WO2023207710A1 - 一类抗体药物偶联物、其药物组合物及应用 - Google Patents

一类抗体药物偶联物、其药物组合物及应用 Download PDF

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WO2023207710A1
WO2023207710A1 PCT/CN2023/089224 CN2023089224W WO2023207710A1 WO 2023207710 A1 WO2023207710 A1 WO 2023207710A1 CN 2023089224 W CN2023089224 W CN 2023089224W WO 2023207710 A1 WO2023207710 A1 WO 2023207710A1
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刘金明
任云
何婷
田强
宋宏梅
葛均友
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四川科伦博泰生物医药股份有限公司
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/14—Ortho-condensed systems

Definitions

  • This application belongs to the field of medicine, and specifically relates to a type of antibody-drug conjugate, its pharmaceutical composition and application.
  • Antibody-drug conjugate couples antibodies and small molecule cytotoxic drugs through specific linkers.
  • the antibody serves as a carrier to transport small molecule drugs into target cells, thereby reducing systemic exposure. Improving safety is a hot topic in the research and development of targeted tumor therapy.
  • ISAC immunostimulating antibody conjugate
  • Combination medication is, on the one hand, the combined use of two existing drugs, such as the combination of cytotoxic drugs and immunostimulants, and on the other hand, the combination of two active ingredients to form a new single drug.
  • bifunctional load immunostimulatory antibody drug conjugates obtained by coupling cytotoxic drugs and immunostimulants to antibodies can simultaneously enter tumor cells and tumor microenvironment immunity. cells, exerting the dual effects of tumor killing of cytotoxic drugs and local immune activation of immune stimulators, thereby improving the efficacy of antibody drug conjugates in treating cancer.
  • the present invention is a bifunctional loaded immunostimulatory antibody drug conjugate obtained by coupling cytotoxic drugs and TLR agonists to antibodies. It can enter tumor cells and tumor microenvironment immune cells at the same time, exerting the tumor killing and killing effects of cytotoxic drugs.
  • the dual effects of local immune activation of TLR agonists have improved cancer treatment effects compared with antibody drug conjugates coupled with cytotoxic drugs alone.
  • the present invention provides an antibody drug conjugate represented by formula (I):
  • Ab is the targeting group
  • M is the linker site connected to the targeting group
  • X is the linker connecting M and Aa;
  • Aa is an amino acid fragment or a peptide fragment formed from two or more amino acids
  • L 1 is a covalent bond or a linker connecting Aa and D 1 ;
  • L 2 is the linker connecting Aa and D 2 ;
  • D 1 is selected from cytotoxic drug fragments
  • D 2 is selected from TLR agonist fragments
  • n is selected from 1 to 10, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the Ab is a targeting group that can target an antigen of interest to a cell surface receptor or a tumor surface antigen.
  • the Ab is an antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein the antibody or antigen-binding fragment includes a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a linear antibody, a bispecific antibody, a multispecific antibody, a chimeric antibody, a murine Source antibodies, humanized antibodies, fully human antibodies, and fusion proteins containing the antigen-binding portion of the antibody.
  • the Ab is an antibody or an antigen-binding fragment thereof, wherein the antigen-binding fragment is selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, disulfide-linked Fv, and scFv.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of anti-Her-2 antibody, anti-EGFR antibody, anti-VEGFR antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-CTLA -4 antibodies and anti-Trop-2 antibodies.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is Trastuzumab.
  • M is a covalent bond or selected from the following structures:
  • each a is independently selected from an integer of 1-5
  • b is selected from an integer of 1-3
  • the 1 position of M is connected to Ab
  • the 2 position is connected to X.
  • M is a covalent bond or selected from the following structures:
  • each a is independently selected from an integer of 1-5
  • b is selected from an integer of 1-3
  • the 1 position of M is connected to Ab
  • the 2 position is connected to X.
  • M is a covalent bond or selected from the following structures:
  • M is a covalent bond or selected from the following structures:
  • M is a covalent bond or selected from the following structures:
  • X is a covalent bond or selected from C 1-6 alkylene, -NH-(CH 2 ) c -C(O)-,
  • each c is independently selected from an integer from 1 to 10; the 3 position of X is connected to M, and the 4 position is connected to Aa.
  • X is a covalent bond
  • each c is independently selected from an integer from 1 to 10 (for example, an integer from 5 to 10, another example from 8 to 10); the 3 position of X is connected to M, and the 4 position is connected to Aa.
  • Aa is selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Gly, Phe, Ala, Val, Ser, Thr, His, Trp, Cys, Asp , Glu, Lys, Tyr and Arg, optionally, each amino acid is independently modified by a C 1-6 alkyl or polyethylene glycol hydrophilic structural unit.
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural units are selected from Each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, and another example of an integer of 8-10).
  • Aa is selected from fragments of the following amino acids and peptide fragments formed from any combination of two or more of them: Gly, Phe, Ala, Val, Cys, Asp, Glu, Lys, and Arg, and Each amino acid is independently optionally modified with a C 1-6 alkyl or polyethylene glycol hydrophilic structural unit.
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural units are selected from Each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, and another example of an integer of 8-10).
  • Aa is selected from fragments of the following amino acids and peptide fragments formed by any combination of two or more of them: Val, Cys, Asp, Glu and Lys, wherein the Glu and Lys carboxyl termini are optional ground cover Modification, wherein each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, another example is an integer of 8-10).
  • Aa is selected from the following structures:
  • each R 7 is independently selected from H, C 1-6 alkyl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; each R 8 is independently selected from hydroxyl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; the 5 position is connected to X , the 6 position is connected to one of L 1 and L 2 , and the 7 position is connected to the other of L 1 and L 2 .
  • position 5 is connected to X
  • position 6 is connected to L 1
  • position 7 is connected to L 2 .
  • position 5 is connected to X
  • position 6 is connected to L 2
  • position 7 is connected to L 1 .
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural units are selected from Each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, and another example of an integer of 8-10).
  • R 7 is H.
  • Aa is selected from the following structures:
  • each R 7 is independently selected from H, C 1-6 alkyl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; each R 8 is independently selected from hydroxyl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; the 5 position is connected to X , position 6 is connected to one of L 1 and L 2 , position 7 is connected to the other of L 1 and L 2 ; preferably, position 5 is connected to X, position 6 is connected to L 1 , and position 7 is connected to L 2 .
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural units are selected from Each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, and another example of an integer of 8-10).
  • L is a covalent bond or is selected from the group consisting of a non-cleavable linker and a cleavable linker, wherein the cleavable linker is cleaved by an enzyme present in a pathological environment selected from the group consisting of proteases, phosphatases, Pyrophosphatase, ⁇ -glucuronidase, ⁇ -galactosidase, and sulfatase.
  • L 1 is a covalent bond or -L a -L b -L c -, where:
  • L a is a covalent bond or selected from C 1-6 alkylene, -NH-(CH 2 ) c -C(O)-, Wherein, each c is independently selected from an integer from 1 to 10;
  • L b is a covalent bond or selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Val, Cit, Glu, Lys, Arg, Phe, Leu, Gly, Ala and Asn ;
  • L c is a covalent bond, -NH-CH 2 - or selected from the following structures:
  • L 1 is a covalent bond or -L a -L b -L c -, where:
  • L a is a covalent bond or selected from C 1-6 alkylene, -NH-(CH 2 ) c -C(O)-, Wherein, each c is independently selected from an integer from 1 to 10;
  • L b is a covalent bond or selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Val, Cit, Glu, Lys, Arg, Phe, Leu, Gly, Ala and Asn ;
  • L c is a covalent bond, -NH-CH 2 - or selected from the following structures:
  • La is a covalent bond or selected from Wherein, each c is independently selected from an integer of 1-10.
  • L b is a covalent bond or is selected from the following structures:
  • R 9 is selected from H, acetyl, fluorenyloxycarbonyl, trityl and polyethylene glycol hydrophilic structural units.
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural unit is Each c is independently selected from an integer of 1-10.
  • L c is -NH-CH 2 - or
  • L 1 is a covalent bond or -L a -L b -L c -, where:
  • L a is a covalent bond or selected from Wherein, each c is independently selected from an integer from 1 to 10;
  • L b is a covalent bond or selected from
  • L c is -NH-CH 2 -or
  • L is a covalent bond or is selected from the following structures:
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L is a covalent bond or is selected from the following structures:
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L is :
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L is :
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L is :
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L2 is selected from the group consisting of a non-cleavable linker and a cleavable linker, wherein the cleavable linker is cleaved by an enzyme present in a pathological environment selected from the group consisting of protease, phosphatase, pyrophosphatase, beta -Glucuronidase, beta-galactosidase and sulfatase.
  • L2 is -Ld - Le - Lf- , wherein:
  • L d is a covalent bond or a divalent structure selected from one or more of the following: C 1-6 alkylene, -C(O)-(CH 2 ) d -NH-, Wherein, each d is independently selected from an integer from 1 to 12;
  • L e is a covalent bond or selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Val, Cit, Glu, Lys, Arg, Phe, Leu, Gly, Ala and Asn ;
  • L f is a covalent bond, -CH 2 -NH- or selected from the following structures:
  • L2 is -Ld - Le - Lf- , wherein:
  • L d is a covalent bond or a divalent structure selected from one or more of the following: C 1-6 alkylene, -C(O)-(CH 2 ) d -NH-, Wherein, each d is independently selected from an integer from 1 to 12;
  • L e is a covalent bond or selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Val, Cit, Glu, Lys, Arg, Phe, Leu, Gly, Ala and Asn ;
  • L f is a covalent bond, -CH 2 -NH- or selected from the following structures:
  • L e is a covalent bond or selected from the following structures:
  • each R 10 is independently selected from H, acetyl, fluorenyloxycarbonyl, trityl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; preferably, the polyethylene glycol hydrophilic structural units are Each d is independently selected from an integer from 1 to 10.
  • L is selected from the following structures:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D 2 .
  • L is selected from the following structures:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D 2 ;
  • L is selected from the following structures:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D 2 .
  • L2 is:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D2 .
  • L2 is:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D2 .
  • D1 is selected from a cytotoxic drug fragment selected from the group consisting of tubulin inhibitors, DNA damaging agents, and topoisomerase inhibitors, including but not limited to Dolastatins, auristatins, maytansines, Tubulysins and cryptomycins
  • the DNA damaging agents include but are not limited to PBDs, ducarmycin (duocarmycin) and calicheamicin (calicheamicin)
  • the topoisomerase inhibitors include but are not limited to camptothecin and its derivatives.
  • the tubulin inhibitor is selected from the group consisting of Aplysia 10, MMAE, MMAF, maytansine, DM1, DM3, and DM4, and the topoisomerase inhibitor is selected from the group consisting of camptothecin, SN- 38. Ixotecan, topotecan, belotecan, 10-hydroxycamptothecin, 9-aminocamptothecin, doxorubicin, epirubicin and PNU-159682.
  • D is selected from the following structures:
  • D2 is a TLR agonist fragment.
  • the TLR agonist is selected from the group consisting of TLR2 agonists, TLR4 agonists, TLR6 agonists, TLR7 agonists, TLR8 agonists, TLR7/8 agonists, and TLR9 agonists.
  • D2 is a TLR agonist fragment selected from the group consisting of a TLR7 agonist, a TLR8 agonist, and a TLR7/8 agonist.
  • D 2 is a TLR agonist fragment
  • the TLR agonist is a compound represented by formula (II):
  • X 1 is selected from N and C;
  • X 2 is selected from N and C;
  • At least one of X 1 and X 2 is selected from N;
  • X 3 is selected from O, S and N;
  • X 4 is selected from O, S, N and CR 4 ;
  • R 1 is selected from C 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene-OC 1-6 alkyl
  • R 2 is selected from hydrogen and the formula -L 3 -L 4 -L 5 -L 6 ;
  • L 3 is selected from covalent bond and C 1-6 alkylene
  • L 4 is selected from covalent bond, C 3-10 cycloalkyl, 3-12 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl and 5-10 membered heteroaryl, the cycloalkyl, heterocyclyl, aromatic and heteroaryl are optionally substituted by one or more radicals selected from hydrogen, halogen, cyano, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy and -C 1-6 alkylene-NH 2 Replaced by regiment;
  • L 5 is selected from covalent bond, -O-, -S-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)-O-, -OC(O)-O-, -NR 5 -, -C(O)-NR 5 -, -NR 5 -C(O)-, -OC(O)-NR 5 -, -NR 5 -C(O)-O-, -NR 5 -C (O)-NR 5 -, -S(O) r -NR 5 -, -NR 5 -S(O) r -, and -NR 5 -S(O) r -NR 5 -;
  • L 6 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl, -(O-CH 2 CH 2 ) n -OC 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) n - OC 1-6 alkyl, the alkyl is optionally replaced by one or more hydrogen, halogen, hydroxyl, -NH 2 , -NH-C(O)-OC 1-6 alkyl, C 1-6 Substituted by alkoxy, carboxyl and -C(O)-OC 1-6 alkyl groups;
  • R 3 is selected from hydrogen and the formula -L 7 -L 8 -L 9 -L 10 ;
  • L 7 is selected from covalent bond and C 1-6 alkylene
  • L 8 is selected from covalent bond, C 3-10 cycloalkyl, 3-12 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl and 5-10 membered heteroaryl, the cycloalkyl, heterocyclyl, aromatic and heteroaryl are optionally substituted by one or more radicals selected from hydrogen, halogen, cyano, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy and -C 1-6 alkylene-NH 2 Replaced by regiment;
  • L 9 is selected from covalent bond, -O-, -S-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)-O-, -OC(O)-O-, -NR 6 -, -C(O)-NR 6 -, -NR 6 -C(O)-, -OC(O)-NR 6 -, -NR 6 -C(O)-O-, -NR 6 -C (O)-NR 6 -, -S(O) p -NR 6 -, -NR 6 -S(O) p -, and -NR 6 -S(O) p -NR 6 -;
  • L 10 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl, -(O-CH 2 CH 2 ) q -OC 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene -(O-CH 2 CH 2 ) q - OC 1-6 alkyl, the alkyl is optionally replaced by one or more hydrogen, halogen, hydroxyl, -NH 2 , -NH-C(O)-OC 1-6 alkyl, C 1-6 Substituted by alkoxy, carboxyl and -C(O)-OC 1-6 alkyl groups;
  • R 4 is selected from hydrogen, halogen, cyano, hydroxyl, C 1-6 alkyl, C 1-6 haloalkyl, C 1-6 alkoxy and C 3-10 cycloalkyl;
  • Each R 5 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl
  • Each R 6 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl
  • Each r is independently 1 or 2;
  • n is independently selected from an integer from 1 to 25;
  • Each p is independently 1 or 2;
  • Each q is independently selected from an integer from 1 to 25;
  • D 2 is connected to L 2 through R 2 or R 3 in formula (II).
  • each n is independently selected from 1-15, preferably, n is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15.
  • each q is independently selected from 1-15, preferably, q is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15.
  • X3 is selected from S and N.
  • L is selected from covalent bonds and C 1-3 alkylene.
  • L4 is selected from the group consisting of covalent bond, 3-12 membered heterocyclyl, C6-10 aryl, and 5-10 membered heteroaryl, any of which Optionally substituted with one or more groups selected from hydrogen, halogen, cyano, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy and -C 1-6 alkylene-NH 2 .
  • L 5 is selected from covalent bond, -NR 5 -, -C(O)-NR 5 -, -NR 5 -C(O)-, -OC(O)-NR 5 -, - NR 5 -C(O)-O-, -NR 5 -C(O)-NR 5 -, -S(O) r -NR 5 -, -NR 5 -S(O) r - and -NR 5 - S(O) r -NR 5 -, each R 5 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl; preferably, L 5 is selected from covalent bond and -NR 5 -, each R 5 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl.
  • L 6 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl, and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) n -OC 1-6 alkyl, which alkyl is either Optionally one or more selected from hydrogen, halogen, hydroxyl, -NH 2 , -NH-C(O)-OC 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, carboxyl and -C(O)- OC 1-6 alkyl group substituted, n is 1-10.
  • L is selected from a covalent bond and a 3-12 membered heterocyclyl optionally substituted by one or more members selected from the group consisting of hydrogen, halogen, cyano, and C 1-6 alkyl replaced.
  • L9 is a covalent bond.
  • L 10 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl, and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) q -OC 1-6 alkyl, q is 1-10 .
  • R 3 is selected from hydrogen and the formula -L 7 -L 8 -L 9 -L 10 ;
  • L 8 is selected from covalent bonds and 3-12 membered heterocyclyl groups, which are optionally replaced by one or more members selected from hydrogen, halogen, cyanide Substituted with C 1-6 alkyl group;
  • L 9 is a covalent bond
  • L 10 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) q -OC 1-6 alkyl;
  • q is selected from 1-10, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10.
  • X 1 is C
  • X 2 is N
  • X 3 is S
  • X 4 is selected from CR 4 ;
  • R 1 is selected from C 1-6 alkyl
  • R 2 is selected from the formula -L 3 -L 4 -L 5 -L 6 ;
  • L 3 is selected from covalent bond and C 1-6 alkylene
  • L 4 is selected from covalent bond, 3-12 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl and 5-10 membered heteroaryl, the heterocyclyl, aryl and heteroaryl are optionally replaced by one or more Substituted with a group selected from hydrogen, halogen, cyano, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy and -C 1-6 alkylene-NH 2 ;
  • L 5 is selected from covalent bonds and -NR 5 -, and each R 5 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl;
  • L 6 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) n -OC 1-6 alkyl, which is optionally replaced by one or more Each is selected from hydrogen, halogen, hydroxyl, -NH 2 , -NH-C(O)-OC 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, carboxyl and -C(O)-OC 1-6 alkyl replaced by a group.
  • D2 is selected from the following structures:
  • the antibody drug conjugate is selected from the following structures:
  • Each m is independently selected from 1-10, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the Ab is trastuzumab.
  • the antibody drug conjugate has a DAR value of 2.0-5.0, such as 2.0-2.5, 2.0-3.0, 2.0-3.5, 2.0-4.0, 2.0-4.5, 2.0-5.0, 2.5-3.0, 2.5-3.5, 2.5-4.0, 2.5-4.5, 2.5-5.0, 3.0-3.5, 3.0-4.0, 3.0-4.5, 3.0-5.0, 3.5-4.0, 3.5-4.5, 3.5-5.0, 4.0-4.5, 4.0- 5.0, or 4.0-5.0.
  • 2.0-5.0 such as 2.0-2.5, 2.0-3.0, 2.0-3.5, 2.0-4.0, 2.0-4.5, 2.0-5.0, 2.5-3.0, 2.5-3.5, 2.5-4.0, 2.5-4.5, 2.5-5.0, 3.0-3.5, 3.0-4.0, 3.0-4.5, 3.0-5.0, 3.5-4.0, 3.5-4.5, 3.5-5.0, 4.0-4.5, 4.0- 5.0, or 4.0-5.0.
  • the present invention provides a drug-linker simultaneously coupled with a cytotoxic drug and a TLR agonist, which can be used to prepare the aforementioned antibody-drug conjugate.
  • the present invention provides compounds of formula (III) or pharmaceutically acceptable salts, esters, stereoisomers, tautomers, polymorphs, solvates, N-oxides, and isotopic labels thereof
  • compounds of formula (III) or pharmaceutically acceptable salts, esters, stereoisomers, tautomers, polymorphs, solvates, N-oxides, and isotopic labels thereof Compounds, metabolites or prodrugs of:
  • M 1 is the precursor of the linker site connected to a targeting group, wherein the targeting group is as defined in any one of the preceding paragraphs;
  • X is the linker connecting M and Aa;
  • Aa is selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids
  • L 1 is a covalent bond or a linker connecting Aa and D 1 ;
