稳定性的靶蛋白，特别地衍生自人生殖细胞的免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)。还披露具有溶解性和极佳热稳定性的人或工程化VH和VL结构域抗体以及人或工程化VH和VL结构域抗体支架，其是通过TAPE方法来筛选的。还提供包括通过TAPE方法筛选的人或工程化VH或VL结构域抗体支架中的随机CDR序列的文库、其制备方法、与通过使用所述文库筛选的靶蛋白具有结合能力的VH或VL结构域抗体，以及包括所述结构域抗体的药物组合物。
欧洲专利申请EP2422811描述结合至细胞内表位的抗体；所述胞内抗体包含能够特异性结合抗原并且优选地不含编码其分泌的可操作序列且因此保留在细胞内的抗体的至少一部分。在一个实施方案中，胞内抗体包含scFv。scFv多肽进一步包含VH与VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能形成抗原结合的所需结构。还描述具体实施方案，其中胞内抗体结合至Eph受体的细胞质结构域并防止其信号传导(例如，自身磷酸化)。在另一个具体实施方案中，胞内抗体结合至B型Ephrin(例如，EphrinB1、EphrinB2或EphrinB3)的细胞质结构域。
PCT公开案WO 2011003896和欧洲专利申请EP2275442描述细胞内功能性PCNA-Chromobodies，其是使用编码特异性结合至增殖细胞核抗原(PCNA)的多肽的核酸分子制造的。包含一个或两个框架区中的一个或多个氨基酸的保守取代的此类多肽的例子包括MANVQLNESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSDISPSGAVKAYSDSVKGRFTISRDNAKNRLYLQMNSLTPEDTGEYFCTKVQSPRTRIPAPSSQGTQVTVSS(SEQ ID NO:19)和MANVQLNESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSEISPSGAVKAYSDSVKGRFTISRDNAKNRLYLQMNSLTPEDTGEYFCTKVQSPRTRIPAPSSQGTQVTVSS(SEQ ID NO:20)，包括所述多肽的框架区。在所述例子中，已经确定PCNA结合中所涉及的框架区以及CDR区域。
欧洲专利申请EP2703485描述选择血浆细胞或浆母细胞以及产生靶抗原特异性抗体的方法，以及新颖的单克隆抗体。在一个实施方案中，鉴定表达细胞内免疫球蛋白的细胞。
抗体包被剂
在一些实施方案中，可以使用本文所述的抗体或抗体片段制备包括抗体包被剂的组合物。如本文所用，术语“抗体包被剂”是指包括一种或多种表面缔合抗体或抗体片段的任何颗粒、纳米颗粒、分子、蛋白质、融合蛋白、脂质、脂质体、细胞膜、细胞或其他结构。基于用于包被的抗体或抗体片段的特异性，抗体包被剂可以靶向一种或多种聚糖、蛋白质、细胞、组织和/或器官。
抗体包被剂可以包括缔合的、包封的或包埋的负荷。负荷可以是可检测标记。一些负荷可以包括一种或多种治疗剂。此类治疗剂可以包括但不限于药物、化学治疗剂和细胞毒性剂。可以使用细胞毒性剂杀伤细胞或以其他方式使细胞失能。细胞毒性剂可以包括但不限于细胞支架抑制剂[例如，微管蛋白聚合抑制剂，如美坦辛或澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀E[MMAE]和单甲基澳瑞他汀F[MMAF])和纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂]、DNA损伤剂(例如，卡奇霉素、倍癌霉素和吡咯并苯并二氮杂卓二聚体，如塔利林和特西林)、拓扑异构酶抑制剂[例如，喜树碱化合物或衍生物，如7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)和依沙替康衍生物DXd]、转录抑制剂(例如，RNA聚合酶抑制剂，如鹅膏蕈碱)和激酶抑制剂[例如，磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂或丝裂原激活蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂]。
在一些实施方案中，抗体包被剂可以包括用本文所述的一种或多种抗体或抗体片段包被的纳米颗粒。此类抗体包被剂可以靶向一种或多种聚糖，包括但不限于细胞相关聚糖。一些此类抗体包被剂包括一种或多种细胞毒性剂。
蛋白质和变体
本发明的聚糖相互作用抗体可以作为完整多肽、多种多肽或多肽片段存在，其独立地可以由一种或多种核酸(one or more nucleic acids)、多个核酸(a plurality ofnucleic acids)、核酸片段或前述任一种的变体编码。如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，所编码多肽小于约50个氨基酸，则将所述多肽称为肽。如果多肽是肽，其长度将是至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、同源物、直系同源物、片段以及前述的其他等效物、变体和类似物。多肽可以是单一分子，或者可以是多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。其还可以包括单链或多链多肽，并且可以是缔合或连接的。术语多肽也可以应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
术语“多肽变体”是指氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。如与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。通常，变体将与天然或参考序列具有至少约50％同一性(同源性)，并且优选地，其将与天然或参考序列至少约80％、更优选地至少约90％相同(同源)。
在一些实施方案中，提供“变体模拟物”。如本文所用，术语“变体模拟物”是含有可模拟激活序列的一个或多个氨基酸的序列。例如，谷氨酸可以用作磷-苏氨酸和/或磷-丝氨酸的模拟物。可替代地，变体模拟物可以导致失活或产生含有所述模拟物的失活产物，例如，苯丙氨酸可以用作酪氨酸的失活取代；或者丙氨酸可以用作丝氨酸的失活取代。本发明的聚糖相互作用抗体的氨基酸序列可以包括天然存在的氨基酸，并且因此可以被视为蛋白质、肽、多肽或其片段。
可替代地，聚糖相互作用抗体可以同时包括天然的和非天然存在的氨基酸。
术语“氨基酸序列变体”是指氨基酸序列如与天然或起始序列相比具有一些差异的分子。氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。“天然”或“起始”序列不应与野生型序列相混淆。如本文所用，天然或起始序列是相对术语，是指初始分子，可针对它进行比较。“天然”或“起始”序列或分子可以代表野生型(所述序列发现于自然界中)，但是不一定是野生型序列。
通常，如与天然序列相比，变体将具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％至少99.8％或至少99.9％序列同一性。“序列同一性”在应用于氨基酸序列或核苷酸序列时定义为，在比对序列并考虑到空位和片段(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与第二序列中的残基相同的残基的百分比。两个聚合序列的同一性百分比的计算例如可以通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，可以在第一和第二聚合序列的一个或两个中引入空位用于最佳比对，并且可以出于比较目的忽视不相同序列)。在某些实施方案中，出于比较目的比对的序列长度是参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应位置的残基。在第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的残基占据时，则在所述位置所述分子是相同的。两个序列之间的同一性百分比是这些序列共享的相同位置的数量的函数，并考虑两个序列的最佳比对需要引入的空位数和每个空位的长度。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用诸如以下文献中所述的那些方法的方法来确定：Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,1994；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M Stockton Press,纽约,1991；上述各文献通过引用并入本文。例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)来确定，所述算法已经并入使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4的ALIGN程序(2.0版)中。两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以可替代地使用GCG软件包中的使用NWSgapdna.CMP矩阵的GAP程序来确定。一般用于确定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于以下文献中披露的那些：Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)；所述文献是通过引用并入本文。确定同一性的技术被编纂于可公开获得的电脑程序中。确定两个序列之间的同源性的示例性电脑软件包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215,403(1990))。
“同系物”在应用于氨基酸序列时意指其他物种的相应序列，其与第二物种的第二序列具有显著同一性。
“类似物”意指包括相差一个或多个氨基酸改变(例如，氨基酸残基的取代、添加或缺失)但仍维持亲代多肽的特性的多肽变体。
本发明预期若干种类型的基于氨基酸的聚糖相互作用抗体，包括变体和衍生物。这些抗体包括取代、插入、缺失和共价变体和衍生物。因此，本发明的范围内包括含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的聚糖相互作用抗体分子。例如，可以将序列标签或氨基酸(如一个或多个赖氨酸)添加至本发明的肽序列(例如，在N末端或C末端)。序列标签可以用于肽纯化或定位。赖氨酸可以用于增加肽溶解度或允许生物素化。可替代地，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区的氨基酸残基可以任选地缺失，从而提供截短的序列。根据序列的使用，某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可以可替代地缺失，如例如，作为较大序列的一部分的序列的表达，所述较大序列是可溶的或者连接至固体支持物。
“取代变体”在涉及蛋白质时是去除天然或起始序列中的至少一个氨基酸残基并在相同位置将不同氨基酸插入其位置的那些变体。取代可以是单一取代，其中分子中仅一个氨基酸被取代，或者其可以是多取代，其中同一分子中两个或更多个氨基酸被取代。
如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指用大小、电荷或极性类似的不同氨基酸取代正常存在于序列中的氨基酸。保守取代的例子包括用非极性(疏水)残基(如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸)取代另一个非极性残基。同样，保守取代的例子包括用一个极性(亲水)残基取代另一个极性残基，如在精氨酸与赖氨酸之间、在谷氨酰胺与天冬酰胺之间以及在甘氨酸与丝氨酸之间的取代。另外，用碱性残基(如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一个碱性残基，或者用一个酸性残基(如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一个酸性残基，是保守取代的其他例子。非保守取代的例子包括用非极性(疏水)氨基酸残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸)取代极性(亲水)残基(如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸)，和/或用极性残基取代非极性残基。
“插入变体”在涉及蛋白质时是紧邻天然或起始序列中的特定位置的氨基酸插入一个或多个氨基酸的那些变体。“紧邻”氨基酸意指连接至氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。
“缺失变体”在涉及蛋白质时是去除天然或起始氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的那些变体。通常，缺失变体将在分子的特定区域中缺失一个或多个氨基酸。
如本文所用，术语“衍生物”是与术语“变体”同义使用，并且是指已经相对于参考分子或起始分子以任何方式进行修饰或改变的分子。在一些实施方案中，衍生物包括已经用有机蛋白质性或非蛋白质性衍生剂修饰的天然或起始蛋白质，以及翻译后修饰。共价修饰是通过使蛋白质的所靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，或者通过作用于所选重组宿主细胞中的翻译后修饰的利用机制，以传统方式引入。所得共价衍生物可用于针对鉴定对生物活性重要的残基的程序，用于免疫测定，或用于制备用于重组糖蛋白的免疫亲和纯化的抗蛋白抗体。此类修饰是本领域普通技术人员所熟知的，并且无需过度实验即可进行。
某些翻译后修饰是重组宿主细胞对所表达多肽的作用的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常在翻译后脱酰胺，变为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。可替代地，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一种形式可以存在于根据本发明使用的蛋白质中。
其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,第79-86页(1983))。
共价衍生物明确包括融合分子，其中本发明蛋白质共价键合至非蛋白质性聚合物。非蛋白质性聚合物通常是亲水合成聚合物，即原本在自然界中未发现的聚合物。然而，在自然界中存在并且通过重组或体外方法产生的聚合物是有用的，如从自然界分离的聚合物。亲水聚乙烯聚合物落在本发明的范围内，例如，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是聚乙烯亚烷基醚，如聚乙二醇、聚丙二醇。蛋白质可以以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式连接至各种非蛋白质性聚合物，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧亚烷基。
“特征”在涉及蛋白质时被定义为分子的独特的基于氨基酸序列的组分。本发明蛋白质的特征包括表面表现、局部构象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任一组合。
如本文所用，在涉及蛋白质时，术语“表面表现”是指在最外层表面上出现的蛋白质的基于多肽的组分。
如本文所用，在涉及蛋白质时，术语“局部构象形状”意指蛋白质的基于多肽的结构表现，其位于蛋白质的可定义空间内。
如本文所用，在涉及蛋白质时，术语“折叠”意指在能量最低化后，氨基酸序列的所得构象。折叠可以发生在折叠过程的二级或三级水平上。二级水平折叠的例子包括β折叠片和α螺旋。三级折叠的例子包括由于含能量力的聚集或分离形成的结构域和区域。以这种方式形成的区域包括疏水和亲水袋等。
如本文所用，术语“转角”在其涉及蛋白质构象时意指改变肽或多肽的主链方向并且可以包括1、2、3或更多个氨基酸残基的弯曲部。
如本文所用，在涉及蛋白质时，术语“环”是指肽或多肽的结构特征，其反转肽或多肽的主链方向并且包括4个或更多个氨基酸残基。Oliva等人已经鉴定至少5类蛋白质环(J.Mol Biol 266(4):814-830；1997)。
如本文所用，在涉及蛋白质时，术语“半环”是指已鉴定环的一部分，其具有衍生其的环的氨基酸残基数的至少一半。应理解，环可能并非始终含有偶数个氨基酸残基。因此，在环含有或者经鉴定包括奇数个氨基酸的那些情况下，奇数环的半环将包括所述环的整数部分或下一个整数部分(环的氨基酸数/2+/-0.5个氨基酸)。例如，被鉴定为7个氨基酸的环的环可以产生3个氨基酸或4个氨基酸的半环(7/2＝3.5+/-0.5等于3或4)。
如本文所用，在涉及蛋白质时，术语“结构域”是指多肽的具有一种或多种可鉴定的结构或功能特征或特性(例如，结合能力，用作蛋白质-蛋白质相互作用位点)的基序。
如本文所用，在涉及蛋白质时，术语“半结构域”意指已鉴定结构域的一部分，其具有衍生其的结构域的氨基酸残基数的至少一半。应理解，结构域可能并非始终含有偶数个氨基酸残基。因此，在结构域含有或经鉴定包括奇数个氨基酸的那些情况下，奇数结构域的半结构域将包括结构域的整数部分或下一个整数部分(结构域的氨基酸数/2+/-0.5个氨基酸)。例如，被鉴定为7个氨基酸的结构域的结构域可以产生3个氨基酸或4个氨基酸的半结构域(7/2＝3.5+/-0.5等于3或4)。还应理解，可以在结构域或半结构域内鉴定子结构域，这些子结构域具有小于全部的在衍生其的结构域或半结构域中鉴定的结构或功能特性。还应理解，本文中任何结构域类型的氨基酸无需沿多肽主链邻接(即，非相邻氨基酸可以结构上折叠以产生结构域、半结构域或子结构域)。
如本文所用，在涉及蛋白质时，术语“位点”在其涉及基于氨基酸的实施方案时，与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。位点代表肽或多肽内可以在本发明的基于多肽的分子内被修饰、操纵、改变、衍生或变化的位置。
如本文所用，术语“末端(termini)或末端(terminus)”在涉及蛋白质时是指肽或多肽的极端。这个极端并不仅限于肽或多肽的最初或最末位点，还可以包括末端区域中的其他氨基酸。本发明的基于多肽的分子可以被表征为同时具有N末端(终点为具有游离氨基(NH2)的氨基酸)和C末端(终点为具有游离羧基(COOH)的氨基酸)。本发明蛋白质在一些情况下是由通过二硫键或通过非共价力结合在一起的多条多肽链构成(多聚体、寡聚体)。这些种类的蛋白质将具有多个N末端和C末端。可替代地，多肽的末端可以进行修饰，使得其根据具体情况以并非基于多肽的部分开始或结束(如有机缀合物)。
一旦将任何特征鉴定或定义为本发明分子的组分，可以通过移动、对换、倒转、缺失、随机化或复制进行这些特征的若干种操纵和/或修饰中的任一种。此外，应理解，对特征的操纵可以导致与对本发明分子的修饰相同的结果。例如，涉及结构域缺失的操纵将导致分子长度改变，正如修饰核酸以编码小于全长的分子那样。
修饰和操纵可以通过本领域中已知的方法来完成，如定点诱变。然后可以使用体外或体内测定测试所得经修饰分子的活性，如本文所述的那些或者本领域中已知的任何其他适宜的筛选测定。
同位素变化
本发明的聚糖相互作用抗体可以含有一个或多个是同位素的原子。如本文所用，术语“同位素”是指具有一个或多个额外中子的化学元素。在一个实施方案中，本发明化合物可以被氘化。如本文所用，术语“氘化的”是指已经有一个或多个氢原子被氘同位素替代的物质。氘同位素是氢的同位素。氢核含有一个质子，而氘核同时含有一个质子和一个中子。聚糖相互作用抗体可以被氘化以改变化合物的物理特性，如稳定性，或者允许化合物用于诊断和实验应用中。
缀合物和组合
本发明预期，本发明的聚糖相互作用抗体可以与一种或多种同源或异源分子复合、缀合或组合。如本文所用，“同源分子”意指至少一种结构或功能相对于起始分子类似的分子，而“异源分子”是至少一种结构或功能相对于起始分子不同的分子。因此，结构同系物是结构基本相似的分子。其可以是相同的。功能同系物是功能基本相似的分子。其可以是相同的。
本发明的聚糖相互作用抗体可以包括缀合物。本发明的此类缀合物可以包括天然存在的物质或配体，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、芽霉菌糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体还可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如，合成聚氨基酸、寡核苷酸(例如，适体)。聚氨基酸的例子包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦腈。多胺的例子包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、精脒、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状聚合物多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季铵盐或α螺旋肽。
缀合物还可以包括靶向基团，例如，细胞或组织靶向剂或基团，例如，结合至指定细胞类型(如肾细胞)的凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质(例如，抗体)。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素细胞激素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬胺酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适体。
靶向基团可以是蛋白质(例如，糖蛋白)，或肽(例如，对共配体具有特异性亲和性的分子)，或抗体(例如，结合至指定细胞类型(如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的抗体)。靶向基团还可以包括激素和激素受体。其还可以包括非肽种类，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖或适体。
靶向基团可以是能够靶向特定受体的任一配体。例子包括但不限于叶酸、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、适体、整联蛋白受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、5-羟色胺受体配体、PSMA、内皮缩血管肽、GCPII、生长抑素、LDL和HDL配体。在特定实施方案中，靶向基团是适体。适体可以是未经修饰的，或者具有本文所公开的修饰的任一组合。
在仍其他实施方案中，聚糖相互作用抗体共价缀合至细胞渗透多肽。细胞渗透肽还可以包括信号序列。本发明的缀合物可以被设计为具有增加的稳定性；增加的细胞转染；和/或改变的生物分布(例如，靶向特定组织或细胞类型)。
可以将缀合部分添加至聚糖相互作用抗体，使得其允许标记或标识靶标以供清除。此类加标签/标识分子包括但不限于泛素、荧光分子、人流感血球凝集素(HA)、c-myc[人原癌基因myc的10个氨基酸的区段，具有序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:21)]、组氨酸(His)、标识[序列DYKDDDDK的短肽(SEQ ID NO:22)]、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、V5(猿猴病毒5表位的副粘病毒)、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、辣根过氧化物酶(HRP)和地高辛配基。
在一些实施方案中，在疾病或病症的治疗中，聚糖相互作用抗体分子可以与另一种或其他分子组合。
核酸
本发明包含核酸分子。在一些实施方案中，核酸编码本发明的抗体(包括但不限于抗体、抗体片段、胞内抗体和嵌合受体抗原)。此类核酸分子包括但不限于DNA分子、RNA分子、多核苷酸、寡核苷酸、mRNA分子、载体、质粒和其他构建体。如本文所用，术语“构建体”是指任何重组核酸分子，包括但不限于质粒、粘粒、自主复制的多核苷酸分子或者线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子。本发明还包含经编程或产生以表达编码聚糖相互作用抗体的核酸分子的细胞。此类细胞可以通过使用转染、电穿孔、病毒递送等来产生。用本发明的构建体工程化的病毒可以包括但不限于慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和噬菌体。在一些情况下，本发明的核酸包括密码子优化的核酸。产生密码子优化的核酸的方法是本领域中已知的并且可以包括但不限于美国专利号5,786,464和6,114,148中所述的那些，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，核酸序列进行密码子优化以改善蛋白质表达或去除隐蔽剪接位点。
II.方法和用途
治疗剂
本公开文本的方法包括但不限于利用一种或多种聚糖相互作用抗体用于治疗、诊断、定量、生物加工、实验和/或研究目的的方法。此类聚糖相互作用抗体可以包括抗STn抗体。
癌症相关的应用
异常糖基化是癌细胞转化的标志。已经在人类癌症中描述多种异常糖基化形式，从而将特定肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)鉴定为一类适合于特异性肿瘤靶向的细胞表面分子(Cheever,M.A.等人,Clin Cancer Res.2009年9月1日；15(17):5323-37)。已经在上皮癌症中发现TACA抗原表达，所述上皮癌症包括但不限于乳腺癌、结肠癌、肺癌、膀胱癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌和肝癌。已经在胚胎性癌症中发现TACA抗原表达，所述胚胎性癌症包括但不限于卵黄囊瘤和精原细胞瘤。另外，已经在多种组织的许多黑色素瘤、癌瘤和白血病中发现TACA抗原表达(Heimburg-Molinaro等人,Vaccine.2011年11月8日:29(48):8802-8826)。本发明的靶向一种或多种TACA的抗体在本文中被称作“抗TACA抗体”。
据估计，所有癌瘤中约80％表达截短的聚糖，即Tn抗原。除了少数例外情况，Tn和唾液酸化形式唾液酸基Tn(STn)在正常的健康组织中不表达。此外，非人免疫原性唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)似乎在癌瘤(如乳腺癌)上以Neu5Gc-STn(GcSTn)的形式差异性表达。
