TW202144014A - 一種抗體藥物偶聯物的製備方法 - Google Patents

一種抗體藥物偶聯物的製備方法 Download PDF

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Abstract

本揭露涉及一種抗體藥物偶聯物的製備方法。具體而言，本揭露涉及抗體藥物偶聯物的合成和純化步驟。採用本揭露的方法製備的抗體藥物偶聯物具有更均一的藥物載量分佈。

Description

一種抗體藥物偶聯物的製備方法
本申請要求2020年3月25日提交的中國專利申請(申請號CN 202010219311.2)和2021年3月19日提交的中國專利申請(申請號CN 202110297397.5)的優先權。
本揭露涉及一類抗體藥物偶聯物的製備方法，尤其涉及一類抗體藥物偶聯物的製備方法的合成步驟和純化步驟。
這裡的陳述僅提供與本揭露有關的背景訊息，而不必然地構成現有技術。
化療依然是包括手術、放療、以及靶向治療法在內的最重要的抗癌手段之一。盡管高效細胞毒性藥物的種類很多，但是腫瘤細胞和正常細胞之間差別很小，限制了這些抗腫瘤化合物由於毒副作用在臨床上的廣泛應用。而抗腫瘤單株抗體對於腫瘤細胞表面抗原具有特異性，抗體藥物已成為抗腫瘤治療的前線藥物，但單獨使用抗體作為抗腫瘤藥物時，療效經常不盡人意。
抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)將單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒性藥物相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和細胞毒性藥物的高效性，同時又避免了前者療效偏低和後者毒副作用過大等缺陷。這也就意味著，與以往傳統的化療藥物相比，抗體藥物偶聯物能精準地結合腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響(Mullard A,(2013)Nature Reviews Drug Discovery,12：329-332；DiJoseph JF,Armellino DC,(2004)Blood,103：1807-1814)。
2000年第一個抗體藥物偶聯物Mylotarg(吉妥珠單抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，惠氏製藥有限公司)被美國FDA批准上市，用於治療急性髓細胞白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；US4970198；US 5079233；US 5585089；US 5606040；US 5693762；US 5739116；US 5767285；US 5773001)。
2011年8月，Adcetris®(brentuximab vedotin，西雅圖基因遺傳公司)藉由美國FDA快速審評通道，用於治療霍奇金淋巴瘤以及復發性間變性大細胞淋巴瘤(Nat.Biotechnol(2003)21(7)：778-784；WO2004010957；WO2005001038；US7090843；US7659241；WO2008025020)。Adcetris®是一種新型的ADC藥物，能使藥物直接作用於淋巴瘤細胞上的靶點CD30後發生內吞作用從而誘導腫瘤細胞的凋亡。
Mylotarg和Adcetris都是針對血液腫瘤進行靶向治療，血液腫瘤和實體腫瘤相比組織結構相對簡單。2013年2月，Kadcyla(ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)獲得美國FDA批准，用於治療HER2陽性同時對曲妥珠單抗(Tratuzumab，商品名：Herceptin)和紫杉醇有抗藥性的晚期或轉移性乳腺癌患 者(WO2005037992；US8088387)。Kadcyla是美國FDA批准的治療實體腫瘤的第一個ADC藥物。
用於抗體藥物偶聯物的具有細胞毒性的小分子有幾類，其中有一類是喜樹鹼衍生物，它们藉由抑制拓樸異構酶I而具有抗腫瘤作用。報導喜樹鹼衍生物依沙替康(化學名：(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’：6,7]咪唑并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)應用於抗體藥物偶聯物(ADC)的文獻有WO2014057687；Clinical Cancer Research(2016)22(20)：5097-5108；Cancer Sci(2016)107：1039-1046。但仍需進一步開發療效更好的ADC藥物。
本揭露提供一種抗體藥物偶聯物的製備方法，其中該抗體藥物偶聯物的結構如通式(Pc-La-Y-D)所示：
Figure 110110879-A0202-12-0003-2
其中，
W選自C1-8烷基、C1-8烷基-C3-7環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該直鏈雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中該C1-8烷基、C3-7環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、C1-6烷基、 氯C1-6烷基、氘代C1-6烷基、C1-6烷氧基和C3-7環烷基中的一個或多個取代基所取代；
L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-和化學鍵，其中p1為1至20的整數；
L3為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸殘基選自苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、瓜胺酸、絲胺酸(S)、谷胺酸(Q)和天冬胺酸(D)中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、C1-6烷基、氯C1-6烷基、氘代C1-6烷基、C1-6烷氧基和C3-7環烷基中的一個或多個取代基所取代；
R1為鹵C1-6烷基或C3-7環烷基；
R2選自氫原子、鹵C1-6烷基和C3-7環烷基；
或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-7環烷基；
R5選自氫原子、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、氘代C1-6烷基和羥基C1-6烷基；
R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、氘代C1-6烷基和羥基C1-6烷基；
m為0或1；
n為3至8，n是小數或整數；
Pc為抗體或其抗原結合片段；
該製備方法包括如下的步驟：
步驟(a)：在約1℃至約36℃的反應溫度條件下，抗體或其抗原結合片段與還原劑反應；
步驟(b)：步驟(a)的產物與下式(La-Y-D)所示的化合物反應；
Figure 110110879-A0202-12-0005-3
其中，W，L2，L3，R1，R2，R5，R6，R7和m如上所定義。
在另一個方面，本揭露提供一種抗體藥物偶聯物的製備方法，該抗體藥物偶聯物具有如下式所示的結構：
Figure 110110879-A0202-12-0005-4
其中，n為4至8，n是小數或整數；
該製備方法包括如下的步驟：
步驟(a)：在約1℃至約36℃的反應溫度條件下，抗體或其抗原結合片段與還原劑反應；
步驟(b)：步驟(a)的產物與下式所示的化合物反應；
Figure 110110879-A0202-12-0005-5
在可選的實施方案中，步驟(a)中的所述反應溫度條件為約4℃至約30℃，較佳為約20℃至約30℃，更佳為25℃，非限制性的實施例包括約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃。在一些實施方案中，該反應溫度條件為13℃至28℃或13℃至25℃。
在可選的實施方案中，步驟(a)中的反應是在pH為約4.5至約6.5的條件下進行的，較佳該反應是在pH為約5.0至約6.0的條件下進行的，更佳該反應是在pH為約5.6的條件下進行的。在非限制性的實施例中，反應是在pH為約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、或約6.0中進行的。
在可選的實施方案中，步驟(a)中的反應是在緩衝劑中進行的；在非限制性的實施例中，該緩衝劑選自組胺酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑和醋酸鹽緩衝劑。
在可選的實施方案中，步驟(a)中的反應是在緩衝劑中進行的；在非限制性的實施例中，該緩衝劑為組胺酸-鹽酸緩衝劑。
在可選的實施方案中，該緩衝劑選自含有EDTA的組胺酸鹽緩衝劑和含有EDTA的組胺酸-鹽酸緩衝劑。示例性地，該組胺酸鹽緩衝劑的濃度為1mM至100mM、10mM至50mM、20mM、30mM或40mM；EDTA的濃度為1mM至10mM、2mM至5mM、2.5mM、3mM或4mM。在一些實施方案中，該緩衝劑含有10mM至50mM的組胺酸鹽緩衝劑和1mM至10mM的EDTA。在一些實施方案中，該緩衝劑含有20mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑和2.5mM的EDTA。EDTA指乙二胺四乙酸。
在可選的實施方案中，步驟(a)中的所述還原劑選自三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其鹽、1,4-二巰基蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇(β-ME)等合適的還原劑，較佳為TCEP或其鹽更佳為三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽。
在可選的實施方案中，步驟(a)中還原劑與抗體或其抗原結合片段(Pc)的莫耳比為2至10：1、2.6至7：1、2.9至3.7：1、3.2至3.4：1或3.3：1。
在可選的實施方案中，步驟(b)是在有機溶劑中進行，較佳的有機溶劑包括二甲基亞碸(DMSO)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N,N-二甲基乙醯胺(DMAc)、乙腈或其混合物。在非限制性的實施例中，步驟(b)包括：將式(La-Y-D)所示的化合物溶於DMSO，並將步驟(a)的產物與式(La-Y-D)所示的化合物的DMSO溶液混合。
在可選的實施方案中，上述製備方法還包括步驟(c)，該步驟(c)包括將步驟(b)的產物進行純化。該純化可以採用陽離子管柱層析或親和管柱層析純化，該陽離子層析的填料選自Capto S Impact和Poros XS，較佳為Capto S Impact。在一些實施方式中，該Capto S Impact是CaptoTM S Impact。在一些實施方式中，該Poros XS是PorosTM XS。
在可選的實施方案中，藥物載量(n)的範圍可以是每個抗體或其抗原結合片段(Pc)結合3至8個、4至8個、5至7個，較佳5.3至6.1個，更佳5.7個細胞毒性藥物。n是小數或整數。在一些實施方案中，n是5.3、5.4、5.5、5.6或5.7。
在可選的實施方案中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下；較佳為結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為6%以下。在非 限制性的實施例中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下、3%以下、2%以下或1%以下；未結合藥物的抗體重鏈比例為6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下或1%以下。或者，在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上或95%以上。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為1%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為4%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為1%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為4%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為70%以上。在一些實施方式中，該抗體重鏈比例和/或抗體輕鏈比例是藉由反向色譜測定的。
在可選的實施方案中，該製備方法是適用於大規模製備的。該製備方法的曲妥珠抗體投料量在100mg以上，較佳為1克以上，更佳為10克以上，最佳為100克以上。
在可選的實施方案中，該抗體藥物偶聯物具有如通式(Pc-Lb-Y-D)所示的結構：
Figure 110110879-A0202-12-0009-6
其中，
s1為2至8的整數；
Pc、R1、R2、R5、R6、R7、m和n如上所定義；
該製備方法包括如下的步驟：
步驟(a)：在約1至約36℃的反應溫度條件下，抗體或其抗原結合片段與還原劑反應；
步驟(b)：步驟(a)的產物與下式(Lb-Y-D)所示的化合物反應；
Figure 110110879-A0202-12-0009-7
其中，s1、R1、R2、R5、R6、R7和m如上所定義。
在可選的實施方案中，前述抗體藥物偶聯物具有如下的結構：
Figure 110110879-A0202-12-0010-8
Figure 110110879-A0202-12-0011-9
Figure 110110879-A0202-12-0012-10
其中Pc和n如通式(Pc-La-Y-D)中所定義。
在可選的實施方案中，其中該Pc為抗體或其抗原結合片段，該抗體選自嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。在一些實施方案中，該抗體為單株抗體。
在可選的實施方案中，該抗體或其抗原結合片段選自抗HER2(ErbB2)抗體、抗EGFR抗體、抗B7-H3抗體、抗c-Met抗體、抗HER3(ErbB3)抗體、抗HER4(ErbB4)抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD44抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD73抗體、抗CD105抗體、抗CEA抗體、抗A33抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUCl抗體、抗Lewis Y抗體、抗VEGFR抗體、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體和抗Mesothelin抗體，或其抗原結合片段；
較佳地，該抗體或其抗原結合片段選自曲妥珠單抗(Trastuzumab)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、恩必利珠單抗(Enoblituzumab)、艾米貝珠單抗(Emibetuzumab)、伊諾妥珠單抗(Inotuzumab)、品那妥珠單抗(Pinatuzumab)、苯妥昔單抗(Brentuximab)、吉妥 珠單抗(Gemtuzumab)、必法妥珠單抗(Bivatuzumab)、洛瓦妥珠單抗(Lorvotuzumab、cBR96和格雷馬圖單抗(Glematumamab)，或其抗原結合片段。
在可選的實施方案中，該抗體偶聯物具有如下式所示的結構：
Figure 110110879-A0202-12-0013-11
其中，n為4至8，n是小數或整數。
在另一個方面，本揭露提供一種抗體藥物偶聯物的製備方法，該抗體藥物偶聯物具有如下式所示的結構：
Figure 110110879-A0202-12-0013-13
其中，n為4至8，n是小數或整數；
該製備方法包括如下的步驟：
步驟(a)：在反應溫度為約4℃至約30℃，和pH為約4.5至約6.5的條件下，曲妥珠單抗(Trastuzumab)與T℃EP反應；
步驟(b)：步驟(a)的產物與下式所示的化合物反應；
Figure 110110879-A0202-12-0014-14
在可選的實施方案中，該抗體藥物偶聯物具有如下式所示的結構：
Figure 110110879-A0202-12-0014-15
其中，n為4至8，n是小數或整數；
該製備方法包括如下的步驟：
步驟(a)：在反應溫度為約25℃，和pH為約5.6的條件下，Trastuzumab與TCEP反應，該反應是在含有EDTA的組胺酸-鹽酸緩衝劑中進行的；
步驟(b)：步驟(a)的產物與下式所示的化合物反應；
Figure 110110879-A0202-12-0014-16
步驟(c)：包括將步驟(b)的產物進行陽離子層析管柱或親和層析管柱純化。在一些實施方案中，該含有EDTA的組胺酸-鹽酸緩衝劑中含有20mM組胺酸-鹽酸緩衝劑和2.5mM EDTA。
本揭露還提供一種抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體藥物偶聯物的結構如通式(Pc-La-Y-D)所示：
Figure 110110879-A0202-12-0015-17
其中，
W選自C1-8烷基、C1-8烷基-C3-7環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該直鏈雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中該C1-8烷基、C3-7環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、C1-6烷基、氯C1-6烷基、氘代C1-6烷基、C1-6烷氧基和C3-7環烷基中的一個或多個取代基所取代；
L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-和化學鍵，其中p1為1至20的整數；
L3為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸殘基選自苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、瓜胺酸、絲胺酸(S)、谷胺酸(Q)、天冬胺酸(D)中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、C1-6烷基、氯C1-6烷基、氘代C1-6烷基、C1-6烷氧基和C3-7環烷基中的一個或多個取代基所取代；
R1為鹵C1-6烷基或C3-7環烷基；
R2選自氫原子、鹵C1-6烷基和C3-7環烷基；
或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-7環烷基；
R5選自氫原子、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、氘代C1-6烷基和羥基C1-6烷基；
R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、氘代C1-6烷基和羥基C1-6烷基；
m為0或1；
n為4至8，n是小數或整數；
Pc為抗體或其抗原結合片段；
該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下；較佳為結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為6%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為1%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為4%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合 4個藥物的抗體重鏈比例為1%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為4%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為70%以上。
本揭露還提供一種抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體藥物偶聯物是由前述的抗體藥物偶聯物的製備方法製備獲得的；並且，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下；較佳為結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為6%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為1%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為4%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為1%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為4%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為70%以上。
本揭露還提供一種抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體藥物偶聯物具有如下式所示的結構：
Figure 110110879-A0202-12-0018-18
其中，n為4至8，n是小數或整數；
該抗體藥物偶聯物是由前述的抗體藥物偶聯物的製備方法製備獲得的；並且，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下；較佳為結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為6%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為1%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為4%以下。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上。在一些實施方式中，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為1%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為4%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為70%以上。
本揭露提供一種更利於大規模生產的製備方法。具體地，該製備方法所獲得的產品藥物載量分佈更窄、游離毒素含量更低、產率更高。
術語