  • L 2 is the linker connecting Aa and D 2 ;
  • D 1 is selected from cytotoxic drug fragments
  • D2 is selected from TLR agonist fragments.
  • M1 is selected from the following structures:
  • each a is independently selected from an integer of 1-5, b is selected from an integer of 1-3, and M a is an activated group of a carboxyl group (for example, a pentafluorophenoxy group).
  • M1 is selected from the following structures:
  • each a is independently selected from an integer of 1-5, b is selected from an integer of 1-3, and M a is the activation group of the carboxyl group.
  • M1 is a covalent bond or selected from the following structures:
  • M1 is a covalent bond or selected from the following structures:
  • X is a covalent bond or selected from C 1-6 alkylene, -NH-(CH 2 ) c -C(O)-,
  • each c is independently selected from an integer from 1 to 10; the 3 position of X is connected to M, and the 4 position is connected to Aa.
  • X is a covalent bond
  • each c is independently selected from an integer from 1 to 10 (for example, an integer from 5 to 10, another example from 8 to 10); the 3 position of X is connected to M, and the 4 position is connected to Aa.
  • Aa is selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Gly, Phe, Ala, Val, Ser, Thr, His, Trp, Cys, Asp , Glu, Lys, Tyr and Arg, optionally, each amino acid is independently modified by a C 1-6 alkyl or polyethylene glycol hydrophilic structural unit.
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural units are selected from Each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, and another example of an integer of 8-10).
  • Aa is selected from fragments of the following amino acids and peptide fragments formed from any combination of two or more of them: Gly, Phe, Ala, Val, Cys, Asp, Glu, Lys, and Arg, and Each amino acid is independently optionally modified with a C 1-6 alkyl or polyethylene glycol hydrophilic structural unit.
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural units are selected from Each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, and another example of an integer of 8-10).
  • Aa is selected from fragments of the following amino acids and is formed by any combination of two or more of them: Peptide fragments formed into: Val, Cys, Asp, Glu and Lys, wherein the Glu and Lys carboxyl termini are optionally replaced by Modification, wherein each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, another example is an integer of 8-10).
  • Aa is selected from the following structures:
  • each R 7 is independently selected from H, C 1-6 alkyl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; each R 8 is independently selected from hydroxyl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; the 5 position is connected to X , the 6 position is connected to one of L 1 and L 2 , and the 7 position is connected to the other of L 1 and L 2 .
  • position 5 is connected to X
  • position 6 is connected to L 1
  • position 7 is connected to L 2
  • position 5 is connected to X
  • position 6 is connected to L 2
  • position 7 is connected to L 1 .
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural units are selected from Each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, and another example of an integer of 8-10).
  • R 7 is H.
  • Aa is selected from the following structures:
  • each R 7 is independently selected from H, C 1-6 alkyl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; each R 8 is independently selected from hydroxyl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; the 5 position is connected to X , position 6 is connected to one of L 1 and L 2 , position 7 is connected to the other of L 1 and L 2 ; preferably, position 5 is connected to X, position 6 is connected to L 1 , and position 7 is connected to L 2 .
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural units are selected from Each c is independently selected from an integer of 1-10 (for example, an integer of 5-10, and another example of an integer of 8-10).
  • L is a covalent bond or is selected from the group consisting of a non-cleavable linker and a cleavable linker, wherein the cleavable linker is cleaved by an enzyme present in a pathological environment selected from the group consisting of proteases, phosphatases, Pyrophosphatase, beta-glucose Aldase, beta-galactosidase, and sulfatase.
  • L 1 is a covalent bond or -L a -L b -L c -, where:
  • L a is a covalent bond or selected from C 1-6 alkylene, -NH-(CH 2 ) c -C(O)-, Wherein, each c is independently selected from an integer from 1 to 10;
  • L b is a covalent bond or selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Val, Cit, Glu, Lys, Arg, Phe, Leu, Gly, Ala and Asn ;
  • L c is a covalent bond, -NH-CH 2 - or selected from the following structures:
  • L 1 is a covalent bond or -L a -L b -L c -, where:
  • L a is a covalent bond or selected from C 1-6 alkylene, -NH-(CH 2 ) c -C(O)-, Wherein, each c is independently selected from an integer from 1 to 10;
  • L b is a covalent bond or selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Val, Cit, Glu, Lys, Arg, Phe, Leu, Gly, Ala and Asn ;
  • L c is a covalent bond, -NH-CH 2 - or selected from the following structures:
  • La is a covalent bond or selected from Wherein, each c is independently selected from an integer of 1-10. In some embodiments, L b is a covalent bond or is selected from the following structures:
  • R 9 is selected from H, acetyl, fluorenyloxycarbonyl, trityl and polyethylene glycol hydrophilic structural units.
  • the polyethylene glycol hydrophilic structural unit is Each c is independently selected from an integer of 1-10.
  • L c is -NH-CH 2 - or
  • L 1 is a covalent bond or -L a -L b -L c -, where:
  • L a is a covalent bond or selected from Wherein, each c is independently selected from an integer from 1 to 10;
  • L b is a covalent bond or selected from
  • L c is -NH-CH 2 -or
  • L is a covalent bond or is selected from the following structures:
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L is a covalent bond or is selected from the following structures:
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L is selected from the following structures:
  • L is selected from the following structures:
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L is selected from the following structures:
  • position 8 is connected to Aa, and position 9 is connected to D 1 .
  • L2 is selected from the group consisting of a non-cleavable linker and a cleavable linker, wherein the cleavable linker is cleaved by an enzyme present in a pathological environment selected from the group consisting of protease, phosphatase, pyrophosphatase, beta -Glucuronidase, beta-galactosidase and sulfatase.
  • L2 is -Ld - Le - Lf- , wherein:
  • L d is a covalent bond or a divalent structure selected from one or more of the following: C 1-6 alkylene, -C(O)-(CH 2 ) d -NH-, Wherein, each d is independently selected from an integer from 1 to 12;
  • L e is a covalent bond or selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Val, Cit, Glu, Lys, Arg, Phe, Leu, Gly, Ala and Asn ;
  • L f is a covalent bond, -CH 2 -NH- or selected from the following structures:
  • L2 is -Ld - Le - Lf- , wherein:
  • L d is a covalent bond or a divalent structure selected from one or more of the following: C 1-6 alkylene, -C(O)-(CH 2 ) d -NH-, Wherein, each d is independently selected from an integer from 1 to 12;
  • L e is a covalent bond or selected from amino acid fragments and peptide fragments formed from two or more amino acids, wherein the amino acids are selected from Val, Cit, Glu, Lys, Arg, Phe, Leu, Gly, Ala and Asn ;
  • L f is a covalent bond, -CH 2 -NH- or selected from the following structures:
  • L e is a covalent bond or selected from the following structures:
  • each R 10 is independently selected from H, acetyl, fluorenyloxycarbonyl, trityl and polyethylene glycol hydrophilic structural units; preferably, the polyethylene glycol hydrophilic structural units are Each d is independently selected from an integer from 1 to 10.
  • L is selected from the following structures:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D 2 .
  • L is selected from the following structures:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D 2 ;
  • L is selected from the following structures:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D 2 .
  • L is selected from the following structures:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D2 .
  • L is selected from the following structures:
  • position 10 is connected to Aa, and position 11 is connected to D2 .
  • D1 is selected from a cytotoxic drug fragment selected from the group consisting of tubulin inhibitors, DNA damaging agents, and topoisomerase inhibitors, including but not limited to Dolastatins, auristatins, maytansines, Tubulysins and cryptomycins
  • the DNA damaging agents include but are not limited to PBDs, ducarmycin (duocarmycin) and calicheamicin (calicheamicin)
  • the topoisomerase inhibitors include but are not limited to camptothecin and its derivatives.
  • the tubulin inhibitor is selected from the group consisting of Aplysia 10, MMAE, MMAF, maytansine, DM1, DM3, and DM4, and the topoisomerase inhibitor is selected from the group consisting of camptothecin, SN- 38. Ixotecan, topotecan, belotecan, 10-hydroxycamptothecin, 9-aminocamptothecin, doxorubicin, epirubicin and PNU-159682.
  • D is selected from the following structures:
  • D2 is a TLR agonist fragment.
  • the TLR agonist is selected from the group consisting of TLR2 agonists, TLR4 agonists, TLR6 agonists, TLR7 agonists, TLR8 agonists, TLR7/8 agonists, and TLR9 agonists.
  • D2 is a TLR agonist fragment selected from the group consisting of a TLR7 agonist, a TLR8 agonist, and a TLR7/8 agonist.
  • D 2 is a TLR agonist fragment
  • the TLR agonist is a compound represented by formula (II):
  • X 1 is selected from N and C;
  • X 2 is selected from N and C;
  • At least one of X 1 and X 2 is selected from N;
  • X 3 is selected from O, S and N;
  • X 4 is selected from O, S, N and CR 4 ;
  • R 1 is selected from C 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene-OC 1-6 alkyl
  • R 2 is selected from hydrogen and the formula -L 3 -L 4 -L 5 -L 6 ;
  • L 3 is selected from covalent bond and C 1-6 alkylene
  • L 4 is selected from covalent bond, C 3-10 cycloalkyl, 3-12 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl and 5-10 membered heteroaryl, the cycloalkyl, heterocyclyl, aromatic and heteroaryl are optionally substituted by one or more radicals selected from hydrogen, halogen, cyano, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy and -C 1-6 alkylene-NH 2 Replaced by regiment;
  • L 5 is selected from covalent bond, -O-, -S-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)-O-, -OC(O)-O-, -NR 5 -, -C(O)-NR 5 -, -NR 5 -C(O)-, -OC(O)-NR 5 -, -NR 5 -C(O)-O-, -NR 5 -C (O)-NR 5 -, -S(O) r -NR 5 -, -NR 5 -S(O) r -, and -NR 5 -S(O) r -NR 5 -;
  • L 6 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl, -(O-CH 2 CH 2 ) n -OC 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) n - OC 1-6 alkyl, the alkyl is optionally replaced by one or more hydrogen, halogen, hydroxyl, -NH 2 , -NH-C(O)-OC 1-6 alkyl, C 1-6 Substituted by alkoxy, carboxyl and -C(O)-OC 1-6 alkyl groups;
  • R 3 is selected from hydrogen and the formula -L 7 -L 8 -L 9 -L 10 ;
  • L 7 is selected from covalent bond and C 1-6 alkylene
  • L 8 is selected from covalent bond, C 3-10 cycloalkyl, 3-12 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl and 5-10 membered heteroaryl, the cycloalkyl, heterocyclyl, aromatic and heteroaryl are optionally substituted by one or more radicals selected from hydrogen, halogen, cyano, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy and -C 1-6 alkylene-NH 2 Replaced by regiment;
  • L 9 is selected from covalent bond, -O-, -S-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)-O-, -OC(O)-O-, -NR 6 -, -C(O)-NR 6 -, -NR 6 -C(O)-, -OC(O)-NR 6 -, -NR 6 -C(O)-O-, -NR 6 -C (O)-NR 6 -, -S(O) p -NR 6 -, -NR 6 -S(O) p -, and -NR 6 -S(O) p -NR 6 -;
  • L 10 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl, -(O-CH 2 CH 2 ) q -OC 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene -(O-CH 2 CH 2 ) q - OC 1-6 alkyl, the alkyl is optionally replaced by one or more hydrogen, halogen, hydroxyl, -NH 2 , -NH-C(O)-OC 1-6 alkyl, C 1-6 Substituted by alkoxy, carboxyl and -C(O)-OC 1-6 alkyl groups;
  • R 4 is selected from hydrogen, halogen, cyano, hydroxyl, C 1-6 alkyl, C 1-6 haloalkyl, C 1-6 alkoxy and C 3-10 cycloalkyl;
  • Each R 5 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl
  • Each R 6 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl
  • Each r is independently 1 or 2;
  • n is independently selected from an integer from 1 to 25;
  • Each p is independently 1 or 2;
  • Each q is independently selected from an integer from 1 to 25;
  • D 2 is connected to L 2 through R 2 or R 3 in formula (II).
  • each n is independently selected from 1-15, preferably, n is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15.
  • each q is independently selected from 1-15, preferably, q is selected from 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 and 15.
  • X3 is selected from S and N.
  • L is selected from covalent bonds and C 1-3 alkylene.
  • L4 is selected from the group consisting of covalent bond, 3-12 membered heterocyclyl, C6-10 aryl, and 5-10 membered heteroaryl, any of which Optionally substituted with one or more groups selected from hydrogen, halogen, cyano, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy and -C 1-6 alkylene-NH 2 .
  • L 5 is selected from covalent bond, -NR 5 -, -C(O)-NR 5 -, -NR 5 -C(O)-, -OC(O)-NR 5 -, - NR 5 -C(O)-O-, -NR 5 -C(O)-NR 5 -, -S(O) r -NR 5 -, -NR 5 -S(O) r - and -NR 5 - S(O) r -NR 5 -, each R 5 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl; preferably, L 5 is selected from covalent bond and -NR 5 -, each R 5 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl.
  • L 6 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl, and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) n -OC 1-6 alkyl, which alkyl is either Optionally one or more selected from hydrogen, halogen, hydroxyl, -NH 2 , -NH-C(O)-OC 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, carboxyl and -C(O)- OC 1-6 alkyl group substituted, n is 1-10.
  • L is selected from a covalent bond and a 3-12 membered heterocyclyl optionally substituted by one or more members selected from the group consisting of hydrogen, halogen, cyano, and C 1-6 alkyl replaced.
  • L9 is a covalent bond.
  • L 10 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl, and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) q -OC 1-6 alkyl, q is 1-10 .
  • R 3 is selected from hydrogen and the formula -L 7 -L 8 -L 9 -L 10 ;
  • L 8 is selected from covalent bonds and 3-12 membered heterocyclyl groups, which are optionally replaced by one or more members selected from hydrogen, halogen, cyanide Substituted with C 1-6 alkyl group;
  • L 9 is a covalent bond
  • L 10 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) q -OC 1-6 alkyl;
  • q is selected from 1-10, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10.
  • X 1 is C
  • X 2 is N
  • X 3 is S
  • X 4 is selected from CR 4 ;
  • R 1 is selected from C 1-6 alkyl
  • R 2 is selected from the formula -L 3 -L 4 -L 5 -L 6 ;
  • L 3 is selected from covalent bond and C 1-6 alkylene
  • L 4 is selected from covalent bond, 3-12 membered heterocyclyl, C 6-10 aryl and 5-10 membered heteroaryl, the heterocyclyl, aryl and heteroaryl are optionally replaced by one or more Substituted with a group selected from hydrogen, halogen, cyano, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy and -C 1-6 alkylene-NH 2 ;
  • L 5 is selected from covalent bonds and -NR 5 -, and each R 5 is independently selected from hydrogen and C 1-6 alkyl;
  • L 6 is selected from hydrogen, C 1-6 alkyl and -C 1-6 alkylene-(O-CH 2 CH 2 ) n -OC 1-6 alkyl, which is optionally replaced by one or more Each is selected from hydrogen, halogen, hydroxyl, -NH 2 , -NH-C(O)-OC 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, carboxyl and -C(O)-OC 1-6 alkyl replaced by a group.
  • D2 is selected from the following structures:
  • the present invention provides a pharmaceutical composition, which contains any of the above-mentioned antibody drug conjugates, compounds (such as drug linkers, TLR agonists or cytotoxic drugs) or their pharmaceutically acceptable Salts, esters, stereoisomers, tautomers, polymorphs, solvates, N-oxides, isotopically labeled compounds, metabolites or prodrugs, and one or more pharmaceutical excipients .
  • the present invention provides any of the aforementioned antibody drug conjugates, compounds (such as drug linkers, TLR agonists or cytotoxic drugs) or pharmaceutically acceptable salts, esters, stereoisomers thereof
  • compounds such as drug linkers, TLR agonists or cytotoxic drugs
  • pharmaceutically acceptable salts, esters, stereoisomers thereof The use of isomers, tautomers, polymorphs, solvates, N-oxides, isotopically labeled compounds, metabolites or prodrugs in the preparation of antibody drug conjugates, especially in the preparation of any of the preceding items The antibody drug conjugate.
  • the present invention provides any of the aforementioned antibody drug conjugates, compounds (such as drug linkers, TLR agonists or cytotoxic drugs) or pharmaceutically acceptable salts, esters, stereoisomers thereof isomers, tautomers, polymorphs, solvates, N-oxides, isotopically labeled compounds, metabolites or prodrugs, or pharmaceutical compositions for use in the preparation of treatments and/or prevention of cancer (e.g., HER2-positive cancer , such as HER2-positive gastric cancer, breast cancer or non-small cell lung cancer).
  • cancer e.g., HER2-positive cancer , such as HER2-positive gastric cancer, breast cancer or non-small cell lung cancer.
  • the present invention provides any of the aforementioned antibody drug conjugates, compounds (such as drug linkers, TLR agonists or cytotoxic drugs) or pharmaceutically acceptable salts, esters, stereoisomers thereof isomers, tautomers, polymorphs, solvates, N-oxides, isotopically labeled compounds, metabolites or prodrugs, or pharmaceutical compositions for the treatment and/or prevention of cancer (e.g., HER2 positive cancer, such as HER2-positive gastric cancer, breast cancer, or non-small cell lung cancer).
  • cancer e.g., HER2 positive cancer, such as HER2-positive gastric cancer, breast cancer, or non-small cell lung cancer.
  • the present invention provides a method of treating and/or preventing cancer (e.g., HER2-positive cancer, such as HER2-positive gastric cancer, breast cancer, or non-small cell lung cancer), comprising administering to a subject in need thereof treatment and/or prevention of cancer. /or a prophylactically effective amount of any of the aforementioned antibody-drug conjugates, compounds (such as drug linkers, TLR agonists or cytotoxic drugs) or their pharmaceutically acceptable salts, esters, stereoisomers, Tautomers, polymorphs, solvates, N-oxides, isotopically labeled compounds, metabolites or prodrugs, or pharmaceutical compositions.
  • cancer e.g., HER2-positive cancer, such as HER2-positive gastric cancer, breast cancer, or non-small cell lung cancer
  • the present invention provides methods for preparing compounds represented by formula (III) of the present invention.
  • LG 1 and LG 2 represent leaving groups, including but not limited to halogen, hydroxyl, succinimide ester, active ester, etc.
  • PG 1 and PG 2 represent protecting groups, including but not limited to benzyloxycarbonyl ( Cbz), tert-butoxycarbonyl (Boc), fluorenyloxycarbonyl (Fmoc), benzyl, acetyl, tert-butyl, etc.
  • L 1a is the precursor structure to form L 1 , preferably containing an unsaturated double bond, and occurs through The addition reaction on the unsaturated double bond connects Aa;
  • D 1 , D 2 , L 1 , L 2 , X, Aa and M 1 are as defined above;
  • Step 1 Compound III-1 and compound III-2 undergo a condensation reaction to obtain compound III-3;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably a combination of 1-hydroxybenzotriazole and 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride .
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 2 Compound III-3 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-4;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from 1,4-dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, with dichloromethane being preferred.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable acid, which may be selected from hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, preferably trifluoroacetic acid.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Step 3 Compound III-4 and compound III-5 undergo a condensation reaction to obtain compound III-6;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethyl Oxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3 -Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 1-hydroxybenzotriazole and 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 4 Compound III-6 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-7;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from 1,4-dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, with dichloromethane being preferred.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable acid, which may be selected from acetic acid, hydrobromic acid, hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, preferably trifluoroacetic acid.