已经在人类癌症中描述多种异常糖基化形式，从而将特定聚糖鉴定为一类适合于特异性肿瘤靶向的细胞表面分子(Cheever,M.A.等人,Clin Cancer Res.2009年9月1日；15(17):5323-37)。例如，多种人类癌症类型(尤其如膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌)显示STn抗原的高表达，这在正常人类组织中是罕见的(Karlen,P.等人,Gastroenterology.1998年12月；115(6):1395-404；Ohno,S.等人,Anticancer Res.2006年11月-12月；26(6A):4047-53)。另外，STn在肿瘤相关粘蛋白上的存在与具有较差预后的癌症有关，并且以此被视为癌症检测和靶向疗法的有吸引力的表位(Cao,Y.等人,VirchowsArch.1997年9月；431(3):159-66；Julien,S.等人,Br J Cancer.2009年6月2日；100(11):1746-54；Itzkowitz,S.H.等人,Cancer.1990年11月1日；66(9):1960-6；Motoo,Y.等人,Oncology.1991年；48(4):321-6；Kobayashi,H.等人,J Clin Oncol.1992年1月；10(1):95-101)。Tn和STn形成与基因Cosmc中的体细胞突变相关，所述基因编码形成活性T-合酶所需的分子伴侣(Ju,T.等人,Nature.2005年10月27日；437(7063):1252；Ju,T.等人,CancerRes.2008年3月15日；68(6):1636-46)。其还可以从增加的唾液酸转移酶ST6GalNAc I表达产生(Ikehara,Y.等人,Glycobiology.1999年11月；9(11):1213-24；Brockhausen,I.等人,Biol Chem.2001年2月；382(2):219-32)。STn的从头表达可以调节癌瘤细胞，改变恶性表型，并导致侵袭性更强的细胞行为(Pinho,S.等人,Cancer Lett.2007年5月8日；249(2):157-70)。虽然STn在恶性组织中高度表达，但是在健康的人类细胞中也发现了低水平(Jass,J.R.等人,J Pathol.1995年6月；176(2):143-9；Kirkeby,S.等人,Arch OralBiol.2010年11月；55(11):830-41)。单独的STn作为癌症检测和疗法的靶标已经吸引人们的注意(Cheever,M.A.等人,Clin Cancer Res.2009年9月1日；15(17):5323-37)。
除了STn的存在以外，其他糖基化变化已经描述于癌症中。其中一种变化涉及Neu5Gc。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和Neu5Gc是哺乳动物细胞表面上的两种主要唾液酸。Neu5Ac和Neu5Gc的差别仅在于，Neu5Gc包含与附接至碳5的化学基团相连的额外氧原子。由于功能基因的损失，人类只能合成呈Neu5Ac形式而不是Neu5Gc形式的唾液酸。然而，Neu5Gc可以从动物衍生的饮食来源(如红肉)以代谢方式并入人体中(Tangvoranuntakul,P.等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2003年10月14日；100(21):12045-50；Nguyen,D.H.等人,JImmunol.2005年7月1日；175(1):228-36；US 7,682,794、US 8,084219、US2012/0142903、WO2010030666和WO 2010030666，所述文献通过引用以其整体并入本文)。Neu5Gc在人肿瘤中非常丰富(Higashi,H.等人,Cancer Res.1985年8月；45(8):3796-802；Miyoshi I.等人,Mol Immunol.1986.23:631-638；Hirabayashi,Y.等人,Jpn J Cancer Res.1987.78:614-620；Kawachi.S等人,Int Arch Allergy Appl Immunol.1988.85:381-383；Devine,P.L.等人,Cancer Res.1991.51:5826-5836；Malykh,Y.N.等人,Biochimie.2001.83:623-634和Inoue,S.等人,2010.Glycobiology.20(6):752-762)并且在正常人组织中极低，这在数十年来都被人忽视(Diaz,S.L.等人,PLoS One.2009.4:e4241；Tangvoranuntakul,P.等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2003.100:12045-12050；Varki,A.等人,GlycoconjJ.2009.26:231-245)。与健康人组织相比，饮食衍生的Neu5Gc在癌症组织中增加的代谢积累可能通过至少三种因素来解释：快速生长伴随竞争性内源Neu5Ac的产生不足，由生长因子诱导的增强的巨胞饮作用(Dharmawardhane,S.等人,Mol Biol Cell.2000年10月；11(10):3341-52；Simonsen,A.等人,Curr Opin Cell Biol.2001年8月；13(4):485-92；Johannes,L.等人,Traffic.2002年7月；3(7):443-51；Amyere,M.等人,Int J MedMicrobiol.2002年2月；291(6-7):487-94)，和溶酶体唾液酸转运蛋白基因sialin的基因表达因缺氧而上调(Yin,J.等人,Cancer Res.2006年3月15日；66(6):2937-45)。另外，迄今所测试的所有人类包含针对非人Neu5Gc的多克隆抗体库，这使其成为异种-自身抗原的第一个例子(Padler-Karavani,V.等人,Glycobiology.2008年10月；18(10):818-30；Varki,N.M.等人,Annu Rev Pathol.2011；6:365-93)。显示饮食Neu5Gc面对抗Neu5Gc反应在恶性肿瘤中的积累通过诱导低级慢性炎症促进肿瘤进展(Hedlund,M.等人,Proc Natl AcadSci U S A.2008年12月2日；105(48):18936-41)。因此，人肿瘤上含有Neu5Gc的聚糖表位代表有价值的药物靶向可能性。近期研究表明癌症患者中存在针对含有Neu5Gc的STn(GcSTn)而不是Neu5Ac-STn(AcSTn)的抗体，并探索其作为癌症检测的特异性生物标记物的潜力(Padler-Karavani,V.等人,Cancer Res.2011年5月1日；71(9):3352-63)。
MUC1是关键细胞表面糖蛋白，其通常广泛糖基化，但是在肿瘤细胞中糖基化不足。MUC1的稀疏糖基化导致免疫原性抗原的暴露。这些糖基化可以沿着MUC1核心肽序列或者沿着核心碳水化合物残基。这些TACA包括但不限于N-乙酰半乳糖胺(Tn)、唾液酸基(α2,6)N-乙酰半乳糖胺(STn)和半乳糖(β1-3)N-乙酰半乳糖胺(也称为Thomsen-Friedenreich抗原或TF)。已经估计，所有癌瘤中约80％在MUC1的核心碳水化合物之间表达Tn，其中STn在人癌瘤细胞上强表达并且与癌症进展和转移相关。除了少数例外情况，Tn和STn在正常健康组织中不表达。唾液酸形成STn上的突出表位。本发明利用以下事实：异常Neu5Gc-STn(GcSTn)聚糖表达似乎对多种癌瘤具有高特异性。
在MUC1的情况下，Neu5Gc并入STn中产生肿瘤特异性靶标，即一位点，其是治疗肿瘤组织的基于抗体的疗法的有吸引力的靶标。在本发明的一些实施方案中，聚糖相互作用抗体靶向包含Neu5Gc的表达MUC1的癌细胞。迄今，已经在来自多种人类癌症组织的糖缀合物中检测到Neu5Gc，所述癌症组织包括但不限于结肠癌、视网膜母细胞瘤组织、黑色素瘤、乳腺癌和卵黄囊瘤组织。在本发明的一些实施方案中，预期用聚糖相互作用抗体治疗这些形式的癌症以及本文未明确列出的特征为存在包含Neu5Gc的癌细胞的其他形式的癌症的方法。
已经鉴定包含聚糖的其他抗原，其与癌症相关表达(Heimburg-Molinaro,J.等人,Cancer vaccines and carbohydrate epitopes.Vaccine.2011年11月8日；29(48):8802-26)。这些肿瘤相关碳水化合物抗原包括但不限于血型Lewis相关抗原[包括但不限于LewisY(LeY)、LewisX(LeX)、唾液酸基LewisX(SLeX)和唾液酸基LewisA(SLeA)]、鞘糖脂相关的抗原[包括但不限于Globo H、阶段特异性胚胎抗原-3(SSEA-3)和包含唾液酸的鞘糖脂]、神经节苷脂相关的抗原[包括但不限于神经节苷脂GD2、GD3、GM2、岩藻糖基GM1和Neu5GcGM3]和聚唾液酸相关的抗原。
在一些实施方案中，本发明的治疗药可以针对Lewis血型抗原。Lewis血型抗原包含通过α1-3连接或α1-4连接连接至GlcNAc的岩藻糖残基。其可以发现于糖脂和糖蛋白二者上。Lewis血型抗原可以发现于是这些抗原的分泌者的个体的体液中。其在红细胞上的出现是由于红细胞从血清吸收Lewis抗原所致。
在一些实施方案中，本发明的治疗药可以针对LeY。LeY(也称为CD174)是由包含α1,2连接以及α1,3连接的岩藻糖残基的Galβ1,4GlcNAC构成，从而产生Fucα(1,2)Galβ(1,4)Fucα(1,3)GlcNAc表位。其是通过α1,3岩藻糖基转移酶从H抗原合成，所述酶将α1,3岩藻糖附接至母链的GlcNAc残基。LeY可以在多种癌症中表达，包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌和上皮癌。由于其在正常组织中的低表达水平和在许多癌症中升高的表达水平，LeY抗原是有吸引力的治疗性抗体的靶标。
在一些实施方案中，本发明的治疗药可以针对LeX。LeX包含表位Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-R。其也被称为CD15和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)。这种抗原最初被认为与取自经历用F9畸胎癌细胞免疫的小鼠的血清具有免疫反应性。还发现LeX与特定阶段的胚胎发育相关。其还在存在和不存在癌症的两种情况下在多种组织中表达，但是也可以发现于乳腺癌和卵巢癌中，其中其仅由癌细胞表达。
在一些实施方案中，本发明的治疗药可以针对SLeA和/或SLeX。SLeA和SLeX分别包含结构[Neu5Acα2-3Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAcβ-R]和[Neu5Acα2-3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-R]。其表达在癌细胞中上调。这些抗原在血清中的存在与恶性肿瘤和较差预后相关。SLeX主要作为粘蛋白末端表位而被发现。其在多种不同癌症中表达，包括乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠癌、肝癌、肺癌和前列腺癌。在本发明的一些实施方案中，SLeA和SLeX靶标包含Neu5Gc(在本文中分别被称为GcSLeA和GcSLeX)。
在一些实施方案中，本发明的治疗药可以针对糖脂和/或存在于糖脂上的表位，包括但不限于鞘糖脂。鞘糖脂包含通过神经酰胺羟基连接至聚糖的脂质神经酰胺。在细胞膜上，鞘糖脂形成被称为“脂筏”的簇。
在一些实施方案中，本发明的治疗药可以针对Globo H。Globo H是最初在乳腺癌细胞中鉴定的癌症相关的鞘糖脂。Globo H的聚糖部分包含Fucα(1-2)Galβ(1-3)GalNAcβ(1-3)Galα(1-4)Galβ(1-4)Glcβ(1)。虽然在许多种正常上皮组织中发现，但是已经鉴定Globo H与许多肿瘤组织相关，包括但不限于小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌和子宫内膜瘤。
在一些实施方案中，本发明的治疗药可以针对神经节苷脂。神经节苷脂是包含唾液酸的鞘糖脂。根据神经节苷脂命名法，使用G作为神经节苷脂的缩写。这个缩写后跟着指代所附接的唾液酸残基数目的字母M、D或T(分别是1、2或3)。最后，使用数字1、2或3指代在通过薄层色谱分析时每次移行的距离级别(其中3行进最远距离，其次是2，再次是1)。已知神经节苷脂参与癌症相关的生长和转移，并且是在肿瘤细胞的细胞表面上表达。在肿瘤细胞上表达的神经节苷脂包括但不限于GD2、GD3、GM2和岩藻糖基GM1(本文中也称为Fuc-GM1)。在本发明的一些实施方案中，聚糖相互作用抗体是针对GD3。GD3是细胞生长调节剂。在一些实施方案中，使用针对GD3的抗体来调节细胞生长和/或血管发生。在一些实施方案中，使用针对GD3的抗体来调节细胞附着。在本发明的一些实施方案中，聚糖相互作用抗体是针对GM2。在一些实施方案中，针对GM2的抗体用于调节细胞间接触。在一些实施方案中，本发明的神经节苷脂靶标包含Neu5Gc。在一些实施方案中，此类靶标可以包括包含Neu5Gc的GM3变体(在本文中被称为GcGM3)。GcGM3的聚糖组分是Neu5Gcα2-3Galβ1-4Glc。GcGM3是肿瘤细胞的已知组分。
在一些实施方案中，由本发明的抗TACA抗体靶向的TACA可以包括但不限于以下文献中所列的那些中的任一种：美国公开号US 2013/0236486 A1、US 2013/0108624 A1、US2010/0178292 A1、US 2010/0104572 A1、US 2012/0039984 A1、US 2009/0196916 A1和US2009/0041836 A1，上述各文献的内容通过引用以其整体并入本文。
本公开文本的方法包括用本文所述的一种或多种抗体治疗癌症的方法。此类抗体可以包括表2中呈现的一个或多个可变结构域。抗体可以进一步包括表3中呈现的一个或多个IgG恒定结构域。抗体可以是人源化抗体。抗体可以是包括治疗剂的抗体药物缀合物，所述治疗剂包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。治疗剂可以是细胞毒性剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。细胞毒性剂可以是MMAE。细胞毒性剂可以通过接头接合至抗体。
癌症中的STn
免疫系统具有促进抗肿瘤细胞免疫活性(包括先天和适应性免疫活性)的多种机制。如本文所用，术语“抗肿瘤细胞免疫活性”是指免疫系统杀伤或防止肿瘤细胞生长和/或增殖的任何活性。在一些情况下，抗肿瘤免疫活性包括识别和天然杀伤(NK)细胞的肿瘤细胞杀伤和巨噬细胞的吞噬作用。适应性抗肿瘤免疫应答包括肿瘤抗原摄取和通过抗原呈递细胞(APC)(如树突细胞(DC))呈递，导致调节T细胞抗肿瘤活性和/或扩增B细胞且分泌肿瘤特异性抗体。肿瘤特异性抗体与肿瘤的结合可以导致肿瘤细胞死亡的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)机制。
如本文所用，术语“免疫抗性肿瘤细胞”是指降低或逃避抗肿瘤细胞免疫活性的肿瘤细胞。一些研究指示，STn(已知的TACA)在肿瘤细胞表面上的表达或分泌至肿瘤细胞微环境中可以促进肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫活性。如本文所用，术语“肿瘤细胞微环境”是指邻近或包围肿瘤细胞的任何区域。此类区域包括但不限于肿瘤细胞之间的区域、肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的区域、细胞外基质的周围流体和周围组分。
Ogata等人证明，包含STn的唾液酸化粘蛋白降低肿瘤细胞的NK细胞靶向(Ogata,S.等人,1992.Canc.Res.52:4741-6，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。这项研究发现，绵羊、牛和猪颌下腺粘蛋白(分别是OSM、BSM和PSM)的存在导致几乎100％抑制细胞毒性(参见Ogata等人的表2)。Jandus等人的其他研究证明，由于可以与NK细胞siglec受体相互作用的唾液酸聚糖配体的表达导致NK抑制，一些肿瘤细胞可以逃避NK破坏(Jandus,C.等人,2014,JCI.pii:65899，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
Toda等人的研究证明，STn可以结合B细胞上的CD22受体，导致降低的信号转导和减少的B细胞激活(Toda,M.等人,2008.Biochem Biophys Res Commun.372(1):45-50，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。树突细胞(DC)可以通过调节T细胞活性影响适应性免疫活性。Carrascal等人的研究发现，膀胱癌细胞的STn表达在DC中诱导耐受性，从而降低其在T细胞中诱导抗肿瘤细胞免疫活性的能力(Carrascal,MA等人,2014.MolOncol.pii:S1574-7891(14)00047-7，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。这些研究揭示，与STn阳性膀胱癌细胞发生接触的DC展示具有CD80、CD86、IL-12和TNF-α的低表达的致耐受性的表达谱。另外，发现DC调节调控T细胞，使得T细胞具有IFNγ的低表达和FoxP3的高表达。van Vliet和其他人的其他研究指示，巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL)的DC表面表达可以导致那些细胞靶向肿瘤组织(van Vliet,SJ.,2007.Amsterdam:VrijeUniversiteit.第1-232页，和van Vliet,SJ.等人,2008.J Immunol.181(5):3148-55,Nollau,P.等人,2013.J Histochem Cytochem.61(3):199-205，上述各项的内容通过引用以其整体并入本文)。到达组织的DC由于MGL相互作用可以以三种方式之一影响T辅助(Th)细胞。DC可以诱导T细胞耐受性、T细胞免疫活性或效应T细胞的下调。已经显示MGL结合至AcSTn和GcSTn二者，并且已经深度分析亲和性(Mortezai,N.等人,2013.Glycobiology.23(7):844-52，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。有趣的是，已经显示MUC1在肿瘤上的表达会导致T细胞耐受性，保护肿瘤细胞免受免疫根除。
在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体(包括但不限于抗STn抗体)可以用于治疗包含一种或多种表达一种或多种TACA的肿瘤细胞的受试者。在一些情况下，本发明的聚糖相互作用抗体(包括但不限于抗STn抗体)可以用于增加针对表达STn的肿瘤细胞的抗肿瘤细胞免疫活性。此类抗体可以增加针对免疫抗性肿瘤细胞的适应性免疫应答和/或先天免疫应答。一些聚糖相互作用抗体可以用于增加NK抗肿瘤细胞活性。在一些情况下，此类聚糖相互作用抗体可以阻断在NK细胞上表达的聚糖受体与癌细胞上或周围组织中的STn聚糖之间的相互作用。
在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体(包括但不限于抗STn抗体)可以用于增加B细胞抗肿瘤细胞活性。此类抗体可以降低B细胞上的CD22受体与癌细胞上或周围组织中的STn聚糖之间的相互作用。Sjoberg等人的研究证明，糖蛋白上的α2,6连接的唾液酸的9-O-乙酰化也降低B细胞CD22受体与此类糖蛋白之间的相互作用(Sjoberg,E.R.等人1994.JCB.126(2):549-562)。Shi等人的另一项研究揭示，鼠类红白血病细胞上较高水平的9-O-乙酰化唾液酸残基使得这些细胞更易患补体介导的溶解(Shi,W-X.等人,1996.J ofBiol Chem.271(49):31526-32，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在一些实施方案中，本发明的抗STn抗体能够选择性结合非9-O-乙酰化STn，降低总体STn结合，但是降低肿瘤细胞生长和/或增殖。(例如，通过增加B细胞抗肿瘤活性和增加补体介导的肿瘤细胞破坏)。在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体(包括但不限于抗STn抗体)可以用于增加DC抗肿瘤活性。此类抗体可以用于降低DC对肿瘤细胞的耐受性。降低的DC耐受性可以包括增加CD80、CD86、IL-12和/或TNF-α的DC表达。在一些情况下，DC抗肿瘤细胞活性可以包括促进T细胞抗肿瘤细胞活性。此类抗体可以防止DC MGL与癌细胞上或癌细胞附近表达的聚糖之间的结合。
Ibrahim等人的研究表明，高水平的抗STn抗体以及内分泌疗法可以在患有转移性乳腺癌的女性中增加总体存活和至进展时间(TTP)(Ibrahim,N.K.等人,2013.4(7):577-584，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在这项研究中，在用连接至钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)的STn进行疫苗接种后，抗STn抗体水平升高。在一些实施方案中，本发明的抗STn抗体可以与内分泌疗法(例如，他莫昔芬(tamoxifen)和/或芳香酶抑制剂)组合使用。
STn表达已经牵涉到促进卵巢瘤细胞的转移潜力中。根据本公开文本的一些方法，抗STn抗体可以用于降低卵巢瘤细胞转移。此类方法可以包括将转移降低约1％至约15％、约5％至约25％、约10％至约50％、约20％至约60％、约30％至约70％、约40％至约80％、约50％至约90％、约75％至约95％或至少95％。
本公开文本的一些方法包括用本文所述的一种或多种抗体治疗受试者的癌症的方法，其中所述受试者具有至少一种表达STn的癌细胞。所述抗体可以结合STn。此类抗体可以包括表2中呈现的一个或多个可变结构域。一些抗体或抗原结合片段可以包括本文所述的抗体序列的不同组合。此类抗体可以进一步包括表3中所呈现的IgG恒定结构域中的一个或多个。抗体可以是人源化抗体。抗体可以是包括治疗剂的抗体药物缀合物，所述治疗剂包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。治疗剂可以是细胞毒性剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。细胞毒性剂可以是MMAE。细胞毒性剂可以通过接头接合至抗体。
在一些实施方案中，本公开文本提供治疗受试者的癌症的方法，其中所述受试者具有至少一种表达STn的癌细胞，并且其中所述受试者患有铂难治性疾病。铂难治性疾病是针对癌症加以治疗的受试者的总群体中一定百分比的受试者经历的对基于铂的治疗的抗性。所述受试者可以通过将抗STn抗体给予至受试者来治疗。所述至少一种癌细胞可以是卵巢癌细胞。所述至少一种癌细胞可对顺铂有抗性。所述至少一种癌细胞可以是肿瘤的一部分。
用于治疗患有铂难治性疾病的受试者的癌症的抗STn抗体可以是ADC。ADC可以与细胞毒性剂缀合，包括本文所呈现的形式中的任一种。抗STn抗体可以以约0.1mg/kg至约25mg/kg的剂量来给予。给予可以通过静脉内注射来进行。给予可以包括但不限于每日给予、每周给予或每个月给予。
在一些实施方案中，抗STn抗体治疗可以降低受试者体液和/或组织中可检测水平的STn。STn可以与蛋白质或其他载体缔合。在一些情况下，血清中的STn水平有所下降。
作为治疗靶标的癌症干细胞
癌症干细胞或CSC(也称为肿瘤起始细胞)是异质性癌性组织或肿瘤细胞群内的细胞的子集，其驱动原发性和转移性肿瘤的起始、生长、散布和复发(Karsten和Goletz,SpringerPlus,2013,2,301)，其可以根据肿瘤类型以总群体的不同比例存在。CSC与终末分化细胞的区别之处在于其能自我更新并产生非CSC的分化后代(Gupta等人,Naturemedicine,2009,15,1010-1012)。这些特性与正常干细胞的那些特性相似。正常干细胞与CSC之间的此类区别对治疗具有重要影响。
已经确定，数目增加的细胞表面生物标记物意味着将CSC与其非CSC对应物相区分(Medema等人,Nature cell biology,2013,15,338-344；Zoller,Cancer,2011,11,254-267)。这些生物标记可以包括但不限于CD44、CD133、CD117和醛脱氢酶亚型1(ALDH1)。虽然这些生物标记中的一些衍生自对小鼠肿瘤和人细胞系的研究，但是已经使用原发性人肿瘤样品验证其他生物标记。最近也已经发现，可接受这些生物标记物中的一种，即跨膜CD44糖蛋白或透明质酸受体(其是多种肿瘤类型的熟知成分)作为人类癌症中真正的CSC标记物，并且事实上是最频繁观察到的标记物(Lobo等人,2007,23,675-699)。
CD44以若干种变体亚型存在，通过在全长CD44基因的20个外显子和19个内含子之间发生的选择性剪接事件产生(Williams等人,Experimental biology and medicine,2013,238,324-338)。逐渐增加的实验证据指出CD44和其变体在促进CSC的先天转移性和药物抗性表型中的支持作用(Negi等人,Journal of drug targeting,2012,20,561-573)，这部分是由于调节细胞内信号转导途径所致(Williams等人,Experimental biology andmedicine,2013,238,324-338)。另外，已知患有展示高水平CD44细胞的三阴性乳腺癌以及若干种其他癌症类型的患者具有较差预后和较高死亡率(Negi等人,Journal of drugtargeting,2012,20,561-573)。这些观察结果支持以下观念：靶向CD44提供通过除了成熟癌细胞以外，抑制或消除CSC来治疗癌症的方式。实际上，已经通过实验尝试了多种靶向CD44的方法，并获得不同程度的成功。这些包含众多种技术，包括使用缀合的和未缀合的抗体、纳米载体药物系统和透明质酸缀合药物(Negi等人,Journal of drug targeting,2012,20,561-573)。然而，在若干种情况下，在体内研究中观察到毒性效应；这些不利的副作用可能可归因于除了CD44和变体在所靶向CSC和成熟肿瘤细胞的表面上的存在以外，CD44和变体在大多数脊椎动物细胞膜上也普遍存在(Naor等人,Seminars in cancerbiology,2008,18,260-267)。靶向CD44蛋白(其是正常人干细胞的成分)(Williams等人,Experimental biology and medicine,2013,238,324-338)也可能损害正常干细胞功能(Leth-Larsen等人,Molecular medicine,2012,18,1109-1121)。虽然大量研究指出靶向CSC上以及成熟肿瘤细胞上的CD44蛋白的需要性，这种方法的内在问题仍然使得目前难以设计可绕过正常组织以及正常干细胞的抑制剂。