為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本揭露將申請PCT/CN2019/107873中的全部內容引入本申請。
“抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)”是將抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素或具有細胞殺傷活性的小分子藥物相連，充分利用了抗體對腫瘤細胞的特異性或高表達抗原細胞結合的特異性和細胞毒素的高效性，避免對正常細胞的毒副作用。與以往傳統的化療藥物相比，抗體藥物偶聯物能精準地結合腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響。
“緩衝劑”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。將pH控制在適當範圍中的緩衝劑的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。
“組胺酸鹽緩衝劑”是包含組胺酸根離子的緩衝劑。組胺酸鹽緩衝劑的實例包括組胺酸-鹽酸、組胺酸-醋酸、組胺酸-磷酸、組胺酸-硫酸等緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸緩衝劑，組胺酸-醋酸緩衝劑是組胺酸與醋酸配製而成，組胺酸鹽酸緩衝劑是組胺酸與鹽酸或組胺酸與組胺酸鹽酸鹽配製而成。
“磷酸鹽緩衝劑”是包括磷酸根離子的緩衝劑。磷酸鹽緩衝劑的實例包括磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉-枸櫞酸等。較佳的磷酸鹽緩衝劑是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉。
“醋酸鹽緩衝劑”是包括醋酸根離子的緩衝劑。醋酸鹽緩衝劑的實例包括醋酸-醋酸鈉、醋酸組胺酸鹽、醋酸-醋酸鉀、醋酸醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。較佳的醋酸鹽緩衝劑是醋酸-醋酸鈉。
本文所用術語“約”、“大約”是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本揭露該“抗體”指免疫球蛋白，是完整抗體由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。本揭露該抗體較佳為針對靶細胞上細胞表面抗原的特異性抗體，非限制性實施例為以下抗體：抗HER2(ErbB2)抗體、抗EGFR 抗體、抗B7-H3抗體、抗c-Met抗體、抗HER3(ErbB3)抗體、抗HER4(ErbB4)抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD44抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD73抗體、抗CD105抗體、抗CEA抗體、抗A33抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUCl抗體、抗Lewis Y抗體、抗VEGFR抗體、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體或抗Mesothelin抗體中一個或多個；較佳為曲妥珠單抗(曲妥珠單抗，商品名Herceptin)、帕妥珠單抗(帕妥珠單抗，也被稱作2C4，商品名Perjeta)、尼妥珠單抗(尼妥珠單抗，商品名泰欣生)、恩諾妥珠單抗(Enoblituzumab)、艾米貝珠單抗(Emibetuzumab)、伊諾妥珠單抗(Inotuzumab)、品那妥珠單抗(Pinatuzumab)、苯妥昔單抗、吉妥珠單抗、必法妥珠單抗(Bivatuzumab)、洛瓦妥珠單抗(Loivotuzumab)、cBR96和格雷馬圖單抗(Glematumamab)。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本揭露所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR1-3)。
在本揭露中，本揭露所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本揭露中，本揭露所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
本揭露的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳人源化抗體。
術語“鼠源抗體”在本揭露中為根據本領域知識和技能用鼠製備抗體。製備時用特定抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜带大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找 到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本揭露的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。
術語“裸抗體”，是指未與異源模塊(例如細胞毒性模塊)或放射性標記物綴合的抗體。
本揭露中所述的“抗體的抗原結合片段”可以指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段，以及與抗原結合的Fv片段scFv片段。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能够形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。
本揭露的術語“抗原結合位點”指抗原上連續或不連續的，由本揭露抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
本揭露中所述的“ADCC”，即抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾、降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4嵌合體，IgG4的F234A/L235A突變。
本揭露中所述的突變序列中的“突變”包括但不限於“回復突變”、“保守修飾”或“保守置換或取代”。本揭露中所述的“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水 性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。
本揭露所述的“突變序列”是指對本揭露的核苷酸序列和/或胺基酸序列進行適當的替換、插入或缺失等突變修飾情況下，得到的與本揭露的核苷酸序列和/或胺基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和/或胺基酸序列。本揭露中所述的序列同一性可以至少為85%、90%或95%，較佳至少為95%。非限制性實施例包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For Biotechnology Institute網站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默認設置來進行。
術語“接頭單元”或“連接片段”或“連接單元”是指一端與抗體或其抗原結合片段連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與抗體或藥物相連。
接頭，包括延伸物、間隔物和胺基酸單元，可以藉由本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。
本揭露工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子的烷基，更佳含有1至10個碳原子的烷基，最佳含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正 壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基。
術語“雜烷基”指含有一個或多個選自N、O和S的雜原子的烷基，其中烷基如上所定義。
術語“亞烷基”指飽和的直鏈或支鏈脂肪族烴基，其具有2個從母體烷的相同碳原子或兩個不同的碳原子上除去兩個氫原子所衍生的殘基，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子，更佳含有1至6個碳原子的伸烷基。伸烷基的非限制性實例包括但不限於亞甲基(-CH2-)、1,1-伸乙基(-CH(CH3)-)、1,2-伸乙基(-CH2CH2)-、1,1-伸丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-伸丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-伸丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-伸丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和1,5-伸丁基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)等。伸烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳獨立地任選 選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基中的一個或多個取代基所取代。
術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基或環烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至12個碳原子，更佳包含3至10個碳原子，最較佳包含3至7個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。
術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳環烷基環包含3至10個環原子。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌嗪基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。
術語“螺雜環基”指5至20元的單環之間共用一個原子(稱螺原子)的多環雜環基團，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14元，更佳為7至10元。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺雜環基分為單螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，較佳為單螺雜環基和雙螺雜環基。更較佳為4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元單螺雜環基。螺雜環基的非限制性實例包括：
Figure 110110879-A0202-12-0028-19
術語“稠雜環基”指5至20元，系統中的每個環與體系中的其他環共享毗鄰的一對原子的多環雜環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環稠雜環基。稠雜環基的非限制性實例包括：
Figure 110110879-A0202-12-0028-20
術語“橋雜環基”指5至14員，任意兩個環共用兩個不直接連接的原子的多環雜環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，較佳為雙環、三環或四環，更佳為雙環或三環。橋雜環基的非限制性實例包括：
Figure 110110879-A0202-12-0029-21
該雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：
Figure 110110879-A0202-12-0029-22
和
Figure 110110879-A0202-12-0029-23
等。
雜環基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基。
術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共享毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10員，例如苯基和萘基，較佳苯基。該芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性實例包括：
Figure 110110879-A0202-12-0030-24
芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基和雜環烷硫基。
術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為5至10員，更較佳為5員或6員，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。該雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性實例包括：
Figure 110110879-A0202-12-0030-25
雜芳基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基和雜環烷硫基。
術語“胺基保護基”是為了使分子其它部位進行反應時胺基保持不變，用易於脫去的基團對胺基進行保護。非限制性實施例包含9-芴甲氧羰 基、第三丁氧羰基、乙醯基、苄基、烯丙基和對甲氧苄基等。這些基團可任選地被選自鹵素、烷氧基或硝基中的1-3個取代基所取代。該胺基保護基較佳為9-芴甲氧羰基。
術語“環烷基烷基”指烷基被一個或多個環烷基取代，較佳被一個環烷基取代，其中烷基如上所定義，其中環烷基如上所定義。
術語“鹵烷基”指烷基被一個或多個鹵素取代，其中烷基如上所定義。
術語“氘代烷基”指烷基被一個或多個氘原子取代，其中烷基如上所定義。
術語“羥基”指-OH基團。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
術語“胺基”指-NH2。
術語“硝基”指-NO2。
術語“氰基”指-CN。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1~3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
術語“載藥量”或“藥物載量”(DAR)是指ADC中每個抗體或其抗原結合片段上加載的細胞毒性藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值，其是整數或小數。在本揭露的實施方式中，載藥量表示為n，示例性的可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的均值。可用一般方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗和HPLC鑒定偶聯反應後每個ADC分子的藥物平均數量。
術語“藥物載量分佈”是指抗體藥物偶聯物群體中，連接不同數量藥物的抗體的分佈情況，例如，群體中連接0、2、4、6和8個藥物的抗體的分佈情況。值得注意的是，由於可能產生降解產物，使得1、3、5和7的DAR也可能包含於混合物中。本揭露中，抗體藥物載量分佈可以採用結合不同數量藥物的抗體重鏈來表徵，例如：H0表示未結合藥物的重鏈，H1表示結合一個藥物的重鏈，H2表示結合兩個藥物的重鏈，H3表示結合三個藥物的重鏈，H4表示結合四個藥物的重鏈。示例性的，H3比例為4%即代表在抗體藥物偶聯物的重鏈群體中，結合三個藥物的重鏈比例為4%。相應的，本揭露中抗體藥物載量分佈也可以採用結合不同數量藥物的抗體輕鏈來表徵，L0表示未結合藥物的抗體輕鏈，L1表示結合1個藥物的抗體輕鏈。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組 合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“置換”是指溶解抗體蛋白的溶劑體系的置換，例如，使用穩定製劑的緩衝體系經物理操作方式將含抗體蛋白的高鹽或高滲溶劑體系置換，從 而使抗體蛋白存在於穩定製劑中。所稱物理操作方式包括但不限於超濾、透析或離心後複溶。
圖1A為本揭露ADC-19的血漿穩定性實驗結果。
圖1B為本揭露ADC-18的血漿穩定性實驗結果。
圖1C為本揭露ADC-20的血漿穩定性實驗結果。
圖2為本揭露ADC-21、ADC-24對JIMT-1荷瘤小鼠藥效評價。
圖3為本揭露ADC對人乳腺癌細胞SK-BR-3移植瘤裸小鼠的療效評價。
圖4為本揭露ADC-25的血漿穩定性實驗結果。
圖5為本揭露ADC對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的療效。
圖6為本揭露ADC對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效。
圖7為本揭露ADC對人膠質細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的療效。
以下結合實施例進一步描述解釋本揭露，但這些實施例並非意味著限制本發明的範圍。
本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
一、抗體藥物偶聯物的製備及其性質和生物學測試
化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或質譜(MS)來確定的。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)，化學位移是以10-6(ppm)作為單位給出。
MS的測定用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(生產商：Thermo，型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。
UPLC的測定用Waters Acquity UPLC SQD液質聯用儀。
HPLC的測定使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150×4.6mm色譜管柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(Gimini C18 150×4.6mm色譜管柱)。
UV-HPLC的測定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度計。
增殖抑制率及IC50值的測定用PHERA starFS酶標儀(德國BMG公司)。
薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm矽膠板。
管柱層析一般使用煙臺黃海200~300目矽膠為載體。
本揭露的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。
實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。
氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。
氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。
加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。
氫化反應通常抽真空，充入氫氣，重複操作3次。
微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。
實施例中如無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。
實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫。
室溫為最適宜的反應溫度，溫度範圍是20℃~30℃。
實施例中pH=6.5的PBS緩衝液的配製：取KH2PO4 8.5g，K2HPO4.3H2O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置於瓶中，定容至2L，超聲波使其全部溶解，搖勻即得。
純化化合物採用的管柱層析的沖提劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括：A：二氯甲烷和異丙醇體系，B：二氯甲烷和甲醇體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。
本揭露部分化合物是藉由Q-TOF LC/MS來表徵的。Q-TOF LC/MS使用安捷倫6530精確質量數四級杆-飛行時間質譜儀和安捷倫1290-Infinity超高效液相色譜儀(安捷倫Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色譜管柱)。
實施例1-1
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丙烷-1-甲醯胺1
Figure 110110879-A0202-12-0037-26
向依喜替康甲磺酸鹽1b(2.0mg，3.76μmol，採用專利申請“EP0737686A1”公開的方法製備而得)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基環丙基甲酸1a(1.4mg，3.7μmol，採用公知的方法“Tetrahedron Letters,25(12),1269-72；1984”製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(3.8mg，13.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄 層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物1(1.6mg，產率：82.1%)。
MS m/z(ESI)：520.2[M+1]
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.90-7.84(m,1H),7.80-7.68(m,1H),5.80-5.70(m,1H),5.62-5.54(m,2H),5.44-5.32(m,2H),5.28-5.10(m,2H),3.40-3.15(m,3H),2.44(s,3H),2.23(t,1H),2.06-1.75(m,2H),1.68-1.56(m,1H),1.22-1.18(m,2H),1.04-0.98(m,2H),0.89(t,3H).