  • the reaction can be carried out with the addition of triethylsilane as an ion trapping agent.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Step 5 Addition reaction occurs between compound III-7 and compound III-8 to obtain compound III-9;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from 1,4-dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Step 6 Compound III-9 and compound III-10 undergo a cyclization reaction to obtain compound III;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide, water and any combination thereof, preferably dimethyl sulfoxide Mixed solvent with water.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a metal catalyst.
  • the metal catalyst may be selected from copper sulfate, cuprous iodide, cuprous bromide, copper acetate, preferably copper sulfate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of ascorbic acid or sodium ascorbate.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • the present invention provides another method for preparing the compound of formula (III), which includes the following steps:
  • LG 1 , LG 2 and LG 3 represent leaving groups, including but not limited to halogen, hydroxyl, succinimide ester, active ester, etc.
  • PG 1 and PG 2 represent protecting groups, including but not limited to benzyl Oxycarbonyl (Cbz), tert-butoxycarbonyl (Boc), fluorenyloxycarbonyl (Fmoc), benzyl, acetyl, tert-butyl, etc.;
  • D 1 , D 2 , L 1 , L 2 , Aa and M 1 are as defined above;
  • Step 1 Compound III-11 and compound III-12 undergo a condensation reaction to obtain compound III-13;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 2 Compound III-13 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-14;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from 1,4-dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, with dichloromethane being preferred.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable acid, which may be selected from hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, zinc bromide, preferably zinc bromide.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Step 3 Compound III-14 and compound III-5 undergo a condensation reaction to obtain compound III-15;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethyl Aminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotris Azole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 4 Compound III-15 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-16;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from N,N-dimethylformamide, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, preferably N,N-dimethylformamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable base, which may be selected from diethylamine and piperidine, preferably piperidine.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 6 hours.
  • Step 5 Compound III-16 and compound III-17 undergo a substitution reaction to obtain compound III;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from dichloromethane, tetrahydrofuran, 1,2-dichloroethane, diethyl ether, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethylformamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • the present invention provides another method for preparing the compound of formula (III), which includes the following steps:
  • LG 1 , LG 2 and LG 3 represent leaving groups, including but not limited to halogen, hydroxyl, succinimide ester, active ester, etc.
  • PG 1 and PG 2 represent protecting groups, including but not limited to benzyl Oxycarbonyl (Cbz), tert-butoxycarbonyl (Boc), fluorenyloxycarbonyl (Fmoc), benzyl, acetyl, tert-butyl, etc.;
  • D 1 , D 2 , L 1 , L 2 , Aa and M 1 are as defined above;
  • Step 1 Compound III-18 and compound III-19 undergo a condensation reaction to obtain compound III-20;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 2 Compound III-20 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-21;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from 1,4-dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, with dichloromethane being preferred.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable acid, which may be selected from hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, preferably trifluoroacetic acid.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Step 3 Compound III-21 and compound III-22 undergo a condensation reaction to obtain compound III-23;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 4 Compound III-23 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-24;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from N,N-dimethylformamide, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, preferably N,N-dimethylformamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable base, which may be selected from diethylamine and piperidine, preferably piperidine.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 6 hours.
  • Step 5 Compound III-24 and compound III-25 undergo a substitution reaction to obtain compound III;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from dichloromethane, tetrahydrofuran, 1,2-dichloroethane, diethyl ether, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethylformamide. Said anti This should preferably be carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Aa is a polypeptide fragment formed by two or more amino acids
  • Aa is -Aa 1 -Aa 2 -, where Aa 1 and Aa 2 are the amino acid fragments constituting Aa;
  • the invention provides a method for preparing formula (III) Another method of compound, which includes the following steps:
  • LG 1 , LG 2 and LG 3 represent leaving groups, including but not limited to halogen, hydroxyl, succinimide ester, active ester, etc.
  • PG 1 , PG 2 and PG 3 represent protecting groups, including but not limited to Not limited to benzyloxycarbonyl (Cbz), tert-butoxycarbonyl (Boc), fluorenyloxycarbonyl (Fmoc), benzyl, acetyl, tert-butyl, etc.
  • Aa 1 and Aa 2 are amino acid fragments constituting Aa;
  • D 1 , D 2 , L 1 , L 2 , X, Aa and M 1 are as defined above;
  • Step 1 Compound III-26 and compound III-27 undergo a condensation reaction to obtain compound III-28;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, preferably N,N-diisopropylethylamine amine.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 2 Compound III-28 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-29;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from 1,4-dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, with 1,4-dioxane being preferred.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable acid, which may be selected from acetic acid, hydrobromic acid, hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, preferably hydrochloric acid.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Step 3 Compound III-29 and compound III-30 undergo a condensation reaction to obtain compound III-31;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 4 Compound III-31 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-32;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from 1,4-dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, with dichloromethane being preferred.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable acid, which may be selected from hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, preferably trifluoroacetic acid.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Step 5 Compound III-32 and compound III-33 undergo a condensation reaction to obtain compound III-34;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, preferably N,N-diisopropylethylamine amine.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 6 Compound III-34 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-35;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from N,N-dimethylformamide, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, preferably N,N-dimethylformamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable base, which may be selected from diethylamine and piperidine, preferably piperidine.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 6 hours.
  • Step 7 Compound III-35 and compound III-36 undergo a substitution reaction to obtain compound III;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from dichloromethane, tetrahydrofuran, 1,2-dichloroethane, diethyl ether, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethylformamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Aa is a polypeptide fragment formed by two or more amino acids
  • Aa is -Aa 1 -Aa 2 -; the present invention provides another method for preparing the compound of formula (III), which includes the following steps:
  • LG 1 , LG 2 and LG 3 represent leaving groups, including but not limited to halogen, hydroxyl, succinimide ester, active ester, etc.
  • PG 1 and PG 2 represent protecting groups, including but not limited to benzyl Oxycarbonyl (Cbz), tert-butoxycarbonyl (Boc), fluorenyloxycarbonyl (Fmoc), benzyl, acetyl, tert-butyl, etc.
  • Aa 1 and Aa 2 are respectively amino acid fragments or composed of two or more amino acids The polypeptide fragment formed;
  • D 1 , D 2 , L 1 , L 2 , X, Aa and M 1 are as defined above;
  • Step 1 Compound III-37 and compound III-38 undergo a condensation reaction to obtain compound III-39;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 2 Compound III-39 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-40;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from N,N-dimethylformamide, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, preferably N,N-dimethylformamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable base, which may be selected from diethylamine and piperidine, preferably piperidine.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 6 hours.
  • Step 3 Compound III-40 and compound III-41 undergo a condensation reaction to obtain compound III-42;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dichloromethane, dimethyl sulfoxide, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethyl Formamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a condensing agent.
  • the condensation agent may be selected from 1-hydroxybenzotriazole, 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline, 2-(7-azobenzotriazole) -N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, benzotriazole-1 -oxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, preferably 2-(7-azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethylurea hexafluorophosphate.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the condensation reaction is preferably carried out for a suitable time, such as 1 to 12 hours.
  • Step 4 Compound III-42 undergoes deprotection reaction to obtain compound III-43;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from 1,4-dioxane, dichloromethane, tetrahydrofuran and any combination thereof, with dichloromethane being preferred.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable acid, which may be selected from hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, zinc bromide, preferably zinc bromide.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • Step 5 Compound III-43 undergoes a substitution reaction with compound III-44 to obtain compound III;
  • the reaction is preferably carried out in a suitable organic solvent.
  • the organic solvent can be selected from dichloromethane, tetrahydrofuran, 1,2-dichloroethane, diethyl ether, N,N-dimethylformamide and any combination thereof, preferably N,N-dimethylformamide.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a base.
  • the base can be selected from N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine, with N,N-diisopropylethylamine being preferred.
  • the reaction is preferably carried out at a suitable temperature, preferably -10-60°C.
  • the reaction is preferably carried out for a suitable time, for example 1 to 12 hours.
  • antibody refers to an immunoglobulin molecule usually composed of two pairs of polypeptide chains, each pair having a light chain (LC) and a heavy chain (HC).
  • Antibody light chains can be classified into kappa (kappa) and lambda (lambda) light chains.
  • Heavy chains can be classified as mu, delta, gamma, alpha, or epsilon, and define the antibody's isotype as IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE, respectively.
  • the variable and constant regions are connected by a "J" region of approximately 12 or more amino acids, and the heavy chain also contains a "D" region of approximately 3 or more amino acids.
  • Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region (CH).
  • the heavy chain constant region consists of 3 domains (CH1, CH2 and CH3).
  • Each light chain consists of a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL).
  • the light chain constant region consists of one domain, CL.
  • the constant domain is not directly involved in the binding of antibodies to antigens, but exhibits a variety of effector functions, such as mediating the interaction of immunoglobulins with host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and classical complement. Binding of the first component of the system (C1q).
  • VH and VL regions can also be subdivided into regions of high variability called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more conservative regions called framework regions (FRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FRs framework regions
  • Each VH and VL consists of 3 CDRs and 4 FRs arranged from the amino terminus to the carboxyl terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the variable regions (VH and VL) of each heavy chain/light chain pair respectively form the antigen-binding site.
  • the assignment of amino acids to regions or domains can follow various numbering systems known in the art.
  • CDR complementarity determining region
  • the variable regions of the heavy chain and light chain each contain three CDRs, named CDR1, CDR2 and CDR3.
  • CDR1, CDR2 and CDR3 The precise boundaries of these CDRs can be defined according to various numbering systems known in the art, for example according to the Kabat numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), Chothia numbering system (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al.
  • the CDRs contained in the antibody or antigen-binding fragment thereof can be determined according to various numbering systems known in the art, for example, by the Kabat, Chothia, IMGT or AbM numbering system.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof contains CDRs defined by the Chothia numbering system.
  • framework region or "FR” residues refers to those amino acid residues in an antibody variable region other than the CDR residues as defined above.
  • antigen-binding fragment of an antibody refers to a polypeptide that is a fragment of an antibody, such as a fragment of a full-length antibody, that retains the ability to specifically bind to the same antigen that the full-length antibody binds and/or competes with the full-length antibody.
  • Specific binding of antigen which is also called the "antigen-binding moiety”. See generally, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, NY (1989)), which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes. It can be obtained by recombinant DNA technology Or antigen-binding fragments of the antibody are produced by enzymatic or chemical cleavage of the intact antibody.
  • Non-limiting examples of antigen-binding fragments include Fab fragments, Fab' fragments, F(ab)' 2 fragments, F(ab)' 3 fragments, Fd , Fv, scFv, di-scFv, (scFv) 2 , disulfide-stabilized Fv proteins ("dsFv"), single domain antibodies (sdAb, Nanobodies) and such polypeptides, which contain an antigen sufficient to confer specificity to the polypeptide At least a portion of an antibody with binding capacity.
  • Engineered antibody variants are reviewed in Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23:1126-1136.
  • Fd means an antibody fragment consisting of VH and CH1 domains
  • dAb fragment means an antibody fragment consisting of a VH domain (Ward et al., Nature 341:544 546 (1989))
  • Fab fragment means an antibody fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains
  • F(ab') 2 fragment means an antibody fragment comprising two Fab fragments connected by a disulfide bridge on the hinge region
  • Fab'fragment means the fragment obtained by reducing the disulfide bond connecting the two heavy chain fragments in the F(ab') 2 fragment, consisting of an intact light chain and the Fd fragment of the heavy chain (consisting of the VH and CH1 structures domain composition) composition.
  • Fv means an antibody fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody. Fv fragments are generally considered to be the smallest antibody fragments that can form a complete antigen-binding site. It is generally believed that six CDRs confer the antigen-binding specificity of an antibody. However, even a variable region (such as an Fd fragment, which contains only three antigen-specific CDRs) can recognize and bind the antigen, although its affinity may be lower than that of the intact binding site.
  • Fc means a complex composed of the second and third constant regions of the first heavy chain of an antibody and the second and third constant regions of the second heavy chain. Antibody fragments formed by disulfide bonding of regions. The Fc fragment of an antibody has many different functions but does not participate in antigen binding.
  • scFv refers to a single polypeptide chain comprising VL and VH domains linked by a linker (see, e.g., Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Roseburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)).
  • Such scFv molecules may have the general structure: NH2 -VL-linker-VH-COOH or NH2 -VH-linker-VL-COOH.
  • Suitable prior art linkers consist of repeated GGGGS amino acid sequences or variants thereof.
  • a linker having the amino acid sequence (GGGGS) 4 can be used, but variants thereof can also be used (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448).
  • Other linkers useful in the present invention are provided by Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol.
  • a disulfide bond may also exist between VH and VL of scFv.
  • the VH and VL domains can be positioned relative to each other in any suitable arrangement. For example, scFv containing NH2 -VH-VH-COOH, NH2- VL-VL-COOH.
  • Each of the above antibody fragments retains the ability to specifically bind to the same antigen that the full-length antibody binds, and/or competes with the full-length antibody for specific binding to the antigen.
  • antibody includes not only intact antibodies but also antigen-binding fragments of the antibodies, unless the context clearly indicates otherwise.
  • Antigen-binding fragments of an antibody can be obtained from a given antibody (e.g., the antibodies provided by the invention) using conventional techniques known to those skilled in the art (e.g., recombinant DNA technology or enzymatic or chemical fragmentation methods) ), and the antigen-binding fragments of the antibody are screened for specificity in the same manner as for intact antibodies.
  • mouse-derived antibody refers to antibodies obtained by fusing B cells of immunized mice with myeloma cells, selecting murine hybrid fusion cells that can both proliferate indefinitely and secrete antibodies, and then screen , Antibody preparation and antibody purification; or it refers to the antibodies secreted by plasma cells after B cells differentiate and proliferate after the antigen invades the mouse body.
  • humanized antibody refers to a non-human antibody that has been genetically engineered and whose amino acid sequence has been modified to increase sequence homology with that of a human antibody.
  • CDR region of a humanized antibody comes from a non-human antibody (donor antibody), and all or part of the non-CDR region (for example, variable region FR and/or constant region) comes from a human source.
  • Immunoglobulins receptor antibodies. Humanized antibodies usually retain the expected properties of the donor antibody, including but not limited to, antigen specificity, affinity, reactivity, ability to increase immune cell activity, ability to enhance immune response, etc.
  • the antibody may be a mouse, rat, rabbit, or non-human primate with desired properties (e.g., antigen specificity, affinity, reactivity, ability to increase immune cell activity, and/or the ability to enhance an immune response) (e.g., cynomolgus monkey) antibodies.
  • desired properties e.g., antigen specificity, affinity, reactivity, ability to increase immune cell activity, and/or the ability to enhance an immune response
  • desired properties e.g., antigen specificity, affinity, reactivity, ability to increase immune cell activity, and/or the ability to enhance an immune response
  • desired properties e.g., antigen specificity, affinity, reactivity, ability to increase immune cell activity, and/or the ability to enhance an immune response
  • cynomolgus monkey e.g., cynomolgus monkey