牵涉到CSC生物学的另一种熟知的肿瘤抗原是上皮粘蛋白MUC1，其是膜栓系糖蛋白，在大多数腺癌上以高水平差异性表达，但是在正常上皮细胞上以低水平表达或者完全不表达。最近已经将MUC1鉴定为多种赘瘤上的CSC生物标记物，包括乳腺癌(Engelmann等人,Cancer research,2008,68,2419-2426)和胰腺癌，其中其表达与高转移和较差预后相关。作为CSC的成分，已经显示MUC1在细胞粘附、增殖、存活和信号传导中发挥功能(Engelmann等人,Cancer research,2008,68,2419-2426)，并且还可以与CD44共表达(Leth-Larsen等人,Molecular medicine,2012,18,1109-1121)。人们正在寻求靶向癌症中的MUC1的免疫治疗方法，其使用疫苗以及其他方法，但是主要在成熟癌细胞疗法的情况下(Julien等人,Biomolecules,2012,2,435-466；Acres等人,Expert review of vaccines,2005,4,493-502)。
已经假设癌症干细胞是通过发生在转移位点的上皮至间充质(EMT)转变(Gupta等人,Nature medicine,2009,15,1010-1012)和/或相反地间充质至上皮(MET)转变来产生(Leth-Larsen等人,Molecular medicine,2012,18,1109-1121)(也称为CSC可塑性，其中非CSC可以产生CSC)。这个发现进一步强调消除癌性组织或肿瘤细胞群中的CSC和非CSC二者的需要。
使用富集的CSC群的近期研究已经揭示，与大量肿瘤不同，这些细胞是相对静止的并且优先对许多类型的当前疗法(包括化学疗法和辐射)有抗性(Leth-Larsen等人,Molecular medicine,2012,18,1109-1121)。因此，当前治疗策略靶向肿瘤的非CSC组分，留下CSC基本不受影响，仅在适当信号后再次出现，在初始位点再次形成复发的原发性肿瘤或散布至远端位点，定殖并产生转移性疾病，这是癌症死亡的主要原因。
当前对癌症干细胞的特性的理解明确强调不仅需要靶向肿瘤中存在的大部分细胞(如当前实践那样)，而且还需要靶向CSC区室，以使得可能实现完全治愈。
如上文所讨论，已经基于肿瘤(包括CSC)相关生物标记物研发的策略面对以下挑战：大多数癌症生物标记也存在于包括正常干细胞在内的正常细胞中。靶向蛋白质生物标记物以消除CSC的疗法也可以靶向正常干细胞，导致正常细胞的消除。
CSC中的肿瘤特异性聚糖
糖基化的异常形式(包括出现Thomsen-nouveau(Tn)抗原(GalNAc-O-Ser/Thr))已经描述于多种人类癌症中，从而将聚糖鉴定为适合于特异性肿瘤靶向的肿瘤相关碳水化合物抗原的全新类别(Rabu等人,Future oncology,2012,8,943-960)。Tn的唾液酸基衍生物(STn)的形成是由唾液酸转移酶ST6GalNAc I介导的，所述酶将唾液酸以α2,6连接添加至Tn抗原。Tn的唾液酸化防止进一步添加糖，由此截断进一步聚糖延伸(Schultz等人,Cancermetastasis reviews,2012,31,501-518)。
虽然STn在正常成年人组织中的存在是罕见的，但是STn存在于多种人类癌症中，尤其包括卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和肺癌(Ferreira等人,Molecularoncology,2013,7,719-731；Kinney等人,Cancer,1997,80,2240-2249)。另外，STn在肿瘤中的存在与转移性疾病、较差预后和降低的总体存活相关(Ferreira等人,Molecularoncology,2013,7,719-731；Kinney等人,Cancer,1997,80,2240-2249)；因此，将STn视为癌症检测和治疗的非常有吸引力的靶标。存在两种不同形式的唾液酸：Neu5Ac和Neu5Gc，其位于STn的末端位置处。Neu5Ac唾液酸化形式在人中占优，因为人由于无活性的CMP-Neu5Ac羟化酶(CMAH)基因而无法合成Neu5Gc。然而，富含Neu5Gc的食物的消费导致外来Neu5Gc并入人细胞中，尤其是癌瘤中。先前研究已经显示，实体瘤吸收并表达唾液酸的Neu5Gc形式(Inoue等人,Glycobiology,2010,20,752-762；Malykh等人,Biochimie,2001,83,623-634；Padler-Karavani等人,Cancer research,2011,71,3352-3363)。结合至是潜在癌症靶标的STn的两种糖亚型[Neu5Ac-STn(AcSTn)和Neu5Gc-STn(GcSTn)]的mAb被命名为泛STn抗体。
STn积累与在实体瘤中反复观察到的特定体细胞突变相关，并且与编码形成活性T-合酶所需的分子伴侣核心1β3-半乳糖基转移酶特异性分子伴侣(COSMC)的基因的失活相关(Ju等人,Nature,2005,437,125)。T-合酶与ST6GalNAc I竞争GalNAc底物，并且因此在由于突变失活时导致增加的STn合成。另外，STn积累还可能源自经常观察到的增加的ST6GalNAc I表达(Brockhausen等人,Biological chemistry,2001,382,219-232；Ikehara等人,Glycobiology,1999,9,1213-1224)。STn的从头表达可以调节癌瘤细胞，改变恶性表型，并导致侵袭性更强的细胞行为(Pinho等人,Cancer letters,2007,249,157-170)。因此，STn不仅是令人感兴趣的癌症生物标记物和治疗靶标，而且干扰STn功能提供具有显著功能性抗转移治疗益处的吸引人的可能性。
虽然众所周知，细胞糖蛋白的糖基化在癌症中改变，但是似乎异常糖基化关于所关注的糖蛋白和聚糖二者是选择性的。事实上，在人肿瘤CSC中，仅CD44和MUC1是STn抗原的主要载体(Cazet等人,Breast cancer research:BCR,2010,12,204；Julien等人,Glycobiology,2006,16,54-64)，直接暗示不仅靶向成熟肿瘤细胞而且靶向CSC的选择性方法。而MUC1是一些上皮细胞的正常表面成分，在这些上皮细胞中MUC1起屏障功能。以与在成熟癌细胞中所观察到的相同的方式，肿瘤相关MUC1的特征为CSC上的低糖基化和增加的唾液酸化，其中STn表现为CSC和成熟肿瘤细胞二者的特异性标记物(Curry等人,Journal ofsurgical oncology,2013,107,713-722)。MUC1的异常寡糖谱产生新标记物(如唾液酸基-Lea(用于CA19-9测试中)、唾液酸基-Lex和唾液酸基-Tn(TAG-72))以及癌细胞(例如，CSC)中的隐蔽表位(如Tn)的表达。另外，由于糖基化不足，粘蛋白的肽核心被暴露，使得核心内的表位(在正常组织衍生的MUC1内不可及)可以用作潜在抗原。
靶向STn的临床方法到目前为止仅由STn疫苗组成。最先进的临床候选者是Theratope，其是由偶合至钥孔虫戚血蓝蛋白的STn组成的治疗性疫苗。在体内小鼠研究中，Theratope免疫诱导有效抗体反应，显示其介导所注射的表达STn的乳腺癌细胞的生长延迟(Julien等人,British journal of cancer,2009,100,1746-1751)。然而，在III期临床试验中在转移性乳腺癌中，Theratope未能符合其主要终点。关于Theratope试验为什么没有达到其主要终点的主要假说是，在登记之前没有针对STn表达评价患者群体。由于乳腺癌中的STn表达在患者之间高度不同，根据研究和检测方法介于25％-80％范围内，因此缺少将STn表达与反应相关联的能力可能遮蔽来自Theratope的任何益处。重要的是，与单独的激素疗法相比，接受激素疗法的患者子集在用Theratope治疗时显示总体存活中值显著延长7.5个月(Ibrahim等人,Journal of clinical oncology:official journal of theAmerican Society of Clinical Oncology,2004,22,2547；和Miles等人,Theoncologist,2011,16,1092-1100)，从而验证靶向STn在特定患者群体中的治疗潜力。另外，由于免疫应答在疫苗接种的患者之间经常显著变化，疫苗方法缺少控制或调节抗体效价的能力，导致患者之间宽范围的治疗性抗体暴露。但是，Theratope以极低毒性耐受良好，表明靶向STn对于癌症治疗的安全性。
对癌细胞中的STn表达的分子基础的逐渐深入的理解强烈表明，在任何细胞表面蛋白上表达STn的细胞也将在许多(如果并非全部)其他O-糖基化细胞表面蛋白上表达STn，使其成为极佳的广泛分布的癌症相关治疗靶标。因此，可以针对CSC富集STn阳性癌细胞群。另外，近期数据证明，消除STn表达使得癌症侵袭性降低且转移行为显著减少(Gill等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 2013,110,E3152-3161)。
作为癌症治疗的靶向CSC的抗STn抗体
本领域中已经描述了若干种抗STn抗体，但是一些抗体证明针对STn抗原或唾液酸化亚型的低特异性。例如，已经显示市售B72.3抗STn抗体不仅结合至STn，还结合至Tn抗原(Bapat,S.A.(2010)Human ovarian cancer stem cells.Reproduction 140,33-41)。工程化以诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，或与细胞毒性有效负载[例如，抗体药物缀合物(ADC)]缀合的靶向STn的单克隆抗体(mAb)的可用性提供对于患有表达STn的肿瘤的癌症患者的显著治疗益处的可能性。另外，此类抗体还会允许研发伴随诊断以预先选择最有可能响应疗法的患者。
STn通常存在于一种或多种CSC表面抗原上，并且其一起用于促进与CSC相关的干性(stemness)和化学抗性特性。因此，抗STn抗体提供CSC相关的癌症靶向剂，其具有以下潜力：不仅通过直接衔接和/或ADCC直接杀伤CSC，而且提供结合至众多种细胞表面蛋白和干扰所述细胞表面蛋白为CSC生存力、自我更新和复制所必需的相关功能的唯一机会。
如本文所讨论，靶向CSC上的STn的原理和优势可以包括：(1)癌症中许多肿瘤特异性截短糖蛋白携带STn；(2)STn是优先在CSC和成熟肿瘤细胞(不论增殖状态如何)二者上，在CD44、MUC1和可能其他重要细胞表面标记物上表达的独特聚糖靶标，从而允许由单一治疗剂靶向这两种肿瘤组分；(3)STn也是CA-125的组分，CA-125是卵巢癌和其他癌症的生物标记；(4)STn是卵巢CSC标记物CD44的组分。因此，使用泛STn鼠类mAb(靶向涵盖连接至Tn的唾液酸的Neu5Ac和Neu5Gc两种形式的表位)将结合至并杀伤CSC或损伤CSC的功能，并且借助共同表位，将结合至并杀伤非CSC肿瘤细胞或损伤非CSC肿瘤细胞的功能。
在一些实施方案中，本发明提供一种或多种抗泛STn mAb用于特异性消除人CSC以及成熟肿瘤细胞。在本发明的一个方面中，抗STn抗体将靶向已验证的STn聚糖自身，而不是特定的糖肽或载体蛋白，这应该提供结合至CSC和非CSC肿瘤群体二者上的CD44、MUC1或其他STn糖基化标记物的广泛潜力。
考虑到靶向肿瘤相关STn中的罕见特异性，本发明可以绕过正常组织，包括正常成年干细胞，由此允许极佳的治疗窗。
根据本发明，本文提供独特的免疫治疗方案，旨在通过消除癌性组织和/或肿瘤细胞群内所含的癌症干细胞(CSC)和成熟癌细胞二者来根除人赘瘤。所述消除是通过靶向仅存在于癌性组织和/或肿瘤细胞群中的细胞表面唾液酸化Tn抗原(STn)结构(包括与癌症干细胞相关的此类结构)来特别赋予的。
结直肠癌
结直肠癌(CRC)具有第4高的发病率，并且目前是美国的癌症相关死亡的第三大死因。目前，20％的患者被诊断患有转移性疾病，并且约50％具有CRC的患者最终将发生转移。对于那些被诊断患有转移性疾病的患者，5年存活率为13.1％。在患有转移性结肠癌(mCRC)的患者中，优先使用治疗性抗体(例如，单克隆抗体)，如抗表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体(例如，西妥昔单抗和帕尼单抗)和抗血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体(例如，贝伐珠单抗和雷莫芦单抗)。
据报道STn的表达存在于83.4％的CRC患者样品中，并且与增加的恶性肿瘤和较差预后相关。STn抗原存在于成年正常结肠上皮细胞中，但是只在通过皂化反应去除O-乙酰基后才可检测，所述皂化反应是在体内不会天然发生的过程(Julien等人,Biomolecules,2012,2,435-466)。因此，STn可以用作治疗CRC的治疗靶标。
在一些实施方案中，本公开文本的聚糖相互作用抗体可以用于治疗CRC和/或mCRC。在一些情况下，此类聚糖相互作用抗体是抗STn抗体，包括但不限于本文所述的那些中的任一种。用于治疗CRC和/或mCRC的聚糖相互作用抗体可以与细胞毒性剂(例如，MMAE和MMAF)缀合。聚糖相互作用抗体可以与其他疗法组合使用，如使用化学治疗剂(例如，氟嘧啶、奥沙利铂和/或伊立替康)和/或使用治疗性抗体(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐珠单抗和/或雷莫芦单抗)的疗法。在一些情况下，聚糖相互作用抗体可以用于治疗对一种或多种其他治疗性治疗有抗性的结直肠癌。
根据一些实施方案，用于治疗结直肠癌的聚糖相互作用抗体可以以约0.5mg/kg至约20mg/kg的剂量来给予。例如，抗体可以以约0.5mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约2.5mg/kg至约10mg/kg或约5mg/kg至约20mg/kg的剂量来给予。
卵巢癌
在一些实施方案中，本公开文本的方法包括治疗卵巢癌的方法。卵巢癌是在2013年期间影响美国女性的主要妇科癌症。据估计，22,240名女性将被诊断为患有这种疾病，并且14,030名女性将死于这种疾病，使其成为美国的女性相关癌症死亡的第五大病因以及最致命的妇科恶性肿瘤(Siegel等人,Cancer statistics,2013.CA:a cancer journal forclinicians 63,11-30)。这种高死亡率可以归因于非症状性发作、晚期初次诊断、这种类型的癌症的侵袭性以及通常缺少可治疗性靶向的遗传变化。当前的护理标准是肿瘤减积，之后进行基于紫杉烷和铂的化学疗法。虽然这种初始治疗导致约70％的患者实现初始完全临床反应，但是这些患者大多将不幸地复发化学抗性疾病(Foster等人,Cancer letters,2013,338,147-157；和McCann等人,PloS one,2011,6,e28077)。部分地，与其他癌症类型一样，复发疾病可以归因于总肿瘤群体内CSC的存在。实际上，已经鉴定并显示卵巢CSC对化学疗法和放射疗法有抗性(Burgos-Ojeda等人,Cancer letters,2012,322,1-7)。因此，仍然与其他形式的癌症一样，消除癌性组织和/或肿瘤细胞群中的CSC以及成熟细胞提供管控复发疾病和理想地实现治愈的最佳希望。
在本发明的一些实施方案中，提供使用抗STn抗体治疗卵巢癌的方法。方法包括将抗STn抗体给予至患有卵巢癌或怀疑患有卵巢癌的受试者。在一些实施方案中，可以靶向卵巢CSC用于卵巢癌治疗，包括但不限于存在于癌性组织和/或肿瘤细胞群中的那些CSC。虽然CD133是研究最广泛的推定的卵巢CSC标记物，但人们认识到，如上文所讨论的STn的已知载体CD44与卵巢癌相关并且包括于鉴定卵巢CSC的标记物集合中(Zhang等人,Cancerresearch,2008,68,4311-4320；Foster等人,Cancer letters,2013,338,147-157；和Zoller,Cancer,2011,11,254-267)。另外，STn是在熟知的卵巢癌生物标记CA-125(MUC16)上以及在MUC1上表达，其中这些STn相关粘蛋白在血清中的水平最近已经被用作癌性与良性卵巢疾病的进一步区分物。升高的STn的血清水平存在于约50％的卵巢癌患者中并且与较低的5年存活率相关(Kobayashi等人,Journal of clinical oncology:officialjournal of the American Society of Clinical Oncology,1991,9,983-987；Kobayashi等人,Journal of clinical oncology:official journal of the American Society ofClinical Oncology,1992,10,95-101；和Chen等人,Journal of proteome research,2013,12,1408-1418)。最后，Vathipadiekal等人在人原发性卵巢癌瘤CSC与非CSC群体之间的差异性基因表达的研究中发现，产生STn的唾液酸转移酶ST6GalNAc I的表达在来自两个区室的细胞之间并无不同。
在一些实施方案中，根据本文所述方法将抗STn抗体给予至患有卵巢癌或怀疑患有卵巢癌的受试者导致此类受试者中的STn阳性细胞减少和/或此类受试者中存在的一种或多种卵巢癌性组织或肿瘤细胞群中的STn阳性细胞减少。在一些实施方案中，所述减少可以包括STn阳性细胞减少约10％至约大于90％(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少90％)。
在一些实施方案中，本发明提供靶向CSC以预防控制或治愈与CSC相关的癌症的抗体。此类抗体可以包括抗STn抗体，包括但不限于本文所述的那些中的任一种。其他抗STn抗体可以包括抗体3F1(SBH Sciences，纳蒂克，马萨诸塞州)或其衍生物，包括具有来自3F1和/或人源化衍生物的CDR的重组抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗STn抗体可以用于靶向对其他形式的治疗有抗性的卵巢癌症干细胞。此类治疗可以包括化学疗法。如本文所用，术语“化学疗法”是指使用化学物质的治疗形式。此类化学物质在本文中被称作“化学治疗剂”。在癌症治疗中，化学治疗剂是减慢或阻止癌细胞增殖的药剂。如本文所用，术语“化学疗法抗性”或“化学抗性”用于指不受化学疗法治疗影响或者对化学疗法治疗的敏感性有限的细胞。此类化学疗法治疗可以包括用奥拉帕尼(olaparib)、卡铂和/或紫杉醇治疗。靶向化学疗法抗性卵巢癌症干细胞的方法可以利用卵巢癌症干细胞中在化学疗法治疗后发生的STn表达的变化。在一些情况下，化学疗法抗性卵巢癌症干细胞在化学疗法治疗之前和/或之后表达STn。在一些情况下，化学疗法抗性卵巢癌症干细胞中的细胞表面STn表达可能在化学疗法治疗后增加。在用奥拉帕尼、卡铂和/或紫杉醇进行化学疗法治疗后，一些卵巢癌症干细胞可能增殖，导致具有奥拉帕尼、卡铂和/或紫杉醇抗性的表达STn的癌细胞群体。在一些实施方案中，抗STn抗体可以用于靶向奥拉帕尼、卡铂和/或紫杉醇抗性细胞。在一些情况下，这些抗性细胞是癌症干细胞。在一些实施方案中，受试者的抗STn抗体治疗可以在用奥拉帕尼、卡铂和/或紫杉醇治疗受试者后实施。
因此，本发明方法可以包括通过将抗STn抗体给予至患有卵巢癌的受试者来治疗癌症的方法。抗STn抗体可以在用化学治疗剂(例如，奥拉帕尼、卡铂和/或紫杉醇)治疗之前、期间或之后给予。抗STn抗体可以靶向在给予化学治疗剂(例如，奥拉帕尼、卡铂和/或紫杉醇)之前、期间和/或之后存在的表达STn的卵巢癌症干细胞。抗STn抗体可以包括可变结构域，其具有选自SEQ ID NO:1-12中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗STn抗体是抗体-药物缀合物。此类抗体药物缀合物可以包括细胞毒性剂(例如，单甲基澳瑞他汀E)。用抗STn抗体治疗的受试者中的癌性组织可以经历STn阳性细胞减少。在一些实施方案中，所述减少可以包括STn阳性细胞减少约10％至约大于90％(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少90％)。抗体可以靶向CSC。
在一些实施方案中，具有一种或多种化学疗法抗性卵巢癌干细胞的受试者可以在用一种或多种化学治疗剂(例如，奥拉帕尼、卡铂和/或紫杉醇)治疗后用本发明的抗STn抗体来治疗。化学治疗剂治疗之后的抗STn抗体治疗可以防止肿瘤再现。肿瘤再现是在一种或多种肿瘤细胞或肿瘤的水平降低(例如，由于先前或当前治疗)之后，一种或多种肿瘤细胞或肿瘤的发展。
在一些治疗卵巢癌的方法中，本公开文本的抗STn抗体是与归属于干性和/或分化的细胞信号传导调节剂组合给予。此类调节剂可以包括Notch和/或Hedgehog信号传导的调节剂。
本公开文本的方法包括通过以下方式治疗卵巢癌的方法：从患有或怀疑患有卵巢癌的受试者获得样品，并检测样品中的STn，其中如果检测到STn，则将抗STn抗体给予至受试者。在一些实施方案中，样品是细胞样品(例如，癌性组织样品或肿瘤样品)。细胞样品可以包括BRCA1突变体细胞或非BRCA1突变体细胞。
受试者样品中的STn检测可以通过本领域中已知用于分子化合物检测的任何方法来实施。此类方法可以包括使用一种或多种STn检测抗体。STn检测抗体可以包括能够结合STn的任何抗体。一些STn检测方法可以包括但不限于质谱、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫沉淀和酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一些实施方案中，检测蛋白质相关STn。
在一些实施方案中，所检测的STn可能与卵巢癌症干细胞相关的蛋白质相关。如本文所用，术语“卵巢癌干细胞相关的蛋白质”是指与一种或多种卵巢癌症干细胞相关的任何蛋白质。此类蛋白质可以包括但不限于参与影响卵巢癌症干细胞存活、生长、复制和/或维持的细胞信号传导的细胞表面蛋白、标记物、细胞内蛋白、转录因子和蛋白质。卵巢癌干细胞相关的蛋白质可以包括但不限于Notch、Hedgehog、MUC1、CD44、CD117、CD133和整联蛋白。
在一些实施方案中，本公开文本提供治疗卵巢癌的方法，其包括提供用奥拉帕尼与抗STn抗体进行的组合治疗。此类方法可以包括用奥拉帕尼治疗受试者，并且之后用抗STn抗体治疗受试者。在一些情况下，治疗卵巢癌的方法包括鉴定并非完全响应奥拉帕尼治疗的受试者，并将抗STn抗体给予至所述受试者。
本公开文本的方法可以包括巩固性癌症治疗。巩固性治疗是在化学疗法后实施以实现持续缓和的治疗。典型地，巩固性治疗涉及较低剂量的化学疗法以在保持较低毒性水平的同时防止肿瘤再现。本公开文本用于巩固性癌症治疗的方法可以包括通过给予至少一种化学治疗剂减少受试者中的癌细胞数，并通过给予抗STn抗体维持受试者中或受试者的一种或多种癌性组织中的减少的癌细胞数目(或进一步减少数目)。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌。化学治疗剂可以是奥拉帕尼、卡铂和/或紫杉醇。在一些实施方案中，抗STn抗体是抗体药物缀合物(ADC)。ADC可以包括单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。
在一些实施方案中，本公开文本的方法包括通过给予一种或多种抗STn抗体完全根除卵巢瘤细胞以诱导持久的初始缓和。其他方法包括通过给予一种或多种抗STn抗体在一定时间段中抑制卵巢瘤再现，在一些情况下无过度毒性。此类时间段可以是约1个月至约18个月、约1年至约5年、约2年至约10年或大于10年。
在一些实施方案中，本公开文本提供治疗癌症的方法，其包括从受试者分离一个或多个卵巢瘤细胞，在宿主(例如，小鼠、大鼠、兔、猪或灵长类动物)中用所述一个或多个卵巢瘤细胞产生异种移植肿瘤，将一种或多种抗STn抗体给予所述宿主，并选择所测试一种或多种抗STn抗体中的至少一种用作治疗性抗体来治疗受试者。抗STn抗体可以基于所述抗体减小宿主中的肿瘤体积的能力来选择。
免疫相关靶标
在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体可以是免疫调节抗体。如本文所用，免疫调节抗体是增强或抑制一种或多种免疫功能或途径的抗体。
已知许多细菌聚糖包含唾液酸。在一些情况下，此类聚糖允许细菌逃避宿主(包括但不限于人)的先天免疫系统。在一个例子中，细菌聚糖通过因子H识别抑制替代性补体途径激活。在另一个例子中，细菌聚糖遮蔽可能具有抗原性的下层残基。一些细菌聚糖通过激活抑制性唾液酸结合Ig样凝集素(Siglecs)来参与细胞信号传导事件，所述凝集素减弱针对包含某些唾液酸化部分的实体的免疫应答(Chen,X.等人,Advances in the biologyand chemistry of sialic acids.ACS Chem Biol.2010年2月19日；5(2):163-76)。在一些实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体可以用于治疗与细菌聚糖相关的免疫并发症。
由于如本文所述的Neu5Gc的外来性，一些Neu5Gc聚糖具有免疫原性，导致对可能表达这些聚糖的细胞和其他实体的免疫相关破坏。一些自身免疫破坏可能具有致病性。在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体可以用于治疗患有与Neu5Gc聚糖相关的自身免疫障碍的患者。
在一些实施方案中，本发明的免疫调节抗体可以用于促进或抑制T细胞介导的免疫力。此类抗体可以与T细胞上、T细胞相关蛋白上和/或与T细胞相互作用的一种或多种其他细胞类型上存在的一种或多种聚糖相互作用。增强T细胞介导的免疫力的免疫调节抗体可以用于刺激T细胞介导的癌细胞靶向。
在一些肿瘤中，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的浸润可能导致促进肿瘤细胞生存力和生长的免疫抑制。这被认为是由于免疫抑制性细胞信号传导所致，所述信号传导是通过TAM上存在的髓样C型凝集素受体(CLR)与肿瘤相关粘蛋白之间的相互作用来进行(Allavena,P.等人,Clin Dev Immunol.2010；2010:547179)。在一些实施方案中，本发明的免疫调节抗体与一种或多种肿瘤相关粘蛋白或TACA的结合防止TAM中的免疫抑制性细胞信号传导。
兽医应用
预期本发明的聚糖相互作用抗体将在兽医护理领域中得到应用，包括非人脊椎动物的护理和治疗。如本文所述，术语“非人脊椎动物”包括除了智人(Homo sapiens)以外的所有脊椎动物，包括野生和驯化物种，如伴侣动物和家畜。非人脊椎动物包括哺乳动物，如羊驼、白臀野牛、美洲野牛、骆驼、猫、牛、鹿、犬、驴、大额牛、山羊、荷兰猪、马、骆马、骡子、猪、兔、驯鹿、绵羊、水牛和牦牛。家畜包括在农业环境中饲养以产生诸如食物等材料、劳力和衍生产品(如纤维和化学品)的驯化动物。通常，家畜包括具有显著农业意义的所有哺乳动物、禽类和鱼。特别地，四足类屠宰动物包括肉牛、小母牛、母牛、小牛、公牛、牛、猪和绵羊。
生物加工
在本发明的一些实施方案中，提供通过使细胞与一种或多种能够调节基因表达或改变所产生聚糖的水平和/或类型的聚糖相互作用抗体(如抗体或融合蛋白)接触，在宿主细胞中产生生物产物的方法，其中这种调节或改变促进生物产物的产生。根据本发明，可以通过使用本发明的一种或多种聚糖相互作用抗体来改善生物加工方法。还可以通过补充、替代或添加一种或多种聚糖相互作用抗体来改善生物加工方法。
诊断
在一些实施方案中，本发明的化合物和组合物可以用作诊断剂。在一些情况下，本发明的抗体可以用于对表达靶抗原的细胞、组织、器官等进行鉴定、标记或染色。在其他实施方案中，本发明的抗体可以用于鉴定组织切片(即，组织学组织切片，包括已知或怀疑具有癌细胞的组织)中存在的STn。使用本发明的抗体的此类方法在一些情况下可以用于鉴定组织切片中的癌细胞或肿瘤。组织切片可以来自任何组织或器官，包括但不限于乳房、结肠、胰腺、卵巢、脑、肝、肾、脾、肺、皮肤、胃、肠、食管或骨。