實施例1-2
(S)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-A(R)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-B
Figure 110110879-A0202-12-0038-27
Figure 110110879-A0202-12-0039-28
向1b(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入2-環丙基-2-羥基乙酸2a(2.3mg，19.8μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)、1-羥基苯并三唑(3mg，22.4μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.3mg，22.4μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌2小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物2用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)，B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2-A：1.5mg，2-B：1.5mg)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
單一構型化合物2-B(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.06分鐘，純度：88%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.37(d,1H),7.76(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.56(m,1H),5.48(d,1H),5.41(s,2H),5.32-5.29(m,2H),3.60(t,1H),3.19-3.13(m,1H),2.38(s,3H),2.20-2.14(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.83(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.34-1.28(m,1H),0.86(t,3H),0.50-0.39(m,4H)。
單一構型化合物2-A(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.10分鐘，純度：86%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.35(d,1H),7.78(d,1H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),5.58-5.53(m,1H),5.42(s,2H),5.37(d,1H),5.32(t,1H),3.62(t,1H),3.20-3.15(m,2H),2.40(s,3H),2.25-2.16(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.21-1.14(m,1H),0.87(t,3H),0.47-0.35(m,4H)。
實施例1-3
(S)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-A
(R)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-B
Figure 110110879-A0202-12-0041-29
向1b(5.0mg，9.41μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入3,3,3-三氟-2-羥基丙酸3a(4.1mg，28.4μmol，供應商Alfa)、1-羥基苯并三唑(3.8mg，28.1μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(5.4mg，28.2μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應10分鐘。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌8小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物3用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(1.5mg，1.5mg)。
MS m/z(ESI)：561.9[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.11分鐘，純度：88%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.94(d,1H),7.80(d,1H),7.32(s,1H),7.20(d,1H),6.53(s,1H),5.61-5.55(m,1H),5.45-5.23(m,3H),5.15-5.06(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.26-2.20(m,1H),2.16-2.08(m,1H),2.02-1.94(m,1H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
單一構型化合物(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.19分鐘，純度：90%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.97(d,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.16(d,1H),6.53(s,1H),5.63-5.55(m,1H),5.45-5.20(m,3H),5.16-5.07(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.22-2.14(m,1H),2.04-1.95(m,2H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
實施例1-4
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環戊烷-1-甲醯胺4
Figure 110110879-A0202-12-0043-30
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基-環戊烷甲酸4a(2.2mg，16.9μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.7mg，16.9μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4(2.5mg，產率：80.9%)。
MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.73-7.62(m,2H),5.75-5.62(m,1H),5.46-5.32(m,2H),5.26-5.10(m,1H),3.30-3.10(m,1H),2.43(s,3H),2.28-2.20(m,2H),2.08-1.84(m,8H),1.69-1.58(m,2H),1.04-1.00(m,2H),0.89(t,3H)。
實施例1-5
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羥甲基)環丙烷-1-甲醯胺5
Figure 110110879-A0202-12-0044-31
向1b(2.0mg，3.76μmol)中添加lmL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-(羥甲基)-環戊烷甲酸5a(0.87mg，7.5μmol，採用專利申請“WO201396771”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2mg，7.24μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物5(1.0mg，產率：50%)。
MS m/z(ESI)：533.9[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.07(s,1H),7.23-7.18(m,2H),6.71-6.64(m,1H),6.55-6.51(m,1H),5.36-5.27(m,2H),4.67-4.61(m,2H),3.53-3.48(m,1H),3.30-3.22 (m,2H),3.18-3.13(m,1H),2.71-2.61(m,2H),2.35-2.28(m,1H),2.04-1.91(m,4H),1.53-1.40(m,3H),0.91-0.75(m,4H)。
實施例1-6
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羥基甲基)環丁烷-1-甲醯胺6
Figure 110110879-A0202-12-0045-32
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-(羥基甲基)環丁烷-1-甲酸6a(2.2mg，16.9μmol；採用文獻“Journal of the American Chemical Society,2014,vol.136,#22,p.8138-8142”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.7mg，16.9μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無 水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物6(2.1mg，產率：67.9%)。
MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 7.85-7.62(m,1H),6.88(br,1H),5.87-5.48(m,2H),5.47-5.33(m,1H),5.31-5.06(m,1H),4.25-3.91(m,2H),3.25(br,1H),2.60-2.32(m,3H),2.23(t,1H),2.15-1.95(m,3H),1.70-1.56(m,2H),1.41-1.17(m,9H),1.03(s,1H),0.95-0.80(m,2H)。
實施例1-7
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丁烷-1-甲醯胺7
Figure 110110879-A0202-12-0046-33
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基環丁烷甲酸7a(2.0mg，17.22μmol，供應商藥石)，1-羥基苯并三唑(2.3mg，17.0μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸 鹽(3.2mg，16.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應10分鐘。撤去冰水浴，常溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物7(2.5mg，產率：83.1%)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.28(d,1H),7.75(d,1H),7.29(s,1H),6.51(s,1H),6.12(s,1H),5.59-5.51(m,1H),5.41(s,2H),5.20-5.01(m,2H),3.27-3.17(m,1H),3.15-3.05(m,1H),2.71-2.63(m,1H),2.37(s,3H),2.12-2.05(m,1H),2.03-1.94(m,2H),1.92-1.78(m,4H),1.50-1.42(m,1H),0.90-0.83(m,4H)。
實施例1-8
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8
Figure 110110879-A0202-12-0047-34
Figure 110110879-A0202-12-0048-35
第一步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸苄酯8c
將1-羥基環丙烷-1-羧酸苄酯8a(104mg，0.54mmol；採用專利申請“US2005/20645”公開的方法製備而得)和2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲基乙酸酯8b(100mg，0.27mmol；採用專利申請“CN105829346A”公開的方法製備而得)加入反應瓶，加入5mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(61mg，0.54mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於3mL 1,4-二噁烷中，加入0.6mL水，加入碳酸氫鈉(27 mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(70mg，0.27mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物8c(100mg，產率：73.6%)。
MS m/z(ESI)：501.0[M+1]。
第二步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸8d
將8c(50mg，0.10mmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(25mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到標題產物8d(41mg，產率：100%)。
MS m/z(ESI)：411.0[M+1]。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯8e
將1b(7mg，0.013mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入8d(7mg，0.017mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(7mg，0.026mmol)，冰浴攪拌反應35分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫 酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物8e(8.5mg，產率78.0%)。
MS m/z(ESI)：828.0[M+1]。
第四步
1-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8f
將8e(4mg，4.84μmol)溶於0.2mL二氯甲烷中，加入0.1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物8f(2.9mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：606.0[M+1]。
第五步
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8
將粗品8f(2.9mg，4.84μmol)溶於0.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-二側氧-1H-吡咯-1-基)已醯胺基)乙醯胺基)乙醯胺基)-3-苯基丙酸8g(2.7mg，5.80μmol，採用專利申請“EP2907824”公開的方法製備而得)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2.7mg，9.67μmol)，冰浴攪 拌反應30分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌15分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物8(2mg，產率：39.0%)。
MS m/z(ESI)：1060.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 9.01(d,1H),8.77(t,1H),8.21(t,1H),8.08-7.92(m,2H),7.73(d,1H),7.28(s,1H),7.24-7.07(m,4H),6.98(s,1H),6.50(s,1H),5.61(q,1H),5.40(s,2H),5.32(t,1H),5.12(q,2H),4.62(t,1H),4.52(t,1H),4.40-4.32(m,1H),3.73-3.47(m,8H),3.16-3.04(m,2H),2.89(dd,1H),2.69-2.55(m,2H),2.37-2.23(m,4H),2.12-1.93(m,4H),1.90-1.74(m,2H),1.52-1.38(m,4H),1.33-1.11(m,5H),0.91-0.81(m,4H)。
實施例1-9
N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-B
Figure 110110879-A0202-12-0052-36
Figure 110110879-A0202-12-0053-37
第一步
2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯9a
將2a(1.3g，11.2mmol；採用專利申請“WO2013/106717”公開的方法製備而得)溶於50mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(6.18g，44.8mmol)，溴化 苄(1.33mL，11.2mmol)和四丁基碘化銨(413mg，1.1mmol)。將反應液室溫攪拌48小時，藉由矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物9a(2g，產率：86.9%)。
第二步
10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯9b
將9a(120.9mg,0.586mmol)和8b(180mg，0.489mmol)加入反應瓶，加入4mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(109mg，0.98mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌40分鐘，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於4mL二噁烷中，加入2mL水，加入碳酸氫鈉(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室溫攪拌2小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物9b(48mg，產率：19%)。
MS m/z(ESI)：515.0[M+1]。
第三步
10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸9c
將9b(20mg，0.038mmol)溶於4.5mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(12mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物9c(13mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-環丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯9d
將1b(10mg，18.8μmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品9c(13mg，30.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(16.9mg，61.2μmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物9d(19mg，產率：73.6%)。
MS m/z(ESI)：842.1[M+1]。
第五步
2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺9e
將9d(19mg，22.6μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。往殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，保留固體。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵乾燥得到粗品標題產物9e(17mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：638.0[M+18]。
第六步
N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-B
將粗品9e(13.9mg，22.4μmol)溶於0.6mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(21.2mg，44.8μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(18.5mg，67.3μmol)，冰浴攪拌反應10分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物9。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(9-A：2.4mg，9-B：1.7mg)。
MS m/z(ESI)：1074.4[M+1]。
單一構型化合物9-A(較短保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.14分鐘，純度：85%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.60(t,1H),8.51-8.49(d,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.15(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.74-4.62(m,1H),4.54-4.40(m,2H),3.76-3.64(m,4H),3.62-3.48(m,2H),3.20-3.07(m,2H),3.04-2.94(m,1H),2.80-2.62(m,1H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.15(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.93-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.87(t,3H),0.64-0.38(m,4H)。
單一構型化合物9-B(較長保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.16分鐘，純度：89%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.68-8.60(m,1H),8.58-8.50(m,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.94(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.13(m,3H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.60-5.50(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,2H),4.78-4.68(m,1H),4.60-4.40(m,2H),3.76-3.58(m,4H),3.58-3.48(m,1H),3.20-3.10(m,2H),3.08-2.97(m,2H),2.80-2.72(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.13(m,2H),2.13-2.04(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.91-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,4H),0.91-0.79(m,3H),0.53-0.34(m,4H)。
實施例1-10
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺10-A
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺10-B
Figure 110110879-A0202-12-0058-38
Figure 110110879-A0202-12-0059-40
第一步
3,3,3-三氟-2-羥基丙酸苄酯10a
將3a(1.80g，12.5mmol)溶於100mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(5.17g，37.5mmol)，溴化苄(4.48mL，37.5mmol)和四丁基碘化銨(231mg，0.63mmol)。將反應液加熱至60℃攪拌5小時。將反應液冷卻至室溫，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物10a(980mg，產率：33.5%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.43-7.36(m,5H),5.34(s,2H),4.53(s,1H),3.44(s,1H)。
第二步
1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-10-(三氟甲基)-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯10b
將8b(63mg,0.17mmol)和10a(80mg，0.34mmol)加入反應瓶，加入3mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(38mg，0.34mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌20分鐘，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮，所得殘餘物溶於2mL二噁烷中，加入0.4mL水，加入碳酸氫鈉(19mg，0.23mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(49mg，0.19mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物10b(51mg，產率：55.3%)。
MS m/z(ESI)：559.9[M+18]。
第三步
1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-10-(三氟甲基)-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸10c
將10b(15mg，0.28mmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(15mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物10c(13mg)。
MS m/z(ESI)：452.9[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((3-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,1,1-三氟-3-側氧丙-2-基)氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯10d
將1b(10mg，18.8μmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入10c(13mg，28.7μmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(11mg，39.7μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物10d(16mg，產率97.8%)。