  • amino acids are generally represented by one-letter and three-letter abbreviations well known in the art.
  • alanine can be represented by A or Ala.
  • alkyl refers to a straight-chain or branched saturated hydrocarbon group obtained by removing one hydrogen atom, such as “C 1-20 alkyl”, “C 1-10 alkyl”, “C 1-6 alkyl” , “C 1-4 alkyl”, “C 1-3 alkyl”, etc. Specific examples include but are not limited to: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec.
  • alkylene refers to a group obtained by removing 2 hydrogen atoms from a straight-chain or branched saturated hydrocarbon group, such as “C 1-20 alkylene”, “C 1-10 alkylene”, “C 3-10 “Alkylene”, “C 5-8 alkylene”, “C 1-6 alkylene”, “C 1-4 alkylene”, “C 1-3 alkylene”, etc. Specific examples include but Not limited to: methylene, ethylene, 1,3-propylene, 1,4-butylene, 1,5-pentylene or 1,6-hexylene, etc.
  • cycloalkyl refers to a saturated cyclic saturated hydrocarbon group, including, but not limited to, monocycloalkyl and bicycloalkyl (such as spirocycloalkyl, pentacycloalkyl and bridged cycloalkyl).
  • C 3-10 cycloalkyl refers to a cycloalkyl group having 3 to 10 ring-forming carbon atoms, such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, and the like.
  • heterocyclyl refers to a saturated or partially saturated cyclic structure containing at least one ring member selected from N, O and S. Specific examples include but are not limited to 3-12-membered heterocyclyl, 3-8-membered heterocyclyl, 5-6-membered heterocyclyl, etc., such as tetrahydrofuryl, pyrrolidinyl, piperidinyl, tetrahydropyranyl, etc.
  • heteroaryl refers to an aromatic cyclic structure containing at least one ring member selected from N, O and S. Specific examples include but are not limited to 5-10 membered heteroaryl, 5-6 membered heteroaryl, etc., such as furyl, thienyl, pyrrolyl, thiazolyl, isothiazolyl, thiadiazolyl, oxazolyl, iso Oxazolyl, oxadiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, 1,2,3-triazolyl, 1,2,4-triazolyl, 1,2,3-oxadiazolyl, 1,2 ,4-oxadiazolyl, 1,2,5-oxadiazolyl, 1,3,4-oxadiazolyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, pyrazinyl, 1,2,3- Triazinyl, 1,3,5-triazinyl, 1,2,4,5-tetra
  • aryl refers to a group obtained by removing a hydrogen atom from the carbon atom of the aromatic nucleus of an aromatic hydrocarbon molecule.
  • C 6-10 aromatic Group specific examples include but are not limited to phenyl, naphthyl, anthracenyl, etc.
  • fragment refers to the remaining part of a compound molecule after losing one or more atoms or groups of atoms.
  • cytotoxic drug fragment refers to the remaining portion of the cytotoxic drug obtained after losing a hydrogen atom or hydroxyl group of the cytotoxic drug described herein and connecting it to the linker in the antibody drug conjugate.
  • the cytotoxic drug fragment is represented by D1 .
  • TLR agonist fragment refers to the remaining portion of the TLR agonist described herein that is obtained by losing one or more atoms or groups of atoms and connecting the TLR agonist to a linker in an antibody drug conjugate.
  • the TLR agonist fragment is represented by D2 .
  • each substituent or value is selected independently of the other.
  • each substituent or value may be the same or different from another (other) substituent or value.
  • the present invention also includes all pharmaceutically acceptable isotopically labeled compounds that are identical to the compounds of the present invention except that one or more atoms are substituted with the same atomic number but an atomic mass or mass number different from the atomic mass that predominates in nature. or atomic substitution of mass number.
  • isotopes suitable for inclusion in the compounds of the present invention include, but are not limited to, isotopes of hydrogen (eg, 2 H, 3 H, deuterium D, tritium T); isotopes of carbon (eg, 11 C, 13 C, and 14 C); chlorine Isotopes of fluorine (e.g. 18 F); isotopes of iodine (e.g.
  • isotopes of nitrogen e.g. 13 N and 15 N
  • isotopes of oxygen e.g. 15 O, 17 O and 18 O
  • isotopes of phosphorus such as 32 P
  • isotopes of sulfur such as 35 S.
  • Certain isotopically labeled compounds of the invention eg, those incorporating radioactive isotopes
  • the radioactive isotopes tritium (i.e. 3 H) and carbon-14 (i.e. 14 C) are particularly useful for this purpose because they are easy to incorporate and detect.
  • positron emitting isotopes eg 11 C, 18 F, 15 O and 13 N
  • PTT positron emission tomography
  • Isotopically labeled compounds of the invention may be prepared by methods analogous to those described in the accompanying Schemes and/or Examples and Preparations by using appropriate isotopically labeled reagents in place of the previously employed non-labeled reagents.
  • Pharmaceutically acceptable solvates of the present invention include those in which the crystallization solvent may be isotopically substituted, for example, D2O , acetone- d6 or DMSO- d6 .
  • stereoisomer means an isomer formed due to at least one asymmetric center. In compounds with one or more (eg 1, 2, 3 or 4) asymmetric centers, it can give rise to racemic mixtures, single enantiomers, diastereomeric mixtures and Individual diastereomers. Certain individual molecules may also exist as geometric isomers (cis/trans). Similarly, compounds of the present invention may exist as mixtures of two or more structurally distinct forms in rapid equilibrium (often referred to as tautomers). Representative examples of tautomers include keto-enol tautomers, phenol-ketone tautomers, nitroso-oxime tautomers, and imine-enamine tautomers. wait.
  • the present invention encompasses all possible crystalline forms or polymorphs of the compounds of the invention, which may be a single polymorph or a mixture of more than one polymorph in any proportion.
  • compositions of the present invention may exist in free form for therapeutic use, or, where appropriate, as pharmaceutically acceptable derivatives thereof.
  • pharmaceutically acceptable derivatives include, but are not limited to: pharmaceutically acceptable salts, solvates, metabolites or prodrugs that, upon administration to a patient in need thereof, can directly or indirectly Compounds of the invention or metabolites or residues thereof are provided. Therefore, when reference is made herein to "a compound of the invention", it is also intended to encompass the various derivative forms of the compound described above.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention include acid addition salts and base addition salts thereof. Suitable acid addition salts are formed from acids that form pharmaceutically acceptable salts. Suitable base addition salts are formed from bases that form pharmaceutically acceptable salts.
  • suitable salts see Stahl and Wermuth, "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley-VCH, 2002). Methods for preparing pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the invention are known to those skilled in the art.
  • the compounds of the invention may exist in the form of solvates, preferably hydrates, wherein the compounds of the invention comprise a polar solvent as a structural element of the crystal lattice of said compound.
  • the amount of polar solvent, especially water, may be present in stoichiometric or non-stoichiometric ratios.
  • nitrogen-containing heterocycles are capable of forming N-oxides; those skilled in the art will recognize that nitrogen-containing heterocycles are capable of forming N-oxides. Nitrogen-containing heterocycle. Those skilled in the art will also recognize that tertiary amines are capable of forming N-oxides.
  • N-oxides of heterocyclic and tertiary amines are well known to those skilled in the art and include the use of peroxyacids such as peracetic acid and m-chloroperoxybenzoic acid (MCPBA), hydrogen peroxide, alkyl Hydroperoxides such as tert-butyl hydroperoxide, sodium perborate and dioxirane such as dimethyldioxirane are used to oxidize heterocyclic and tertiary amines.
  • MCPBA m-chloroperoxybenzoic acid
  • alkyl Hydroperoxides such as tert-butyl hydroperoxide
  • sodium perborate and dioxirane such as dimethyldioxirane
  • metabolites of the compounds of the invention ie substances formed in the body upon administration of the compounds of the invention. Such products may result, for example, from oxidation, reduction, hydrolysis, amidation, deamidation, esterification, enzymatic hydrolysis, etc. of the administered compound.
  • the invention includes metabolites of the compounds of the invention, including compounds prepared by contacting a compound of the invention with a mammal for a time sufficient to produce metabolites thereof.
  • the invention further includes within its scope prodrugs of the compounds of the invention, which are certain derivatives of the compounds of the invention which may themselves have little or no pharmacological activity when administered into the body or its Examples can be passed Such as hydrolytic cleavage and conversion into compounds of the invention having the desired activity.
  • prodrugs will be functional group derivatives of the compound that are readily converted in vivo to the desired therapeutically active compound. Additional information on the use of prodrugs can be found in "Pro-drugs as Novel Delivery Systems,” Volume 14, ACS Symposium Series (T. Higuchi and V. Stella) and "Bioreversible Carriers in Drug Design," Pergamon Press, 1987 ( Edited by EB Roche, American Pharmaceutical Association).
  • prodrugs of the present invention may be prepared, for example, by using certain moieties known to those skilled in the art as "pro-moiety” (eg as described in “Design of Prodrugs", H. Bundgaard (Elsevier, 1985)) Prepared by substituting appropriate functional groups present in the compounds of the invention.
  • Antibody-drug conjugates are also characterized by the average loading of the drug moiety (e.g., cytotoxic drugs and TLR agonists) to the antibody-binding moiety, often referred to as the drug-to-antibody ratio (DAR) of the conjugated sample.
  • the drug moiety e.g., cytotoxic drugs and TLR agonists
  • the average DAR of the ADC can be calculated.
  • the DAR of a given antibody drug conjugate sample represents the average number of drug (payload) molecules attached to a tetrameric antibody containing two light chains and two heavy chains.
  • the drug to antibody ratio has an exact value for a particular antibody drug conjugate molecule (e.g., m in formula (I)), it is understood that when used to describe samples containing many molecules, this value will often is an average value, which is due to some degree of non-uniformity typically associated with the coupling step.
  • the average loading of an antibody drug conjugate sample is referred to herein as the drug to antibody ratio or "DAR".
  • the DAR value (drug/antibody ratio of the conjugated sample) of the antibody drug conjugate is 1-10, for example: 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1 ⁇ 6, 1 ⁇ 7, 1 ⁇ 8, 1 ⁇ 9, 1 ⁇ 10, 2 ⁇ 3, 2 ⁇ 4, 2 ⁇ 5, 2 ⁇ 6, 2 ⁇ 7, 2 ⁇ 8, 2 ⁇ 9, 2 ⁇ 10 ,3 ⁇ 4,3 ⁇ 5,3 ⁇ 6,3 ⁇ 7,3 ⁇ 8,3 ⁇ 9,3 ⁇ 10,4 ⁇ 5,4 ⁇ 6,4 ⁇ 7,4 ⁇ 8,4 ⁇ 9,4 ⁇ 10, 5 ⁇ 6, 5 ⁇ 7, 5 ⁇ 8, 5 ⁇ 9, 5 ⁇ 10, 6 ⁇ 7, 6 ⁇ 8, 6 ⁇ 9, 6 ⁇ 10, 7 ⁇ 8, 7 ⁇ 9, 7 ⁇ 10 , 8 to 9, 8 to 10, or 9 to 10, preferably 3 to 8, for example, 3.0 to 3.5, 3.0 to 4.0, 3.0 to 4.5, 3.0 to 5.0, 3.0 to 5.5, 3.0 to 6.0, 3.5 to 4.0, 3.5 ⁇ 4.5, 3.5 ⁇ 5.0,
  • treatment generally refers to the partial or complete stabilization or cure of a disease and/or the side effects resulting from the disease.
  • treatment encompasses any treatment of a patient's disease that: (a) inhibits the symptoms of the disease, i.e., prevents their progression; or (b) alleviates the symptoms of the disease, i.e., causes regression of the disease or symptoms.
  • prevention refers to inhibiting and delaying the onset of a disease, including not only prevention before the development of the disease, but also prevention of the recurrence of the disease after treatment.
  • vertebrate refers to a mammal.
  • Mammals include, but are not limited to, livestock (such as cattle), pets (such as cats, dogs, and horses), primates, mice, and rats.
  • the mammal is a human.
  • an effective amount refers to an amount effective in the necessary dosage and time to achieve the desired therapeutic effect.
  • the “therapeutically effective amount” may vary depending on factors such as the disease state, age, sex and weight of the individual and the ability of the active ingredient to elicit the desired response in the individual.
  • a therapeutically effective amount also encompasses an amount of an active ingredient in which the therapeutically beneficial effects outweigh any toxic or harmful consequences.
  • a therapeutically effective amount of a drug can reduce the number of cancer cells; reduce the size of the tumor; inhibit (ie, slow down to a certain extent, preferably stop) the infiltration of cancer cells into surrounding organs; inhibit (ie, slow down to a certain extent, preferably stop) Tumor metastasis; inhibiting tumor growth to a certain extent; and/or alleviating one or more symptoms related to cancer to a certain extent.
  • the structure of the compound is determined by nuclear magnetic resonance ( 1 H NMR) or mass spectrometry (MS).
  • the measurement instrument of 1 H NMR is JEOL Eclipse 400 nuclear magnetic instrument.
  • the measurement solvent is deuterated methanol (CD 3 OD), deuterated chloroform (CDCl 3 ) or hexadeuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d 6 ), and the internal standard is For tetramethylsilane (TMS), chemical shifts ( ⁇ ) are given in parts per million (ppm).
  • the measuring instrument for MS is Agilent (ESI) mass spectrometer, manufacturer: Agilent, model: Agilent 6120B.
  • Instrument model Agilent 1260, chromatographic column: Waters SunFire Prep C18OBD (19mm ⁇ 150mm ⁇ 5.0 ⁇ m); chromatographic column temperature: 25°C; flow rate: 20.0mL/min; detection wavelength: 214nm; elution gradient: (0min: 10% A, 90% B; 16.0 min: 90% A, 10% B); mobile phase A: acetonitrile; mobile phase B: 0.05% formic acid aqueous solution.
  • the thin layer chromatography silica gel plate uses an aluminum plate (20 ⁇ 20cm) produced by Merck, and the specification used for thin layer chromatography separation and purification is GF 254 (1mm) produced in Yantai.
  • the reaction is monitored by thin layer chromatography (TLC) or LC-MS; the developing solvent systems used include: methylene chloride and methanol system, n-hexane and ethyl acetate system, and petroleum ether and ethyl acetate system.
  • TLC thin layer chromatography
  • LC-MS LC-MS
  • the volume of solvent The ratio can be adjusted according to the polarity of the compound or by adding triethylamine, etc.
  • Instrument model Biotage rapid medium pressure preparative chromatography, chromatographic column: Agela C18 reverse column (Spherical; 20-35 ⁇ m; 100A); chromatographic column temperature: 25°C; flow rate: 28.0mL/min; detection wavelength: 220nm; mobile phase A : Acetonitrile; Mobile phase B: 0.05% formic acid aqueous solution;
  • Microwave reaction uses Biotage Initiator+ (400W, RT ⁇ 300°C) microwave reactor.
  • Column chromatography generally uses 200 to 300 mesh silica gel as the carrier.
  • the eluent system includes: methylene chloride and methanol system, as well as petroleum ether and ethyl acetate system.
  • the volume ratio of the solvent is adjusted according to the polarity of the compound, and a small amount of triethylamine can also be added for adjustment.
  • reaction temperature is room temperature (20°C to 35°C).
  • the reagents used in this invention were purchased from Acros Organics, Aldrich Chemical Company, Tebo Chemical and other companies.
  • the first step Preparation of: (4-((6-nitrothieno[3,2-b]pyridin-7-yl)amino)butyl)carbamic acid tert-butyl ester
  • Second step Preparation of tert-butyl 4-((6-aminothieno[3,2-b]pyridin-7-yl)amino)butyl)carbamate
  • Step 3 Preparation of: (4-((6-pentanolamidothieno[3,2-b]pyridin-7-yl)amino)butyl)carbamic acid tert-butyl ester
  • Step 4 Preparation of (4-(2-butyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridin-1-yl)butyl)carbamic acid tert-butyl ester
  • Step 7 1-(4-((tert-butoxycarbonyl)amino)butyl)-2-butyl-7-methyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2- b] Preparation of pyridine-5-oxide
  • Step 8 (4-(4-amino-2-butyl-7-methyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridin-1-yl)butyl ) Preparation of tert-butyl carbamate
  • Step 10 N-(4-(4-amino-2-butyl-7-methyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridin-1-yl) Preparation of butyl)-4-((2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)methyl)cyclohexane-1-carboxamide
  • Step 11 2-((1-((4-((4-((4-(4-(4-(4-amino-2-butyl-7-methyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3, Preparation of 2-b]pyridin-1-yl)butyl)carbamoyl)cyclohexyl)methyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)thio)acetic acid (Int1)
  • Step 6 7-bromo-2-butyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridine-1-carboxylic acid tert-butyl ester and 7-bromo-2-butan Preparation of tert-butyl-3H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridine-3-carboxylate mixture
  • Step 7 7-bromo-1-(tert-butoxycarbonyl)-2-butyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridine 5-oxide and 7- Preparation of bromo-3-(tert-butoxycarbonyl)-2-butyl-3H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridine 5-oxide mixture
  • Step 8 7-bromo-2-butyl-4-(tert-butylamino)-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridine-1-carboxylic acid tert-butyl Mixture of ester and 7-bromo-2-butyl-4-(tert-butylamino)-3H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridine-3-carboxylic acid tert-butyl ester Preparation
  • Step 9 4-(2-butyl-4-(tert-butylamino)-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridin-7-yl)-3, Preparation of tert-butyl 6-dihydropyridine-1(2H)-carboxylate
  • Step 10 4-(2-butyl-4-(tert-butylamino)-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridin-7-yl)piperidine- Preparation of 1-carboxylic acid tert-butyl ester
  • Triethylamine (0.69g, 6.82mmol) was added to a solution of compound Int3-1 (2g, 3.41mmol) in dichloromethane (30mL), and methylsulfonyl chloride (0.58g, 5.12mmol) was added to the reaction solution while cooling in an ice-water bath. ) and stir at room temperature overnight. After the reaction is complete, dilute the reaction with methylene chloride. It was then washed with sodium carbonate solution and brine in sequence, and the organic phase was concentrated to obtain the title compound of this step (2.2 g, yield: 95.6%).
  • Dess-Martin oxidant (1.23 g, 29.3 mmol) was added to a solution of compound Int9-1 (1 g, 19.5 mmol) in dichloromethane (20 mL), and the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • Step 1 Preparation of benzyl 4-(((6-nitrothieno[3,2-b]pyridin-7-yl)amino)methyl)piperidine-1-carboxylate
  • Step 2 Preparation of 4-(((6-aminothieno[3,2-b]pyridin-7-yl)amino)methyl)piperidine-1-carboxylic acid benzyl ester
  • Step 3 Preparation of 4-(((6-pentanoamidothieno[3,2-b]pyridin-7-yl)amino)methyl)piperidine-1-carboxylic acid benzyl ester
  • Step 5 4-((7-bromo-2-butyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridin-1-yl)methyl)piperidine-1 -Preparation of benzyl carboxylate
  • Step 6 4-((2-butyl-7-methyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridin-1-yl)methyl)piperidine- Preparation of 1-carboxylic acid benzyl ester
  • Step 7 1-((1-((benzyloxy)carbonyl)piperidin)-4-yl)methyl)-2-butyl-7-methyl-1H-imidazo[4,5-d Preparation of ]thieno[3,2-b]pyridine-5-oxide
  • Step 8 4-((4-amino-2-butyl-7-methyl-1H-imidazo[4,5-d]thieno[3,2-b]pyridin-1-yl)methyl ) Preparation of piperidine-1-carboxylic acid benzyl ester
  • Step 2 Preparation of N 7 -((tetrahydro-2H-pyran-4-yl)methyl)thieno[3,2-b]pyridine-6,7-diamine
  • Step 7 7-bromo-N-(tert-butyl)-2-butyl-1-((tetrahydro-2H-pyran-4-yl)methyl)-1H-imidazo[4,5- Preparation of d]thieno[3,2-b]pyridin-4-amine
  • Step 8 4-(2-butyl-4-(tert-butylamino)-1-((tetrahydro-2H-pyran-4-yl)methyl)-1H-imidazo[4,5- Preparation of d]thieno[3,2-b]pyridin-7-yl)-3,6-dihydropyridine-1(2H)-carboxylic acid tert-butyl ester
  • Step 9 4-(2-butyl-4-(tert-butylamino)-1-((tetrahydro-2H-pyran-4-yl)methyl)-1H-imidazo[4,5- Preparation of d]thieno[3,2-b]pyridin-7-yl)piperidine-1-carboxylic acid tert-butyl ester
  • Example 1-1 Using the synthetic route of Example 1-1, the reaction raw material 6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-N-(prop-2-yne-1 -yl)hexanamide was replaced with 6-(2-(methanesulfonyl)pyrimidin-5-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)hexa-5-ynamide to obtain the title compound of this step (3mg, yield: 5.6%).
  • Example 1-1 The synthetic route of Example 1-1 is adopted, and the reaction raw material compound Int5 is replaced by the compound Int6, 6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-N-( Prop-2-yn-1-yl)hexanamide replaced with 6-(2-(methanesulfonyl)pyrimidin-5-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)hexa-5-ynamide , the title compound of this step (5 mg, yield: 8%) was obtained.
  • Example 1-1 The synthetic route of Example 1-1 was adopted, and the reaction raw material compound Int5 was replaced by compound Int6 to obtain the title compound of this step (10 mg, yield: 6%).