在一些实施方案中，本发明的诊断方法可以包括使用免疫组织化学技术分析一种或多种细胞或组织。此类方法可以包括使用本文所述任何聚糖相互作用抗体中的一种或多种。本发明的免疫组织化学方法可以包括将组织切片染色以确定一种或多种糖基化蛋白或其他标记物的存在和/或水平。组织切片可以衍生自受试者肿瘤(例如，患者肿瘤和动物肿瘤，如动物模型肿瘤)。组织切片可以来自福尔马林固定的或未固定的新鲜冷冻组织。在一些情况下，组织切片来自福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。本文所述的聚糖相互作用抗体可以用作一级抗体。使用一级抗体直接接触组织切片并结合至靶表位。一级抗体可以与可检测标记直接缀合，或者可以通过使用检测剂(如二级抗体)来检测。在一些实施方案中，一级抗体或检测剂包括可以用于与底物反应产生可见产物(例如，沉淀物)的酶。此类酶可以包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和过氧化氢酶。
本文所述的抗STn抗体可以根据本公开文本的免疫组织化学方法用于检测组织或细胞中的STn糖基化蛋白。在一些情况下，这些抗体用于检测和/或确定肿瘤组织中的STn水平。此类肿瘤组织可以包括肿瘤微阵列中所包括的肿瘤组织。适宜肿瘤类型包括但不限于乳房、结肠、卵巢、胰腺、皮肤、肠、肺和脑肿瘤。用于免疫组织化学染色技术中的抗STn抗体的水平可以变化，以增加可见染色或降低背景染色水平。在一些实施方案中，使用约0.01μg/ml至约50μg/ml的抗体浓度。例如，可以使用约0.01μg/ml至约1μg/ml、约0.05μg/ml至约5μg/ml、约0.1μg/ml至约3μg/ml、约1μg/ml至约10μg/ml、约2μg/ml至约20μg/ml、约3μg/ml至约25μg/ml、约4μg/ml至约30μg/ml或约5μg/ml至约50μg/ml的抗体浓度。
在一些实施方案中，本发明的诊断方法包括产生STn连接的糖蛋白谱的方法。如本文所用，术语“STn连接的糖蛋白谱”是指指示样品或受试者中的STn连接的糖蛋白的水平和/或身份的一组信息。可以对从受试者获得的样品实施产生STn连接的糖蛋白谱的方法。此类样品可以是生物样品，包括但不限于本文所述的那些中的任一种。生物样品可以是细胞样品。在一些情况下，细胞样品可以包括至少一种肿瘤细胞。在一些实施方案中，肿瘤细胞样品可以包括BRCA1突变体或非BRCA1突变体肿瘤细胞。
STn连接的糖蛋白谱中所包括的糖蛋白可以包括但不限于癌细胞标记物、干细胞标记物、癌症干细胞标记物和干细胞相关蛋白。在一些实施方案中，作为STn连接的糖蛋白谱的一部分鉴定和/或定量的糖蛋白可以包括但不限于CD44、CD133、CD117、整联蛋白、Notch和Hedgehog。
STn连接的糖蛋白谱中的STn连接的糖蛋白的水平和/或身份可以根据本领域中已知用于鉴定蛋白质和/或定量蛋白质水平的任何方法来确定。在一些实施方案中，此类方法可以包括但不限于质谱、阵列分析(例如，抗体阵列或蛋白质阵列)、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫沉淀和ELISA。在一些情况下，STn连接的糖蛋白可以在分析之前从样品进行免疫沉淀。这种免疫沉淀可以使用抗STn抗体来实施。用于STn连接的糖蛋白的免疫沉淀的抗STn抗体可以包括本领域中已知或本文所述的那些中的任一种。在一些实施方案中，使用抗STn抗体将STn糖蛋白从生物样品进行免疫沉淀，并且然后使用质谱进行鉴定和/或定量。
在一些实施方案中，通过STn连接的糖蛋白谱信息来通知癌症治疗。因此，本公开文本提供治疗癌症的方法，其包括从需要癌症治疗的受试者获得样品，从样品产生STn连接的糖蛋白谱，选择结合至STn连接的糖蛋白谱中的STn糖基化蛋白的聚糖相互作用抗体，和将所述聚糖相互作用抗体给予至所述受试者。根据此类方法给予的聚糖相互作用抗体可以包括本文所教示的一种或多种CDR或可变结构域。
在一些实施方案中，本公开文本的方法可以用作伴随诊断。如本文所用，术语“伴随诊断”是指一种测定，其结果有助于诊断或治疗受试者。伴随诊断可用于将患者疾病、障碍或病症严重性水平分层，从而允许调节治疗方案和剂量以降低成本，缩短临床试验的持续时间，提高安全性和/或提高效率。伴随诊断可以用于预测疾病、障碍或病症的发展，并帮助预防性疗法的开方。一些伴随诊断可以用于选择受试者进行一种或多种临床试验。在一些情况下，伴随诊断测定可以与特定治疗并行实施，以促进治疗优化。
在一些实施方案中，本公开文本的方法可以用作癌症相关疾病、障碍和/或病症的伴随诊断。本发明的一些伴随诊断可以用于预测和/或确定癌症的一种或多种形式的严重程度。本发明的一些伴随诊断可以用于依据发生癌症的一种或多种形式的风险来将受试者分层。本发明的一些伴随诊断可以用于促进和加快用于癌症治疗的药物研发。
在一些实施方案中，本公开文本提供通过使用捕获抗体和检测抗体来检测和/或定量样品中STn的方法。如本文所用，“捕获抗体”是以可以检测到的方式结合分析物的抗体。捕获抗体可以与表面或其他载体缔合。检测抗体是促进对分析物的存在或不存在的观察的抗体。在一些实施方案中，捕获抗体和检测抗体二者都结合至STn。根据此类实施方案，捕获抗体和检测抗体可以衍生自不同物种。这可以允许使用仅识别检测抗体并且不受捕获抗体的存在影响的二级抗体。在一些实施方案中，捕获抗体可以结合至STn，并且检测抗体可以结合至所结合STn的蛋白质或载体。用于样品中的STn检测的捕获抗体和检测抗体可以选自市售抗STn抗体以及本文所呈现的任何抗STn抗体。
STn表达修饰的细胞
在一些实施方案中，本公开文本提供具有改变的STn水平的经修饰细胞。此类细胞可以用于多种目的(例如，实验、治疗、抗体测试等)。在一些情况下，本公开文本的方法包括增强一种或多种细胞或组织中的ST6GalNAc I的表达的方法。这可以导致产生一种或多种具有增加的细胞STn(例如，表面表达的STn)表达的细胞。ST6GalNAc I的表达可以例如通过引入一种或多种携带ST6GalNAc I表达构建体的载体来增强。此类表达构建体可以被设计具有天然ST6GalNAc I启动子或具有增强基因表达的启动子。配置为用于增强基因表达的启动子可以具有组成型活性或过高活性的启动子元件。在一些情况下，启动子可以配置为用于诱导型基因表达。此类启动子可以在与激活启动子的诱导型元件的因子接触时变为活性或具有升高的活性。STn表达构建体可以包括hST6GalNAc I pRc-CMV，如以下文献中所述：Julien,S.等人,2001.Glycoconj J,18:883-93，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，表达构建体可以编码STn合成和/或表达中所涉及的其他因子。此类因子可以包括但不限于T-合酶，以及核心1β3-半乳糖基转移酶特异性分子伴侣(COSMC)。在一些实施方案中，具有极低STn表达的细胞转化为表达STn的细胞。此类细胞可以包括但不限于SKOV3细胞、BRCA1突变体细胞和非突变体BRCA1细胞。
还提供相对于未修饰细胞具有降低的STn表达的经修饰细胞。因此，本公开文本的方法包括压制STn表达的方法。此类方法可以包括降低ST6GalNAc I表达。在一些实施方案中，此类方法可以包括给予一种或多种压制ST6GalNAc I表达的核酸分子。此类核酸分子可以包括但不限于抑制性RNA(例如，RNAi或沉默子siRNA)。在一些实施方案中，STn合成和/或表达中所涉及的其他因子可以有所减少。此类因子可以包括但不限于T-合酶和COSMC。在一些实施方案中，天然地表达STn的细胞转化为STn缺陷型细胞。此类细胞可以包括但不限于OVCAR3细胞和OVCAR4细胞。
III.药物组合物
在一些实施方案中，本公开文本包括药物组合物。此类药物组合物可以包括本公开文本的抗体和/或衍生自此类抗体的片段、肽或蛋白质。药物组合物可以通过生物利用度、治疗窗和/或分布容积中的一种或多种来表征。
生物利用度
聚糖相互作用抗体在用如本文所述的递送/配制试剂或媒介物配制为组合物时，如与缺少如本文所述的递送剂的组合物相比，可以展现生物利用度的增加。如本文所用，术语“生物利用度”是指给予至哺乳动物的给定量的聚糖相互作用抗体的全身利用度。生物利用度可以通过测量化合物的未改变形式的在将所述化合物给予至哺乳动物后的曲线下面积(AUC)或者最大血清或血浆浓度(Cmax)来评估。AUC是针对沿横坐标(X轴)的时间标绘沿纵坐标(Y轴)的化合物的血清或血浆浓度的曲线下面积的确定。通常，特定化合物的AUC可以使用本领域普通技术人员已知并且如以下文献中所述的方法来计算：G.S.Banker,ModernPharmaceutics,Drugs and the Pharmaceutical Sciences,第72卷,Marcel Dekker,NewYork,Inc.,1996，所述文献通过引用并入本文。在一些实施方案中，AUC是使用线性梯形法以线性/线性插值来计算。AUC可以以时间单位乘以浓度来表达(即，时间单位*质量单位/体积单位)。例如，AUC可以以单位天*μg/ml来表达。每条浓度-时间曲线的终末消除期可以使用所观察到的一个或多个最终浓度值来鉴定。终末消除期斜率可以使用对未加权浓度数据进行的对数线性回归来确定。
Cmax值是在给予后在受试者的血清或血浆中实现的化合物的最大浓度。特定化合物的Cmax值可以使用本领域普通技术人员已知的方法来测量。如本文所用，短语“增加生物利用度”或“改善药物代谢动力学”意指，在哺乳动物中作为AUC、Cmax或Cmin测量的聚糖相互作用抗体的全身利用度在与如本文所述的递送剂共给予时比不进行这种共给予时更大。在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体的生物利用度可以增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些实施方案中，抗STn抗体的生物利用度可以在药物组合物给予后确定。抗STn抗体可以是抗体药物缀合物，其包括治疗剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。治疗剂可以是细胞毒性剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。细胞毒性剂可以是MMAE。细胞毒性剂可以通过接头接合至抗体。本公开文本的药物组合物可以用于将抗STn抗体提供至受试者，其中抗STn抗体展现约1μg/ml至约5μg/ml、约2μg/ml至约10μg/ml、约3μg/ml至约15μg/ml、约4μg/ml至约20μg/ml、约5μg/ml至约50μg/ml、约20μg/ml至约100μg/ml、约50μg/ml至约200μg/ml、约75μg/ml至约150μg/ml或约100μg/ml至约500μg/ml的Cmax。本公开文本的药物组合物可以用于将抗STn抗体提供至受试者，其中抗STn抗体展现约1天*μg/ml至约5天*μg/ml、约2天*μg/ml至约10天*μg/ml、约5天*μg/ml至约50天*μg/ml、约20天*μg/ml至约200天*μg/ml、约100天*μg/ml至约500天*μg/ml或约250天*μg/ml至约1000天*μg/ml的AUC(从给予开始到最后一次观察到可定量浓度)。
治疗窗
聚糖相互作用抗体在用如本文所述的递送剂配制为组合物时，如与所给予的缺少如本文所述的递送剂的聚糖相互作用抗体组合物的治疗窗相比，可以展现所给予的聚糖相互作用抗体组合物的治疗窗的增加。如本文所用，“治疗窗”是指具有引发治疗效应的高概率的血浆浓度的范围，或者在作用位点处治疗活性物质水平的范围。在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体在与如本文所述的递送剂共给予时的治疗窗可以增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些实施方案中，可以监测化合物半衰期和/或清除速率作为治疗窗的指示物。如本文所用，术语“半衰期”或“t1/2”是指给定过程或化合物浓度达到最终值的一半所用的时间。“终末消除半衰期”或“终末半衰期”是指在因子的浓度达到假平衡后，因子的血浆浓度减小一半所需的时间。如果浓度的下降可能受到一种或多种与消除无关的因子(例如，吸收速率或分布速率)的影响，则将所观察到的半衰期称为“表观”半衰期。如本文所用，术语“清除速率”是指从生物系统或流体清除特定化合物的速率。如果所述速率可能受到一种或多种与清除无关的因子的影响，则将清除速率称为“表观”清除速率。
在一些实施方案中，可以在药物组合物给予后确定抗STn抗体的治疗窗。抗STn抗体可以是抗体药物缀合物，其包括治疗剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。治疗剂可以是细胞毒性剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。细胞毒性剂可以是MMAE。细胞毒性剂可以通过接头接合至抗体。本公开文本的药物组合物可以用于将抗STn抗体提供至受试者，其中抗STn抗体展现约1小时至约10小时、约2小时至约12小时、约4小时至约24小时、约20小时至约30小时、约1天至约5天、约2天至约14天、约4天至约21天、约8天至约28天或大于28天的表观终末消除半衰期。在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物可以用于将抗STn抗体提供至受试者，其中抗STn抗体展现约1ml/kg/天至约10ml/kg/天、约5ml/kg/天至约20ml/kg/天、约15ml/kg/天至约50ml/kg/天或大于50ml/kg/天的表观清除速率。
分布容积
聚糖相互作用抗体在用如本文所述的递送剂配制为组合物时，相对于缺少如本文所述的递送剂的组合物，可以展现改善的(例如，降低的或定向的)分布容积(Vdist)。分布容积(Vdist)将体内药物的量与血液或血浆中的药物浓度相关联。如本文所用，术语“分布容积”是指以与在血液或血浆中相同的浓度在体内含有药物总量所需的流体容积：Vdist等于体内药物的量/血液或血浆中的药物浓度。例如，对于10mg剂量和10mg/L的血浆浓度，分布容积将是1升。分布容积反映药物在血管外组织中存在的程度。与血浆蛋白质结合相比，大分布容积反映化合物结合至组织组分的倾向。在临床环境中，Vdist可以用于确定负荷剂量以实现稳态浓度。Vss是指稳态下的表观分布容积。在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体在与如本文所述的递送剂共给予时的分布容积可以降低至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％。
在一些实施方案中，受试者中抗STn抗体的分布容积可以在药物组合物给予后确定。抗STn抗体可以是抗体药物缀合物，其包括治疗剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。治疗剂可以是细胞毒性剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。细胞毒性剂可以是MMAE。细胞毒性剂可以通过接头接合至抗体。本公开文本的药物组合物可以用于将抗STn抗体提供至受试者，其中抗STn抗体展现约1ml/kg至约10ml/kg、约5ml/kg至约50ml/kg、约20ml/kg至约100ml/kg、约75ml/kg至约150ml/kg或大于150ml/kg的表观Vss。
在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合构成组合物和/或复合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种其他活性物质，例如，治疗和/或预防活性物质。在药物试剂的配制和/或制造中的一般考虑因素可以发现于例如以下文献中：Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,LippincottWilliams&Wilkins,2005(通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，将组合物给予至人、人患者或受试者。出于本公开文本的目的，短语“活性成分”通常是指要如本文所述递送的聚糖相互作用抗体。
虽然本文所提供的药物组合物的说明主要是针对适合给予至人的药物组合物，但是技术人员应理解，此类组合物通常适合于给予至任何其他动物，例如，给予至非人动物，例如非人哺乳动物。修饰适合于给予至人的药物组合物以使所述组合物适合于给予至多种动物是众所周知的，并且普通的兽医学药理学家仅用常规(如果存在)实验即可设计和/或进行这种修饰。预期被给予药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫、犬、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业上相关的鸟类，如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文所述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域已知或后来研发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他附加成分缔合，并且然后如果需要和/或合意，将产物划分、成型和/或包装至所需的单剂量或多剂量单位中。
根据本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量来制备、包装和/或散装销售。如本文所用，“单位剂量”是离散量的药物组合物，其包含预定量的活性成分。活性成分的量通常等于将要给予至受试者的活性成分的剂量和/或这个剂量的实用部分，如例如，这个剂量的一半或三分之一。
根据本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、体型和/或状况并且进一步根据要给予组合物的途径而变化。例如，组合物可以包含介于0.1％与100％之间，例如，介于0.5％与50％之间、介于1％-30％之间、介于5％-80％之间或至少80％(w/w)的活性成分。在一个实施方案中，活性成分是针对癌细胞的抗体。
配制品
聚糖相互作用抗体可以使用一种或多种赋形剂配制，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞渗透性；(3)允许持续或延迟释放(例如，从聚糖相互作用抗体的配制品)；和/或(4)改变生物分布(例如，将聚糖相互作用抗体靶向特定组织或细胞类型)。除了传统的赋形剂(如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂)以外，本发明的配制品可以包括但不限于脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用聚糖相互作用抗体转染的细胞(例如，用于移植至受试者中)及其组合。
赋形剂
如本文所用，术语“赋形剂”是指在使用前与本发明的化合物和/或组合物组合的任何物质。在一些实施方案中，赋形剂无活性并且主要用作本发明的化合物和/或组合物的载体、稀释剂或媒介物。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域中已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用并入本文)。
在本公开文本的范围内预期常规赋形剂介质的使用，除了因为任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容以外，如产生任何不需要的生物学效应或另外以有害方式与药物组合物的任何其他一种或多种组分相互作用。
本文所述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域已知或后来研发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他附加成分缔合的步骤。
根据本公开文本的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量制备、包装和/或散装出售。
根据本公开文本的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量可以根据所治疗受试者的身份、体型和/或状况并且进一步根据要给予组合物的途径而变化。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人和用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂是由美国食品和药物管理局(United States Food and DrugAdministration)批准。在一些实施方案中，赋形剂是药品级的。在一些实施方案中，赋形剂符合United States Pharmacopoeia[美国药典](USP)、European Pharmacopoeia[欧洲药典](EP)、British Pharmacopoeia[英国药典]和/或International Pharmacopoeia[国际药典]的标准。
用于制造药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散和/或粒化剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂可以任选地包括在药物组合物中。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、白陶土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
示例性粒化和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、皂粘土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基-吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(淀粉羟乙酸钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝十二烷基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。
示例性表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄蓍胶、克罗珠克(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶状粘土(例如，皂粘土[硅酸铝]和[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如，十八烷醇、鲸蜡醇、油醇、三醋汀单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer)(例如，羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯聚合物)、角叉菜胶、纤维质衍生物(例如，羧甲基纤维素钠、纤维素粉、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨醇酐单十二烷酸酯[20]、聚氧乙烯山梨醇酐[60]、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯[80]、山梨醇酐单棕榈酸酯[40]、山梨醇酐单硬脂酸酯[60]、山梨醇酐三硬脂酸酯[65]、单油酸甘油酯、山梨醇肝单油酸酯[80])、聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯单硬脂酸酯[45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯和)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯十二烷基醚[30])、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二乙二醇单十二烷酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、十二烷酸乙酯、十二烷基硫酸钠、F 68、188、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、西吡氯铵(cetylpyridiniumchloride)、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、多库酯钠(docusate sodium)等和/或其组合。
示例性结合剂包括但不限于淀粉(例如，玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖类(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、拉克替醇(lactitol)、甘露醇)；天然和合成胶(例如，阿拉伯胶、海藻酸钠、鹿角菜提取物、panwar胶、印度胶、伊莎贝果壳的胶浆、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、硅酸镁铝和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸盐；聚氧化乙烯；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇等；及其组合。
示例性防腐剂可以包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、二羟基丙硫醇、偏重亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、延胡索酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯甲醇、溴硝丙二醇(bronopol)、十六烷基三甲基溴化铵(cetrimide)、西吡氯铵、氯己定(chlorhexidine)、三氯叔丁醇(chlorobutanol)、氯甲酚(chlorocresol)、氯二甲酚(chloroxylenol)、甲酚、乙醇、丙三醇、海克替啶(hexetidine)、咪脲(imidurea)、酚、苯氧乙醇、苯乙基醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于对羟苯基甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、酚、酚类化合物、双酚、三氯叔丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙基醇。示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、乙酸生育酚、甲磺酸去铁胺、十六烷基三甲基溴化铵、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、乙二胺、十二烷基硫酸钠(SLS)、十二烷基乙醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏重亚硫酸钾、GLYDANT对羟基苯甲酸甲酯、115、II、NEOLONETM、KATHONTM和/或