MS m/z(ESI)：870.0[M+1]。
第五步
2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟丙醯胺10e
將10d(16mg，18.4μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。往殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，保留固體；重複三次。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵乾燥得到粗品標題產物10e(12mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：647.9[M+1]。
第六步
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2，3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺10-A
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺10-B
將粗品10e(12mg，18.5μmol)溶於1.0mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(14mg，29.6μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(15mg，54.2μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物10。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)B-乙 腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2.7mg，2.6mg)。
MS m/z(ESI)：1102.0[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.18分鐘，純度：91%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.97(d,1H),8.85-8.76(m,1H),8.37-8.27(m,1H),8.12-8.02(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.26-7.10(m,4H),6.99(s,1H),6.66(br,1H),6.52(s,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,1H),5.37-5.25(m,3H),5.23-5.13(m,1H),4.81-4.68(m,2H),4.51-4.41(m,1H),3.78-3.45(m,6H),3.21-3.13(m,1H),3.02-2.93(m,1H),2.77-2.63(m,2H),2.45-2.29(m,3H),2.24-2.05(m,3H),2.04-1.93(m,5H),1.90-1.75(m,2H),1.52-1.38(m,4H),0.90-0.78(m,5H)。
單一構型化合物(較長保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.23分鐘，純度：90%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 9.05(d,1H),8.97-8.88(m,1H),8.35-8.27(m,1H),8.11-8.03(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.80(d,1H),7.34(s,1H),7.29-7.13(m,4H),6.99(s,1H),6.66(br,1H),6.54(s,1H),5.64-5.55(m,1H),5.43(s,1H),5.36-5.20(m,3H),4.92-4.85(m,1H),4.82-4.72(m,2H),4.52-4.42(m,1H),3.77-3.48(m,6H),3.21-3.14(m,1H),3.03-2.95(m,1H),2.79-2.65(m,2H),2.47-2.28(m,3H),2.25-2.05(m,3H),2.05-1.94(m,5H),1.91-1.76(m,2H),1.52-1.37(m,4H),0.92-0.77(m,5H)。
實施例1-11
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺11
Figure 110110879-A0202-12-0064-42
第一步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丁烷-1-羧酸苄酯11b
將1-羥基環丁烷-羧酸苄酯11a(167mg，0.81mmol，採用文獻“Journal of Medicinal Chemistry,2013,vol.56,# 13,p.5541-5552”公開的方法製 備而得)和8b(150mg，0.41mmol)加入反應瓶，加入5mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(92mg，0.82mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相並濃縮，所得殘餘物溶於3mL二噁烷中，加入0.6mL水，加入碳酸氫鈉(41mg，0.48mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(105mg，0.41mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物11b(37mg，產率：17.6%)。
MS m/z(ESI)：514.6[M+1]。
第二步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丁烷-1-羧酸11c將11b(37mg，71.9μmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(15mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應2小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到標題產物11c(35mg，產率：82%)，直接進行下一步。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丁氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯11d
將1b(10mg，0.018mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入11c(13mg，0.031mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(25mg，0.091mmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入8 mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(8mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系A純化所得殘餘物，得到標題產物11d(19mg，產率73.9%)。
MS m/z(ESI)：842.3[M+1]。
第四步
1-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺11e
將11d(19mg，22.6μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入4mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物11e(15mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第五步
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺11
將粗品11e(2mg，3.22μmol)溶於0.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(1.5mg，3.17μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2.7mg，9.67μmol)，室溫攪拌30分鐘。反應液用油泵旋乾，除掉DMF，殘餘物用 DCM溶解後直接用薄層層析法純化2次(展開劑極性：DCM/MeOH=10/1)，得到標題產物11(1mg，產率：28.8%)。
MS m/z(ESI)：1073.6[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.70-8.60(m,1H),8.28-8.19(m,1H),8.13-7.91(m,3H),7.79-7.71(d,1H),7.29(s,1H),7.25-7.09(m,4H),6.98(s,1H),6.71-6.62(m,1H),6.55-6.47(m,1H),5.64-5.54(m,2H),5.40(s,1H),5.35-5.27(t,2H),5.17-5.10(m,2H),4.60-4.51(m,1H),4.51-4.35(m,2H),3.93-3.78(m,3H),3.71-3.59(m,3H),3.01-2.88(m,3H),2.70-2.64(m,2H),2.44-2.30(m,3H),2.28-2.14(m,3H),2.11-1.92(m,6H),1.90-1.76(m,3H),1.51-1.39(m,4H),0.92-0.75(m,6H)。
實施例1-12
(S)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基丙醯胺12-A(R)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基丙醯胺12-B
Figure 110110879-A0202-12-0067-43
Figure 110110879-A0202-12-0068-44
第一步
3-環丙基-2-羥基丙酸12b
將12a(0.5g，3.87mmol，供應商Adamas)溶於35mL水和乙酸(V：V=4：1)的混合溶劑中，冰水浴降溫至0-5℃，滴加亞硝酸鈉(0.53g，7.74mmol)的2M水溶液，升至室溫攪拌反應3小時。向反應液中加入固體氯化鈉，使水相飽和，用乙酸乙酯(8mL×8)萃取，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮，得到標題產物12b(0.45g，產率：89.3%)。
第二步
(S)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基丙醯胺12-A(R)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基丙醯胺12-B
向1b(45mg，0.085mmol)中加入1.5mL乙醇和1.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，滴加0.1mL N-甲基嗎啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入12b(90mg，0.691mmol)，1-羥基苯并三唑(34mg，0.251mmol)和 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(49mg，0.256mmol)，加畢，室溫攪拌反應3小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物12用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：Sharpsil-T C18 5μm 21.2*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)，B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，得到標題產物(7mg，15mg)。
MS m/z(ESI)：547.9[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.345分鐘，純度：72%(色譜管柱：ZORBAX Ecliphase Plus C18 1.8μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.42(d,1H),7.78(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.60-5.50(m,2H),5.42(s,1H),5.19(q,2H),4.02-4.00(m,1H),3.21-3.11(m,2H),2.39(s,3H),2.21-2.07(m,2H),2.05-1.95(m,1H),1.92-1.68(m,4H),1.53-1.41(m,1H),0.87(t,3H),0.48-0.34(m,2H),0.14-0.01(m,2H)。
單一構型化合物(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.399分鐘，純度：88%(色譜管柱：ZORBAX Ecliphase Plus C18 1.8μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.36(d,1H),7.77(d,1H),7.31(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.51(m,1H),5.48(d,1H),5.42(s,1H),5.20(q,2H),4.09-4.02(m,1H),3.22-3.11(m,2H),2.39(s,3H),2.27-2.06(m,2H),2.05-1.95(m,1H),1.93-1.81(m,2H), 1.65-1.43(m,2H),1.32-1.21(m,1H),0.87(t,3H),0.48-0.33(m,2H),0.14-0.01(m,2H)。
實施例1-13(參照例)
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥乙醯胺
Figure 110110879-A0202-12-0070-45
標題化合物13參照專利“EP2907824A1中說明書第147頁的Example 76”公開的方法製備而得。
實施例1-14
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(環丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺14-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(環丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺14-B
Figure 110110879-A0202-12-0071-46
第一步
3-環丙基-2-羥基丙酸苄酯14a
將12b(200mg，1.54mmol)溶於20mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(1.06g，7.68mmol)，溴化苄(0.16mL，1.34mmol)和四丁基碘化銨(28mg，0.07mmol)。將反應液室溫攪拌48小時，藉由矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物14a(140mg，產率：41.3%)。
第二步
10-(環丙基甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯14b
將14a(94mg,0.427mmol)和8b(130mg，0.353mmol)加入反應瓶，加入10mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(79mg，0.704mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(10mL×4)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物14b(50mg，產率：26.8%)。
MS m/z(ESI)：529.2[M+1]。
第三步
10-(環丙基甲基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸14c
將14b(27mg，0.051mmol)溶於3mL乙酸乙酯，加入鈀碳(7mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物14c(23mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：439.1[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((3-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1-側氧丙-2-基)氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯14d
將1b(22mg，42.38μmol)加入反應瓶，加入3mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加三乙胺(4.3mg，42.49μmol)，加入粗品14c(23mg，51.1μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(17.6mg，63.6μmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入15mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(15mL)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物14d(29mg，產率：79.9%)。
MS m/z(ESI)：856.1[M+1]。
第五步
2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-3-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)丙醯胺14e
將14d(29mg，33.9μmol)溶於0.8mL二氯甲烷中，加入0.4mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。往殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，重複三次。將殘餘物減壓濃縮，油泵乾燥得到粗品標題產物14e(22mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：634.1[M+1]。
第六步
N-((2R,10S)-10-苄基-2-(環丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺14-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-(環丙基甲基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺14-B
將粗品14e(22mg，33.9μmol)溶於2.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，依次加入8g(24mg，50.8μmol)，和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(14mg，50.6μmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物14。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，得到標題產物(2mg，2mg)。
MS m/z(ESI)：1088.4[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.18分鐘，純度：88%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
單一構型化合物(較長保留時間)：
UPLC分析：保留時間1.23分鐘，純度：96%(色譜管柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7μm 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
實施例1-15
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五側氧-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3,4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺15
Figure 110110879-A0202-12-0075-47
Figure 110110879-A0202-12-0076-48
第一步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜癸基)環丙烷-1-羧酸苄酯15b
將8b(500mg，1.35mmol)加入反應瓶，加入6mL四氫呋喃，將1-羥基甲基環丙烷-1-甲酸苄酯15a(233mg，1.13mmol；採用專利申請“EP2862856A1中說明書第262頁的Example 22-2”公開的方法製備而得)加入瓶中，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入氫化鈉(54mg，1.35mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌40分鐘；降至零度加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉 乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物15b(15mg，產率：2.5%)。
MS m/z(ESI)：515.2[M+1]。
第二步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜癸基)環丙烷-1-羧酸15c
將15b(15mg，0.029mmol)溶於2mL乙酸乙酯中，加入鈀碳(3mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應4.5小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到標題產物15c(11mg，產率：89%)。
MS m/z(ESI)：425.2[M+1]。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙基)甲氧基)甲基)胺基)2-側氧乙基)胺基甲酸酯15d
將1b(10mg，0.021mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入15c(11mg，0.026mmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(10.7mg，0.039mmol)，加完後室溫攪拌反應60分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物15d(19mg，產率87.0%)。
MS m/z(ESI)：842.2[M+1]。
第四步
1-(((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)甲基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺15e
將15d(19mg，22.56μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液在0℃下減壓濃縮，加入1mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次；減壓濃縮得到粗品標題產物15e(13.9mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：620.1[M+1]。
第五步
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五側氧-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺15
將粗品15e(13.9mg，22.4μmol)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(15.8mg，33.4μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(9.3mg，33.6μmol)，升至室溫攪拌反應60分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物15(2.5mg，產率：10.3%)。
MS m/z(ESI)：1074.2[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.51-8.37(m,1H),8.22(t,1H),8.14-8.02(m,2H),8.011-7.94(m,1H),7.82-7.73(m,1H),7.29(s,1H),7.26-7.10(m,3H),6.98(s,1H),6.53-6.47(m,1H),5.62-5.50(m,1H),5.45-5.36(m,1H),5.35-5.23(m,2H),5.13-5.02(m,2H),4.61-4.50(m,2H),4.42-4.28(m,2H),3.76-3.61(m,3H),3.60-3.45(m,3H),3.27-3.23(m,1H),3.20-2.81(m,7H),2.75-2.61(m,3H),241-2.28(m,3H),2.23-2.13(m,2H),2.11-2.01(m,1H),2.03-1.94(m,1H),1.90(s,1H),1.87-1.74(m,2H),1.53-1.36(m,3H),1.29-1.08(m,4H),0.90-0.68(m,4H)。
實施例1-16
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五側氧-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺16
Figure 110110879-A0202-12-0079-49
Figure 110110879-A0202-12-0080-50
第一步
1-(羥基甲基)環丁烷-1-羧酸16b
將1-(羥甲基)環丁烷羧酸乙酯16a(250mg，1.58mmol，供應商Alfa)溶於甲醇(2mL)和水(1mL)，加入氫氧化鈉(126mg，3.15mmol)，升溫至40℃，攪拌反應3小時。冷卻至常溫，減壓濃縮除去有機溶劑，用乙醚(10mL)反萃，收集水相。水相用6N鹽酸水溶液調至pH 3-4，減壓濃縮得到固體。加入3mL甲苯，減壓濃縮旋乾，重複三次。油泵乾燥，得到粗品標題產物16b(206mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI，NEG)：129.2[M-1]。
第二步
1-(羥基甲基)環丁烷-1-羧酸苄酯16c
將粗品16b(206mg，1.58mmol)溶於乙腈(15mL)，加入無水碳酸鉀(1.09g，7.90mmol)和四丁基碘化銨(29mg，78.51μmol)，加入溴化苄(216mg，1.26mmol)，室溫攪拌過夜。過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物16c(112mg，產率：32.1%)。
MS m/z(ESI)：221.1[M+1]。
第三步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜癸基)環丁烷-1-羧酸苄酯16d
將16c(77mg，0.35mmol)和8b(100mg，0.27mmol)加入反應瓶，加入3mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(61mg，0.54mmol)，冰浴攪拌10分鐘。加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於3mL1,4-二噁烷中，加入0.5mL水，加入碳酸氫鈉(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(71mg，0.27mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物16d(24mg，產率：16.7%)。
MS m/z(ESI)：551.3[M+23]。