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Abstract

提供一类抗体药物偶联物、其药物组合物及应用。具体地，提供式(I)所示的抗体药物偶联物、用于制备所述抗体药物偶联物的药物-连接体、以及所述抗体药物偶联物在抗肿瘤中的应用。

Description

一类抗体药物偶联物、其药物组合物及应用
本申请是以CN申请号为202210465896.5，申请日为2022年4月29日的申请为基础，并主张其优先权，该CN申请的公开内容在此作为整体引入本申请中。
技术领域
本申请属于医药领域，具体涉及一类抗体药物偶联物、其药物组合物及应用。
背景技术
抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)通过特定的连接子将抗体和小分子细胞毒药物偶联起来，抗体作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，从而降低全身暴露，提高安全性，是肿瘤靶向治疗的研究和发展热点。
随着ADC技术的发展，在ADC的基础上开发出了免疫刺激抗体偶联物(Immune-stimulating antibody conjugate,ISAC)，ISAC通过可/不可切割的连接子将免疫激动剂或免疫调节剂如TLR7和/或TLR8激动剂与抗体偶联形成。免疫刺激抗体偶联物结合了抗体的精确靶向与免疫刺激剂的免疫激活和持久免疫记忆功效，实现系统给药的安全性并引发抗肿瘤免疫反应。
在抗肿瘤治疗的研究中，有一个较为明显的发展趋势是从单一治疗转向联合治疗。从临床需求而言，理想的联合用药可以提高临床疗效，降低药品毒性，延缓或避免抗药性的产生。联合用药一方面是将两种现有药物联合使用，譬如将细胞毒性药物与免疫刺激剂联合使用，另一方面将两种有效成分组合形成新的单一药物。
借助抗体的靶向性，将细胞毒性药物和免疫刺激剂与抗体偶联得到的双功能载荷免疫刺激抗体药物偶联物(immunomodulatory antibody drug conjugate,iADC)，可同时进入肿瘤细胞及肿瘤微环境免疫细胞，发挥细胞毒药物的肿瘤杀伤和免疫刺激剂的局部免疫活化双重功效，从而提高抗体药物偶联物治疗癌症的疗效。
发明内容
本发明将细胞毒性药物和TLR激动剂与抗体偶联得到的一种双功能载荷免疫刺激抗体药物偶联物，其可同时进入肿瘤细胞及肿瘤微环境免疫细胞，发挥细胞毒药物的肿瘤杀伤和TLR激动剂的局部免疫活化双重功效，相较于单独偶联细胞毒性药物的抗体药物偶联物，具有提高的癌症治疗效果。
具体地，本发明提供一种如式(I)所示的抗体药物偶联物：
其中，
Ab为靶向基团；
M为和靶向基团连接的接头部位；
X为连接M和Aa的连接子；
Aa为氨基酸片段或由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段；
L1为共价键或连接Aa和D1的连接子；
L2为连接Aa和D2的连接子；
D1选自细胞毒性药物片段；
D2选自TLR激动剂片段；
m选自1到10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，Ab为可靶向目标抗原的靶向基团，所述靶向基团针对细胞表面受体或肿瘤表面抗原。
在一些实施方案中，Ab为抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、鼠源抗体、人源化抗体、全人抗体和包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白。
在一些实施方案中，Ab为抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv和scFv。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自抗-Her-2抗体、抗-EGFR抗体、抗-VEGFR抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-1抗体、抗-CTLA-4抗体和抗-Trop-2抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为曲妥珠单抗(Trastuzumab)。
在一些实施方案中，M为共价键或选自以下结构：
其中，各a独立地选自1-5的整数，b选自1-3的整数，并且M的1位置与Ab相连，2位置与X相连。
在一些实施方案中，M为共价键或选自以下结构：
其中，各a独立地选自1-5的整数，b选自1-3的整数，并且M的1位置与Ab相连，2位置与X相连。
在一些实施方案中，M为共价键或选自以下结构：
在一些实施方案中，M为共价键或选自以下结构：
在一些实施方案中，M为共价键或选自以下结构：
在一些实施方案中，X为共价键或选自C1-6亚烷基、-NH-(CH2)c-C(O)-、
其中，各c独立地选自1-10的整数；X的3位置与M相连，4位置与Aa相连。
在一些实施方案中，X为共价键或
其中，各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)；X的3位置与M相连，4位置与Aa相连。
在一些实施方案中，Aa选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Gly、Phe、Ala、Val、Ser、Thr、His、Trp、Cys、Asp、Glu、Lys、Tyr和Arg，任选地，各氨基酸独立地被C1-6烷基或聚乙二醇亲水结构单元修饰。在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，Aa选自下述氨基酸的片段和由它们中的两个或多个任意组合形成的肽片段：Gly、Phe、Ala、Val、Cys、Asp、Glu、Lys和Arg，并且各氨基酸各自独立地任选地被C1-6烷基或聚乙二醇亲水结构单元修饰。在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，Aa选自下述氨基酸的片段和由它们中的两个或多个任意组合形成的肽片段：Val、Cys、Asp、Glu和Lys，其中，Glu和Lys羧基端任选地被修饰，其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，Aa选自以下结构：
其中，各R7独立地选自H、C1-6烷基和聚乙二醇亲水结构单元；各R8独立地选自羟基和聚乙二醇亲水结构单元；5位置与X相连，6位置与L1和L2中的一个相连，7位置与L1和L2中的另一个相连。
在一些实施方案中，5位置与X相连，6位置与L1相连，7位置与L2相连。
在一些实施方案中，5位置与X相连，6位置与L2相连，7位置与L1相连。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，R7为H。
在一些实施方案中，Aa选自以下结构：
其中，各R7独立地选自H、C1-6烷基和聚乙二醇亲水结构单元；各R8独立地选自羟基和聚乙二醇亲水结构单元；5位置与X相连，6位置与L1和L2中的一个相连，7位置与L1和L2中的另一个相连；优选地，5位置与X相连，6位置与L1相连，7位置与L2相连。
在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，L1为共价键或选自不可断裂连接子和可断裂连接子，其中，可断裂连接子被病理环境中存在的酶切割，所述酶选自蛋白酶、磷酸酶、焦磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和硫酸酯酶。
在一些实施方案中，L1为共价键或-La-Lb-Lc-，其中：
La为共价键或选自C1-6亚烷基、-NH-(CH2)c-C(O)-、 其中，各c独立地选自1-10的整数；
Lb为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
Lc为共价键、-NH-CH2-或选自以下结构：
在一些实施方案中，L1为共价键或-La-Lb-Lc-，其中：
La为共价键或选自C1-6亚烷基、-NH-(CH2)c-C(O)-、 其中，各c独立地选自1-10的整数；
Lb为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
Lc为共价键、-NH-CH2-或选自以下结构：
在一些实施方案中，La为共价键或选自其中，各c独立地选自1-10的整数。
在一些实施方案中，Lb为共价键或选自以下结构：
其中，R9选自H、乙酰基、芴氧羰基、三苯甲基和聚乙二醇亲水结构单元。在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元为其中各c独立地选自1-10的整数。
在一些实施方案中，Lc为-NH-CH2-或
在一些实施方案中，L1为共价键或-La-Lb-Lc-，其中：
La为共价键或选自其中，各c独立地选自1-10的整数；
Lb为共价键或选自
Lc为-NH-CH2-或
在一些实施方案中，L1为共价键或选自以下结构：
其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L1为共价键或选自以下结构：
其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L1为：