示例性缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、d-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、戊酮酸钙、戊酸、二碱式磷酸钙、磷酸、三碱式磷酸钙、；磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、乙醇等和/或其组合。
示例性润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠等及其组合。
示例性油包括但不限于扁桃仁油、杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油、香柠檬油、黑醋栗籽油、琉璃苣油、刺桧油、洋甘菊油、芸苔油、葛缕子油、腊棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉叶油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、尨牛儿油、南瓜油、葡萄籽油、榛子油、海索草油、肉豆蔻酸异丙酯、希蒙得木油、夏威夷核油、杂薰衣草油、薰衣草油、柠檬油、山苍子油、澳洲坚果油、锦葵油、芒果核油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、橙鲷鱼油、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、sasquana油、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、牛油树脂、硅油、大豆油、葵花油、茶树油、蓟油、椿油、香根草油、胡桃油和小麦胚芽油。示例性油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或其组合。
根据配制者的判断，诸如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂等赋形剂可以存在于组合物中。
在一些实施方案中，用至少一种赋形剂配制本公开文本的抗体。抗体可以是抗STn抗体。抗体可以是包括治疗剂的抗体药物缀合物，所述治疗剂包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。治疗剂可以是细胞毒性剂，包括但不限于本文所呈现的那些中的任一种。细胞毒性剂可以是MMAE。细胞毒性剂可以通过接头接合至抗体。
媒介物
脂质体、脂复合物和脂质纳米颗粒
本发明的聚糖相互作用抗体可以使用一种或多种脂质体、脂复合物或脂质纳米颗粒配制。在一个实施方案中，包含聚糖相互作用抗体的药物组合物进一步包含脂质体。脂质体是人工制备的囊泡，其可以主要包含一个或多个脂双层，并且可以用作用于给予营养素和药物配制品的递送媒介物。脂质体可以具有不同大小，例如但不限于多层囊泡(MLV)，其直径可以是数百纳米并且可以含有一系列由窄水性区室隔开的同心双层；小单层囊泡(SUV)，其直径可以小于50nm；以及大单层囊泡(LUV)，其直径可以介于50与500nm之间。脂质体设计可以包括但不限于调理素或配体，以改善脂质体与不健康组织的附接，或者激活诸如但不限于胞吞作用等事件。脂质体可以含有低或高pH，以改善药物配制品的递送。
脂质体的形成可以依赖于物理化学特征，诸如但不限于所包裹的药物配制品和脂质体成分、其中分散脂质囊泡的介质的性质、所包裹物质的有效浓度和其潜在毒性、囊泡的应用和/或递送期间所涉及的任何其他过程、用于计划应用的囊泡的优化大小、多分散性和贮存期限，以及安全有效的脂质体产物的批次重现性和大规模生产的可能性。
在一个实施方案中，此类配制品还可以经构建或组成改变，使得将其被动或主动地引导至体内的不同细胞类型。
配制品还可以通过其表面上不同配体的表达来选择性靶向，如通过但不限于叶酸、转铁蛋白、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和抗体靶向方法所例示。
脂质体、脂复合物或脂质纳米颗粒可以用于改善聚糖相互作用抗体功能的功效，因为这些配制品可能能够增加使用聚糖相互作用抗体的细胞转染。脂质体、脂复合物或脂质纳米颗粒还可以用于增加聚糖相互作用抗体的稳定性。
特异性配制用于抗体负荷的脂质体是根据本领域中已知的技术来制备，如以下文献中所述：Eppstein等人(Eppstein,D.A.等人,Biological activity of liposome-encapsulated murine interferon gamma is mediated by a cell membranereceptor.Proc Natl Acad Sci U S A.1985年6月；82(11):3688-92)；Hwang等人(Hwang,K.J.等人,Hepatic uptake and degradation of unilamellar sphingomyelin/cholesterol liposomes:a kinetic study.Proc Natl Acad Sci U S A.1980年7月；77(7):4030-4)；US 4,485,045和US 4,544,545。具有持续循环时间的脂质体的产生也描述于US 5,013,556中。
包含本发明的聚糖相互作用抗体的脂质体可以使用反相蒸发利用诸如磷脂酰胆碱、胆固醇以及已经进行聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺等脂质来产生。使用具有确定孔径的过滤器挤出所需直径的脂质体。在另一个实施方案中，本发明的聚糖相互作用抗体可以通过二硫化物交换反应缀合至脂质体的外表面上，如以下文献中所述：Martin等人(Martin,F.J.等人,Irreversible coupling of immunoglobulin fragments topreformed vesicles.An improved method for liposome targeting.J Biol Chem.1982年1月10日；257(1):286-8)。
聚合物和纳米颗粒
本发明的聚糖相互作用抗体可以使用天然和/或合成聚合物来配制。可以用于递送的聚合物的非限制性例子包括但不限于DMRI/DOPE、泊洛沙姆(poloxamer)、壳聚糖、环糊精和聚(乳酸-共-羟乙酸)(PLGA)聚合物。这些可以是生物可降解的。
聚合物配制品可以允许持续或延迟释放聚糖相互作用抗体(例如，在肌内或皮下注射后)。聚糖相互作用抗体的改变的释放概况可以导致例如在延长的时间段期间释放聚糖相互作用抗体。聚合物配制品还可以用于增加聚糖相互作用抗体的稳定性。
聚合物配制品还可以通过不同配体的表达选择性靶向，如通过但不限于叶酸、转铁蛋白和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)所例示(Benoit等人,Biomacromolecules.2011 12:2708-2714；Rozema等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2007 104:12982-12887；Davis,MolPharm.2009 6:659-668；Davis,Nature 2010 464:1067-1070；通过引用以其整体并入本文)。
还可以将本发明的聚糖相互作用抗体使用聚合物、脂质和/或其他生物可降解试剂(诸如但不限于磷酸钙)的组合配制为纳米颗粒。可以将组分组合于核-壳、杂合物和/或叠层架构中，以允许微调纳米颗粒，由此可以增强聚糖相互作用抗体的递送。对于聚糖相互作用抗体，可以在生理pH下使用基于聚(2-(甲基丙稀酰氧基)乙基磷酰胆碱)-嵌段-(2-(二异丙胺基)甲基丙烯酸乙酯)(PMPC-PDPA)的系统，所述聚合物是pH敏感的二嵌段共聚物，其自组装形成纳米级囊泡，也被称为聚合物囊泡(polymersome)。已经显示这些聚合物囊泡成功递送活细胞内的相对高的抗体有效负载。(Massignani等人,Cellular delivery ofantibodies:effective targeted subcellular imaging and new therapeutictool.Nature Proceedings,2010年5月)。
在一个实施方案中，可以使用PEG-电荷-转化聚合物(Pitella等人,Biomaterials.2011 32:3106-3114)形成纳米颗粒以递送本发明的聚糖相互作用抗体。PEG-电荷-转化聚合物可以通过在酸性pH下被裂解为聚阳离子来改善PEG-聚阴离子嵌段共聚物，由此增强胞内体逃逸。
核-壳纳米颗粒的使用另外集中于合成阳离子型交联纳米凝胶核和各种壳的高通量方法(Siegwart等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2011 108:12996-13001)。聚合纳米颗粒的复合、递送和内化可以通过改变纳米颗粒的核与壳组分的化学组成来精确控制。
在一个实施方案中，使用聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的基质来递送本发明的聚糖相互作用抗体。此类基质描述于Nature Biotechnology 10,1446-1449(1992)中。
抗体配制品
本发明的聚糖相互作用抗体可以经配制用于静脉内给予或血管外给予(Daugherty等人,Formulation and delivery issues for monoclonal antibodytherapeutics.Adv Drug Deliv Rev.2006年8月7日；58(5-6):686-706，美国专利公开号2011/0135570，所有这些文献都以其整体并入本文)。血管外给予途径可以包括但不限于皮下给予、腹膜内给予、大脑内给予、眼内给予、病灶内给予、局部给予和肌内给予。
抗体结构可以进行修饰以改善其作为治疗药的有效性。改善可以包括但不限于改善的热力学稳定性、降低的Fc受体结合特性和改善的折叠效率。修饰可以包括但不限于氨基酸取代、糖基化、棕榈酰化和蛋白质缀合。
聚糖相互作用抗体可以用抗氧化剂配制以降低抗体氧化。聚糖相互作用抗体还可以用添加剂配制以降低蛋白质聚集。此类添加剂可以包括但不限于白蛋白、氨基酸、糖、尿素、氯化胍、多元醇、聚合物(如聚乙二醇和葡聚糖)、表面活性剂(包括但不限于聚山梨酯20和聚山梨酯80)或甚至其他抗体。
本发明的聚糖相互作用抗体可以经配制以降低水对抗体结构和功能的影响。此类配制品中的抗体制剂可以是冻干的。经历冻干的配制品可以包括碳水化合物或多元醇化合物以保护并稳定化抗体结构。此类化合物包括但不限于蔗糖、海藻糖和甘露醇。
本发明的聚糖相互作用抗体可以用聚合物配制。在一个实施方案中，聚合物配制品可以含有疏水聚合物。此类聚合物可以是通过水包油包固体包封方法用聚丙交酯-共-乙交酯配制的微球体。还预期包含乙烯-乙酸乙烯酯共聚物的微球体用于抗体递送，并且可以用于延长在递送位点处的抗体释放的时程。在另一个实施方案中，聚合物可以是含水凝胶。此类凝胶可以例如包含羧甲基纤维素。含水凝胶还可以包含透明质酸水凝胶。抗体可以通过腙连接共价连接至此类凝胶，所述腙连接允许在组织中持续递送，所述组织包括但不限于中枢神经系统的组织。
肽和蛋白质配制品
本发明的聚糖相互作用抗体可以用肽和/或蛋白质来配制。在一个实施方案中，可以使用诸如但不限于细胞渗透性肽和蛋白质以及使得能进行细胞内递送的肽的肽递送药物配制品。可以与本发明的药物配制品一起使用的细胞渗透性肽的非限制性例子包括促进递送至细胞内空间的附接至聚阳离子的细胞渗透性肽序列，例如，HIV衍生的TAT肽、渗透素、转运肽或hCT衍生的细胞渗透性肽(参见，例如，Caron等人,Mol.Ther.3(3):310-8(2001)；Langel,Cell-Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL,2002)；El-Andaloussi等人,Curr.Pharm.Des.11(28):3597-611(2003)；和Deshayes等人,Cell.Mol.Life Sci.62(16):1839-49(2005)，所有文献都是通过引用并入本文)。组合物还可以经配制以包括促进将组合物递送至细胞内空间的细胞渗透剂，例如，脂质体。本发明的聚糖相互作用抗体可以与肽和/或蛋白质(诸如但不限于来自AileronTherapeutics(剑桥，马萨诸塞州)和Permeon Biologics(剑桥，马萨诸塞州)的肽和/或蛋白质)，以使得能进行细胞内递送(Cronican等人,ACS Chem.Biol.2010 5:747-752；McNaughton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009 106:6111-6116；Sawyer,Chem BiolDrug Des.2009 73:3-6；Verdine和Hilinski,Methods Enzymol.2012；503:3-33；所有这些文献都是通过引用以其整体并入本文)。
在一个实施方案中，细胞渗透性多肽可以包含第一结构域和第二结构域。第一结构域可以包含超负荷多肽。第二结构域可以包含蛋白质结合配偶体。如本文所用，“蛋白质结合配偶体”包括但不限于抗体和其功能片段、支架蛋白或肽。细胞渗透性多肽可以进一步包含蛋白质结合配偶体的细胞内结合配偶体。细胞渗透性多肽可能能够从其中可能引入聚糖相互作用抗体的细胞分泌。
在本发明的配制品中，可以并入肽或蛋白质以增加聚糖相互作用抗体的细胞转染或改变聚糖相互作用抗体的生物分布(例如，通过靶向特定组织或细胞类型)。
细胞配制品
可以使用本发明的聚糖相互作用抗体组合物基于细胞的配制品来确保细胞转染(例如，在细胞载体中)或改变组合物的生物分布(例如，通过将细胞载体靶向特定组织或细胞类型)。
细胞转移方法
多种方法是本领域中已知的并且适合于将核酸或蛋白质(如聚糖相互作用抗体)引入细胞中，包括病毒和非病毒介导的技术。典型的非病毒介导的技术的例子包括但不限于电穿孔、磷酸钙介导的转移、核转染、声孔效应、热休克、磁转染、脂质体介导的转移、显微注射、微弹介导的转移(纳米颗粒)、阳离子聚合物介导的转移(DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇(PEG)等)或细胞融合。
声孔效应或细胞超声处理的技术是使用声音(例如，超声频率)修饰细胞质膜的渗透性。声孔效应方法是本领域技术人员已知的，并且用于体内递送核酸(Yoon和Park,Expert Opin Drug Deliv.2010 7:321-330；Postema和Gilja,Curr PharmBiotechnol.2007 8:355-361；Newman和Bettinger,Gene Ther.2007 14:465-475；所有文献都是通过引用以其整体并入本文)。声孔效应方法是本领域中已知的，并且例如还在美国专利公开案20100196983中被教示为其与细菌相关，并且在例如美国专利公开案20100009424中被教示为其与其他细胞类型相关，所述专利各自通过引用以其整体并入本文。
电穿孔技术也是本领域中所熟知的，并且用于在体内和在临床上递送核酸(Andre等人,Curr Gene Ther.2010 10:267-280；Chiarella等人,Curr Gene Ther.2010 10:281-286；Hojman,Curr Gene Ther.2010 10:128-138；所有文献都是通过引用以其整体并入本文)。在一个实施方案中，聚糖相互作用抗体可以通过电穿孔来递送。
给予和递送
本公开文本的组合物可以通过本领域中已知的任何标准方法或途径来给予。
本公开文本的聚糖相互作用抗体可以通过导致治疗有效结果的任何途径来给予。这些途径包括但不限于肠内、胃肠、硬膜上、口服、经皮、硬膜上(硬膜外)、大脑内(至大脑中)、脑室内(至大脑室中)、表皮(施加至皮肤上)、真皮内(至皮肤自身中)、皮下(皮肤下方)、鼻给予(经过鼻子)、静脉内(至静脉中)、动脉内(至动脉中)、肌内(至肌肉中)、心内(至心脏中)、骨内输注(至骨髓中)、鞘内(至椎管中)、腹膜内、(输注或注射至腹膜中)、膀胱内输注、玻璃体内(经过眼)、海绵窦内注射(至阴茎根部中)、阴道内给予、子宫内、羊膜外给予、经皮(经过完整皮肤扩散以供全身分布)、经粘膜(经过粘膜扩散)、吸入法(嗅吸法)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(至结膜上)或在滴耳剂中。在具体实施方案中，组合物可以以允许其越过血脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式来给予。本发明的聚糖相互作用抗体的非限制性给予途径描述于下文中。
肠胃外和可注射给予
用于口服和肠胃外给予的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆剂和/或酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可以包含本领域中常用的惰性稀释剂，如例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，以及其混合物。除了惰性稀释剂以外，口服组合物可以包括佐剂，如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在肠胃外给予的某些实施方案中，将组合物与增溶剂混合，所述增溶剂如醇、油、改性油、二醇、聚山梨酯、环糊精、聚合物和/或其组合。在其他实施方案中，包括表面活性剂，如羟丙基纤维素。
可以根据已知技术使用适宜分散剂、润湿剂和/或悬浮剂配制可注射制剂，例如，无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂可以是于无毒性肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如，呈1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂尤其是水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。常规采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。诸如油酸等脂肪酸可以用于可注射物的制备中。
可注射配制品可以例如通过以下方式来灭菌：经细菌截留过滤器过滤，和/或并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂，所述组合物可以在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。
为了延长活性成分的效应，通常需要减慢从皮下或肌内注射吸收活性成分。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。则药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶剂速率又可以取决于晶体粒度和结晶型。可替代地，肠胃外给予的药物形式的延迟吸收是通过将药物溶解或悬浮于油性媒介物中来完成。可注射储库形式是通过形成药物于生物可降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中的微囊基质中来制造。根据药物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库可注射配制品是通过将药物包裹于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
在一些实施方案中，可以静脉内给予本公开文本的组合物。可以通过静脉内推注进行给予。
直肠和阴道给予
用于直肠或阴道给予的组合物典型地是栓剂，其可以通过以下方式制备：将组合物与适宜非刺激性赋形剂混合，所述赋形剂如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，所述赋形剂在环境温度下是固体，但是在体温下是液体，并且因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性成分。
口服给予
用于口服给予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，将活性成分与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂混合，所述赋形剂如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或填充剂或膨胀剂(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)、粘合剂(例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)、保湿剂(例如，甘油)、崩解剂(例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)、溶液阻滞剂(例如，石蜡)、吸收加速剂(例如，季铵化合物)、润湿剂(例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)、吸收剂(例如，白陶土和皂粘土)和润滑剂(例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可以包含缓冲剂。
局部或经皮给予
如本文所述，可以配制含有本发明的聚糖相互作用抗体的组合物用于局部给予。皮肤可以是理想的递送靶位点，因为其易于到达。基因表达可能不仅受限于皮肤，从而潜在地避免非特异性毒性，而且受限于皮肤内的特定层和细胞类型。
所递送组合物的皮肤表达位点将取决于核酸递送的途径。一般考虑三种途径来将聚糖相互作用抗体递送至皮肤：(i)局部施加(例如，用于局部/区域性治疗和/或化妆应用)；(ii)真皮内注射(例如，用于局部/区域性治疗和/或化妆应用)；和(iii)全身递送(例如，用于治疗同时影响皮肤和皮肤外区域的皮肤病)。可以通过本领域中已知的若干种不同方法将聚糖相互作用抗体递送至皮肤。
在一个实施方案中，本发明提供多种敷料(例如，伤口敷料)或绷带(例如，胶布绷带)用于便捷地和/或有效地实施本发明的方法。典型地，敷料或绷带可以包含足量的本文所述的药物组合物和/或聚糖相互作用抗体以允许使用者对一个或多个受试者进行多次治疗。
在一个实施方案中，本发明提供要在多于一次注射中递送的包含聚糖相互作用抗体的组合物。
用于组合物的局部和/或经皮给予的剂型可以包括软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和/或贴剂。通常，将活性成分在无菌条件下与药学上可接受的赋形剂和/或任何所需的防腐剂和/或可能需要的缓冲液混合。
另外，本发明预期使用经皮贴剂，其通常具有提供将化合物受控递送至身体的附加优点。此类剂型可以例如通过将化合物溶解和/或分散于适当介质中来制备。可替代地，或另外，可以通过提供速率控制膜和/或通过将化合物分散于聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。
适于局部给予的配制品包括但不限于液体和/或半液体制剂，如搽剂、洗剂、水包油和/或油包水乳液，如乳膏、软膏剂和/或糊剂，和/或溶液和/或悬浮液。
可局部给予的配制品可以例如包含约1％至约10％(w/w)活性成分，但是活性成分的浓度可以高至所述活性成分在溶剂中的溶解度限值。用于局部给予的配制品可以进一步包含一种或多种本文所述的其他成分。
储库给予
如本文所述，在一些实施方案中，将本发明的组合物配制于储库中以供延长释放。通常，给予靶向特定器官或组织(“靶组织”)。
在本发明的一些方面中，聚糖相互作用抗体被空间保留在靶组织内或靶组织近端。提供将组合物提供至哺乳动物受试者的一个或多个靶组织的方法，其是通过使一个或多个靶组织(包含一个或多个靶细胞)与组合物在条件下接触，使得组合物(特别地组合物的一种或多种聚糖相互作用抗体组分)基本上保留在靶组织中来进行，意味着至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的组合物保留在靶组织中。有利地，保留是通过测量进入靶组织和/或细胞的组合物中存在的聚糖相互作用抗体的水平来确定。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的给予至受试者的聚糖相互作用抗体在给予后的时间段中存在于细胞内。例如，肌内注射至哺乳动物受试者是使用包含一种或多种聚糖相互作用抗体和转染试剂的水性组合物来进行，并且组合物的保留是通过测量肌肉细胞中存在的聚糖相互作用抗体的水平来确定。
本发明的某些方面涉及将组合物提供至哺乳动物受试者的靶组织的方法，其是通过使靶组织(含有一个或多个靶细胞)与组合物在条件下接触，使得组合物基本保留在靶组织中来进行。组合物含有有效量的聚糖相互作用抗体，使得在至少一个靶细胞中产生目的效应。组合物通常含有细胞渗透剂和药学上可接受的载体，但是也预期“裸”聚糖相互作用抗体(如不含细胞渗透剂或其他药剂的聚糖相互作用抗体)。
在一些实施方案中，组合物包括多种不同的聚糖相互作用抗体，其中一种或多于一种聚糖相互作用抗体靶向目的聚糖。任选地，组合物还含有细胞渗透剂以帮助组合物的细胞内递送。对靶向含于预定体积的靶组织内的极大部分细胞中的目的聚糖所需的组合物剂量做出决定(通常，不靶向与预定体积相邻的组织中的聚糖或靶组织远端组织中的聚糖)。在这个决定后，可以将所确定的剂量直接引入哺乳动物受试者的组织中。
在一个实施方案中，本发明提供要在多于一次注射中或通过分割剂量注射来递送的聚糖相互作用抗体。
肺给予
药物组合物可以以适于通过口腔进行肺给予的配制品来制备、包装和/或销售。此类配制品可以包含干燥颗粒，所述干燥颗粒进一步包含活性成分并且具有在约0.5nm至约7nm或约1nm至约6nm范围内的直径。此类组合物适宜地呈干粉剂形式，用于使用包含干粉剂储器的装置给予，可以将推进剂流引导至所述储器以分散粉剂，和/或使用自推进式溶剂/粉剂分散容器给予，如包含溶解和/或悬浮于密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置。此类粉剂包含颗粒，其中以重量计至少98％的颗粒具有大于0.5nm的直径，并且以数目计至少95％的颗粒具有小于7nm的直径。可替代地，以重量计至少95％的颗粒具有大于1nm的直径，并且以数目计至少90％的颗粒具有小于6nm的直径。干粉剂组合物可以包括固体细粉稀释剂，如糖，并且便捷地以单位剂量形式来提供。
低沸点推进剂通常包括沸点在大气压下低于65°F的液体推进剂。通常，推进剂可以构成组合物的50％至99.9％(w/w)，并且活性成分可以构成组合物的0.1％至20％(w/w)。推进剂可以进一步包含其他成分，如液体非离子型和/或固体阴离子型表面活性剂和/或固体稀释剂(其可以具有与包含活性成分的颗粒同阶的粒径)。
经配制用于肺递送的药物组合物可以提供呈溶液和/或悬浮液的微滴形式的活性成分。此类配制品可以作为包含活性成分的水性和/或稀醇性溶液和/或悬浮液(任选地无菌)来制备、包装和/或销售，并且可以便捷地使用任何喷雾和/或雾化装置来给予。此类配制品可以进一步包含一种或多种其他成分，包括但不限于调味剂(如糖精钠)、挥发性油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯)。通过这种给予途径提供的微滴可以具有在约0.1nm至约200nm范围内的平均直径。