第四步
1-(10-(9H-芴-9-基)-5,8-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜癸基)環丁烷-1-羧酸16e
將16d(12mg，22.7μmol)溶於1.5mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(5mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反 應2小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液減壓濃縮，得到粗品標題產物16e(10mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第五步
(9H-芴-9-基)甲基(2-((((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丁基)甲氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯16f
將1b(7.5mg，0.014mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品16e(10mg)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(6mg，0.026mmol)，冰浴攪拌反應30分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物16f(10.6mg，產率87.8%)。
MS m/z(ESI)：856.2[M+1]。
第六步
1-(((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)甲基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺16g
將16f(10.6mg，12.4μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次。減壓濃縮得到粗品標題產物16g(8mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：634.1[M+1]。
第七步
1-((S)-9-苄基-22-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14,17-五側氧-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十二烷基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丁烷-1-甲醯胺16
將粗品16g(8mg)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，加入8g(8.8mg，18.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(5.2mg，18.8μmol)，室溫攪拌反應30分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，得到標題產物16(1.0mg，產率：7.2%)。
MS m/z(ESI)：1088.0[M+1]。
實施例1-17
(1r,4r)-N-((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)-3,6,9,12,15-五側氧-17,20,23,26,29,32,35,38,41-九氧雜-2,5,8,11,14-五氮雜四十三-43-基)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺17
Figure 110110879-A0202-12-0083-51
Figure 110110879-A0202-12-0084-52
第一步
1-苯基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-十氧雜三十一-31-酸第三丁酯17b
將1-苯基-2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧雜二十八-28-醇17a(0.34g，0.67mmol，供應商畢得)溶於10mL二氯甲烷中，依次加入氧化銀(0.24g，1.01mmol)、溴乙酸第三丁酯(0.16g，0.81mmol)和碘化鉀(0.07g，0.40mmol)，室溫 攪拌反應3小時。過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物17b(0.42g，產率：100%)。
MS m/z(ESI)：636.3[M+18]。
第二步
29-羥基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九-1-酸第三丁酯17c
將17b(417mg，0.67mmol)溶於15mL四氫呋喃，加入鈀碳(110mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，升至60℃攪拌反應3小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物17c(357mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：546.2[M+18]。
第三步
29-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九-1-酸第三丁酯17d
將17c(357mg,0.675mmol)溶於10mL甲苯，加入疊氮磷酸二苯酯(279mg，1.014mmol)和1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯(206mg，1.353mmol)，氬氣置換三次，室溫攪拌反應2小時，然後升至105℃反應19小時。反應液冷卻至室溫，濃縮，加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×4)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到粗品標題產物17d(412mg)。
MS m/z(ESI)：571.3[M+18]。
第四步
29-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九-1-酸第三丁酯17e
將17d(230mg，0.415mmol)溶於8mL四氫呋喃，加入鈀碳(58mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應2小時。反應液用矽藻土 過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物17e(220mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：528.2[M+1]。
第五步
1-((1r,4r)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己基)-1-側氧-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜三十一-31-酸第三丁酯17f
將(1r,4r)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-羧酸(98.5mg，0.415mmol)溶於10mL二氯甲烷，加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸鹽(190mg，0.500mmol)和N,N-二異丙基乙胺(162mg，1.253mmol)，氬氣置換三次，加入粗品17e(220mg，0.417mmol)，室溫攪拌反應1小時。加入15mL水，用二氯甲烷(8mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(15mL)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物17f(122mg，產率：39.2%)。
MS m/z(ESI)：747.2[M+1]。
第六步
1-((1r,4r)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己基)-1-側氧-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜三十一-31-酸17g
將17f(122mg，0.163mmol)溶於0.8mL二氯甲烷中，加入0.4mL三氟乙酸，室溫攪拌反應1小時。加入15mL二氯甲烷稀釋，減壓濃縮；加入10mL正己烷，減壓濃縮，重複兩次；再加入10mL甲苯減壓濃縮；用10mL正己 烷：乙醚=5：1的混合溶劑打漿三次，至pH接近7，濃縮，油泵抽乾，得到標題產物17g(98mg，產率：86.8%)。
MS m/z(ESI)：691.2[M+1]。
第七步
2,4-二甲氧基苄基1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙基-1-羧酸酯17h
將8d(164mg，0.40mmol)溶於二氯甲烷(5mL)，依次加入2,4-二甲氧基苄醇(81mg，0.48mmol)，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(115mg，0.60mmol)和4-二甲胺基吡啶(5mg，0.041mmol)，加畢，室溫攪拌反應1小時。加入20mL水，震盪後分層，水相用二氯甲烷(8mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物17h(124mg，產率：55.4%)。
MS m/z(ESI)：583.1[M+23]。
第八步
2,4-二甲氧基苄基(S)-1-((11-苄基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十七-17-基)氧基)環丙基-1-羧酸酯17j
將17h(39mg，69.6μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌1小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮。將所得到的粗品溶於2mL N,N-二甲基甲醯胺，加入(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘胺醯-L-苯丙胺酸17i(35mg，69.8μmol，採用專利申請“CN108853514A中說明書第13頁 的實施例7-12”公開的方法製備而得)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(23mg，83.1μmol)，室溫攪拌1小時。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物17j(48mg，產率：83.9%)。
MS m/z(ESI)：822.0[M+1]。
第九步
(S)-1-((11-苄基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十七-17-基)氧基)環丙烷-1-羧酸17k
將17j(48mg，58.4μmol)溶於1.4mL3%(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降溫至0-5℃，加入三乙基矽烷(21mg，180.6μmol)，冰浴攪拌反應3小時。冰浴下減壓濃縮除去一半有機溶劑，加入5mL乙醚，自然升至室溫打漿，析出白色固體，過濾，收集濾餅，油泵抽乾，得到標題產物17k(33mg，產率：84.1%)。
第十步
(9H-芴-9-基)甲基((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)-3,6,9,12-四側氧-2,5,8,11-四氮雜十三-13-基)胺基甲酸酯17l
將1b(20mg，42.4μmol)加入反應瓶，加入1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，氬氣置換三次，冰水浴冷卻至0~5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至1b溶解。將17k(33mg，49.1μmol)溶於1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然後滴加入上述反應液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基 氯化嗎啉鹽(17.6mg，63.6μmol)。升至室溫，攪拌反應1小時。加入10mL二氯甲烷和5mL水，攪拌5分鐘，靜置分層，收集有機相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物17l(37mg，產率：80.2%)。
MS m/z(ESI)：1090.1[M+1]。
第十一步
(1r,4r)-N-((S)-7-苄基-1-(1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)-3,6,9,12,15-五側氧-17,20,23,26,29,32,35,38,41-九氧雜-2,5,8,11,14-五氮雜四十三-43-基)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺17
將17l(15.5mg，14.23μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次。減壓濃縮，然後用油泵抽乾。將所得粗品溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17g(11mg，15.92μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(6.0mg，21.68μmol)，氬氣置換三次，室溫攪拌反應30分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物17(6mg，產率：27.4%)。
MS m/z(ESI)：1556.4[M+18]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.98(d,1H),8.76(s,1H),8.20(br,1H),8.12-7.95(m,3H),7.93-7.76(m,2H),7.75-7.66(m,2H),7.24(s,1H),7.20-7.05(m,6H),6.97(s,1H),6.64(br,1H),6.55(d,1H),6.47(s,1H),5.61-5.52(m,2H),5.37(s,1H),5.33-5.23(m,2H),5.18(s,1H),5.13(s,1H),5.05(s,1H),5.00(s,1H),4.65-4.55(m,2H),4.53-4.45(m,1H),4.38-4.28(m,2H),3.84(s,2H),3.67(d,3H),3.60-3.40(m,33H),3.18(d,1H),3.15-3.08(m,3H),2.28(s,3H),2.00-1.92(m,3H),1.85(s,2H),1.82-1.73(m,2H),1.68-1.52(m,4H),1.29-1.15(m,3H),0.86-0.76(m,5H)。
實施例1-18
(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六側氧-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十六-46-基)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺18
Figure 110110879-A0202-12-0090-53
Figure 110110879-A0202-12-0091-54
第一步
(R)-2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯18a
(S)-2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯18b
將2a(7.4g，63.7mmol)溶於200mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(35g，253.6mmol)，溴化苄(9.3g，54.4mmol)和四丁基碘化銨(500mg，1.36mmol)。將反應液室溫攪拌16小時，藉由矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物4.1g，進一步手性拆分純化，得到標題產物18a(1.1g)和18b(1.2g)。
第二步
(R)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯18c
將8b(3.1g，8.41mmol)溶於四氫呋喃(55mL)中，加入18a(2.0g，9.70mmol)，冰水浴冷卻至0~5℃，加入第三丁醇鉀(1.89g，16.84mmol)，冰水浴下攪拌10分鐘。加入乙酸乙酯(30mL)和水(20mL)，靜置分層，水相用氯仿(30mL×5)萃取，合併有機相。有機相減壓濃縮，所得殘餘物溶於1,4-二噁烷(32mL)和水(8mL)，加入碳酸鈉(1.78g，16.79mmol)和氯甲酸-9-芴基甲酯(2.18g，8.42mmol)，室溫攪拌2小時。反應液中加入水(30mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(30mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用管柱層析以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物18c(1.3g，產率：30.0%)。
MS m/z(ESI)：515.2[M+1]。
第三步
(R)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸18d
將18c(1.29g，2.51mmol)溶於乙酸乙酯(15mL)中，加入鈀碳(260mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應5小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(20mL)和甲醇(20mL)淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物18d(980mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：425.1[M+1]。
第四步
2,4-二甲氧基苄基(R)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酯18e
將粗品18d(980mg，2.31mmol)溶於二氯甲烷(15mL)中，加入2,4-二甲氧基苄醇(777mg，4.62mmol)，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(664mg，3.46mmol)和4-二甲胺基吡啶(28mg，0.23mmol)，室溫攪拌一小時。減壓濃縮除去有機溶劑，加入20mL水，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(30mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用管柱層析以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物18e(810mg，產率：61.1%)。
MS m/z(ESI)：575.0[M+1]。
第五步
2,4-二甲氧基苄基(R)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基乙酸酯18f
將18e(33mg，57.4μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌1小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物18f(21mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第六步
2,4-二甲氧基苄基(11S,19R)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十-20-酸酯18g
將粗品18f(21mg，57.4μmol)溶於3mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17i(29mg，57.8μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(19mg，68.7μmol)，室溫攪拌1小時。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用 無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物18g(37mg，產率：77.1%)。
MS m/z(ESI)：853.0[M+18]。
第七步
(11S,19R)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十-20-酸18h
將18g(37mg，44.3μmol)溶於1.4mL 3%(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降溫至0-5℃，加入三乙基矽烷(15.4mg，132.4μmol)，冰浴攪拌反應3小時。冰浴下減壓濃縮除去一半有機溶劑，加入5mL乙醚，自然升至室溫打漿，析出白色固體，過濾，收集濾餅，油泵抽乾，得到標題產物18h(24mg，產率：79.1%)。
MS m/z(ESI)：708.2[M+23]。
第八步
(9H-芴-9-基)甲基((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)胺基甲酸酯18i
將1b(30mg，63.6μmol)加入反應瓶，加入1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至1b溶解。將18h(65mg，94.8μmol)溶於1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然後滴加入上述反應液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(27mg，97.6μmol)。升至室溫，攪拌反應1小時。加入10mL二氯 甲烷和5mL水，攪拌5分鐘，靜置分層，收集有機相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物18i(25mg，產率：35.6%)。
MS m/z(ESI)：1104.4[M+1]。
第九步
(S)-2-(2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基)-N-(2-((((R)-1-環丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙氧基)-3-苯基丙醯胺18j
將18i(12mg，10.9μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌1.5小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物18j(10mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：881.0[M+1]。
第十步
(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六側氧-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十六-46-基)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺18
將粗品18j(10mg)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17g(8.5mg，12.3μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.6 mg，16.6μmol)，室溫攪拌30分鐘。反應液過濾，進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物18(9.5mg，產率：56.2%)。
MS m/z(ESI)：1570.2[M+18]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.77(d,1H),8.59-8.55(m,1H),8.42(d,1H),8.37-8.28(m,1H),8.25-8.06(m,2H),7.96-7.86(m,1H),7.86-7.70(m,2H),7.32-7.28(m,1H),7.25-7.14(m,3H),6.67(m,1H),5.96(s,1H),5.80-5.72(m,1H),5.62-5.52(m,2H),5.43-5.30(m,3H),5.28-5.17(m,2H),5.12-5.08(m,1H),4.72-4.35(m,8H),3.95-3.70(m,13H),3.35-3.22(m,14H),2.42-2.32(m,3H),2.05-1.98(m,4H),1.88-1.82(m,12H),1.47-1.39(m,3H),1.32-1.18(m,11H),0.90-0.80(m,4H),0.52-0.37(m,3H),0.32-0.18(m,2H)。
實施例1-19
(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六側氧-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十六-46-基)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺19
Figure 110110879-A0202-12-0096-55
Figure 110110879-A0202-12-0097-57
第一步
(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯19a
將18b(252mg,1.22mmol)加入反應瓶，加入4mL二氯甲烷，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鋰(98mg,1.22mmol)，冰水浴下攪拌反應15分鐘，變澄清，加入8b(300mg,814.3μmol)，冰水浴下攪拌2.5小時。加水(10mL)，分液，水相用二氯甲烷(8mL×2)萃取，合併有機相後用水(10mL×1)洗，飽和食鹽水(10mL×2)洗，無水硫酸鈉乾燥，過濾濃縮得粗品。用 矽膠管柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物19a(282mg，產率：67.2%)。
第二步
(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸19b
將19a(280mg，0.554mmol)溶於8mL乙酸乙酯中，加入鈀碳(84mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應3小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物19b(230mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
第三步
2,4-二甲氧基苄基(S)-10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸酯19c
將粗品19b(230mg，541.8μmol)溶於7mL二氯甲烷中，依次加入2,4-二甲氧基苯甲醇(136.7mg,812.7μmol)，1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(155mg,808.5μmol)和4-二甲胺基吡啶(6.6mg,53.5μmol)，室溫攪拌16小時。反應液用10mL二氯甲烷稀釋後，用水(10mL×1)洗，飽和食鹽水(10mL×2)洗，無水硫酸鈉乾燥，過濾濃縮得粗品。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物19c(159mg，產率：51.0%)
第四步
2,4-二甲氧基苄基(S)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基乙酸酯19d
將19c(60mg，104.4μmol)溶於1mL二氯甲烷中，加入0.5mL二乙胺，室溫攪拌1小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩 次；加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物19d(21mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第五步