其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L1为：
其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L1为：
其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L2选自不可断裂连接子和可断裂连接子，其中，可断裂连接子被病理环境中存在的酶切割，所述酶选自蛋白酶、磷酸酶、焦磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和硫酸酯酶。
在一些实施方案中，L2为-Ld-Le-Lf-，其中：
Ld为共价键或选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C1-6亚烷基、-C(O)-(CH2)d-NH-、 其中，各d独立地选自1-12的整数；
Le为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
Lf为共价键、-CH2-NH-或选自以下结构：
在一些实施方案中，L2为-Ld-Le-Lf-，其中：
Ld为共价键或选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C1-6亚烷基、-C(O)-(CH2)d-NH-、 其中，各d独立地选自1-12的整数；
Le为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
Lf为共价键、-CH2-NH-或选自以下结构：
在一些实施方案中，Le为共价键或选自以下结构：
其中，各R10独立地选自H、乙酰基、芴氧羰基、三苯甲基和聚乙二醇亲水结构单元；优选地，所述聚乙二醇亲水结构单元为各d独立地选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L2选自以下结构：
其中，位置10同Aa相连，位置11同D2相连。
在一些实施方案中，L2选自以下结构：
其中，位置10同Aa相连，位置11同D2相连；
在一些实施方案中，L2选自以下结构：
其中，位置10同Aa相连，位置11同D2相连。
在一些实施方案中，L2为：
其中，位置10与Aa相连，位置11与D2相连。
在一些实施方案中，L2为：
其中，位置10与Aa相连，位置11与D2相连。
在一些实施方案中，D1选自细胞毒性药物片段，所述细胞毒性药物选自微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂和拓扑异构酶抑制剂，所述微管蛋白抑制剂包括但不限于海兔毒素(dolastatin)、澳瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类、微管溶素(Tubulysins)类和隐粘菌素(cryptomycins)类，所述DNA损伤剂包括但不限于PBD类、杜卡霉素 (duocarmycin)类和卡齐霉素(calicheamicin)类，所述拓扑异构酶抑制剂包括但不限于喜树碱及其衍生物。
在一些实施方案中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素10、MMAE、MMAF、美登素、DM1、DM3和DM4，所述拓扑异构酶抑制剂选自喜树碱、SN-38、依喜替康、拓扑替康、贝洛替康、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、阿霉素、表柔比星和PNU-159682。
在一些实施方案中，D1选自以下结构：
在一些实施方案中，D2为TLR激动剂片段。
在一些实施方案中，所述TLR激动剂选自TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂和TLR9激动剂。
在一些实施方案中，D2为TLR激动剂片段，所述TLR激动剂选自TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR7/8激动剂。
在一些实施方案中，D2为TLR激动剂片段，所述TLR激动剂为式(II)所示化合物：
其中，
X1选自N和C；
X2选自N和C；
且X1和X2中至少一个选自N；
X3选自O、S和N；
X4选自O、S、N和CR4；
R1选自C1-6烷基和-C1-6亚烷基-O-C1-6烷基；
R2选自氢和式-L3-L4-L5-L6；
L3选自共价键和C1-6亚烷基；
L4选自共价键、C3-10环烷基、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代；
L5选自共价键、-O-、-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-NR5-、-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-、-O-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-O-、-NR5-C(O)-NR5-、-S(O)r-NR5-、-NR5-S(O)r-和-NR5-S(O)r-NR5-；
L6选自氢、C1-6烷基、-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代；
R3选自氢和式-L7-L8-L9-L10；
L7选自共价键和C1-6亚烷基；
L8选自共价键、C3-10环烷基、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代；
L9选自共价键、-O-、-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-NR6-、-C(O)-NR6-、-NR6-C(O)-、-O-C(O)-NR6-、-NR6-C(O)-O-、-NR6-C(O)-NR6-、-S(O)p-NR6-、-NR6-S(O)p-和-NR6-S(O)p-NR6-；
L10选自氢、C1-6烷基、-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代；
R4选自氢、卤素、氰基、羟基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基和C3-10环烷基；
各R5独立地选自氢和C1-6烷基；
各R6独立地选自氢和C1-6烷基；
各r独立地为1或2；
各n独立地选自1-25的整数；
各p独立地为1或2；
各q独立地选自1-25的整数；
D2通过式(II)中的R2或R3与L2相连。
在一些实施方案中，各n独立地选自1-15，优选地，n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
在一些实施方案中，各q独立地选自1-15，优选地，q选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
在一些实施方案中，X3选自S和N。
在一些实施方案中，L3选自共价键和C1-3亚烷基。
在一些实施方案中，L4选自共价键、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代。
在一些实施方案中，L5选自共价键、-NR5-、-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-、-O-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-O-、-NR5-C(O)-NR5-、-S(O)r-NR5-、-NR5-S(O)r-和-NR5-S(O)r-NR5-，各R5独立地选自氢和C1-6烷基；优选地，L5选自共价键和-NR5-，各R5独立地选自氢和C1-6烷基。
在一些实施方案中，L6选自氢、C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代，n为1-10。
在一些实施方案中，L8选自共价键和3-12元杂环基，所述杂环基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基和C1-6烷基所取代。
在一些实施方案中，L9为共价键。
在一些实施方案中，L10选自氢、C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基，q为1-10。
在一些实施方案中，R3选自氢和式-L7-L8-L9-L10；
L8选自共价键和3-12元杂环基，所述杂环基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰 基和C1-6烷基所取代；
L9为共价键；
L10选自氢、C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基；
q选自1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一些实施方案中，X1为C；
X2为N；
X3为S；
X4选自CR4；
R1选自C1-6烷基；
R2选自式-L3-L4-L5-L6；
L3选自共价键和C1-6亚烷基；
L4选自共价键、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代；
L5选自共价键和-NR5-，各R5独立地选自氢和C1-6烷基；
L6选自氢、C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代。
在一些实施方案中，D2选自以下结构：

在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物选自以下结构：














各m独立地选自1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，所述Ab为曲妥珠单抗。
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物的DAR值为2.0-5.0，例如2.0-2.5，2.0-3.0，2.0-3.5，2.0-4.0，2.0-4.5，2.0-5.0，2.5-3.0，2.5-3.5，2.5-4.0，2.5-4.5，2.5-5.0，3.0-3.5，3.0-4.0，3.0-4.5，3.0-5.0，3.5-4.0，3.5-4.5，3.5-5.0，4.0-4.5，4.0-5.0，或4.0-5.0。
药物-连接体
在另一个方面，本发明提供一种同时偶联有细胞毒性药物和TLR激动剂的药物-连接体，其可用于制备前述抗体药物偶联物。
具体地，本发明提供式(III)的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药：
其中，
M1为和靶向基团连接的接头部位的前体，其中所述靶向基团如前文任一项所定义；
X为连接M和Aa的连接子；
Aa选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段；
L1为共价键或连接Aa和D1的连接子；
L2为连接Aa和D2的连接子；
D1选自细胞毒性药物片段；
D2选自TLR激动剂片段。
在一些实施方案中，M1选自以下结构：
其中，各a独立地选自1-5的整数，b选自1-3的整数，Ma为羧基的活化基团(例如，五氟苯氧基)。
在一些实施方案中，M1选自以下结构：
其中，各a独立地选自1-5的整数，b选自1-3的整数，Ma为羧基的活化基团。
在一些实施方案中，M1为共价键或选自以下结构：
在一些实施方案中，M1为共价键或选自以下结构：
在一些实施方案中，X为共价键或选自C1-6亚烷基、-NH-(CH2)c-C(O)-、
其中，各c独立地选自1-10的整数；X的3位置与M相连，4位置与Aa相连。
在一些实施方案中，X为共价键或
其中，各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)；X的3位置与M相连，4位置与Aa相连。
在一些实施方案中，Aa选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Gly、Phe、Ala、Val、Ser、Thr、His、Trp、Cys、Asp、Glu、Lys、Tyr和Arg，任选地，各氨基酸独立地被C1-6烷基或聚乙二醇亲水结构单元修饰。在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，Aa选自下述氨基酸的片段和由它们中的两个或多个任意组合形成的肽片段：Gly、Phe、Ala、Val、Cys、Asp、Glu、Lys和Arg，并且各氨基酸各自独立地任选地被C1-6烷基或聚乙二醇亲水结构单元修饰。在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，Aa选自下述氨基酸的片段和由它们中的两个或多个任意组合形 成的肽片段：Val、Cys、Asp、Glu和Lys，其中，Glu和Lys羧基端任选地被修饰，其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，Aa选自以下结构：
其中，各R7独立地选自H、C1-6烷基和聚乙二醇亲水结构单元；各R8独立地选自羟基和聚乙二醇亲水结构单元；5位置与X相连，6位置与L1和L2中的一个相连，7位置与L1和L2中的另一个相连。在一些实施方案中，5位置与X相连，6位置与L1相连，7位置与L2相连。在一些实施方案中，5位置与X相连，6位置与L2相连，7位置与L1相连。 在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。在一些实施方案中，R7为H。
在一些实施方案中，Aa选自以下结构：
其中，各R7独立地选自H、C1-6烷基和聚乙二醇亲水结构单元；各R8独立地选自羟基和聚乙二醇亲水结构单元；5位置与X相连，6位置与L1和L2中的一个相连，7位置与L1和L2中的另一个相连；优选地，5位置与X相连，6位置与L1相连，7位置与L2相连。在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数(例如5-10的整数，再例如8-10的整数)。
在一些实施方案中，L1为共价键或选自不可断裂连接子和可断裂连接子，其中，可断裂连接子被病理环境中存在的酶切割，所述酶选自蛋白酶、磷酸酶、焦磷酸酶、β-葡萄糖 醛酸酶、β-半乳糖苷酶和硫酸酯酶。
在一些实施方案中，L1为共价键或-La-Lb-Lc-，其中：
La为共价键或选自C1-6亚烷基、-NH-(CH2)c-C(O)-、 其中，各c独立地选自1-10的整数；
Lb为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
Lc为共价键、-NH-CH2-或选自以下结构：
在一些实施方案中，L1为共价键或-La-Lb-Lc-，其中：
La为共价键或选自C1-6亚烷基、-NH-(CH2)c-C(O)-、 其中，各c独立地选自1-10的整数；
Lb为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
Lc为共价键、-NH-CH2-或选自以下结构：
在一些实施方案中，La为共价键或选自其中，各c独立地选自1-10的整数。在一些实施方案中，Lb为共价键或选自以下结构：
其中，R9选自H、乙酰基、芴氧羰基、三苯甲基和聚乙二醇亲水结构单元。在一些实施方案中，所述聚乙二醇亲水结构单元为其中各c独立地选自1-10的整数。
在一些实施方案中，Lc为-NH-CH2-或
在一些实施方案中，L1为共价键或-La-Lb-Lc-，其中：
La为共价键或选自其中，各c独立地选自1-10的整数；
Lb为共价键或选自
Lc为-NH-CH2-或
在一些实施方案中，L1为共价键或选自以下结构：
其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L1为共价键或选自以下结构：
其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L1选自以下结构：

其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。在一些实施方案中，L1选自以下结构：
其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L1选自以下结构：
其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连。
在一些实施方案中，L2选自不可断裂连接子和可断裂连接子，其中，可断裂连接子被病理环境中存在的酶切割，所述酶选自蛋白酶、磷酸酶、焦磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和硫酸酯酶。
在一些实施方案中，L2为-Ld-Le-Lf-，其中：
Ld为共价键或选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C1-6亚烷基、-C(O)-(CH2)d-NH-、 其中，各d独立地选自1-12的整数；
Le为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
Lf为共价键、-CH2-NH-或选自以下结构：
在一些实施方案中，L2为-Ld-Le-Lf-，其中：
Ld为共价键或选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C1-6亚烷基、-C(O)-(CH2)d-NH-、 其中，各d独立地选自1-12的整数；
Le为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
Lf为共价键、-CH2-NH-或选自以下结构：
在一些实施方案中，Le为共价键或选自以下结构：
其中，各R10独立地选自H、乙酰基、芴氧羰基、三苯甲基和聚乙二醇亲水结构单元；优选地，所述聚乙二醇亲水结构单元为各d独立地选自1-10的整数。
在一些实施方案中，L2选自以下结构：
其中，位置10同Aa相连，位置11同D2相连。
在一些实施方案中，L2选自以下结构：
其中，位置10同Aa相连，位置11同D2相连；
在一些实施方案中，L2选自以下结构：
其中，位置10同Aa相连，位置11同D2相连。
在一些实施方案中，L2选自以下结构：
其中，位置10与Aa相连，位置11与D2相连。
在一些实施方案中，L2选自以下结构：
其中，位置10与Aa相连，位置11与D2相连。
在一些实施方案中，D1选自细胞毒性药物片段，所述细胞毒性药物选自微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂和拓扑异构酶抑制剂，所述微管蛋白抑制剂包括但不限于海兔毒素(dolastatin)、澳瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类、微管溶素(Tubulysins)类和隐粘菌素(cryptomycins)类，所述DNA损伤剂包括但不限于PBD类、杜卡霉素 (duocarmycin)类和卡齐霉素(calicheamicin)类，所述拓扑异构酶抑制剂包括但不限于喜树碱及其衍生物。
在一些实施方案中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素10、MMAE、MMAF、美登素、DM1、DM3和DM4，所述拓扑异构酶抑制剂选自喜树碱、SN-38、依喜替康、拓扑替康、贝洛替康、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、阿霉素、表柔比星和PNU-159682。
在一些实施方案中，D1选自以下结构：
在一些实施方案中，D2为TLR激动剂片段。
在一些实施方案中，所述TLR激动剂选自TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂和TLR9激动剂。
在一些实施方案中，D2为TLR激动剂片段，所述TLR激动剂选自TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR7/8激动剂。
在一些实施方案中，D2为TLR激动剂片段，所述TLR激动剂为式(II)所示化合物：
其中，
X1选自N和C；
X2选自N和C；
且X1和X2中至少一个选自N；
X3选自O、S和N；
X4选自O、S、N和CR4；
R1选自C1-6烷基和-C1-6亚烷基-O-C1-6烷基；
R2选自氢和式-L3-L4-L5-L6；
L3选自共价键和C1-6亚烷基；
L4选自共价键、C3-10环烷基、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代；
L5选自共价键、-O-、-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-NR5-、-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-、-O-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-O-、-NR5-C(O)-NR5-、-S(O)r-NR5-、-NR5-S(O)r-和-NR5-S(O)r-NR5-；
L6选自氢、C1-6烷基、-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代；
R3选自氢和式-L7-L8-L9-L10；
L7选自共价键和C1-6亚烷基；
L8选自共价键、C3-10环烷基、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代；
L9选自共价键、-O-、-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-NR6-、-C(O)-NR6-、-NR6-C(O)-、-O-C(O)-NR6-、-NR6-C(O)-O-、-NR6-C(O)-NR6-、-S(O)p-NR6-、-NR6-S(O)p-和-NR6-S(O)p-NR6-；
L10选自氢、C1-6烷基、-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代；
R4选自氢、卤素、氰基、羟基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基和C3-10环烷基；
各R5独立地选自氢和C1-6烷基；
各R6独立地选自氢和C1-6烷基；
各r独立地为1或2；
各n独立地选自1-25的整数；
各p独立地为1或2；
各q独立地选自1-25的整数；
D2通过式(II)中的R2或R3与L2相连。
在一些实施方案中，各n独立地选自1-15，优选地，n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
在一些实施方案中，各q独立地选自1-15，优选地，q选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。
在一些实施方案中，X3选自S和N。
在一些实施方案中，L3选自共价键和C1-3亚烷基。
在一些实施方案中，L4选自共价键、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代。
在一些实施方案中，L5选自共价键、-NR5-、-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-、-O-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-O-、-NR5-C(O)-NR5-、-S(O)r-NR5-、-NR5-S(O)r-和-NR5-S(O)r-NR5-，各R5独立地选自氢和C1-6烷基；优选地，L5选自共价键和-NR5-，各R5独立地选自氢和C1-6烷基。
在一些实施方案中，L6选自氢、C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代，n为1-10。
在一些实施方案中，L8选自共价键和3-12元杂环基，所述杂环基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基和C1-6烷基所取代。
在一些实施方案中，L9为共价键。
在一些实施方案中，L10选自氢、C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基，q为1-10。
在一些实施方案中，R3选自氢和式-L7-L8-L9-L10；
L8选自共价键和3-12元杂环基，所述杂环基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰 基和C1-6烷基所取代；
L9为共价键；
L10选自氢、C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基；
q选自1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在一些实施方案中，X1为C；
X2为N；
X3为S；
X4选自CR4；
R1选自C1-6烷基；
R2选自式-L3-L4-L5-L6；
L3选自共价键和C1-6亚烷基；
L4选自共价键、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-3烷基、C1-3烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代；
L5选自共价键和-NR5-，各R5独立地选自氢和C1-6烷基；
L6选自氢、C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代。
在一些实施方案中，D2选自以下结构：