鼻内、鼻和颊给予
本文中描述为可用于肺递送的配制品可用于鼻内递送药物组合物。另一种适于鼻内给予的配制品是包含活性成分并且具有约0.2μm至500μm的平均颗粒的粗粉剂。这种配制品是以采用鼻烟的方式来给予，即通过从保持靠近鼻子的粉剂容器经鼻道快速吸入来给予。
适于鼻给予的配制品可以例如包含大约少至0.1％(w/w)并且多至100％(w/w)的活性成分，并且可以包含一种或多种本文所述的其他成分。药物组合物可以以适于颊给予的配制品来制备、包装和/或销售。此类配制品可以例如呈使用常规方法制造的片剂和/或锭剂形式，并且可以例如包含0.1％至20％(w/w)的活性成分，剩余部分包含口服可溶解和/或可降解组合物以及任选地一种或多种本文所述的其他成分。可替代地，适于颊给予的配制品可以包含含有活性成分的粉剂和/或气溶胶化和/或雾化的溶液和/或悬浮液。此类粉化、气溶胶化和/或气溶胶化的配制品在分散时可以具有在约0.1nm至约200nm范围内的平均粒径和/或微滴大小，并且可以进一步包含一种或多种本文所述的任何其他成分。
眼或耳给予
药物组合物可以以适于眼或耳给予的配制品来制备、包装和/或销售。此类配制品可以例如呈眼或耳滴剂的形式，包括例如活性成分于水性或油性液体赋形剂中的0.1/1.0％(w/w)溶液和/或悬浮液。此类滴剂可以进一步包含缓冲剂、盐和/或一种或多种其他的本文所述的任何其他成分。可用的其他可眼给予的配制品包括包含呈微晶型和/或于脂质体制剂中的活性成分的那些。还可以使用视网膜下插入物作为给予形式。
有效负载给予
本文所述的聚糖相互作用抗体可以用于多种不同的场景中，其中需要将物质(“有效负载”)递送至生物靶标，例如递送可检测物质用于检测靶标，或者递送治疗剂或诊断剂。检测方法可以包括但不限于体外和体内成像方法二者，例如，免疫组织化学、生物发光成像(BLI)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)、电子显微镜检查、X射线计算机断层摄影术、拉曼成像(Raman imaging)、光学相干断层摄影术、吸收成像、热成像、荧光反射成像、荧光显微镜检查、荧光分子断层摄影术成像、核磁共振成像、X射线成像、超声成像、光声成像、实验室测定或者在需要加标签/染色/成像的任何情况中。
聚糖相互作用抗体可以设计为以任何有用取向包括接头和有效负载二者。例如，使用具有两端的接头，将一端附接至有效负载并将另一端附接至聚糖相互作用抗体。本发明的聚糖相互作用抗体可以包括多于一种有效负载以及可裂解接头。在另一个例子中，可以使用可以通过接头附接至聚糖相互作用抗体并且可以荧光标记的药物在体内(例如，在细胞内)跟踪药物。
其他例子包括但不限于将聚糖相互作用抗体用于可逆地药物递送至细胞中。
本文所述的聚糖相互作用抗体可以用于将有效负载(例如，可检测试剂或治疗剂)细胞内靶向至特定细胞器。另外，本文所述的聚糖相互作用抗体可以用于将治疗剂递送至例如活动物中的细胞或组织。例如，本文所述的聚糖相互作用抗体可以用于递送化学治疗剂以杀伤癌细胞。通过接头附接至治疗剂的聚糖相互作用抗体可以促进成员渗透，从而允许治疗剂移动至细胞中以到达细胞内靶标。
在一些实施方案中，有效负载可以是治疗剂，如细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂或其他治疗剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括可能对细胞有害的任何药剂。离子包括但不限于紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙啶、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、嘌罗霉素(puromycin)、类美登素(maytansinoid)(例如，美登醇(maytansinol)(参见美国专利号5,208,020，以其整体并入本文)、雷查霉素(rachelmycin)(CC-1065，参见美国专利号5,475,092、5,585,499和5,846,545，所有文献都是通过引用并入本文)以及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(例如，碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。其他治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷基化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thiotepa chlorambucil)、雷查霉素(CC-1065)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(前道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，放线菌素D(前放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱、长春碱、紫杉醇和类美登素)。在本发明的抗STn抗体的情况下，肿瘤杀伤可以通过毒素与此类抗STn抗体的缀合来加强。
在一些实施方案中，有效负载可以是可检测试剂，如各种有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光材料、发光材料(例如，鲁米诺(luminol))、生物发光材料(例如，萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白)、化学发光材料、放射性材料(例如，18F、67Ga、81mKr、82Rb、111In、123I、133Xe、201Tl、125I、35S、14C、3H或99mTc(例如，作为过锝酸盐(锝酸盐(VII)，TcO4-))和对比剂(例如，金(例如，金纳米颗粒)、钆(例如，螯合Gd)、氧化铁(例如，超顺磁性氧化铁(SPIO)、单晶氧化铁纳米颗粒(MION)和超小超顺磁性氧化铁(USPIO))、锰螯合物(例如，Mn-DPDP)、硫酸钡、碘化造影剂(碘海醇(iohexol))、微泡或全氟碳)。此类光学可检测标记包括例如但不限于4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸根合均二苯乙烯-2,2'二磺酸；吖啶和衍生物(例如，吖啶和吖啶异硫氰酸酯)；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸酯；N-(4-苯胺基-l-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄(Brilliant Yellow)；香豆素和衍生物(例如，香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)和7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))；酞菁染料；焰红染料；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5'5"-二溴焦没食子酚-磺基萘(溴焦酚红)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸根合二氢-均二苯乙烯-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸根合均二苯乙烯-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]-萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物(例如，曙红和曙红异硫氰酸酯)；赤藓红和衍生物(例如，赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯)；胡米胺；荧光素和衍生物(例如，5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、X-罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯(QFITC或XRITC)和荧光胺)；2-[2-[3-[[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(3-磺丙基)-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]亚乙基]-2-[4-(乙氧基羰基)-1-哌嗪基]-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-1,1-二甲基-3-(3-磺丙基)-1H-苯并[e]吲哚鎓氢氧化物，内盐，与n,n-二乙基乙胺的复合物(1:1)(IR144)；5-氯-2-[2-[3-[(5-氯-3-乙基-2(3H)-苯并噻唑-亚基)亚乙基]-2-(二苯基氨基)-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-3-乙基苯并噻唑鎓高氯酸盐(IR140)；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物(例如，芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-芘)；丁酸酯量子点；反应红4(CIBACRONTM亮红3B-A)；罗丹明和衍生物(例如，6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯若丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N',N'四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))；核黄素；玫红酸；铽螯合物衍生物；酞菁-3(Cy3)；酞菁-5(Cy5)；酞菁-5.5(Cy5.5),酞菁-7(Cy7)；IRD 700；IRD 800；Alexa 647；La Jolta Blue；酞化青；和萘酞菁。
在一些实施方案中，可检测试剂可以是不可检测的前体，其在激活后变得可检测(例如，荧光四嗪-荧光团构建体(例如，四嗪-BODIPY FL、四嗪-俄勒冈绿488或四嗪-BODIPYTMR-X)酶可激活的荧光剂[例如，(VisEn Medical)]。可以使用酶标记组合物的体外测定包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀测定、免疫荧光法、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和蛋白质印迹分析。
组合
聚糖相互作用抗体可以与一种或多种其他治疗、预防、诊断或成像药剂组合使用。“与……组合”并不旨在暗示所述药剂必须同时给予和/或经配制以供一起递送，但是这些递送方法在本公开文本的范围内。组合物可以与一种或多种其他所需治疗剂或医疗程序并行给予，或者在所述治疗剂或医疗程序之前或之后给予。通常，每种药剂将以针对所述药剂确定的剂量和/或时间表来给予。在一些实施方案中，本公开文本涵盖递送药物、预防、诊断和/或成像组合物，所述组合物与可以改善其生物利用度、降低和/或修改其代谢、抑制其排泄和/或修改其在体内的分布的药剂组合。
在一些实施方案中，聚糖相互作用抗体可以与一种或多种癌症治疗剂组合使用，如化学治疗剂、治疗性抗体和/或细胞周期抑制剂。将聚糖相互作用抗体治疗与此类癌症治疗剂组合可以提供有益的治疗特性，例如协同抗肿瘤活性，并且可以用于治疗癌症。在一些情况下，此类方法可以用于靶向对化学疗法、抗体疗法和/或细胞周期抑制剂治疗有抗性的癌细胞。靶向药物抗性癌细胞的方法可以利用在化学疗法、抗体疗法和/或细胞周期抑制剂治疗后发生的癌细胞中STn表达的变化。在一些情况下，药物抗性癌细胞在治疗之前和/或之后表达STn。在一些情况下，药物抗性癌细胞中的细胞表面STn表达在治疗后可能增加。在治疗后，一些癌细胞可能增殖，产生对所用的一种或多种癌症治疗剂有抗性的表达STn的癌细胞群体。在一些情况下，药物抗性癌细胞是癌症干细胞。
因此，本发明的方法可以包括将抗STn抗体给予至受试者以靶向在给予一种或多种癌症治疗剂后存在的表达STn的癌细胞的方法。此类抗STn抗体可以包括具有选自SEQ IDNO:1-12中任一个的氨基酸序列的可变结构域。用抗STn抗体治疗的受试者和/或受试者中的癌性组织可能经历STn阳性细胞的减少。在一些实施方案中，所述减少可以包括STn阳性细胞减少约10％至约大于90％(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少90％)。
在一些实施方案中，与抗STn抗体组合使用的化学治疗剂可以包括但不限于紫杉烷(例如，紫杉醇和多西他赛)、基于铂的药剂(例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂)、拓扑异构酶抑制剂(例如，伊立替康)、核苷酸类似物(例如，5-氟尿嘧啶和吉西他滨)、激酶抑制剂[例如，普纳替尼和索拉非尼]和PARP抑制剂[例如，奥拉帕尼(LYNPARZATM)]。化学治疗剂可以通过包括但不限于抑制微管功能、酶功能或DNA合成的机制来引起细胞死亡或防止细胞生长。
在一些实施方案中，与抗STn抗体组合使用的治疗性抗体可以包括靶向癌细胞表面受体的抗体。在对细胞增殖和/或迁移重要的细胞信号传导途径中可能涉及此类表面受体。在一些情况下，表面受体可以是表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)或人表皮生长因子受体(HER)。靶向这些受体的抗体或相关因子可以抑制癌细胞生长和/或迁移。示例性抗EGFR抗体包括西妥昔单抗和帕尼单抗示例性抗VEGF抗体包括贝伐珠单抗和雷莫芦单抗示例性抗HER2抗体包括曲妥珠单抗其中，西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐珠单抗和雷莫芦单抗是FDA批准用于治疗结直肠癌的抗体。
在一些实施方案中，细胞周期抑制剂可以与抗STn抗体治疗组合使用。细胞周期抑制剂可以包括但不限于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂、检查点激酶抑制剂、Polo样激酶(PLK)抑制剂和Aurora激酶抑制剂。如本文所用，术语“细胞周期抑制剂”是指减慢或停止细胞周期进程的任何药剂。细胞周期抑制剂可以诱导细胞周期停滞在不同阶段，并且可以导致细胞死亡和/或生长抑制。
在一些实施方案中，细胞周期抑制剂可以是CDK抑制剂。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是一组丝氨酸/苏氨酸激酶。CDK和其细胞周期蛋白配偶体是驱动细胞周期转换的关键调控酶。其中，CDK4和CDK6是从G0或G1期转换至S期的关键驱动者。CDK4和CDK6(在本文中被称为CDK4/6)是以组织特异性方式表达的紧密同系物。CDK4/6与细胞周期蛋白D形成复合物并磷酸化视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白。Rb磷酸化减弱其对E2F转录因子的抑制，所述E2F转录因子导致编码DNA复制所需蛋白质的基因的转录。这可以允许细胞进入S期。整个S期中的进展受细胞周期蛋白E-CDK2和细胞周期蛋白A-CDK2复合物控制。从G2期转换至M期是由CDK1通过与细胞周期蛋白配偶体、细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白B的相互作用来调控。靶向CDK(一般或特定CDK)的治疗剂可以阻碍细胞周期进展并防止细胞增殖。参见Otto和Sicinski,Nat Rev Cancer.2017；17(2):93-115；和Asghar等人,Nat Rev DrugDiscov.2015；14(2):130–146；所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些情况下，CDK抑制剂可以是选择性CDK4/6抑制剂。由于CDK4/6在G1至S转换中的作用，抑制CDK4/6引起细胞周期停滞在G1期中。示例性CDK4/6抑制剂包括但不限于帕博西尼(Pfizer)、瑞博西尼(Novartis)和阿贝西尼(Eli Lilly)。帕博西尼(PD-0332991，)是已批准用于治疗晚期(转移性)乳腺癌的药物(Finn等人,Breast CancerRes.2009；11(5):R77；Rocca等人,Expert Opin Pharmacother.2014；15(3):407-20；美国专利号6,936,612；7,863,278；7,208,489；和7,456,168，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。帕博西尼可以根据美国专利号7,345,171中披露的方法来制备和表征，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文。类似地，瑞博西尼(LEE011)还以高效能选择性抑制CDK4/6。瑞博西尼和瑞博西尼的药学上可接受的盐可以根据美国专利号8,685,980和9,193,732中详述的方法来制备，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文。阿贝西尼(LY-2835219)不仅抑制CDK4和CDK6，而且抑制若干种其他激酶，包括PIM1(美国专利号7,855,211，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在肺癌、卵巢癌和黑色素瘤患者中报道阿贝西尼的早期活性(Shapiro等人,ASCO会议摘要2013；31:2500)。
在一些情况下，CDK抑制剂可以是泛CDK抑制剂。此类抑制剂可以阻断若干种CDK并导致细胞周期停滞在不同阶段，如G1停滞、G2停滞和/或G2/M停滞。示例性泛CDK抑制剂包括但不限于夫拉平度(flavopiridol)(阿伏昔地(alvocidib))、迪那西利(dinaciclib)(MK-7965)、R-罗可韦汀(R-roscovitine)、AT7519、密西克利(milciclib)、TG02、CYC065和RGB-286638。例如，泛CDK抑制剂可以是半合成的夫拉平度(例如，参见美国专利号4,900,727)或夫拉平度的类似物(例如，参见美国专利号5,733,920和5,849,733，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。作为另一个例子，泛CDK抑制剂可以是迪那西利或其药学上可接受的盐，如美国专利号7,119,200中所披露，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，与聚糖相互作用抗体组合使用的细胞周期抑制剂可以是检查点激酶抑制剂。对检查点激酶(例如，CHK1、CHK2或WEE1)的抑制可能损害细胞周期检查点(例如，S检查点、G2/M检查点或有丝分裂纺锤体组装检查点)，从而使细胞周期即使在DNA损伤存在下也能进展。这可以在有丝分裂期间通过称为“有丝分裂灾变”的机制触发细胞死亡。示例性检查点激酶抑制剂包括但不限于MK-8776、prexasertib(LY2606368)、AZD1775、GDC-0575和以下文献中所述的那些：Visconti等人J Exp Clin Cancer Res.2016；35:153，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，细胞周期抑制剂可以是Polo样激酶(PLK)抑制剂。Polo样激酶(PLK)是细胞周期的调控性丝氨酸/苏氨酸激酶。PLK1是PLK家族的最具特征的成员，并且其是关键的有丝分裂蛋白激酶，其参与许多调控事件，如G2/M转换、纺锤体组装成熟、染色体分离和有丝分裂退出。示例性PLK1抑制剂包括但不限于瑞格塞替(rigosertib)(ON01910.Na)、伏拉塞替(volasertib)(BI 6727)、BI 2536、HMN-176、TKM-080301、NMS-P937、DAP-81、环巴林1(Cyclopalin 1)、ZK-噻唑烷酮(TAL)、SBE13、COM-36、LFM-A13、双岐藻素(scytonemin)、渥曼青霉素(wortmannin)和GSK461364A(Kumar和Kim,Biomed ResInt.2015；2015:705745，其内容通过引用以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，细胞周期抑制剂可以是Aurora激酶抑制剂。Aurora激酶包括高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶的家族，其对于整个有丝分裂期间的忠实转换是重要的。Aurora A在多个有丝分裂事件中具有关键作用，包括中心体成熟、染色体排列、纺锤体组装、减数分裂成熟和胞质分裂。Aurora B是染色体乘客复合物的组分并且牵涉在染色体凝集和取向以及胞质分裂的正确执行中。示例性Aurora激酶抑制剂包括巴拉塞替(barasertib)(AZD1152)、阿立塞替(alisertib)(MLN8237)、达努塞替(danusertib)(PHA-739358)、ENMD-2076、AT9283、PF-03814735和AMG 900(Bavetsias和Linardopoulos,FrontOncol.2015；5:278，上述文献的内容通过引用以其整体并入本文)。
剂量
本公开文本涵盖通过任何适当途径进行的用于治疗、药物、诊断或成像中的任一种的聚糖相互作用抗体的递送，考虑到药物递送科学中的可能进展。递送可以是裸递送或经配制递送。
裸递送
可以将本发明的聚糖相互作用抗体以裸形式递送至细胞、组织、器官或生物体。如本文所用，术语“裸的”是指所递送的聚糖相互作用抗体不含促进转染或渗透性的试剂或修饰。可以使用本领域中已知以及本文所述的给予途径将裸聚糖相互作用抗体递送至细胞、组织、器官和/或生物体。裸递送可以包括配制于简单缓冲液中，如盐水或PBS。
经配制递送
本发明的聚糖相互作用抗体可以使用本文所述方法来配制。配制品可以包含可以经修饰和/或未经修饰的聚糖相互作用抗体。配制品可以进一步包括但不限于细胞渗透剂、药学上可接受的载体、递送剂、生物蚀解或生物相容性聚合物、溶剂和持续释放递送储库。可以使用本领域中已知以及本文所述的给予途径将经配制聚糖相互作用抗体递送至细胞。
组合物也可以进行配制用于以本领域中若干种方式中的任一种直接递送至器官或组织，所述方式包括但不限于直接浸泡或浸浴，经过导管，通过凝胶、粉剂、软膏剂、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂，通过使用以组合物包被或浸渍的诸如织物或生物可降解材料等基质等。
给药
本发明提供包含将根据本发明的一种或多种聚糖相互作用抗体给予至有需要的受试者的方法。可以使用有效用于疾病、障碍和/或病症的预防、治疗、诊断或成像的任一量和任一给予途径将编码聚糖相互作用抗体的核酸、包含聚糖相互作用抗体的蛋白质或复合物、或其药物、成像、诊断或预防组合物给予至受试者。所需要的准确剂量将随受试者而改变，根据受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重性、特定组合物、其给予方式、其活性模式等。根据本发明的组合物典型地以剂量单位形式来配制，以便于给予和剂量的一致性。然而，应理解，本发明的组合物的总日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任一特定患者的具体治疗有效的剂量水平、预防有效的剂量水平或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和所述障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；所采用具体化合物的给予时间、给予途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中熟知的类似因素。
在一些实施方案中，本公开文本的化合物(例如，抗STn抗体)可以作为组合物的一部分来给予，其中组合物包括约0.01mg/ml至约1mg/ml、约0.1mg/ml至约5mg/ml、约0.5mg/ml至约10mg/ml、约2mg/ml至约20mg/ml或约5mg/ml至约50mg/ml的此类化合物的浓度。
在一些实施方案中，组合物可以以约0.01ml/kg至约1ml/kg、约0.2ml/kg至约1.2ml/kg、约0.05ml/kg至约2ml/kg、约0.1ml/kg至约3ml/kg、约0.5ml/kg至约5ml/kg、约2ml/kg至约10ml/kg或约5ml/kg至约20ml/kg的每受试者体重的体积来给予。给予可以通过静脉内给予(例如，静脉内推注)来进行。
在某些实施方案中，本公开文本的化合物或组合物可以以足以递送约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约6mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约20mg/kg或约10mg/kg至约200mg/kg的每受试者体重的活性化合物(例如，抗STn抗体或化学治疗剂)的量的剂量水平来给予。可以一天实施一次或多次给予，以获得所需的治疗、诊断、预防或成像效应。所需剂量可以根据任何剂量时间表来递送，包括但不限于一天三次、一天两次、一天一次、每隔一天、每隔两天、每周、每两周、每三周、或每四周、每两个月、每三个月、每四个月、每5个月、每6个月、或每年。在某些实施方案中，所需剂量可以使用多次给予(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多次给予)来递送。
根据本发明，聚糖相互作用抗体可以以分割剂量方案来给予。如本文所用，“分割剂量”是将单一单位剂量或总日剂量分为两个或更多个剂量，例如，单一单位剂量的两次或更多次给予。如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/以一次/单一途径/单一接触点(即，单一给予事件)给予的任何治疗药的剂量。如本文所用，“总日剂量”是在24小时时段中给予或规定的量。其可以作为单一单位剂量给予。在一个实施方案中，将本发明的聚糖相互作用抗体以分割剂量给予至受试者。可以将聚糖相互作用抗体仅在缓冲液中配制，或者在本文所述的配制品中配制。可以将包含如本文所述的聚糖相互作用抗体的药物组合物配制为本文所述的剂型，如局部、鼻内、气管内或可注射(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、心内、腹膜内或皮下)剂型。药物试剂的配制和/或制造中的一般考虑可以发现于例如以下文献：Remington:The Science and Practice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过引用并入本文)。
包衣或壳