2,4-二甲氧基苄基(11S,19S)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十-20-酸酯19e
將粗品19d(36mg，102.2μmol)溶於4mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17i(52mg，103.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(34.6mg，125.0μmol)，室溫攪拌1小時。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物19e(70mg，產率：80.2%)。
第六步
(11S,19S)-11-苄基-19-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,18-二氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜二十-20-酸19f
將19e(70mg，83.7μmol)溶於2.5mL 3%(v/v)的二氯乙酸的二氯甲烷溶液，冰水浴降溫至0-5℃，加入三乙基矽烷(29mg，249.4μmol)，冰浴攪拌反應3小時。冰浴下減壓濃縮除去一半有機溶劑，加入5mL乙醚，自然升至室溫打漿，析出白色固體，過濾，收集濾餅，油泵抽乾，得到標題產物19f(57mg，產率：99.2%)。
第七步
(9H-芴-9-基)甲基((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2- b]喹啉-1-基)胺基-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)胺基甲酸酯19g
將1b(30mg，63.6μmol)加入反應瓶，加入1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至1b溶解。將19f(57mg，83.1μmol)溶於1mL 10%(v/v)的甲醇的二氯甲烷溶液，然後滴加入上述反應液中，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(26mg，93.9μmol)。升至室溫，攪拌反應1小時。加入10mL二氯甲烷和5mL水，攪拌5分鐘，靜置分層，收集有機相；水相用二氯甲烷(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物19g(56mg，產率：79.8%)。
MS m/z(ESI)：1103.1[M+1]。
第八步
(S)-2-(2-(2-胺基乙醯胺基)乙醯胺基)-N-(2-((((S)-1-環丙基-2-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)-3-苯基丙醯胺19h
將19g(4.6mg，4.16μmol)溶於1.5mL二氯甲烷中，加入0.75mL二乙胺，室溫攪拌1.6小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物19h(4.0mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
第九步
(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15,18-六側氧-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-十氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜四十六-46-基)-4-((2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)環己烷-1-甲醯胺19
將粗品19h(4.0mg)溶於1mL N,N-二甲基甲醯胺，加入17g(2.9mg，4.2μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(1.5mg，5.4μmol)，室溫攪拌40分鐘。反應液過濾，進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜管柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物19(2.1mg，產率：32.4%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.71-8.62(m,1H),8.59-8.51(m,1H),8.34-8.26(m,1H),8.14-8.02(m,2H),7.95-7.86(m,1H),7.83-7.69(m,2H),7.35-7.31(m,1H),7.29-7.11(m,3H),7.01(s,1H),6.72-6.50(m,3H),5.59-5.50(m,2H),5.42(s,2H),5.38-5.18(m,3H),4.79-4.69(m,2H),4.61-4.42(m,3H),3.91(s,2H),3.79-3.65(m,4H),3.63-3.44(m,13H),3.41-3.30(m,2H),3.26-3.09(m,5H),3.08-2.84(m,4H),2.81-2.64(m,3H),2.42-2.28(m,3H),2.24-2.12(m,2H),2.05-1.93(m,4H),1.89-1.77(m,2H),1.72-1.56(m,3H),1.53-1.38(m,3H),1.34-1.10(m,11H),0.94-0.78(m,5H),0.52-0.35(m,3H)。
實施例1-20(參照例)
Figure 110110879-A0202-12-0102-58
標題化合物20參照專利“CN104755494A”中說明書第163頁的實施例58”提供的方法合成。
以下抗體按抗體一般方法進行製備，例如可進行載體構建後，轉染真核細胞如HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，表達純化後獲得。
以下為Trastuzumab的序列：
輕鏈
Figure 110110879-A0202-12-0102-59
SEQ ID NO.1
重鏈
Figure 110110879-A0202-12-0102-60
Figure 110110879-A0202-12-0103-61
SEQ ID NO.2
以下為Pertuzumab的序列：
輕鏈
Figure 110110879-A0202-12-0103-62
SEQ ID NO.3
重鏈
Figure 110110879-A0202-12-0103-63
Figure 110110879-A0202-12-0104-64
SEQ ID NO.4
以下為B7H3抗體1F9DS的序列：
輕鏈
Figure 110110879-A0202-12-0104-65
SEQ ID NO.5
重鏈
Figure 110110879-A0202-12-0104-66
SEQ ID NO.6
實施例1-21 ADC-1
Figure 110110879-A0202-12-0105-67
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；2.5mL，9.96mg/mL，0.168μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/mL，並取出2.0mL溶液往下反應。
將化合物10-較短保留時間化合物(2.1mg，2.02μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述2.0mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性產物ADC-1的PBS緩衝液(5.0mg/mL，1.1mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=5.09。
實施例1-22 ADC-2
Figure 110110879-A0202-12-0106-68
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；2.5mL，9.96mg/mL，0.168μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/mL，並取出2.0mL溶液往下反應。
將化合物10-較長保留時間化合物(2.1mg，2.02μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述2.0mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性產物ADC-2的PBS緩衝液(4.95mg/mL，1.1mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.39。
實施例1-23 ADC-3
Figure 110110879-A0202-12-0106-69
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；2.5mL，9.96mg/mL，0.168μmol)加 入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.082mL，0.82μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/mL，並取出2.0mL溶液往下反應。
將化合物8(2.1mg，2.02μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述2.0mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-3通式的示例性產物ADC-3的PBS緩衝液(5.24mg/mL，1.1mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.36。
實施例1-24 ADC-4
Figure 110110879-A0202-12-0107-70
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；3.74mL，13.38mg/mL，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至6.7mg/mL，並取出1.3mL溶液往下反應。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(1.0mg，0.93μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述1.3mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反 應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-4的PBS緩衝液(1.72mg/mL，2.36mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.39。
實施例1-25 ADC-5
Figure 110110879-A0202-12-0108-71
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；3.0mL，6.70mg/mL，0.136μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.067mL，0.67μmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，並取出0.614mL溶液往下反應。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(0.5mg，0.42μmol)溶解於0.031mL DMSO中，加入到上述0.614mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-5的PBS緩衝液(3.08mg/mL，0.82mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=3.16。
實施例1-26 ADC-6
Figure 110110879-A0202-12-0109-72
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；3.74mL，13.38mg/mL，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至6.7mg/mL，並取出0.75mL溶液往下反應。
將化合物9-較長保留時間化合物9-B(0.68mg，0.63μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述0.75mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4B通式的示例性產物ADC-6的PBS緩衝液(1.78mg/mL，1.78mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=3.94。
實施例1-27 ADC-7
Figure 110110879-A0202-12-0109-74
在37℃條件下，向抗體帕妥珠單抗(Pertuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；5.0mL，10mg/mL，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/mL，並取出1.0mL溶液往下反應。
將化合物8(0.65mg，0.6μmol)溶解於0.1mL DMSO中，加入到上述1.0mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-7通式的示例性產物ADC-7的PBS緩衝液(1.42mg/mL，2.15mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=6.91。
實施例1-28 ADC-8
Figure 110110879-A0202-12-0110-75
在37℃條件下，向抗體帕妥珠單抗(Pertuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；5.0mL，10mg/mL，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/mL，並取出1.6mL溶液往下反應。
將化合物10-較短保留時間化合物(1.04mg，1.0μmol)溶解於0.1mL DMSO中，加入到上述1.6mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-8通式的示例性產物ADC-8的PBS緩衝液(2.14mg/mL，2.31mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=6.58。
實施例1-29 ADC-9
Figure 110110879-A0202-12-0111-76
在37℃條件下，向抗體帕妥珠單抗(Pertuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；5.0mL，10mg/mL，0.338μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.173mL，1.73μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至5.0mg/mL，並取出0.8mL溶液往下反應。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(0.55mg，0.5μmol)溶解於0.1mL DMSO中，加入到上述0.8mL溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-9A通式的示例性產物ADC-9的PBS緩衝液(2.27mg/mL，1.11mL)，於4℃儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=3.16。
實施例1-30 ADC-10
Figure 110110879-A0202-12-0112-77
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.574mL，38.78mmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，19.76μL，197.6nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物14-較短保留時間化合物(0.64mg，588nmol)溶解於40μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-10通式的示例性產物ADC-10的PBS緩衝液(5.48mg/mL，1.03mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.25。
實施例1-31 ADC-11
Figure 110110879-A0202-12-0113-78
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.646mL，43.64nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，22.24μL，222.4nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物14-較長保留時間化合物(0.72mg，662nmol)溶解於40μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-10通式的示例性產物ADC-11的PBS緩衝液(2.13mg/mL，1.87mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.03。
實施例1-32 ADC-12
Figure 110110879-A0202-12-0113-81
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.726mL，49.05nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，25.0μL，250.0nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物15(0.81mg，754nmol)溶解於40μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-12通式的示例性產物ADC-12的PBS緩衝液(3.34mg/mL，1.45mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.93。
實施例1-33 ADC-13
Figure 110110879-A0202-12-0114-83
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.287mL，19.39nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，9.88μL，98.8nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物16(0.32mg，294nmol)溶解於20μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-13通式的示例性產物ADC-13的PBS緩衝液(2.37mg/mL，0.88mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.53。
實施例1-34 ADC-14
Figure 110110879-A0202-12-0115-84
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.592mL，40.0nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，20.38μL，203.8nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物17(0.92mg，598nmol)溶解於40μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-14通式的示例性產物ADC-14的PBS緩衝液(0.30mg/mL，12.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.61。
實施例1-35 ADC-15
Figure 110110879-A0202-12-0116-85
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.592mL，40.0nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，20.38μL，203.8nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物18(0.93mg，599nmol)溶解於40μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-15通式的示例性產物ADC-15的PBS緩衝液(0.32mg/mL，11.8mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.89。
實施例1-36 ADC-16
Figure 110110879-A0202-12-0116-86
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.53mL，35.8nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，18.25μL，182.5nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物19(0.83mg，534nmol)溶解於35μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-16通式的示例性產物ADC-16的PBS緩衝液(0.32mg/mL，12.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.43。
實施例1-37 ADC-17
Figure 110110879-A0202-12-0117-87
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.0mL，135.12nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，43.2μL，432nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(2.22mg，2067nmol)溶解於175μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-17的PBS緩衝液(1.32mg/mL，12.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=5.42。
實施例1-38 ADC-18(參照例)
Figure 110110879-A0202-12-0118-88
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.5mL，101.3nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，51.7μL，517nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(2.0mg，1934nmol)溶解於100μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-18通式的示例性產物ADC-18的PBS緩衝液(0.79mg/mL，13.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.23。
實施例1-39 ADC-19
Figure 110110879-A0202-12-0119-89
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.36mL，91.9nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，46.9μL，469nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(2.0mg，1862nmol)溶解於100μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-19的PBS緩衝液(0.73mg/mL，13.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.26。
實施例1-40 ADC-20
Figure 110110879-A0202-12-0119-90
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.5mL，101.3nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，51.7μL，517nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物10-較長保留時間化合物(2.0mg，1815nmol)溶解於100μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性產物ADC-20的PBS緩衝液(0.73mg/mL，13.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.43。
實施例1-41 ADC-21(參照例)
Figure 110110879-A0202-12-0120-91
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.86mL，125.4nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，63.9μL，639nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(2.07mg，2001nmol)溶解於150μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應 液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-18通式的示例性產物ADC-21的PBS緩衝液(2.91mg/mL，4.44mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.23。
實施例1-42 ADC-22
Figure 110110879-A0202-12-0121-92
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，1.88mL，127.2nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，64.9μL，649nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(2.1mg，1955nmol)溶解於150μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-22的PBS緩衝液(3.56mg/mL，3.98mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.79。
實施例1-43 ADC-23(參照例)
Figure 110110879-A0202-12-0122-93
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，345mL，23.31μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，11.89mL，118.9μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3.5小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(362mg，350μmol)溶解於7.12mL MeCN和3.56mL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液藉由超濾膜包先後用含有2%(v/v)MeCN和1%(v/v)DMSO的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)、琥珀酸緩衝水溶液(pH=5.3的0.01M的琥珀酸緩衝水溶液)脫鹽純化，之後加入蔗糖至60mg/mL、吐溫20至0.2mg/mL，裝瓶凍乾後得到FADC-18通式的示例性產物ADC-23的凍乾粉樣品，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.05。