在一些实施方案中，所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药选自以下结构：















药物组合物
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其含有前文任一项所述的抗体药物偶联物、化合物(例如药物连接体、TLR激动剂或细胞毒性药物)或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药，以及一种或多种药用辅料。
制备各种含有一定量的活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述，制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药用辅料。
应用
在另一个方面，本发明提供前文任一项所述的抗体药物偶联物、化合物(例如药物连接体、TLR激动剂或细胞毒性药物)或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药在制备抗体药物偶联物中的用途，特别是制备前文任一项所述的抗体药物偶联物。
在另一个方面，本发明提供前文任一项所述的抗体药物偶联物、化合物(例如药物连接体、TLR激动剂或细胞毒性药物)或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药、或药物组合物在制备治疗和/或预防癌症(例如HER2阳性癌症，例如HER2阳性胃癌、乳腺癌或非小细胞肺癌)的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供前文任一项所述的抗体药物偶联物、化合物(例如药物连接体、TLR激动剂或细胞毒性药物)或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药、或药物组合物，其用于治疗和/或预防癌症(例如HER2阳性癌症，例如HER2阳性胃癌、乳腺癌或非小细胞肺癌)。
在另一个方面，本发明提供一种治疗和/或预防癌症(例如HER2阳性癌症，例如HER2阳性胃癌、乳腺癌或非小细胞肺癌)的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的前文任一项所述的抗体药物偶联物、化合物(例如药物连接体、TLR激动剂或细胞毒性药物)或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药、或药物组合物。
制备方法
在另一个方面，本发明提供制备本发明中式(III)所示化合物的方法。
当式(III)的化合物的X含有结构片段时，X为其中Xa和Xb分别为X中两侧的结构；本发明提供了制备式(III)的化合物的方法，其包括以下步骤：
其中，LG1和LG2表示离去基团，包括但不限于卤素、羟基、丁二酰亚胺酯、活性酯等，PG1和PG2表示保护基团，包括但不限于苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、芴氧羰基(Fmoc)、苄基、乙酰基、叔丁基等；L1a为形成L1的前体结构，优选含不饱和双键，并通过发生在该不饱和双键上的加成反应与Aa连接；
D1、D2、L1、L2、X、Aa和M1如上文所定义；
步骤一：化合物III-1与化合物III-2发生缩合反应得到化合物III-3；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的组合。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤二：化合物III-3发生脱保护反应得到化合物III-4；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自1,4-二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选二氯甲烷。所述反应优选在适合的酸存在下进行，所述酸可选自盐酸、三氟乙酸，优选三氟乙酸。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤三：化合物III-4与化合物III-5发生缩合反应得到化合物III-6；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙 氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的组合。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤四：化合物III-6发生脱保护反应得到化合物III-7；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自1,4-二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选二氯甲烷。所述反应优选在适合的酸存在下进行，所述酸可选自醋酸、氢溴酸、盐酸、三氟乙酸，优选三氟乙酸。所述反应可添加三乙基硅烷作为离子捕获剂。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤五：化合物III-7与化合物III-8发生加成反应得到化合物III-9；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自1,4-二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤六：化合物III-9与化合物III-10发生环合反应得到化合物III；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、水及其任意组合，优选二甲基亚砜和水的混合溶剂。所述反应优选在金属催化剂的存在下进行。所述金属催化剂可选自硫酸铜、碘化亚铜、溴化亚铜、醋酸铜，优选硫酸铜。所述反应优选在抗坏血酸或抗坏血酸钠的存在下进行。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
当X为共价键时，本发明提供了制备式(III)的化合物的另一种方法，其包括以下步骤：
其中，LG1、LG2和LG3表示离去基团，包括但不限于卤素、羟基、丁二酰亚胺酯、活性酯等，PG1和PG2表示保护基团，包括但不限于苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、芴氧羰基(Fmoc)、苄基、乙酰基、叔丁基等；
D1、D2、L1、L2、Aa和M1如上文所定义；
步骤一：化合物III-11与化合物III-12发生缩合反应得到化合物III-13；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤二：化合物III-13发生脱保护反应得到化合物III-14；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自1,4-二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选二氯甲烷。所述反应优选在适合的酸存在下进行，所述酸可选自盐酸、三氟乙酸、溴化锌，优选溴化锌。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤三：化合物III-14与化合物III-5发生缩合反应得到化合物III-15；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲 氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤四：化合物III-15发生脱保护反应得到化合物III-16；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在适合的碱存在下进行，所述碱可选自二乙胺、哌啶，优选哌啶。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-6小时。
步骤五：化合物III-16与化合物III-17发生取代反应得到化合物III；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,2-二氯乙烷、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
当X为共价键时，本发明提供了制备式(III)的化合物的另一种方法，其包括以下步骤：
其中，LG1、LG2和LG3表示离去基团，包括但不限于卤素、羟基、丁二酰亚胺酯、活性酯等，PG1和PG2表示保护基团，包括但不限于苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、芴氧羰基(Fmoc)、苄基、乙酰基、叔丁基等；
D1、D2、L1、L2、Aa和M1如上文所定义；
步骤一：化合物III-18与化合物III-19发生缩合反应得到化合物III-20；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。 所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤二：化合物III-20发生脱保护反应得到化合物III-21；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自1,4-二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选二氯甲烷。所述反应优选在适合的酸存在下进行，所述酸可选自盐酸、三氟乙酸，优选三氟乙酸。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤三：化合物III-21与化合物III-22发生缩合反应得到化合物III-23；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤四：化合物III-23发生脱保护反应得到化合物III-24；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在适合的碱存在下进行，所述碱可选自二乙胺、哌啶，优选哌啶。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-6小时。
步骤五：化合物III-24与化合物III-25发生取代反应得到化合物III；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,2-二氯乙烷、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反 应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
当Aa是由两个或两个以上氨基酸形成的多肽片段时，Aa为-Aa1-Aa2-，其中Aa1和Aa2为构成Aa的氨基酸片段；本发明提供了制备式(III)的化合物的另一种方法，其包括以下步骤：
其中，LG1、LG2和LG3表示离去基团，包括但不限于卤素、羟基、丁二酰亚胺酯、活性酯等，PG1、PG2和PG3表示保护基团，包括但不限于苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、芴氧羰基(Fmoc)、苄基、乙酰基、叔丁基等；Aa1和Aa2为构成Aa的氨基酸片段；
D1、D2、L1、L2、X、Aa和M1如上文所定义；
步骤一：化合物III-26与化合物III-27发生缩合反应得到化合物III-28；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙 胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤二：化合物III-28发生脱保护反应得到化合物III-29；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自1,4-二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选1,4-二氧六环。所述反应优选在适合的酸存在下进行，所述酸可选自醋酸、氢溴酸、盐酸、三氟乙酸，优选盐酸。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤三：化合物III-29与化合物III-30发生缩合反应得到化合物III-31；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤四：化合物III-31发生脱保护反应得到化合物III-32；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自1,4-二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选二氯甲烷。所述反应优选在适合的酸存在下进行，所述酸可选自盐酸、三氟乙酸，优选三氟乙酸。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤五：化合物III-32与化合物III-33发生缩合反应得到化合物III-34；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙 胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤六：化合物III-34发生脱保护反应得到化合物III-35；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在适合的碱存在下进行，所述碱可选自二乙胺、哌啶，优选哌啶。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-6小时。
步骤七：化合物III-35与化合物III-36发生取代反应得到化合物III；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,2-二氯乙烷、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
当Aa是由两个或两个以上氨基酸形成的多肽片段时，Aa为-Aa1-Aa2-；本发明提供了制备式(III)的化合物的另一种方法，其包括以下步骤：
其中，LG1、LG2和LG3表示离去基团，包括但不限于卤素、羟基、丁二酰亚胺酯、活性酯等，PG1和PG2表示保护基团，包括但不限于苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、芴氧羰基(Fmoc)、苄基、乙酰基、叔丁基等；Aa1和Aa2分别为氨基酸片段或由两个或两个以上氨基酸形成的多肽片段；
D1、D2、L1、L2、X、Aa和M1如上文所定义；
步骤一：化合物III-37与化合物III-38发生缩合反应得到化合物III-39；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤二：化合物III-39发生脱保护反应得到化合物III-40；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在适合的碱存在下进行，所述碱可选自二乙胺、哌啶，优选哌啶。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-6小时。
步骤三：化合物III-40与化合物III-41发生缩合反应得到化合物III-42；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在缩合剂的存在下进行。所述缩合剂可选自1-羟基苯并三唑、2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，优选2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述缩合反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤四：化合物III-42发生脱保护反应得到化合物III-43；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自1,4-二氧六环、二氯甲烷、四氢呋喃及其任意组合，优选二氯甲烷。所述反应优选在适合的酸存在下进行，所述酸可选自盐酸、三氟乙酸、溴化锌，优选溴化锌。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
步骤五：化合物III-43与化合物III-44发生取代反应得到化合物III；
所述反应优选在适合的有机溶剂中进行。所述有机溶剂可选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,2-二氯乙烷、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺及其任意组合，优选N,N-二甲基甲酰胺。所述反应优选在碱的存在下进行。所述碱可选自N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶，优选N,N-二异丙基乙胺。所述反应优选在适合的温度下进行，所述温度优选为-10-60℃。所述反应优选进行合适的时间，例如1-12小时。
术语定义
除非在下文中另有定义，本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。提及本文中使用的技术意图指在本领域中通常所理解的技术，包括那些对本领域技术人员显而易见的技术的变化或等效技术的替换。并且，本文中所用的基因组学、核酸化学、分子生物学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循本领域已知的各种编号系统。
术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDRs，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)、IMGT编号系统 (Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)或AbM编号系统(Martin ACR,Cheetham JC,Rees AR(1989)Modelling antibody hypervariable loops:A combined algorithm.Proc Natl Acad Sci USA 86:9268–9272)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中，抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定，例如通过Kabat、Chothia、IMGT或AbM编号系统确定。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有的CDR通过Chothia编号系统定义。
术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fd、Fv、scFv、di-scFv、(scFv)2、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段；术语“Fab’片段”意指还原连接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDRs赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDRs)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
术语“Fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定 区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
术语“scFv”是指，包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。在某些实施方案中，VH和VL结构域可以以任何合适的排列彼此相对定位。例如，包含NH2-VH-VH-COOH、NH2-VL-VL-COOH的scFv。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
术语“鼠源抗体”是指通过下述方法获得的抗体：融合免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞，筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，继而进行筛选、抗体制备和抗体纯化；或者是指，由抗原侵入小鼠体内后B细胞分化增殖而形成浆细胞所分泌产生的抗体。
术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体 抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它变体形式为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
术语“烷基”表示直链或支链饱和烃基去掉1个氢原子得到的基团，例如“C1-20烷基”、“C1-10烷基”、“C1-6烷基”、“C1-4烷基”、“C1-3烷基”等，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。
术语“亚烷基”表示直链或支链饱和烃基去掉2个氢原子得到的基团，例如“C1-20亚烷基”、“C1-10亚烷基”、“C3-10亚烷基”、“C5-8亚烷基”、“C1-6亚烷基”、“C1-4亚烷基”、“C1-3亚烷基”等，具体实例包括但不限于：亚甲基、亚乙基、1,3-亚丙基、1,4-亚丁基、1,5-亚戊基或1,6-亚己基等。
术语“环烷基”是指饱和环状饱和烃基，包括但不限于单环烷基和双环烷基(诸如螺环烷基、并环烷基和桥环烷基)。术语“C3-10环烷基”指具有3至10个成环碳原子的环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
术语“杂环基”是指含至少一个选自N、O和S的环成员的饱和或部分饱和的环状结构。具体实例包括但不限于3-12元杂环基、3-8元杂环基、5-6元杂环基等，例如四氢呋喃基、吡咯烷基、哌啶基、四氢吡喃基等。
术语“杂芳基”是指含至少一个选自N、O和S的环成员的芳香环状结构。具体实例包括但不限于5-10元杂芳基、5-6元杂芳基等，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4,5-四嗪基等。
术语“芳基”是指芳烃分子的芳核碳原子上去掉一个氢原子得到的基团。例如C6-10芳 基，具体实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基等。
本文中所用术语“片段”或“结构片段”，是指化合物分子失去一个或多个原子或原子团后剩余的部分。例如“细胞毒性药物片段”是指本文中所述细胞毒性药物失去一个氢原子或羟基等与所述抗体药物偶联物中连接体连接后得到的该细胞毒性药物的剩余部分。在一些具体的实施方案中，该细胞毒性药物片段用D1表示。同样地，“TLR激动剂片段”表示本文中所述TLR激动剂失去一个或多个原子或原子团与抗体药物偶联物中连接体连接得到的该TLR激动剂的剩余部分。在一些具体的实施方案中，该TLR激动剂片段用D2表示。
如果取代基或数值被描述为“独立地选自”一组基团或数值，则各取代基或数值独立于另一者被选择。因此，各取代基或数值可与另一(其他)取代基或数值相同或不同。
本发明还包括所有药学上可接受的同位素标记的化合物，其与本发明的化合物相同，除了一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于在自然界中占优势的原子质量或质量数的原子替代。适合包含入本发明的化合物中的同位素的实例包括但不限于氢的同位素(例如2H、3H、氘D、氚T)；碳的同位素(例如11C、13C及14C)；氯的同位素(例如37Cl)；氟的同位素(例如18F)；碘的同位素(例如123I及125I)；氮的同位素(例如13N及15N)；氧的同位素(例如15O、17O及18O)；磷的同位素(例如32P)；及硫的同位素(例如35S)。某些同位素标记的本发明的化合物(例如掺入放射性同位素的那些)可用于药物和/或底物组织分布研究(例如分析)中。放射性同位素氚(即3H)及碳-14(即14C)因易于掺入且容易检测而特别可用于该目的。用正电子发射同位素(例如11C、18F、15O及13N)进行取代可在正电子发射断层显像术(PET)研究中用于检验底物受体占据情况。被同位素标记的本发明的化合物可通过与描述于随附路线和/或实施例及制备中的那些类似的方法通过使用适当的被同位素标记的试剂代替之前采用的非标记的试剂来制备。本发明的药学上可接受的溶剂合物包括其中结晶溶剂可被同位素取代的那些，例如，D2O、丙酮-d6或DMSO-d6。
术语“立体异构体”表示由于至少一个不对称中心形成的异构体。在具有一个或多个(例如1个、2个、3个或4个)不对称中心的化合物中，其可产生外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体。特定个别分子也可以几何异构体(顺式/反式)存在。类似地，本发明的化合物可以两种或更多种处于快速平衡的结构不同的形式的混合物(通常称作互变异构体)存在。互变异构体的代表性实例包括酮-烯醇互变异构体、苯酚-酮互变异构体、亚硝基-肟互变异构体、亚胺-烯胺互变异构体等。要理解，本申请的范围涵盖所有这样的以任意比例(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的异构体或其混合物。
本发明涵盖本发明的化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其可为单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。
还应当理解，本发明的某些化合物可以游离形式存在用于治疗，或适当时，以其药学上可接受的衍生物形式存在。在本发明中，药学上可接受的衍生物包括但不限于：药学上可接受的盐、溶剂合物、代谢物或前药，在将它们向需要其的患者给药后，能够直接或间接提供本发明的化合物或其代谢物或残余物。因此，当在本文中提及“本发明的化合物”时，也意在涵盖化合物的上述各种衍生物形式。
本发明的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐及碱加成盐。适合的酸加成盐由形成药学上可接受盐的酸来形成。适合的碱加成盐由形成药学上可接受盐的碱来形成。适合的盐的综述参见Stahl及Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use”(Wiley-VCH,2002)。用于制备本发明的化合物的药学上可接受的盐的方法为本领域技术人员已知的。
本发明的化合物可以溶剂合物(优选水合物)的形式存在，其中本发明的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。
本领域技术人员会理解，由于氮需要可用的孤对电子来氧化成氧化物，因此并非所有的含氮杂环都能够形成N-氧化物；本领域技术人员会识别能够形成N-氧化物的含氮杂环。本领域技术人员还会认识到叔胺能够形成N-氧化物。用于制备杂环和叔胺的N-氧化物的合成方法是本领域技术人员熟知的，包括用过氧酸如过氧乙酸和间氯过氧苯甲酸(MCPBA)、过氧化氢、烷基过氧化氢如叔丁基过氧化氢、过硼酸钠和双环氧乙烷(dioxirane)如二甲基双环氧乙烷来氧化杂环和叔胺。这些用于制备N-氧化物的方法已在文献中得到广泛描述和综述，参见例如：T.L.Gilchrist,Comprehensive Organic Synthesis,vol.7,pp 748-750；A.R.Katritzky和A.J.Boulton,Eds.,Academic Press；以及G.W.H.Cheeseman和E.S.G.Werstiuk，Advances in Heterocyclic Chemistry,vol.22,pp 390-392,A.R.Katritzky和A.J.Boulton,Eds.,Academic Press。
在本发明的范围内还包括本发明的化合物的代谢物，即在给药本发明的化合物时体内形成的物质。这样的产物可由例如被给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、酶解等产生。因此，本发明包括本发明的化合物的代谢物，包括通过使本发明的化合物与哺乳动物接触足以产生其代谢产物的时间的方法制得的化合物。
本发明在其范围内进一步包括本发明的化合物的前药，其为自身可具有较小药理学活性或无药理学活性的本发明的化合物的某些衍生物，当被给药至身体中或其上时可通过例 如水解裂解转化成具有期望活性的本发明的化合物。通常这样的前药会是所述化合物的官能团衍生物，其易于在体内转化成期望的治疗活性化合物。关于前药的使用的其他信息可参见“Pro-drugs as Novel Delivery Systems”，第14卷，ACS Symposium Series(T.Higuchi及V.Stella)及“Bioreversible Carriers in Drug Design,”Pergamon Press,1987(E.B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association)。本发明的前药可例如通过用本领域技术人员已知作为“前-部分(pro-moiety)(例如“Design of Prodrugs”，H.Bundgaard(Elsevier,1985)中所述)”的某些部分替代本发明的化合物中存在的适当官能团来制备。
在本文中，本发明抗体药物偶联物中出现的表示靶向部分为抗体或抗原结合片段时，抗体或抗原结合片段中的巯基与连接体的具体连接方式。
在本文中，本发明抗体药物偶联物中出现的表示靶向部分为抗体或抗原结合片段时，抗体或抗原结合片段中的氨基与连接体的具体连接方式。
抗体药物偶联物的特征还在于药物部分(例如细胞毒性药物和TLR激动剂)与抗体结合部分的平均负载量，通常称为偶联样品的药物对抗体比率(DAR)。例如，从还原和去糖基化样品的LC-MS数据，并根据LC和HC链的平均负载量，可以计算ADC的平均DAR。给定抗体药物偶联物样品的DAR表示连接至含有两条轻链和两条重链的四聚体抗体的药物(有效负载)分子的平均数。
虽然对于特定抗体药物偶联物分子而言，药物对抗体比率具有确切值(例如，在式(I)中为m)，但是应理解当用来描述含有许多分子的样品时，该值将经常是平均值，这归因于典型地与偶联步骤相关的某种程度的非均匀性。抗体药物偶联物样品的平均载量在本文中称为药物对抗体比率或“DAR”。
在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物的DAR值(偶联样品的药物/抗体比值)为1-10，例如：1～2，1～3，1～4，1～5，1～6，1～7，1～8，1～9，1～10，2～3，2～4，2～5，2～6，2～7，2～8，2～9，2～10，3～4，3～5，3～6，3～7，3～8，3～9，3～10，4～5，4～6，4～7，4～8，4～9，4～10，5～6，5～7，5～8，5～9，5～10，6～7，6～8，6～9，6～10，7～8，7～9，7～10，8～9，8～10，或9～10，优选为3～8，例如，3.0～3.5，3.0～4.0，3.0～4.5，3.0～5.0，3.0～5.5，3.0～6.0，3.5～4.0，3.5～4.5，3.5～5.0，3.5～5.5，3.5～6.0，3.5～6.5，3.5～7.0，3.5～7.5，3.5～8.0，4.0～4.5，4.0～5.0，4.0～5.5，4.0～6.0，4.0～6.5，4.0～7.0，4.0～7.5，4.0～8.0，4.5～5.0，4.5～5.5，4.5～6.0，4.5～6.5，4.5～7.0，4.5～7.5，4.5～8.0，5.0～5.5，5.0～6.0，5.0～6.5，5.0～7.0，5.0～7.5，5.0～8.0，5.5～6.0，5.5～6.5，5.5～7.0，5.5～7.5，5.5～8.0，6.0～6.5，6.0～7.0，6.0～7.5，6.0～8.0，6.5～7.0，6.5～7.5，6.5～8.0，7.0～7.5，7.0～8.0或7.5～8.0。
在本发明中，“治疗”一般是指部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(b)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
在本发明中，“预防”是指抑制和延迟疾病的发作，不仅包括在发展疾病之前的预防，还包括在治疗后预防疾病的复发。
在本发明中，“受试者”指脊椎动物。在一些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在一些实施方案中，哺乳动物指人。
在本发明中，“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗效果的量。所述“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及活性成分在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还涵盖活性成分的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。在癌症治疗中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。
具体实施方式
为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，以下结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
化合物的结构是通过核磁共振(1H NMR)或质谱(MS)来确定的。1H NMR的测定仪器为JEOL Eclipse 400核磁仪，测定溶剂为氘代甲醇(CD3OD)、氘代氯仿(CDCl3)或六氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。
MS的测定仪器为Agilent(ESI)质谱仪，生产商：Agilent，型号：Agilent 6120B。
制备高效液相色谱仪的制备方法：
仪器型号：Agilent 1260，色谱柱：Waters SunFire Prep C18OBD(19mm×150mm×5.0μm)；色谱柱温：25℃；流速：20.0mL/min；检测波长：214nm；洗脱梯度：(0min：10％A，90％B；16.0min：90％A，10％B)；流动相A：乙腈；流动相B：0.05％甲酸水溶液。
薄层色谱硅胶板(TLC)使用Merck产的铝板(20×20cm)，薄层层析分离纯化采用的规格是烟台产GF 254(1mm)。
反应的监测采用薄层色谱法(TLC)或LC-MS；使用的展开剂体系包括：二氯甲烷和甲醇体系，正己烷和乙酸乙酯体系，以及石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节或者加入三乙胺等进行调节。
反向柱层析的制备方法：
制备方法A：
仪器型号：Biotage快速中压制备色谱，色谱柱：Agela C18反向柱(Spherical；20-35μm；100A)；色谱柱温：25℃；流速：28.0mL/min；检测波长：220nm；流动相A：乙腈；流动相B：水；
制备方法B：
仪器型号：Biotage快速中压制备色谱，色谱柱：Agela C18反向柱(Spherical；20-35μm；100A)；色谱柱温：25℃；流速：28.0mL/min；检测波长：220nm；流动相A：乙腈；流动相B：0.05％甲酸水溶液；
制备方法C：
仪器型号：Biotage快速中压制备色谱，色谱柱：Agela C18反向柱(Spherical；20-35μm；100A)；色谱柱温：25℃；流速：28.0mL/min；检测波长：220nm；流动相A：乙腈；流动相B：0.05％碳酸氢铵水溶液；
微波反应使用Biotage Initiator+(400W,RT～300℃)微波反应器。
柱层析一般使用200～300目硅胶为载体。洗脱剂体系包括：二氯甲烷和甲醇体系，以及石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺进行调节。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温(20℃～35℃)。
本发明所使用的试剂购自Acros Organics、Aldrich Chemical Company、特伯化学等公司。
在常规的合成法以及实施例、和中间体合成例中，各缩写的意思如以下所示。