片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以经制备具有包衣和壳，如肠溶包衣和药物配制领域中熟知的其他包衣。它们可以任选地包含遮光剂，并且可以具有如下的组成，即它们仅在或优先在肠道的某一部分中任选地以延迟方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。可以使用类似类型的固体组合物作为填充剂用于使用诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软填充和硬填充明胶胶囊中。
IV.试剂盒和装置
试剂盒
本文所述的任何组合物可以包括于试剂盒中。在非限制性例子中，包括抗原分子在内的用于产生聚糖相互作用抗体的试剂包括于试剂盒中。试剂盒可以进一步包括用于产生或合成聚糖相互作用抗体的试剂或说明书。其还可以包括一种或多种缓冲液。本发明的其他试剂盒可以包括用于制造聚糖相互作用抗体蛋白或核酸阵列或文库的组分，并且因此可以包括例如固体支持物。
在一些实施方案中，本公开文本包括用于筛选、监测和/或诊断受试者的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种聚糖相互作用抗体。此类试剂盒可以单独使用或与一种或多种筛选、监测和/或诊断的其他方法组合使用(例如，作为伴随诊断)。一些试剂盒包括以下中的一种或多种：缓冲液、生物标准品、二级抗体、检测试剂和用于样品预处理(例如，用于抗原修复、阻断等)的组合物。
试剂盒的组分可以包装于水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器工具通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器工具，可以将组分置入其中，并且优选地适当等分。如果试剂盒中存在多于一种组分(标记试剂与标记可以包装在一起)，试剂盒通常还将含有第二、第三或其他额外容器，可以将所述额外组分分别置入其中。试剂盒还可以包含第二容器工具，用于含有无菌的药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂。然而，组分的各种组合可以包含于小瓶中。本发明的试剂盒还将典型地包括含有聚糖相互作用抗体(例如，蛋白质、核酸)的工具，以及处于封闭限制中的任何其他试剂容器用于商业销售。此类容器可以包括注塑成型或吹塑成型的塑料容器，将所需小瓶保持于其中。
当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水溶液，并且无菌水溶液是特别优选的。然而，试剂盒的组分可以作为一种或多种干粉剂来提供。在试剂和/或组分是作为干粉剂来提供时，所述粉剂可以通过添加适宜溶剂来重构。设想，还可以在另一容器工具中提供溶剂。在一些实施方案中，标记染料是作为干粉剂来提供。预期在本发明的试剂盒中提供10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微克或至少1000微克或至多10g干燥染料。然后可以将染料重悬浮于任何适宜溶剂(如DMSO)中。
试剂盒还可以包括采用试剂盒组分的说明书，任何其他实际的使用不包括于试剂盒中。说明书可以包括可以实现的变化。
装置
本文所述的任何组合物可以与装置组合，包被到装置上或包埋于装置中。装置包括但不限于牙植入物、支架、骨替代物、人工关节、瓣膜、起搏器或其他可植入的治疗装置。
V.等效物和范围
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定根据本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效物。本发明的范围并不旨在受限于上述说明，而是如所附的权利要求书中所述。
在权利要求书中，除非上下文明确指示相反或其他含义，否则诸如“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”等冠词可以意指一个或多于一个。除非上下文明确指示相反或其他含义，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、用于或以其他方式相关于给定产物或工艺，则包括一组的一个或多个成员之间的“或”的权利要求或说明被视为满意的。本发明包括其中确切地一个组成员存在于、用于或以其他方式相关于给定产物或工艺的实施方案。本发明包括其中多于一个或全部组成员存在于、用于或以其他方式相关于给定产物或工艺的实施方案。
还应注意，术语“包含”旨在是开放式的并且允许但不需要包括其他元件或步骤。在在本文中使用术语“包含”时，由此也涵盖并公开术语“由……组成”。
在给出范围时，包括端点。此外，应理解，除非根据上下文和本领域普通技术人员的理解另有指示或有其他明确含义，否则在本发明的不同实施方案中，表示为范围的值可以假定所述范围内的任何具体值或子范围，除非上下文明确另有指示，否则精确至所述范围的下限的单位的小数点后一位。
另外，应理解，落在现有技术内的本发明的任何特定实施方案可以明确地从任何一项或多项权利要求排除。由于认为此类实施方案是本领域普通技术人员已知的，即使本文中没有明确陈述排除，也可以将其排除。本发明的组合物的任何特定实施方案(例如，任何核酸或由其编码的蛋白质；任何产生方法；任何使用方法等)可以因任何原因从任何一项或多项权利要求排除，不论是否与现有技术的存在相关。
即使在引文中没有明确陈述，所有引用的来源(例如，本文所引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术)都是通过引用并入本申请。在所引用来源的陈述与本申请冲突的情况下，应以本申请中的陈述为准。
章节和表格的标题并不旨在为限制性的。
实施例
实施例1.聚糖阵列分析
在单一实验中利用优化的聚糖阵列测试抗体对多种聚糖的亲和性和特异性。聚糖阵列包括71种化学合成的且明确定义的聚糖，其中大多数是Neu5Ac和Neu5Gc聚糖对。阵列载玻片是商业购得的(ArrayIt Corp,森尼维耳，加利福尼亚州)并且包括表4中所列的聚糖。
表4.阵列聚糖
300ml环氧封闭缓冲液是通过将15ml的2M Tris缓冲液(pH 8)与0.9ml的16.6M乙醇胺和284.1ml蒸馏水合并来制备。用HCl使溶液达到9.0的最终pH。使用0.2μM硝酸纤维素膜过滤溶液。将环氧缓冲溶液以及1L蒸馏水预加热至50℃。将玻璃载玻片安排在载玻片支架中并快速浸没于含有已加热的环氧封闭缓冲液的染色缸中。将载玻片在环氧封闭缓冲液中在50℃下孵育1小时，并定期振荡以使环氧结合位点失活。之后，冲洗载玻片并用含有1％OVA的PBS在25℃下封闭1小时。将含有多克隆抗体(1:1000)或纯化单克隆抗体(1ug/mL)的血清样品稀释于含有1％OVA的PBS中，并添加至聚糖阵列在25℃下保持1小时。在充分洗涤后，通过将聚糖微阵列载玻片与Cy3缀合的抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch，西格(West Grove)，宾夕法尼亚州)一起孵育1小时来检测抗体的结合。然后充分洗涤载玻片，干燥并用Genepix 4000B扫描仪(激光为100％；增益为350；10μm像素)扫描。使用Genepix软件从所扫描的图像提取原始数据，并对原始数据进行分析。如果抗体证明与两种分子的结合，但是不与Tn或阵列上的任何其他聚糖结合，则认为抗体对AcSTn和GcSTn具有高度特异性。
给予阵列分析，根据阵列聚糖结合谱对抗体进行分类。如果抗体结合至聚糖5、6、23和24，则将抗体分类为能够结合AcSTn和GcSTn的“第1组”抗体。由于此类抗体与较广范围的STn结构和图1A中最大椭圆形指示的STn部分缔合的能力，将此类抗体称为泛STn抗体。如果抗体结合至聚糖5、6、23、24、27和31，则将抗体分类为能够结合STn以及一些相关结构(包括与丝氨酸或苏氨酸的O连接)的“第2组”抗体。认为这些抗体与图1B中的最大椭圆形指示的STn部分缔合。相对于具有GcSTn的结构，一些第2组抗体优选地结合至具有AcSTn的结构。如果抗体结合聚糖5、6、23、24、17、3、19、37、27和31，则将抗体分类为“第3组”抗体(能够结合STn，但是还可以结合较宽集合的相关结构)。与第2组抗体不同，第3组抗体不需要此类结构具有与丝氨酸或苏氨酸的O-连接。认为第3组抗体与图1C中的最大椭圆形指示的STn部分缔合。最后，如果抗体结合至聚糖5、6、23、24和47，则抗体是能够结合至AcSTn和GcSTn二者以及未唾液酸化的Tn抗原(因此具有较宽特异性)的“第4组”抗体。认为第4组抗体与图1D中的最大椭圆形指示的STn部分缔合。
实施例2.小鼠抗STn抗体的产生
mSIA101和mSIA102抗体是使用来自抗STn单克隆抗体的可变结构域产生的，所述抗STn单克隆抗体是如美国公开号US2016/0130356(所述文献的内容通过引用以其整体并入本文)中先前所述通过使用粘蛋白进行鼠类免疫获得的。mSIA103可变结构域序列是从3F1 IgG1抗体(SBH Biosciences，纳蒂克，马萨诸塞州)获得的。IgG2a表达载体构建体(用于抗体重链的质粒H1206和用于抗体轻链的质粒L1206，LakePharma，贝尔蒙特，加利福尼亚州)被修饰以编码IgG2a恒定区上游的mSIA101、mSIA102和mSIA103可变结构域。所表达的结构域序列呈现于表5中。
表5.IgG2a抗体产生中所利用的序列
将编码全长重链氨基酸序列的质粒和编码全长轻链氨基酸序列的质粒转染至细胞中并表达，以产生成熟抗体。
转染中国仓鼠卵巢-K1(CHO-K1)细胞用于产生表达IgG2a抗体的稳定细胞系。将细胞在增湿的5％CO2孵育器中在37℃下在补充有L-谷氨酰胺的化学成分确定的培养基(CD-CHO,Invitrogen,卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中培养。
将大约8千万个在对数期中生长的悬浮CHO细胞通过电穿孔(MaxCyte)用80μg编码全长重链和轻链的总质粒转染。24小时后，将经转染细胞置于针对抗体基因的稳定整合的选择下。在选择过程期间，每2-3天将细胞旋转沉降并重悬浮于新鲜的选择培养基中，直至池恢复其生长速率和生存力为止。监测细胞的生长、滴度以及抗体表达构建体的稳定整合。倍增速率是20小时。
培养稳定细胞系用于大规模生产，并产生10L培养物。通过离心和0.2μm膜过滤澄清从稳定细胞池生产运行收获的条件化培养基。将抗体使用蛋白A亲和色谱纯化，然后通过经过0.2μm膜过滤器灭菌并清除微粒。在低内毒素纯化和过滤后，将浓度设定为5mg/mL，并回收120mg抗体。
为了制备抗体-药物缀合物(ADC)，将抗体与单甲基澳瑞他汀E(MMAE)缀合。这是通过使抗体与马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲氧基羰基-单甲基澳瑞他汀E(MC-vc-PAB-MMAE，在本文中称为CL-MMAE)接触来实施。所得缀合是基于马来酰亚胺-半胱氨酸的，其中用TCEP还原抗体链间二硫键，并且之后连接至药物的马来酰亚胺部分。
将缀合抗体在Sephadex G50柱上除盐以去除残余的非反应性毒素，并且之后在含有150mM NaCl的30mM HEPES pH 7.7中透析。使用尺寸排阻色谱(SEC)和疏水相互作用色谱(HIC)确定药物与抗体的比率(DAR)。
实施例3.小鼠抗体和ADC的表征
在乳腺癌、结肠癌和卵巢癌模型中表征小鼠抗体的体外和体内功效。使用抗体鉴定在表面上表达STn的CRC细胞系。将5种CRC系在体外孵育并生长至融合。通过流式细胞术使用抗STn抗体确定STn表达％。大约30％-70％的所培养SW403、COLO205和LS174T细胞在表面上天然地表达STn(如使用mSIA103检测)，而HT29和RKO在其细胞表面上具有极少至无的可检测STn(如使用hSIA101检测)(参见表6)。
表6.CRC系中的STn表达
细胞系 STn表达％
COLO205 67.7
LS174T 69.9
SW403 30.0
RKO 低至不可检测
HT29 低至不可检测
另外，将CRC组织微阵列(TMA)(NBP2-30214；Novus Bio，利特尔顿，科罗拉多州))针对STn表达染色。所述阵列由59个用和未用神经氨酸酶(唾液酸酶)酶处理的核心组成。神经氨酸酶特异性裂解末端唾液酸并破坏组织上存在的STn抗原。在TMA上的51个赘瘤核心中，45个证明某一水平的阳性膜染色，所有45个上使用抗STn mSIA103的染色都用250mU/mL神经氨酸酶处理消除。使用波形蛋白特异性抗体的染色不受影响，表明mSIA103抗STn抗体结合具有唾液酸特异性。正常结肠(8个核心)上的染色受限于隐窝和表面粘膜层，以及细胞顶面上，所述细胞应免受静脉内给予的ADC治疗剂的影响。
使用COLO205细胞进行初步异种移植研究，以评价小鼠抗体-药物缀合物(ADC)的体内功效。COLO205皮下异种移植模型是通过将5x 106个细胞/小鼠注射至无胸腺裸小鼠的右侧腹中来产生。在肿瘤达到180mm3的平均大小时开始治疗。对小鼠以5mg/kg每周一次给药，持续三周。研究中评价无毒素的单独的mSIA103、mSIA103-CL-MMAE、使用不可裂解接头与单甲基澳瑞他汀F(MMAF)缀合的mSIA103和媒介物对照。mSIA103-CL-MMAE证明显著肿瘤生长抑制，与另外三组相比，具有44.5％的治疗与对照(T/C)的比率(p＝0.008)。
实施例4.人源化抗STn抗体的产生
mSIA101、mSIA102和mSIA103可变结构域的人源化形式是通过将CDR并入人种系序列中来制备，这个过程被称为“CDR移植”。所得可变结构域用于通过表达编码人源化可变结构域和人IgG1恒定结构域的构建体来制备人源化抗体hSIA101、hSIA102和hSIA103。所表达抗体可变结构域和恒定结构域的序列呈现于表7中。
表7.人源化可变结构域
使用与先前对于鼠类抗体所述相同的方法来进行与MMAE的人源化抗体-药物缀合物(ADC)的制备。
实施例5.人源化抗体的表征
使如上所述制备的人源化IgG1抗体经历表征分析，包括基于流式细胞术的与MDA-MB-231-STn细胞的结合分析；通过BSM ELISA进行的结合分析；和聚糖阵列分析。
在基于流式细胞术的结合研究中，在0至300nM的浓度范围中筛选抗体，比较与具有或不具有转染诱导的STn表达的MDA-MB-231细胞的结合。使用抗人APC缀合的二级抗体确定结合，并且仅考虑活细胞(基于碘化丙啶负向选通)。平均每个样品收集5,000个事件。使用FlowJo软件(阿瑟兰，俄勒冈州)分析数据，并获得所得APC平均值和APC％。对这些数据进行对数转换，之后拟合至非线性回归模型，以获得剂量反应曲线和半最大有效浓度(EC50)结合信息。使用人同种型IgG1抗体作为同种型阴性对照。使用表皮生长因子受体(LA22，EMDMillipore，比勒利卡，马萨诸塞州)作为阳性对照。
对于BSM ELISA分析，在牛颌下腺粘蛋白(BSM)包被的孔上在0至100nM的浓度范围内中筛选抗体。用温和高碘酸盐溶液处理孔的子集，之后引入抗体以去除末端唾液酸残基上的侧链(破坏STn抗原)。确定高碘酸盐和非高碘酸盐处理的孔的光学密度并进行对数转换，之后拟合至非线性回归模型以获得剂量反应曲线。从非高碘酸盐处理的孔减去从高碘酸盐处理的孔获得的光学密度值，以获得高碘酸盐敏感性STn结合曲线和相应的EC50值。
如先前所述实施聚糖阵列分析，并基于这些结果向抗体分配阵列聚糖结合谱。
来自流式细胞术、ELISA和聚糖阵列分析的结果呈现于表8中。
表8.抗体表征结果
所测试的所有抗体都证明与细胞相关STn和与BSM相关STn的结合。使用人IgG1同种型对照(Southern Biotech，伯明翰，亚拉巴马州)未观察到结合。在ELISA测定中，hSIA102结合对高碘酸盐不敏感，因此无法通过BSM ELISA确定可靠的EC50。
实施例6.人源化抗体-药物缀合物的分析
在使用MDA-MB-231细胞(亲代或转染用于增强STn的表达)的ADC细胞毒性测定中评估hSIA101、hSIA102和hSIA103的MMAE缀合的ADC形式。使亲代细胞在补充有10％FBS、1xPen/Strep和45μg/mL庆大霉素的伊格尔最低基础培养基(EMEM)中生长。使STn阳性细胞在相同培养基中生长，但是添加1mg/mL G418用于抗生素选择。使用上述适当培养基将细胞分别地(亲代细胞是4,000个细胞/孔，或STn阳性细胞是2,000个细胞/孔)接种于96孔板中。使细胞生长过夜。在16-20小时后，将细胞用变化浓度的测试抗体以一式三份(50nM至0.012nM)处理72小时。然后，使用ADC发光细胞生存力测定试剂盒(Promega，麦迪逊，威斯康星州)分析细胞，以确定所存在的ATP的量，所述ATP是代谢活性细胞的指示物。所述测定使用单一试剂，将其直接添加至补充有血清的培养基中的所培养细胞。所述试剂裂解细胞并产生与存在的ATP的量成比例的发光信号。分析发光信号并用于基于以半最大水平杀伤STn阳性细胞所需的浓度计算所用每种抗体的半最大抑制浓度(IC50)值(参见表9)。
表9.人源化ADC抗体的IC50值
人源化抗体 IC50(nM)
hSIA103 1.3
hSIA102 2.6
hSIA101 5.2
所测试的所有抗体都证明在单一纳摩尔范围内的IC50值，指示每种抗体杀伤表达STn的细胞的强能力。
使用培养中的OVCAR3细胞实施类似研究。使用5pM至约300nM的hSIA101-MMAE和hSIA102-MMAE的剂量，产生hSIA101-MMAE的29nM的IC50值和hSIA102-MMAE的15nM的IC50值。
实施例7.STn测定
研发ELISA测定以对受试者样品中的STn水平进行鉴定并定量。使用高度唾液酸化的牛颌下腺粘蛋白(BSM)产生标准曲线并帮助进行测定优化。在初始测定中，使用市售小鼠抗STn抗体[例如，抗体3F1(SBH Sciences，纳蒂克，马萨诸塞州)、抗体B72.3(参见Colcher,D.等人,1981.PNAS.78(5):3199-203)和抗体CC49(参见Muraro,R.等人,1988.CancerRes.48:4588-96)]包被测定板并捕获所测试样品(添加有BSM的经缓冲溶液或血清样品)中的BSM。使用人源化抗STn抗体(例如，hSIA101、hSIA102和hSIA103)检测所捕获的BSM。通过两种方法测试用于捕获和检测的抗体。一种是在夹心ELISA测定中测试成对匹配。第二种是通过使用荧光抗体标记和改变暴露于表达STn的细胞的顺序进行针对竞争结合的流式细胞术。使用没有竞争性结合的抗体对进行进一步测定研发。
进一步测定利用抗STn抗体作为结合至测定板的捕获抗体，并利用物种特异性检测抗体检测所结合的蛋白质。例如，如果直接标记(例如，Alexa-488、HRP等)检测mAb，则可以利用人抗STn mAb作为包被和检测mAb两种情况。例如，如果直接标记(例如，Alexa-488、HRP等)检测mAb，则可以利用鼠类抗STn mAb作为包被和检测mAb两种情况。用鼠类和人检测抗体二者评估对小鼠样品(例如，从本文所述的异种移植模型研究收集)中和人样品(例如，如本文所述获得的血清样品)中的STn的检测。
实施例8.使用人源化抗STn抗体的STn测定
使用mSIA102作为捕获抗体且使用hSIA102或hSIA103作为检测抗体，以人同种型IgG作为对照检测抗体，实施STn ELISA测定。使用捕获抗体的5微克/毫升(μg/ml)溶液包被ELISA测定板的表面过夜。洗涤并封闭板，之后用介于0nM至6x 10-8nM范围内的牛颌下腺粘蛋白(BSM)的稀释系列进行处理。使用3μg/ml检测抗体来检测结合至测定表面的BSM。使用抗人抗体与辣根过氧化物酶的缀合物(0.08μg/ml)结合检测抗体，并使用HRP底物检测抗体-抗原复合物。结果证明，人源化抗STn抗体能够检测所结合的BSM，且hSIA103的抗体结合的半最大有效浓度(EC50)是9x 10-9nM，并且hSIA101的抗体结合的半最大有效浓度(EC50)是2x 10-8nM。使用同种型对照检测抗体未观察到结合。
实施例9.药物代谢动力学研究
将均与MMAE缀合的抗体hSIA101和hSIA102以5mg/kg的剂量(通过重量分析确定的剂量)通过静脉内(IV)尾静脉注射给予来给予至雌性无胸腺小鼠，以评价抗体终末消除半衰期。每个组由9只小鼠组成。在第1小时、第4小时、第8小时、第24小时、第48小时、第72小时、第168小时、第336小时和第672小时收集血液(血清)，并用于计算抗体半衰期。
在研究结束时使用软件(Pharsight Corp.，山景城，加利福尼亚州)进行药物代谢动力学(PK)参数评价。从给予第一剂量的开始直至最后一次观察到的可定量浓度之后的时间为止(AUC最后一次)以及从研究开始至无限(AUCINF)评价曲线下面积(AUC)。还确定所观察到的最大血浆浓度(Cmax)、所观察到的清除率(CL)、终末消除半衰期(HL)、稳态分布容积(Vss)和末期分布容积(Vz)。PK参数是使用稀疏采样的非区室分析来计算。结果呈现于表10中。
表10.PK参数
根据研究，确定hSIA101-MMAE具有2.55天的终末消除半衰期，同时确定hSIA102-MMAE具有3.77天的终末消除半衰期。这些值与使用其他抗体-药物缀合物报道的那些值相当(参见，例如，Leal,M.等人,2015,Bioconjugate Chem,26:2223-32，其报道抗5T4抗体-药物缀合物的终末消除半衰期是3.5天)。
实施例10.过表达STn的细胞系的产生
将已建立的癌细胞系工程化以稳定表达STn，如以下文献中所述：Julien等人(Julien,S.等人,2005.Breast Cancer Res Treat.90(1):77-84)。用递送ST6GalNAc I表达构建体(hST6GalNAc I pRc-CMV)的慢病毒载体或对照(pRc-CMV空载体)转导细胞。在含有遗传霉素418(G418，1mg/mL)的培养基中选择稳定转染。使用限制稀释策略将抗性细胞接种至96孔板中，并亚克隆三次，以获得稳定克隆系。克隆系证明变化的ST6GalNAc I表达[如通过定量聚合酶链式反应(qPCR)分析所确定]。将稳定表达额外STn(如与野生型细胞相比)的OVCAR3细胞系称为“OVCAR3-STn”细胞。使用流式细胞术分析使用抗STn抗体验证STn的成功表达。
实施例11.具有增强的ST6GalNAc I表达的SKOV3细胞系的产生
用递送ST6GalNAc I表达构建体(hST6GalNAc I pRc-CMV)的慢病毒载体转导SKOV3细胞。产生稳定细胞池并选择6个具有ST6GalNAc I的变化表达的克隆[如通过定量聚合酶链式反应(qPCR)分析所确定](参见表11)。
表11.所选克隆中的ST6GalNAc I的表达水平
在与未转导细胞系中的水平相比时，克隆7、8和13证明最高的ST6GalNAc I mRNA水平。
测试表达无STn(野生型)、中等水平的STn(克隆15)和高水平的STn(克隆13)的SKOV3克隆对抗STn抗体治疗的敏感性。将细胞培养并用媒介物对照、hSIA101、hSIA101-MMAE、hSIA102或hSIA102-MMAE以2.5nM、5nM、10nM、50nM和100nM的浓度水平加以处理。随后通过MTT测定(EMD Millipore，比勒利卡，马萨诸塞州)测量细胞生存力。在表达高水平STn的细胞中，所有剂量的hSIA101-MMAE和hSIA102-MMAE处理都降低细胞生存力，并且在中等表达STn的细胞中，大于2.5nM的剂量降低细胞生存力。在表达中等水平STn的细胞中，所有剂量的hSIA101-MMAE和hSIA102-MMAE处理都降低细胞生存力，并且在中等表达STn的细胞中，大于5nM的剂量降低细胞生存力。在不表达STn的细胞中，hSIA101-MMAE和hSIA102-MMAE具有极小效应，但是在所用最高剂量下除外。这些结果指示，细胞对抗STn治疗的易感性取决于STn的表达水平。
实施例12.在OVCAR3细胞系衍生的小鼠异种移植物中的体内研究
用OVCAR3人卵巢癌细胞产生无胸腺裸小鼠皮下异种移植小鼠模型。用人源化抗STn ADC(1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg)、同种型ADC(1mg/kg、5mg/kg)、紫杉醇(20mg/kg)或仅媒介物治疗动物。每周一次静脉内给予ADC，持续四周。每周一次腹膜内给予紫杉醇，持续三周。在表12中所指示天数测量肿瘤体积和体重。与媒介物和同种型ADC对照相比，人源化ADC显著减小肿瘤体积(参见表12)，同时对总体重具有极小作用。这个数据表明，抗STn ADC在体内无毒性并且有效减小血清卵巢异种移植物体积。在研究结束时，收集肿瘤组织并使用免疫组织化学分析STn的表达。与其他治疗相比，来自用抗STn ADC治疗的小鼠的肿瘤组织显示降低的STn表达。
表12.肿瘤体积
实施例13.患者CRC样品中的STn表达
通过流式细胞术用hSIA101和两种市售抗体B72.3和CC49探测原始患者CRC样品。所测试的所有10个样品STn阳性的。结果呈现于表13中。在表中，％STn表示为存活CD45-/CD34-群体的％。通常用hSIA101比用市售抗体更稳健地鉴定STn表达。表达介于3％-47％阳性范围内，且转移样品证明最高阳性细胞百分比。这表明，可以利用抗STn抗体鉴定肿瘤样品中的STn特异性群体。
表13.患者样品中的STn表达
实施例14.CRC系中的体外毒素测试
基于初步流式细胞术分析揭示，COLO205和LS174T系中总细胞群的大约60％-70％表达STn，实施体外测试以测试基于抗STn抗体的治疗。考虑到使用小鼠和人源化抗STnMMAE ADC的初步结果，实施实验来鉴定抗STn ADC对结直肠癌的最佳毒素/接头。用一组10种常见ADC毒素检查具有不同STn表达水平的8个CRC系(COLO205、LS174T、RKO、HT-29、LS180和SW403)以及STn表达修饰细胞系[COLO205 STn敲低、LS174T STn敲低、RKO STn+(过表达ST6GalNAc I)和HT-29STn+(过表达ST6GalNAc I)]的抗性，所述ADC毒素包括澳瑞他汀(MMAE和MMAF)、美坦辛(DM4和DM1)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(塔利林和特西林)和拓扑异构酶抑制剂(SN-38和DXd)以及其他天然药剂(倍癌霉素和鹅膏蕈碱)。将CRC的敏感性与护理标准(伊立替康，也被称为CPT-11)和单独的媒介物相比，以获得半最大抑制性(细胞毒性)浓度(IC50)。为了完成这个过程，在具有不同内源STn表达水平的CRC细胞系以及那些细胞系的STn水平增加或减少的衍生物中测试未缀合的毒素。
用ST6GalNAc I引导的沉默子siRNA(ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)使用文献中所述的方法在COLO205和LS174T细胞中进行STn表达的敲低(例如，Gao等人,Nat Med.2015年11月；21(11):1318-25)。相比之下，用递送ST6GalNAc I表达构建体的慢病毒载体转导RKO和HT-29细胞(表达极低至无可检测水平的STn)，以获得表达升高STn水平的克隆群体。通过流式细胞术和蛋白质印迹分析监测工程化细胞在细胞表面上的STn表达，并且利用qRT-PCR监测ST6GalNac I mRNA水平。在孵育后24、48、72和96小时将未缀合的毒素添加至CRC系以获得IC50值，从而确立敏感性。根据制造商的指导使用发光细胞生存力测定试剂盒(Promega，麦迪逊，威斯康星州)来评价治疗后的细胞生存力。选择两种具有合意的ADC特性的毒素进行抗体缀合和进一步表征。