實施例1-44 ADC-24
Figure 110110879-A0202-12-0123-95
在37℃條件下，向抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab)的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，332mL，22.43μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，11.44mL，114.4μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3.5小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(241mg，224μmol)溶解於13.76mL MeCN和6.88mL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液藉由超濾膜包先後用含有4%(v/v)MeCN和2%(v/v)DMSO的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)、琥珀酸緩衝水溶液(pH=5.3的0.01M的琥珀酸緩衝水溶液)脫鹽純化，之後加入蔗糖至60mg/mL、吐溫20至0.2mg/mL，裝瓶凍乾後得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-24的凍乾粉樣品，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.07。
實施例1-45 ADC-25
Figure 110110879-A0202-12-0124-96
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.14mL，144.60nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，73.7μL，740nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(3.0mg，2793nmol)溶解於150μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性產物ADC-25的PBS緩衝液(1.28mg/mL，13.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.87。
實施例1-46 ADC-26(參照例)
Figure 110110879-A0202-12-0124-97
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.89mL，60.14nmol)加入配置 好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1μL，300nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(1.0mg，967nmol)溶解於100μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性產物ADC-26的PBS緩衝液(1.61mg/mL，4.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.15。
實施例1-47 ADC-27
Figure 110110879-A0202-12-0125-98
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1μL，300nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(1.02mg，950nmol)溶解於100μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5 的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性產物ADC-27的PBS緩衝液(1.94mg/mL，3.5mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.11。
實施例1-48 ADC-28(參照例)
Figure 110110879-A0202-12-0126-99
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.36mL，159.47nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，81.3μL，810nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(3.0mg，2901nmol)溶解於150μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性產物ADC-28的PBS緩衝液(1.29mg/mL，13.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.46。
實施例1-49 ADC-29
Figure 110110879-A0202-12-0127-101
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.80mL，50.06nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，28.6μL，290nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-較短保留時間化合物9-A(1.29mg，1201nmol)溶解於100μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-25通式的示例性產物ADC-29的PBS緩衝液(2.63mg/mL，2.4mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.24。
實施例1-50 ADC-30(參照例)
Figure 110110879-A0202-12-0127-102
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.86mL，58.4nmol)加入配置好 的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，29.1μL，290nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物20(1.0mg，967nmol)溶解於100μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-26通式的示例性產物ADC-30的PBS緩衝液(1.61mg/mL，4.0mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.15。
實施例1-51 ADC-31
Figure 110110879-A0202-12-0128-103
在37℃條件下，向抗體B7H3抗體1F9DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1μL，300nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物8(1.0mg，943nmol)溶解於100μl DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液， 含0.001M的EDTA)，得到FADC-31通式的示例性產物ADC-31的PBS緩衝液(1.47mg/mL，4.5mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.33。
ADC原液藥物載量分析
實驗目的及原理
ADC原液是一種抗體交聯物類藥物，其治療疾病的機理是依賴抗體的靶向性將毒素分子運送到細胞中，進而將細胞殺死。藥物的載量對藥效起著決定性的作用。使用紫外法對ADC原液的藥物載量進行了測定。
實驗方法
將裝有琥珀酸鈉緩衝液的比色皿分別置於參比吸收池和樣品測定吸收池中後，扣除溶劑空白後，再將裝有供試品溶液的比色皿置於樣品測定吸收池中，測定280nm和370nm處吸光度。
結果計算：採用紫外分光光度法(使用儀器：Thermo nanodrop2000紫外分光光度計)測定ADC原液載量，其原理是在某波長下ADC原液的總吸光值等於細胞毒藥物與單株抗體在該波長下吸光值的加和，即：
(1)A280nm=εmab-280bCmab+εDrug-280bCDrug
εDrug-280：藥物在280nm平均莫耳消光係數5100；
CDrug：藥物的濃度；
εmab-280：曲妥珠單抗原液或帕妥珠單抗原液在280nm平均莫耳消光係數214600；
Cmab：曲妥珠單抗原液或帕妥珠單抗原液的濃度；
b：光程長度為1cm。
同理可以得到樣品在370nm下的總吸光值方程：
(2)A370nm=εmab-370bCmab+εDrug-370bCDrug
εDrug-370：藥物在370nm平均莫耳消光係數19000；
CDrug：藥物的濃度；
εmab-370：曲妥珠單抗原液或帕妥珠單抗原液在370nm消光係數為0；
Cmab：曲妥珠單抗原液的濃度；
b：光程長度為1cm。
由(1)和(2)兩種方程結合單株抗體和藥物在兩個檢測波長下的消光係數和濃度數據可以計算出藥物的載量。
藥物載量=CDrug/Cmab。
生物學評價
測試例1-1：本揭露化合物對腫瘤細胞體外增殖抑制測試
一、測試目的
本實驗的目的是為了檢測本揭露藥物化合物，對U87MG細胞(中科院細胞庫，Catalog # TCHu138)和SK-BR-3腫瘤細胞(人乳腺癌細胞，ATCC，貨號HTB-30)體外增殖的抑制活性。以不同濃度的化合物體外處理細胞，經6天培養後，採用CTG(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay，Promega，貨號：G7573)試劑對細胞的增值進行檢測，根據IC50值評價該化合物的體外活性。
二、實驗方法
下面以對U87MG細胞體外增殖抑制測試方法為例，用於舉例說明本揭露中測試本揭露化合物對腫瘤細胞進行體外增殖抑制活性測試的方法。本方法同樣適用於，但不限於對其它腫瘤細胞進行體外增殖抑制活性測試。
1、細胞培養：U87MG和SK-BR-3細胞分別用10%FBS的EMEM培養基(GE，貨號SH30024.01)和含10%FBS的McCoy's 5A培養基(Gibco，貨號16600-108)培養。
2、細胞準備：取對數生長期的U87MG和SK-BR-3細胞，用PBS(磷酸鹽緩衝液，上海源培生物科技股份有限公司)洗滌1次之後，加入2-3mL胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA(1x)，Gibico,Life Technologies公司)消化2-3min，待細胞消化完全後，加入10-15mL細胞培養液，將經過消化的細胞沖提下來，1000rpm離心5min，棄上清，接著加入10-20mL細胞培養液將細胞重懸，製成單細胞懸液。
3、細胞鋪板：將U87MG和SK-BR-3單細胞懸液混勻，用細胞培養液分別調整活細胞密度至2.75×103cells/mL和8.25×103cells/mL，將密度調整過後的細胞懸液混勻，以180μL/孔加入96孔細胞培養板。96孔板外周孔只加入200μL培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO2)。
4、化合物準備：用DMSO(二甲基亞碸，上海泰坦科技股份有限公司)溶解化合物，配製成初始濃度為10mM的存儲液。
小分子化合物的起始濃度為500nM，配藥方法如下。
在96孔U型底配藥板第一列中分別加入30μL不同待測樣品，樣品濃度為100μM；第2列至第11列每孔中加入20μL DMSO。取第一列樣品10 μL至第二列20μL DMSO中，混勻，取10μL至第三列中，以此類推至第10列。將配藥板中的藥每孔取5μL至95μL EMEM培養基中，混勻，待用。
ADC的起始濃度為10nM或500nM，配藥方法如下。
在96孔板第一列中分別加入100μL不同待測樣品，樣品濃度為100nM或5μM；第2列至第11列每孔中加入100μL PBS。取第一列樣品50μL至第二列100μL PBS中，混勻，取50μL至第三列中，以此類推3倍稀釋至第10列。
5、加樣操作：向培養板中加入20μL配置的不同濃度的待測樣品，每個樣品兩複孔。將培養板在培養箱孵育6天(37℃，5% CO2)。
6、顯色操作：取出96孔細胞培養板，向每孔加入90μL CTG溶液，室溫孵育10分鐘。
7、讀板操作：取出96孔細胞培養板，置於酶標儀(BMG labtech，PHERAstar FS)中，用酶標儀測定化學發光。
三、數據分析
用Microsoft Excel，Graphpad Prism 5對數據進行處理分析。實驗結果參見下表1。
表1. 本揭露中的小分子片段對SK-BR-3細胞和U87細胞體外增殖抑制的IC50值
Figure 110110879-A0202-12-0133-104
結論：本揭露中的小分子片段對SK-BR-3細胞和U87細胞具有明顯的增殖抑制活性，手性中心對化合物的抑制活性有一定影響。
測試例1-2：本揭露抗體藥物偶聯物對HER2靶標的腫瘤細胞的體外增殖抑制測試
本實驗的目的是為了檢測本揭露針對HER2靶標的抗體藥物偶聯物，對SK-BR-3(人乳腺癌細胞，ATCC，貨號HTB-30)和MDA-MB-468(人乳腺癌細胞，ATCC，貨號HTB-132)體外增殖的抑制活性。以不同濃度的化合物體外處理細胞，經6天培養後，採用CTG試劑對細胞的增值進行檢測，根據IC50值評價該化合物的體外活性。
按照測試例1的測試方法，測試細胞為SK-BR-3和MDA-MB-468，細胞培養液分別為含10% FBS的McCoy's 5A培養基(Gibco，貨號16600-108)，含10% FBS的EMEM培養基(GE，貨號SH30024.01)，和含10% FBS的L-15培養基(ThermoFisher，貨號11415-114)。用細胞培養液將三株細胞分別調整活細胞密度至8.33×103個細胞/mL、8.33×103個細胞/mL和1.39×104個細胞/mL，將密度調整過後的細胞懸液混勻，以180μL/孔加入96孔細胞培養板。對相關化合物進行測試，得到結果見下表2。
表2. 本揭露抗體藥物偶聯物對HER2靶標的腫瘤細胞的體外增殖抑制的IC50值
Figure 110110879-A0202-12-0134-105
結論：本揭露針對HER2靶標的抗體藥物偶聯物對HER2陽性細胞SK-BR-3具有明顯的增殖抑制活性；同時，它們對HER2陰性細胞MDA-MB-468增殖抑制活性弱；具有良好的選擇性。
測試例1-3：Her2-ADC血漿穩定性實驗
將ADC-19樣品、ADC-18樣品、ADC-20樣品、人血漿、猴血漿(上海美迪西生物醫藥股份有限公司)、和1%BSA(Sigma)PBS溶液(上海生工)分別用0.22μm的過濾器過濾除菌。將ADC-19、ADC-18、ADC-20分別以終濃度200μg/mL加入上述無菌血漿或1%BSA PBS溶液中，置於37℃細胞培養箱中孵育，將孵育當天記為第0天，隨後分別在第7天、14天和21天取出樣品，進行游離毒素的檢測。
取25μL樣品至96孔板中；加入50μL內標工作液(100ng/mL喜樹鹼乙腈溶液)及150μL乙腈；渦旋混合5分鐘，離心10分鐘(4000rpm)，5μL進行LC/MS/MS(美國應用生物系統公司)分析。
結果顯示：ADC-19在人和猴血漿，以及1%BSA PBS溶液中都相當穩定，游離毒素的釋放率最高不超過2.1%，且在第14天趨於穩定，見圖1A。
ADC-18在人和猴血漿中穩定性差，游離毒素的釋放率最高分別為14.5%和8.10%。在1%BSA PBS溶液中比較穩定，見圖1B。
ADC-20在人血漿、猴血漿和1%BSA PBS溶液中穩定性均比較差，游離毒素的釋放率最高分別為21.7%、29.7%和21.7%，且在1%BSAPBS溶液中一直處於降解狀態，見圖1C。
測試例1-4：JIMT-1荷瘤小鼠藥效評價
1、試驗目的
以nu/nu裸鼠為受試動物，評價Her2-ADC抗體T-DM1、ADC-21、ADC-24腹腔注射給藥後，對人乳腺癌細胞曲妥珠單抗(Trastuzumab)耐藥株(赫賽汀)JIMT-1移植瘤裸小鼠的療效。
2、受試藥物及材料
2-1、受試藥物
T-DM1(參考US20050169933製備)
ADC-21：3mg/kg
ADC-21：10mg/kg
ADC-24：3mg/kg
ADC-24：10mg/kg
空白對照(Blank)：PBS
2-2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
2-3、試驗動物
nu/nu裸鼠，購自北京維通利華。
3、試驗方法
在小鼠右肋部皮下接種JIMT-1細胞(南京科佰)(5×106/只，具有50%人工基底膜)，腫瘤生長8天，長至203.09±11.94mm3後將動物隨機分組(d1)，8隻/組，共6組。
採用腹腔注射給藥，共給藥2次。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。
數據統計使用Excel 2003統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照組(Vehicle，PBS)及實驗組的相對腫瘤體積。
4、試驗結果
實驗結果如圖2顯示，腹腔注射給藥2次，觀察至第34天時結束實驗。T-DM1(10mg/kg)對腫瘤無抑制作用；ADC-21，3mg/kg的抑瘤率46.22%(P<0.01)；ADC-21，10mg/kg的抑瘤率56.77%(P<0.001)；ADC-24，3mg/kg的抑瘤率62.77%(P<0.001)；ADC-24，10mg/kg的抑瘤率76.32%(P<0.001)。在同等劑量情況下，ADC-24的抑瘤效果明顯好於ADC-21。
測試例1-5：SK-BR-3荷瘤小鼠藥效評價
1、試驗目的
以nu/nu裸鼠為受試動物，評價Her2-ADC抗體ADC-21、ADC-22腹腔注射給藥後對人乳腺癌細胞SK-BR-3移植瘤裸小鼠的療效。
2、受試藥物及材料
2-1、受試藥物
ADC-21：1mg/kg
ADC-21：6mg/kg
ADC-22：1mg/kg
ADC-22：6mg/kg
空白對照(Blank)：PBS。
2-2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
2-3、試驗動物
nu/nu裸鼠，購自北京維通利華。
3、試驗方法
在小鼠右肋部皮下接種SK-BR-3細胞(ATCC)(5×106/隻，具有50%人工基底膜)，腫瘤生長20天，長至153.34±11.73mm3後將動物隨機分組(d0)，8隻/組，共5組。
採用腹腔注射給藥1次。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。
數據統計使用Excel 2003統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照及實驗組的相對腫瘤體積。
4、試驗結果
實驗結果如圖3顯示，腹腔注射給藥1次，觀察至第28天時結束實驗，ADC-21 1mg/kg的抑瘤率15.01%；ADC-21 6mg/kg的抑瘤率77.4%，且和空白對照相比有非常顯著差異(P<0.001)。ADC-22 1mg/kg的抑瘤率19.82%； ADC-22 6mg/kg的抑瘤率98.38%(P<0.001)。同為6mg/kg劑量情況下，ADC-22的抑瘤效果也明顯好於ADC-21。
測試例1-6：血漿穩定性
將樣品ADC-25，以100μg/mL的終濃度，分別與人血漿、猴血漿、和1%BSA PBS溶液混合均勻後，過濾除菌後置於37℃水浴鍋內孵育，將孵育當天記為第0天，隨後分別在第7天、14天和21天取出樣品，進行游離毒素的檢測。
不同時間點的樣品取出後放至室溫，渦旋混勻；取25μL樣品至96孔板中；加入50μL內標工作液(100ng/mL喜樹鹼乙腈溶液)及150μL乙腈；渦旋混合5分鐘，離心10分鐘(4000rpm)，取上清液5μL進行LC/MS/MS分析。
結果如圖4顯示，ADC-25在人和猴血漿，以及1%BSA PBS溶液中都相當穩定，游離毒素的釋放率最高不超過2%，且在第14天趨於穩定。
測試例1-7：ADC對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的療效評價
1、試驗目的
本實驗以BALB/cA-nude裸小鼠為受試動物，評價本揭露ADC化合物對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的療效。
2、受試藥物及材料
2-1、受試藥物
ADC-27(3mg/kg)
ADC-26(3mg/kg)
空白對照(Blank)：pH7.4的PBS緩衝液。
2-2、配製方法：pH7.4的PBS緩衝液。
2-3、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠：購自上海傑思捷實驗動物有限責任公司。
3、試驗方法
實驗用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7週，皮下接種人腦星形膠質母細胞瘤U87MG細胞(人腦星形膠質母細胞瘤，中科院細胞庫，Catalog # TCHu138)。接種細胞後第十天，將動物隨機分組(D0)，每組8隻，開始腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：
V=1/2×a×b2
其中，a、b分別表示長、寬。
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的對照組(空白)及實驗組的相對腫瘤體積。
4、試驗結果
腹腔注射(i.p.)給藥每週1次，共給藥3次，觀察至第22天時，ADC-27 3mg/kg的抑瘤率達到63.3%(P<0.0001)；ADC-26 3mg/kg的抑制率達到49.1%。ADC-27顯示出比ADC-26更強的抗腫瘤療效。
給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。檢測結果如表3和圖5所示。所檢測抗體能夠有效抑制荷瘤裸鼠中U87MG移植瘤的生長，並且呈現出劑量依賴性。
表3. 給藥抗體對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的療效(D22)
Figure 110110879-A0202-12-0141-106
***表示P<0.001
測試例1-8：ADC對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效評價
1、試驗目的
本實驗以BALB/cA-nude裸小鼠為受試動物，評價本揭露ADC化合物對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效。
2、受試藥物及材料
2-1、受試藥物
ADC-29(3mg/kg)
ADC-28(3mg/kg)
陰性對照ADC(3mg/kg)：非B7H3靶點抗體與化合物20偶聯形成的抗體藥物偶聯物。
2-2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
2-3、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠：購自常州卡文斯實驗動物有限責任公司。
3、試驗方法
實驗用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7週，皮下接種人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562細胞(ATCC，Catalog #ATCC® CCL-138TM)。接種細胞後第十天，將動物隨機分組(D0)，每組8隻，開始腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：
V=1/2×a×b2
其中，a、b分別表示長、寬。
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的對照組(陰性對照)及實驗組的相對腫瘤體積。
4、試驗結果
腹腔注射給藥每週1次，共給藥3次，觀察至第28天時，受試ADC抑瘤率分別是：ADC-29 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到72.27%(P<0.001)； ADC-28 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到56.2%(P<0.001)。ADC-29均顯示出比ADC-28更強的抗腫瘤療效。
給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。檢測結果如表4和圖6所示。所檢測抗體能夠有效抑制荷瘤裸鼠中Detroit 562移植瘤的生長，並且呈現出劑量依賴性。
表4. 給藥抗體對荷瘤裸鼠Detroit 562移植瘤的療效(D28)
Figure 110110879-A0202-12-0143-108
***表示P<0.001
測試例1-9：U87-MG荷瘤小鼠藥效評價
1、試驗目的
以Balb/c裸鼠為受試動物，在其人膠質瘤細胞U87MG移植瘤模型上評價B7H3-抗體藥物偶連物腹腔注射後的療效。
2、受試藥物及材料
2-1、受試藥物
ADC-30 1mg/kg
ADC-30 3mg/kg
ADC-31 1mg/kg
ADC-31 3mg/kg
空白對照(Blank)：PBS
2-2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
2-3、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠：購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。
3、試驗方法
在小鼠右肋部皮下接種U87MG細胞(人腦星形膠質母細胞瘤，中科院細胞庫，Catalog # TCHu138)(2.5×106/隻)，腫瘤生長14天，長至167.49mm3後將動物隨機分組(d1)，8隻/組，共5組。
採用腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次。每週測量2次瘤體積和體重，記錄數據。
數據統計使用Excel 2003統計軟體：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SQRT計算；組間差異P值以TTEST計算。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照組(Vehicle)及實驗組的相對腫瘤體積。
4、試驗結果
實驗結果如圖7顯示，腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，觀察至第18天時，受試ADC抑瘤率分別為：ADC-30 1mg/kg的抑瘤率為0.31%；ADC-30 3mg/kg的抑瘤率達到45.23%(P<0.0001)；ADC-31 1mg/kg的抑瘤率達到39.22%(P<0.01)；ADC-31 3mg/kg的抑瘤率達到80.24%(P<0.0001)。在同等劑量情況下，ADC-31的抑瘤效果明顯好於ADC-30。
二、製備工藝優化
以下實施例的示例性產物具有如下式所示的結構：
Figure 110110879-A0202-12-0145-109
實施例2-1
在0℃條件下，在含有2.5mM EDTA的20mM組胺酸-鹽酸緩衝液(pH 5.6)中，含61.71mg曲妥珠的抗體原液(0.0004251mmol，用20mM組胺酸-鹽酸緩衝液稀釋曲妥珠抗體至抗體終濃度15mg/mL)與0.7311mg三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，0.002550mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(3.196mg，0.002975mmol)溶解於0.2062mL DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.2052mL DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中 間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，加入過量半胱胺酸淬滅反應。得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-2-1。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.45。
實施例2-2
在13℃條件下，在含有2.5mM EDTA的20mM組胺酸-鹽酸緩衝液(pH5.6)中，含61.71mg曲妥珠的抗體原液(0.0004251mmol，用20mM組胺酸-鹽酸緩衝液稀釋曲妥珠抗體至抗體終濃度15mg/mL)與0.5118mg三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，0.001785mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(3.196mg，0.002975mmol)溶解於0.2062mL DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.2052mL DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，加入過量半胱胺酸淬滅反應。得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-2-2。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.49。
實施例2-3
在25℃條件下，在含有2.5mM EDTA的20mM組胺酸-鹽酸緩衝液(pH 5.6)中，含61.71mg曲妥珠的抗體原液(0.0004251mmol，用20mM組胺酸-鹽酸緩衝液稀釋曲妥珠抗體至抗體終濃度15mg/mL)與0.4021mg三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，0.001403mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(3.196mg，0.002975mmol)溶解於0.2062mL DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.2052mL DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，加入過量半胱胺酸淬滅反應。得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-2-3。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.39。
實施例2-4
在28℃條件下，在含有2.5mM EDTA的20mM組胺酸-鹽酸緩衝液(pH5.6)中，含61.71mg曲妥珠的抗體原液(0.0004251mmol，用20mM組胺酸-鹽酸緩衝液稀釋曲妥珠抗體至抗體終濃度15mg/mL)與0.3899mg三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，0.001360mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(3.196mg，0.002975mmol)溶解於0.2062mL DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.2052mL DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，加入過量半胱胺酸淬滅反應。得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-2-4。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.44。
實施例2-5
在37℃條件下，在含有2.5mM EDTA的20mM組胺酸-鹽酸緩衝液(pH 5.6)中，含61.71mg曲妥珠的抗體原液(0.0004251mmol，用20mM組胺酸-鹽酸 緩衝液稀釋曲妥珠抗體至抗體終濃度15mg/mL)與0.3778mg三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，0.001318mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(3.196mg，0.002975mmol)溶解於0.2062mL DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.2052mL DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，加入過量半胱胺酸淬滅反應。得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-2-5。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.46。
實施例2-6
在13℃條件下，在含有2.5mM EDTA的50mM PBS緩衝液(pH 6.5)中，含55.02mg曲妥珠的抗體原液(0.0003790mmol，用50mM PBS緩衝液稀釋曲妥珠抗體至抗體終濃度15mg/mL)與0.4563mg三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，0.001592mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(2.850mg，0.002653mmol)溶解於0.1839mL DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.1829mL DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，加入過量半胱胺酸淬滅反應。得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-2-6。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.39。
實施例2-7
在25℃條件下，在含有2.5mM EDTA的50mM PBS緩衝液(pH 6.5)中，含55.02mg曲妥珠的抗體原液(0.0003790mmol，用50mM PBS緩衝液稀釋曲妥珠抗體至抗體終濃度15mg/mL)與0.3477mg三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，0.001213mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(2.850mg，0.002653mmol)溶解於0.1839mL DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.1829mL DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，加入過量半胱胺酸淬滅反應。得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-2-7。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.50。
實施例2-8
在37℃條件下，在含有2.5mM EDTA的50mM PBS緩衝液(pH 6.5)中，含55.02mg曲妥珠的抗體原液(0.0003790mmol，用50mM PBS緩衝液稀釋曲妥珠抗體至抗體終濃度15mg/mL)與0.3259mg三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，0.001137mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(2.850mg，0.002653mmol)溶解於0.1839mL DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.1829mL DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，加入過量半胱胺酸淬滅反應。得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-2-8。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.47。
實施例2-9
在25℃條件下，在含有2.5mM EDTA的20mM組胺酸-鹽酸緩衝液(pH 5.6)中，含127.4g曲妥珠的抗體原液(0.88mmol，用20mM組胺酸-鹽酸緩衝液稀釋曲妥珠至抗體終濃度15mg/mL)與0.83g三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Sigma，2.90mmol)在恆溫水浴中攪拌反應3小時，生成中間體I溶液。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(6.6g，6.14mmol)溶解於0.43L DMSO中，生成化合物9-A的DMSO溶液。向上述中間體I溶液中預加0.43L DMSO，再將上述化合物9-A的DMSO溶液加入到預加DMSO的中間體I溶液中，於水浴25℃攪拌反應1小時，停止反應。
將上述反應液用Capto S Impact(GE)陽離子層析管柱純化，分別用不少於9個管柱體積的含有10%(v/v)DMSO的0.05M醋酸緩衝液(pH=5.5)和6個管柱體積0.05M醋酸緩衝液(pH=5.5)洗滌，再用0.05M醋酸緩衝液(pH 5.5，含0.39M氯化鈉)進行沖提，去除反應液中游離毒素和殘留溶劑。在25℃，將陽離子沖提液進行7倍體積等體積超濾(30kd超濾膜包)換液至0.01M琥珀酸緩衝液(pH 5.0)，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-A1。採用上述方法製備4個批次的樣品。
反相色譜-質譜法測定得上述4個批次樣品的載藥量均為5.7。四個批次收率分別為100.8%、98.9%、97.4%和99.0%。
實施例2-10
在37℃條件下，向曲妥珠單抗的PBS緩衝液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，164mL，11.08μmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，3.55mL，35.5μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3.5小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9較短保留時間化合物9-A(185mg，172μmol)溶解於3.88mL乙腈和1.94mL DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液藉由超濾膜包先後用含有2%(v/v)乙腈和1%(v/v)DMSO的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液)、琥珀酸緩衝水溶液(pH=5.3的0.01M的琥珀酸緩衝水溶液)脫鹽純化，除去小分子，得到FADC-4A通式的示例性產物ADC-B14樣品，於4℃儲存。
反相色譜-質譜法計算平均值：n=5.3。
測試例2-1藥物載量分佈測試
1.RP-DAR測定方法
1.1.在以下測量條件下進行RP-DAR分析：
UPLC系統：Waters H-Class超高效液相色譜儀UPLC系統
檢測器：TUV檢測器(測量波長：280nm)
色譜管柱：Waters ACQUITY UPLC Protein BEH C4(2.1mm×150mm,1.7μm)
管柱溫：80℃
流速：0.3mL/min
樣品室溫度：20℃
運行時間：25min
流動相A：0.1%二氟乙酸(DFA)水溶液
流動相B：0.1%DFA乙腈溶液
梯度程序：27.0%B-44.0%B(0.00min-12.00min)，44.0%B-100%B(12.00min-13.00min)，100%B-100%B(13.00min-20.00min)，100%B-27.0%B(20.00min-20.04min)，27.0%B-27.0%B(20.04min-25min)
注入樣品量：1.0μL
1.2.數據分析
當與藥物不結合的抗體的輕鏈(L0)和重鏈(H0)相比時，在藥物結合的輕鏈(一個藥物結合的輕鏈：L1)和藥物結合的重鏈(一個藥物結合的重鏈：H1，兩個藥物結合的重鏈：H2，三個藥物結合的重鏈：H3，四個藥物結合的重鏈：H4)的情況下，疏水性與結合藥物的數目成比例的增加，並且保留時間延長。因此，以L0、L1、H0、H1、H2、H3和H4的順序進行沖提。
由於藥物接頭吸收UV，根據以下表達式，使用輕鏈、重鏈和藥物接頭的莫耳吸光係數，根據結合的藥物的數目，對所得的峰面積進行校正。計算公式如下：
輕鏈(ε LC-280)/(ε LC-280+連接藥物數×ε藥物-280)
重鏈(ε HC-280)/(ε HC-280+連接藥物數×ε藥物-280)
備註：ε LC-280：輕鏈在280nm的莫耳消光係數；
ε HC-28：重鏈在280nm的莫耳消光係數；
ε藥物-280：毒素在280nm的莫耳消光係數。
表5. 反相色譜載藥量計算表
Figure 110110879-A0202-12-0153-110
備註：LC校正峰面積總和=L0校正峰面積+L1校正峰面積
HC校正峰面積總和=H0校正峰面積+H1校正峰面積+H2校正峰面積+H3校正峰面積+H4校正峰面積
載藥量n=2×Σ(連接藥物數×校正峰面積百分比)/100
2．測定結果
表6. 藥物載量分佈測定
Figure 110110879-A0202-12-0154-112
註：ADC-2-1至ADC-2-8中，H4的含量低於檢測限(<<1%)
結果顯示，對於採用相同緩衝體系，不同還原反應溫度製備的樣品，隨著還原反應溫度的降低，樣品藥物載量分佈均一程度顯著提高；對於採用相同還原反應溫度，不同緩衝體系製備的樣品，採用組胺酸-鹽酸緩衝體系的樣品藥物載量分佈更為均一。
測試例2-2：游離毒素測試
1．游離毒素測定方法
1.1.在以下測量條件下進行HPLC分析：
HPLC系統：Waters H-Class超高效液相色譜儀UPLC系統
檢測器：TUV檢測器(測量波長：370nm)
色譜管柱：Waters ACQUITY UPLC Petide BEH C18(130Å，2.1mm×150mm,1.7μm)
管柱溫：40℃
流速：0.3mL/min
樣品室溫度：10℃
流動相A：0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液
流動相B：0.1% TFA乙腈溶液
梯度程序：25.0%B-25.0%B(0.00min-1.00min)，25.0%B-55.0%B(1.00min-17.00min)，55.0%B-25.0%B(17.00min-17.10min)，25.0%B-25.0%B(17.10min-20.00min)
注入樣品量：5.0μL
1.2.數據分析
毒素的LOD限度的計算公式如下：
毒素限度(ppm)=0.1×4×1000/C
註：
a)0.1為毒素LOD溶液濃度(μg/mL)，4為樣品前處理時的稀釋倍數，1000為單位換算係數，C為測定樣品的蛋白濃度(mg/mlmL)。
b)供試品中的游離毒素峰面積小於LOD溶液的峰面積，則判定為小於限度或未檢測出。
2．測定結果
對ADC-A1(批次1-4)和ADC-B14進行游離毒素檢測，結果(見表7)表明採用陽離子管柱層析不僅適用於大規模製備，也顯著減少了游離毒素。
表7. 游離毒素測定
Figure 110110879-A0202-12-0156-113
<110> 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.) 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)
<120> 一種抗體藥物偶聯物的製備方法
<130> 721020CPCT
<150> CN202010219311.2
<151> 2020-03-25
<150> CN202110297397.5
<151> 2021-03-19
<160> 6
<170> SIPOSequeneeListing 1.0
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> Trastuzumab輕鏈
<400> 1
Figure 110110879-A0202-12-0157-116
<210> 2
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> Trastuzumab重鏈
<400> 2
Figure 110110879-A0202-12-0158-117
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> Pertuzumab輕鏈
<400> 3
Figure 110110879-A0202-12-0159-118
<210> 4
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> Pertuzumab重鏈
<400> 4
Figure 110110879-A0202-12-0159-119
Figure 110110879-A0202-12-0160-120
<210> 5
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> B7H3抗體1F9DS輕鏈
<400> 5
Figure 110110879-A0202-12-0160-121
Figure 110110879-A0202-12-0161-122
<210> 6
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> B7H3抗體1F9DS重鏈
<400> 6
Figure 110110879-A0202-12-0161-123
Figure 110110879-A0202-12-0162-124
Figure 110110879-A0202-11-0001-1

Claims (15)

  1. 一種抗體藥物偶聯物的製備方法，其中該抗體藥物偶聯物的結構如通式(Pc-La-Y-D)所示：
    Figure 110110879-A0202-13-0001-154
    其中，
    W選自C1-8烷基、C1-8烷基-C3-7環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該直鏈雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中該C1-8烷基、C3-7環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、C1-6烷基、氯C1-6烷基、氘代C1-6烷基、C1-6烷氧基和C3-7環烷基中的一個或多個取代基所取代；
    L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-和化學鍵，其中p1為1至20的整數；
    L3為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸殘基選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸和天冬胺酸中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、C1-6烷基、氯C1-6烷基、氘代C1-6烷基、C1-6烷氧基和C3-7環烷基中的一個或多個取代基所取代；
    R1為鹵C1-6烷基或C3-7環烷基；
    R2選自氫原子、鹵C1-6烷基和C3-7環烷基；
    或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-7環烷基；
    R5選自氫原子、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、氘代C1-6烷基和羥基C1-6烷基；
    R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、氘代C1-6烷基和羥基C1-6烷基；
    m為0或1；
    n為3至8，n是小數或整數；
    Pc為抗體或其抗原結合片段；
    該製備方法包括如下的步驟：
    步驟(a)：在約1℃至約36℃的反應溫度條件下，抗體或其抗原結合片段與還原劑反應；
    步驟(b)：步驟(a)的產物與下式(La-Y-D)所示的化合物反應；
    Figure 110110879-A0202-13-0002-155
    其中，W，L2，L3，R1，R2，R5，R6，R7和m如上所定義。
  2. 如請求項1所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中步驟(a)中的該反應溫度條件為約4℃至約30℃，較佳為約20℃至約30℃，更佳為約25℃。
  3. 如請求項1或2所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中步驟(a)中的反應是在pH為約4.5至約6.5的條件下進行的；較佳地，該反應是在pH為約5.0至約6.0的條件下進行的；更佳地，該反應是在pH為約5.6的條件下進行的。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中步驟(a)中的反應是在緩衝劑中進行的；較佳地，該緩衝劑選自組胺酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑和醋酸鹽緩衝劑；更佳地，該緩衝劑為含有EDTA的組胺酸鹽緩衝劑。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中步驟(a)中的該還原劑選自三(2-羧乙基)膦或其鹽、1,4-二巰基蘇糖醇和β-巰基乙醇，較佳為三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中該製備方法還包括步驟(c)，該步驟(c)包括將步驟(b)的產物進行陽離子管柱層析或親和管柱層析純化；較佳地，該步驟(c)包括將步驟(b)的產物進行陽離子管柱層析，該陽離子層析的填料選自Capto S Impact和Poros XS，較佳為Capto S Impact。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中該抗體或其抗原結合片段選自抗HER2(ErbB2)抗體、抗EGFR抗體、抗B7-H3抗體、抗c-Met抗體、抗HER3(ErbB3)抗體、抗HER4(ErbB4)抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD44抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD73抗體、抗CD105抗體、抗CEA抗體、抗A33抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗Lewis Y抗體、抗VEGFR抗體、抗GPNMB抗體、抗Integrin抗體、抗PSMA抗體、抗Tenascin-C抗體、抗SLC44A4抗體和抗Mesothelin抗體，或其抗原結合片段；
    較佳地，該抗體或其抗原結合片段選自曲妥珠單抗(Trastuzumab)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、尼妥珠單抗(Nimotuzumab)、恩必利珠單抗(Enoblituzumab)、艾米貝珠單抗(Emibetuzumab)、伊諾妥珠單抗(Inotuzumab)、品那妥珠單抗(Pinatuzumab)、苯妥昔單抗(Brentuximab)、吉妥珠單抗(Gemtuzumab)、必法妥珠單抗(Bivatuzumab)、洛瓦妥珠單抗(Lorvotuzumab)、cBR96和格雷馬圖單抗(Glematumamab)，或其抗原結合片段。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中該抗體藥物偶聯物具有如下式所示的結構：
    Figure 110110879-A0202-13-0004-156
    其中，n為4至8，n是小數或整數。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中n為4至8的小數或整數，較佳為5至7的小數或整數，更佳為5.3至6.1的小數或整數。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的抗體藥物偶聯物的製備方法，其中該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；
    較佳地；該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上。
  11. 一種抗體藥物偶聯物的製備方法，其中該抗體藥物偶聯物具有如下式所示的結構：
    Figure 110110879-A0202-13-0005-157
    其中，n為4至8，n是小數或整數；
    該製備方法包括如下的步驟：
    步驟(a)：在反應溫度為約4℃至約30℃，和pH為約5.0至約6.0的條件下，Trastuzumab與TCEP反應；
    步驟(b)：步驟(a)的產物與下式所示的化合物反應；
    Figure 110110879-A0202-13-0005-158
  12. 一種抗體藥物偶聯物的製備方法，其中該抗體藥物偶聯物具有如下式所示的結構：
    Figure 110110879-A0202-13-0005-159
    其中，n為4至8，n是小數或整數；
    該製備方法包括如下的步驟：
    步驟(a)：在反應溫度為約25℃，和pH為約5.6的條件下，Trastuzumab與TCEP反應，該反應是在含有EDTA的組胺酸-鹽酸緩衝劑中進行的；
    步驟(b)：步驟(a)的產物與下式所示的化合物反應；
    Figure 110110879-A0202-13-0006-160
    步驟(c)：包括將步驟(b)的產物進行陽離子層析管柱純化。
  13. 一種抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體藥物偶聯物的結構如通式(Pc-La-Y-D)所示：
    Figure 110110879-A0202-13-0006-161
    其中，
    W選自C1-8烷基、C1-8烷基-C3-7環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該直鏈雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中該C1-8烷基、C3-7環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、C1-6烷基、氯C1-6烷基、氘代C1-6烷基、C1-6烷氧基和C3-7環烷基中的一個或多個取代基所取代；
    L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-和化學鍵，其中p1為1至20的整數；
    L3為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸殘基選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、C1-6烷基、氯C1-6烷基、氘代C1-6烷基、C1-6烷氧基和C3-7環烷基中的一個或多個取代基所取代；
    R1為鹵C1-6烷基或C3-7環烷基；
    R2選自氫原子、鹵C1-6烷基和C3-7環烷基；
    或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-7環烷基；
    R5選自氫原子、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、氘代C1-6烷基和羥基C1-6烷基；
    R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、C1-6烷基、鹵C1-6烷基、氘代C1-6烷基和羥基C1-6烷基；
    m為0或1；
    n為4至8，n是小數或整數；
    Pc為抗體或其抗原結合片段；
    並且，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；
    較佳地；該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上。
  14. 一種抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體藥物偶聯物是由如請求項1至9中任一項所述的抗體藥物偶聯物的製備方法製備獲得的；並且，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；
    較佳地；該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上。
  15. 一種抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗體藥物偶聯物具有如下式所示的結構：
    Figure 110110879-A0202-13-0008-162
    其中，n為4至8，n是小數或整數；
    該抗體藥物偶聯物是由如請求項11或12所述的抗體藥物偶聯物的製備方法製備獲得的；並且，該抗體藥物偶聯物的藥物載量分佈為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；
    較佳地；該抗體藥物偶聯物的藥物載量分布為：在抗體重鏈群體中，結合4個藥物的抗體重鏈比例為4%以下，並且未結合藥物的抗體重鏈比例為5%以下；以及在抗體輕鏈群體中，結合1個藥物的抗體輕鏈比例為65%以上。
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