实施例15.在CRC模型中对抗STn ADC的评价
将两种毒素缀合至两种所选人源化抗STn抗体，并利用结合测定来确保维持STn结合特异性。结合测定(基于流式细胞术的测定、ELISA和聚糖阵列)是如先前所述来进行。将一种人同种型IgG1抗体与两种毒素中的每一种分别缀合并用作阴性结合对照。分别利用EGFR(克隆LA22)和CEA(克隆CD66e)抗体作为结合至MDA-MB-231和CRC系的阳性对照。
在上述三种CRC系中测试抗STn ADC的体外功效。总计测试8种条件，包括：抗STn 1+毒素1；抗STn 1+毒素2；抗STn 2+毒素1；抗STn 2+毒素2；同种型+毒素1；同种型+毒素2；护理标准和媒介物。分别使用生存力测定和软琼脂生长测定来评价抗STn ADC对细胞生存力和集落形成的效应。根据发光细胞生存力测定试剂盒(Promega，麦迪逊，威斯康星州)进行生存力测定。根据制造商的说明书计算相对ADC效能，以获得生存力百分比和IC50值。进行集落形成测定，其中将细胞稀释至基于甲基纤维素的培养基中并在ADC存在下在37℃下生长5-14天。计数并比较集落数。在两种测定中，测试抗STn ADC浓度的范围并产生适用的IC50值。将结果与护理标准化学治疗剂和同种型ADC对照相比较。基于IC50数据和集落形成信息选择两种最高ADC。
评价CRC异种移植TMA的STn表达，以鉴定两种STn阳性CRC模型用于体内研究。阵列由20种覆盖各个阶段、亚型、遗传背景和治疗反应/抗性模型的独特模型组成。通过免疫组织化学(IHC)评估STn表达。将TMA用两种抗STn抗体、同种型对照和仅二级抗体染色。使用预复合策略进行IHC检测，其中将抗体与抗人IgG生物素标记的二级抗体一起孵育，并且之后与组织一起孵育。对染色进行评分以评估赘瘤特异性膜染色。选择两种CRC异种移植模型和一种抗STn ADC用于体内异种移植研究。
在单一药剂、多药物剂量研究中使用两种细胞系和三个剂量浓度(1、2.5和5mg/kg)评价抗STn ADC候选者的体内功效。异种移植小鼠模型是通过将表达STn的人CRC细胞(即，5x 106个细胞1:1(v/v)基质胶)皮下注射至ICR SCID小鼠(约80只小鼠)的右侧腹中来制备。在60只小鼠达到大约200mm3的平均肿瘤体积之后，将其随机化至6个组中(n＝10只小鼠/组)，组均肿瘤大小大致相当。所述组接受抗STn ADC(1、2.5或5mg/kg)、同种型ADC对照(5mg/kg)、SOC(伊立替康40mg/kg)或媒介物(DPBS)。基于先前的抗STn ADC MMAE PK研究，治疗是每周一次通过静脉内注射给予，持续四周。每周两次测量肿瘤体积和体重，并且在媒介物对照组的肿瘤大小达到终点体积(≥1500mm3)时或者在小鼠变得垂死时，杀死各个小鼠。在研究结束时，通过IHC和流式细胞术评估每组小鼠的肿瘤STn表达。
基于这些研究的结果，进一步优化毒素/接头以改善抗STn ADC的体内和体外功效。
实施例16.CRC PDX模型的选择
使用人源化抗STn抗体评估来自患者衍生的肿瘤(PDX)细胞的CRC肿瘤微阵列(TMA)的STn表达，以确定用于PDX研究的反应模型。通过IHC评估含有总计超过200个核心的充分表征的市售福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的PDX TMA(CrownBio，圣克拉拉，加利福尼亚州)的STn表达。这些TMA是由多种幼稚和护理标准抗性PDX模型组成，包括对AP24534[普纳替尼，(RET抑制剂)]、西妥昔单抗、贝伐珠单抗(阿伐他汀)、曲妥珠单抗索拉非尼、5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨、伊立替康或紫杉醇具有抗性的那些。将TMA用未缀合的抗STn抗体、同种型抗体或仅二级抗体染色。对所有IHC分析的TMA以盲化方式针对抗体染色强度、频率和定位用显微镜检查进行评分。检查STn表达与CRC进展之间的关联并用于通知模型选择。
基于IHC数据，选择10种PDX用于用抗STn ADC候选者进行体外测试。在先前所述的生存力测定和集落形成测定中评估这10种PDX模型的细胞毒性和集落形成。包括同种型ADC对照、三种SOC药剂(伊立替康、西妥昔单抗和贝伐珠单抗，作为单一药剂)和媒介物对照用于分析。基于STn表达和抗STn ADC体外反应，选择三种PDX模型[包括1种护理标准(SOC)抗性PDX模型]用于体内研究。
实施例17.单一剂量PK研究
在体内研究之前，在单一剂量体内小鼠研究中评价抗STn ADC候选者的PK特性。在这项单一剂量研究中利用两个剂量水平(2.5和5mg/kg)以及10个时间点(给药后0、1、4、8、24、48、72、168、336和672小时)。每个治疗组包括总计9只小鼠，具有三个小鼠亚组以允许交错采血。在指定的时间点，使小鼠流血并将血清收集至血清分离器管中。允许血液凝结最少30分钟，并且然后在收集的1小时内通过离心(3500rpm，10min，在5℃下)进行加工。在离心后，分离血清并用于免疫测定中以确定血清中存在的抗STn ADC。确定终末消除半衰期(HL)、曲线下面积(AUC)、所观察到的最大血浆浓度(Cmax)、稳态分布容积(Vss)和末期分布容积(Vz)。使用PK参数来确定体内PDX研究的最佳给药方案。
实施例18.在PDX小鼠模型中评价体内功效
使用通过PDX TMA的免疫组织化学分析鉴定的三种PDX模型实施PDX小鼠研究，以评价作为单一药剂疗法的抗STn ADC候选者的体内功效。将抗STn ADC(1、2.5或5mg/kg)、同种型ADC对照(5mg/kg)、SOC(伊立替康(40mg/kg)、西妥昔单抗(10mg/kg)或贝伐珠单抗(10mg/kg))或单独的媒介物给予随机化至6个组(10只小鼠/组)中的PDX小鼠。每周一次对动物进行给药，持续四周。在研究开始时和结束时通过IHC和流式细胞术检查STn表达。
实施例19.PDX小鼠模型中的组合治疗
在所选PDX小鼠模型中以并行或依序治疗评价抗STn ADC候选者与护理标准(SOC)疗法的组合疗法。
对于并行治疗，总共测试9个治疗组，10只小鼠/组，包括：仅媒介物、抗STn ADC(1mg/kg)、抗STn ADC(5mg/kg)、仅SOC only、SOC+媒介物、SOC+抗STn ADC(1mg/kg)、SOC+抗STn ADC(5mg/kg)、SOC+未缀合抗STn(1mg/kg)和SOC+未缀合抗STn(5mg/kg)。每周对动物进行给药，持续四周。在研究开始时和结束时通过IHC和流式细胞术检查STn肿瘤表达。
对于依序治疗，首先用SOC治疗小鼠。在四周治疗或中值肿瘤消退至初始肿瘤体积的<25％之后，则将小鼠随机化至如下6个组中：抗STn ADC(1mg/kg)、抗STn ADC(5mg/kg)、未缀合抗体(1mg/kg)、未缀合抗体(5mg/kg)、一种同种型ADC对照和媒介物对照。每周对动物进行给药，持续四周。在研究开始时和结束时通过IHC和流式细胞术检查STn肿瘤表达。
实施例20.试点多剂量毒理学研究
实施多剂量研究以评估在食蟹猴中hSIA101-MMAE给予的药物代谢动力学特征和毒性。研究包括寿命中评估，如死亡率/发病率、临床观察、体重、食物消耗、体温、局部刺激、眼科学和临床病理学评估。将9只雄性动物(2-4岁)用于这些研究，每个治疗组3只猴子，列于表14中。
表14.治疗组
通过静脉内推注对所有组总共给药2次，一次是在第1天且再一次是在第22天。在第1天和第22天使用以下时间表收集血液样品用于药物代谢动力学研究：在给药前(0)，然后在给药后1、3、6、24、48、72、96和168小时。仅对于第1天给药，在给药后240、336和504小时收集其他血液样品。使用以下时间表收集血液样品用于临床病理学评价(临床化学、血液学和凝血)：在给药前(测试前)、第8天、第22天(第二次给药前)和在第29天于安乐死之前。临床化学评价包括评价肌酸酐钠、总蛋白、钾、碱性磷酸酶、甘油三酯、氯化物、丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、天冬氨酸钙氨基转移酶、白蛋白、无机磷、葡萄糖、球蛋白、尿素氮、胆固醇和白蛋白/球蛋白比率。血液学评价包括评价血细胞比容、平均红细胞血红蛋白浓度、血红蛋白、网织红细胞计数(绝对值和相对值)、血小板计数、红细胞计数、平均血小板容积、总白细胞计数、平均红细胞血红蛋白、差异性白细胞计数(绝对值和相对值)、平均红细胞容积和红细胞分布宽度。使用K3-EDTA作为抗凝血药。凝血评价包括评价凝血酶原时间和活化部分促凝血酶原激酶时间。在第29天将所有组安乐死并收集器官用于验尸。
受试者血液样品的血清用于人IgG水平的药物代谢动力学(PK)评价。使用Phoenix药物代谢动力学软件(Certara，美国)使用与静脉内推注给予途径一致的非区室性方法来估计PK参数。所有参数都是从来自第1天和第22天的血清中的各个人IgG浓度产生。相对于每次剂量给予的结束，使用额定采样时间来估计参数。出于参数估计的目的，基于最早观察到的两个血清浓度回推在第1天零时刻的浓度。将报道为不可定量的浓度值处理为不存在的样品。
相对于第一剂量获得的血清抗体浓度值呈现于图2中，并且相对于第二剂量获得的值呈现于图3中。浓度-时间曲线下面积(AUC)是使用线性梯形法以线性/线性插值来计算。对于在单独的时间点具有测试项的少于3个可定量浓度的PK概况，不计算AUC。在实践中，每个浓度-时间曲线的终末消除期是使用至少最终观察到的三个浓度值来鉴定。终末消除期的斜率是使用对数线性回归基于未加权的浓度数据来确定。平均值和标准偏差(SD；在括号中)呈现于表15和表16中。Cmax是指在给药后测量的最大观察浓度。AUC最后一次是指使用线性或线性/对数梯形法从剂量给予开始至最后一次观察到可定量浓度的浓度-时间曲线下面积。AUC0-7天是指相同的浓度-时间曲线下面积，但是其中不包括超出第7天的面积。AUCINF是指从剂量给予开始外推至无限时间的浓度-时间曲线下面积。CL是指抗体在所分析基质中的表观清除速率。HL是指表观终末消除半衰期。Vss是指稳态下的表观分布容积。
表15.在第一剂量后获得的PK参数
表16.在第二剂量后获得的PK参数
在第1天，对人IgG的全身性暴露的增加是线性的并且在1mg/kg/剂量与6mg/kg/剂量之间与剂量成比例，且略微倾向于大于与剂量成比例的。在第22天，全身性暴露的增加在1mg/kg/剂量与6mg/kg/剂量之间是非线性的。在比较第1天与第22天时，根据AUC(0-t)，观察到对人IgG的全身性暴露的减少，随剂量水平的增加而增加。
将存活至第29天的动物安乐死并提交以供验尸。对显微镜评价所需的组织进行修剪，常规加工，包埋于石蜡中，并用苏木素和曙红染色，之后通过光学显微镜检查进行评价。
未记录到与测试物品相关的肉眼发现。所观察到的肉眼发现被认为是偶发的，具有一般在这个品系和年龄的食蟹猴中观察到的性质，和/或在对照和所治疗动物中具有类似的发病率，并且因此被认为与抗体给予无关。在研究动物中没有出现体重减轻或死亡，并且在所评估的所有器官之间没有观察到肉眼病理变化。组织病理学变化仅限于骨髓，是与MMAE相关的效应。观察到极小至轻度降低的细胞构成和轻度减小的髓红比。血液学参数的变化(即，低度嗜中性粒细胞减少症)与其他MMAE抗体药物缀合物一致并且不被视为与靶标相关。最后，所有临床化学结果在整个研究期间都保持正常。
实施例21.细胞系产生
为了产生临床级抗体，根据试剂盒(ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)产生稳定的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。用含有编码人源化抗STn抗体的基因的构建体转染CHO-S细胞。基于二相选择方案来选择稳定克隆。选择具有高产率的克隆进行进一步表征。将稳定细胞系转移至优质生产规范(GMP)设施以产生抗体用于GLP毒理学测试和I期临床试验供应。
实施例22.组织交叉反应性研究
实施组织交叉反应性研究以评估与人和非临床安全性测试中所用的相关物种的结合谱(中靶结合和潜在的脱靶结合)。检查人源化抗STn抗体与一组正常的人、大鼠、小鼠和食蟹猴组织的结合。以1-3μg/ml对10个正常冷冻组织切片实施研究：心脏、脑、肾、胃、肺、小肠、结肠、肝、胰腺、脾和骨髓。阳性对照是含有STn阳性癌细胞的人胰腺肿瘤，并且阴性对照是相同样本内所含的正常基质细胞。所有正常组织之间的染色受限于细胞质。不使用一级抗体或使用同种型对照IgG作为阴性对照来实施其他分析。
在所测试的三种抗体中，hSIA101具有最低的与正常人组织的交叉反应性。观察到对心脏血管、胃上皮细胞、小肠上皮细胞和脾血管的组织具有中等结合活性。还发现抗体与来自食蟹猴(参见表17)和大鼠(未显示)的类似类型的组织发生交叉反应。在表中：1+＝弱染色；2+＝中等染色；3+＝强染色；4+＝强烈染色；Neg＝阴性；freq＝频繁(在>75％-100％的细胞中染色)；occ＝偶然(在>25％-50％的细胞中染色)；并且罕见是指在1％-5％的细胞中染色。
表17.组织交叉反应性研究结果
在任何组织的细胞膜上均未观察到染色。大脑、小脑、肾和肝未染色。同种型和仅二级对照分析证明无染色，而仅阳性对照组织(胰腺肿瘤)证明经hSIA101强膜染色。
实施例23.在卵巢PDX肿瘤模型中抗STn抗体治疗与顺铂治疗之间的比较
在异种移植肿瘤模型中使用来自两名不同患者的人类患者衍生的卵巢癌肿瘤将抗STn ADC候选者与护理标准(SOC)疗法相比较。先前已通过免疫组织化学染色确认患者样品表达STn，并且将来自先前未用化学疗法治疗的(未接受化学治疗的)一名患者的肿瘤和来自先前用化学疗法治疗的患者的肿瘤植入无胸腺免疫缺陷型裸小鼠中。选择具有成功肿瘤生长的小鼠，并通过每周IV注射给予抗体(5mg/kg剂量)；通过每周腹膜内注射给予顺铂(3mg/kg剂量)(限于3次剂量)；或给予媒介物对照。所给予抗体包括hSIA101、hSIA101-ADC(与MMAE缀合)或与MMAE缀合的IgG同种型对照(同种型-ADC)。具有未接受化学治疗的肿瘤的小鼠接受抗体治疗达4周，而具有化学抗性肿瘤的小鼠接受抗体治疗达6周。在治疗结束后监测用hSIA101-ADC或同种型-ADC治疗的小鼠中的肿瘤体积4-5周，以评估肿瘤消退。
随时间测量顺铂敏感性(图4，上图)和顺铂抗性(图4，下图)肿瘤体积。与其他治疗相比，hSIA101-ADC治疗产生最有效的肿瘤体积减小。与顺铂治疗相比，通过用hSIA101-ADC治疗进行的治疗使以顺铂抗性细胞产生的肿瘤显著减小(图4，下图)。因此，hSIA101-ADC治疗可以用于有效治疗顺铂敏感性肿瘤和顺铂抗性肿瘤。有趣的是，75％的用hSIA101-ADC治疗的未接受化学治疗的小鼠在治疗结束后4周时完全无肿瘤，而在hSIA101-ADC治疗结束后5周时于75％的患有化学抗性肿瘤的小鼠中观察到大于50％肿瘤消退。
序列表
<110> SIAMAB THERAPEUTICS, INC.
<120> 聚糖相互作用化合物和使用方法
<130> 2033.1030PCT
<140> PCT/US2018/XXXXXX
<141> 2018-03-02
<150> 62/577,830
<151> 2017-10-27
<150> 62/563,718
<151> 2017-09-27
<150> 62/486,826
<151> 2017-04-18
<150> 62/480,126
<151> 2017-03-31
<150> 62/466,766
<151> 2017-03-03
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Ser Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Lys Arg Ser Leu Ser Thr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg
20 25 30
Gly Asn His Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Leu
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Lys Arg Ser Tyr Tyr Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 4
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<212> PRT
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<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile His Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Ala Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Pro Gly Asn Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Cys
65 70 75 80
Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Lys Arg Ser Leu Leu Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Asn
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro Lys Val Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的说明：合成多肽
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Phe Ser Pro Gly Asn Asp Asp Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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Val Ser Ser
115
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<212> PRT
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<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg
20 25 30
Gly Asn His Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Lys
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<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Pro Gly Asn Gly Asp Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Asn
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
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<212> PRT
<213> 小鼠属物种
<400> 13
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
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210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
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Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
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<210> 14
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<212> PRT
<213> 小鼠属物种
<400> 14
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
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Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
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Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 15
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 17
Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 18
Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys
1 5 10
<210> 19
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 19
Met Ala Asn Val Gln Leu Asn Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成多肽
<400> 20
Met Ala Asn Val Gln Leu Asn Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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Trp Val Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ala Val Lys Ala Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Arg
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Gly Glu Tyr
85 90 95
Phe Cys Thr Lys Val Gln Ser Pro Arg Thr Arg Ile Pro Ala Pro Ser
100 105 110
Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 22
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成肽
<400> 23
Lys Asp Glu Leu
1

Claims (14)

1.抗体-药物缀合物(ADC)在制备用于治疗受试者的铂难治性癌症的药物中的用途，其中所述铂难治性癌症(i)选自乳腺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、宫颈癌、胃癌和前列腺癌，(ii)是对顺铂或奥沙利铂有抗性的实体癌，或(iii)是卵巢癌且对顺铂有抗性，其中所述ADC包含：
a)抗STn抗体，其中所述抗STn抗体包含：
1) 具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的重链可变结构域（VH）和具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的轻链可变结构域（VL）；
2) 具有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的VL；或
3) 具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的VL；且
b) 与所述抗STn抗体缀合的细胞毒性剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞毒性剂选自澳瑞他汀、美坦辛、微管溶素、长春花生物碱、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、喜树碱、倍癌霉素、鹅膏蕈碱、磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂和丝裂原激活蛋白激酶（MEK）抑制剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述细胞毒性剂通过接头缀合至所述抗STn抗体。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述接头是可裂解接头。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述接头包含一种或多种聚合物，所述一种或多种聚合物选自聚乙二醇、聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚α-氨基酸、碳水化合物聚合物、糖脂、糖缀合物、聚甘油、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚缩酮、聚缩醛和聚1-羟甲基亚乙基羟甲基甲醛。
6.根据权利要求3所述的用途，其中所述接头包含糖多糖。
7.根据权利要求3所述的用途，其中所述接头包含缬氨酸-瓜氨酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述抗STn抗体包含具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的VL。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述铂难治性癌症是卵巢癌且对顺铂有抗性。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述铂难治性癌症是结直肠癌。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述结直肠癌对用以下中的至少一种进行的治疗有抗性：西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐珠单抗、雷莫芦单抗、曲妥珠单抗、普纳替尼、索拉非尼、5-氟尿嘧啶、多西他赛、吉西他滨、伊立替康或紫杉醇。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述细胞毒性剂包含单甲基澳瑞他汀E (MMAE)。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述抗STn抗体包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的VL且所述细胞毒性剂包含MMAE。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述ADC是以1 mg/kg至6 mg/kg的剂量给予的。
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