一、化合物实施例
中间体制备例1：2-((1-((4-((4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酰基)环己基)甲基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)乙酸(化合物Int1)的制备
第一步：(4-((6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将7-氯-6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶(10.0g,46.59mmol)和N-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺(10.53g,55.91mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中加入N,N-二异丙基乙胺(12.04g,93.18mmol)，缓慢升温至室温搅拌6小时。将反应液倒入水(1500mL)中，并用乙酸乙酯(450mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(150mL) 洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(16.61g，收率：97.3％)。
MS m/z(ESI):367.1[M+H]+。
第二步：(4-((6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-((6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(16.61g,49.37mmol)溶于四氢呋喃(100mL)和甲醇(100mL)的混合溶剂中，加入10％钯碳(2.0g,11.97mmol)，氢气置换三次，反应体系在室温下搅拌12小时，抽滤，甲醇(30mL)洗涤滤饼，滤液浓缩，得到本步的标题化合物(14.47g，收率：87.1％)。
MS m/z(ESI):337.1[M+H]+。
第三步：(4-((6-戊酰胺基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-((6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(14.47g,43.01mmol)和N,N-二异丙基乙胺(11.12g,86.02mmol)溶于四氢呋喃(250mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢滴加正戊酰氯(7.78g,64.52mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。向反应体系中加入水(100mL)淬灭反应，将体系浓缩尽可能除去四氢呋喃，向所得剩余物中加入水(300mL)，并用乙酸乙酯(300mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(150mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(16.72g，收率：92.4％)。
MS m/z(ESI):421.0[M+H]+。
第四步：(4-(2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-((6-戊酰胺基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(16.72g,39.76mmol)和邻氯苯甲酸(3.11g,19.88mmol)加入到甲苯(300mL)中，升温至溶剂回流并分水反应搅拌4小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：100％乙酸乙酯)，得到本步的标题化合物(14.76g，收率：92.2％)。
MS m/z(ESI)：403.2[M+H]+。
第五步：(4-(7-溴-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-(2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(5.41g,13.44mmol)完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺(75mL)和冰醋酸(25mL)的混合溶剂中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入N-溴代丁二酰亚胺(4.78g,26.88mmol)，缓慢升温至室温搅拌24小时。将反应液倒入水(300mL)中，并用乙酸乙酯(300mL)萃取三次，合 并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(150mL)洗涤三次，饱和食盐水(150mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/1(v/v))，得到本步的标题化合物(4.95g，收率：76.5％)。
MS m/z(ESI):481.0[M+H]+。
第六步：(4-(2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将(4-(7-溴-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g,2.08mmol)、三甲基硼氧六环(50wt.％四氢呋喃溶液,2.62g,10.4mmol)、碳酸钾(575.0mg,4.16mmol)和1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(307.3mg,0.42mmol)依次加入1,4-二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶剂中，反应体系经氮气鼓泡5分钟后，于微波下升温至100℃搅拌2小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：100％乙酸乙酯)，得到本步的标题化合物(0.65g，收率：75.0％)。
MS m/z(ESI):417.1[M+H]+。
第七步：1-(4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-5-氧化物的制备
将(4-(2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(0.65g,1.56mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入间氯过氧苯甲酸(538.5mg,3.12mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用二氯甲烷(60mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和亚硫酸钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和食盐水(45mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(640mg，收率：94.8％)。
MS m/z(ESI):433.2[M+H]+。
第八步：(4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将1-(4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-5-氧化物(640mg,1.48mmol)溶于二氯甲烷(10mL)和氨水(5mL)的混合溶剂中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入对甲苯磺酰氯(564.1mg,2.96mmol)，缓慢升温至室温搅拌12小时。向反应体系中加入水(100mL)，二氯甲烷(60mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(45mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝15/1(v/v))，得到本步的标题化合物(266mg，收率：41.6％)。
MS m/z(ESI):432.2[M+H]+。
第九步：1-(4-氨基丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-4-胺(化合物1)的制备
将(4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(266mg,0.62mmol)溶于甲醇(10mL)和氯化氢的1,4-二氧六环溶液(4N,5mL)的混合溶剂中，室温搅拌12小时。浓缩除去溶剂，依次向剩余物中加入二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比为4:1,10mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2mL)，室温搅拌5分钟后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经高压液相制备色谱制备纯化，得到标题化合物(130mg，收率：63.3％)。
MS m/z(ESI):332.1[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.34(s,2H),6.98(d,J＝1.2Hz,1H),6.06(s,2H),4.24(t,J＝8.0Hz,2H),2.86(t,J＝8.0Hz,2H),2.78(t,J＝8.0Hz,2H),2.56(d,J＝1.2Hz,1H),1.83-1.75(m,4H),1.62-1.58(m,2H),1.47-1.40(m,2H),0.96(t,J＝8.0Hz,3H)。
第十步：N-(4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺的制备
将1-(4-氨基丁基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-4-胺(200mg,0.60mmol)和N,N-二异丙基乙胺(155mg,1.2mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，向其中滴加2,5-二氧代吡咯烷-1-基-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-羧酸酯(240mg,0.72mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，反应混合物25℃搅拌反应12小时。向反应体系中加水，二氯甲烷萃取三次，收集有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩所得粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v))得到本步的标题化合物(282mg，收率：85.4％)。
MS m/z(ESI):551.3[M+H]+。
第十一步：2-((1-((4-((4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酰基)环己基)甲基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)硫代)乙酸(Int1)的制备
将N-(4-(4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷-1-甲酰胺(282mg,0.51mmol)和巯基乙酸(94mg,1.02mmol)加入二氯甲烷(50mL)中，反应混合物于25℃搅拌反应30分钟。反应液浓缩得黄色固体，经甲基叔丁基醚打浆，得到本步的标题化合物(237mg，收率：72.3％)。
MS m/z(ESI):643.3[M+H]+。
中间体制备例2：N-(叔丁基)-2-丁基-7-(哌啶-4-基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-4-胺(化合物Int2)的制备
第一步：6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-胺的制备
将7-氯-6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶(2.0g,9.23mmol)溶于甲醇(20mL)中，加入氨的甲醇溶液(7N,26.4mL,184.8mmol)，升温至50℃搅拌4小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂得到本步的标题化合物(1.73g，收率：96.1％)。
MS m/z(ESI):196.1[M+H]+。
第二步：噻吩并[3,2-b]吡啶-6,7-二胺的制备
采用中间体制备例1的合成路线，将第二步反应原料(4-((6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯替换为6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-胺，得到本步的标题化合物(1.4g，收率：98.4％)。
MS m/z(ESI):166.1[M+H]+。
第三步：N-(7-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基)戊酰胺的制备
采用中间体制备例1的合成路线，将第三步反应原料(4-((6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯替换为噻吩并[3,2-b]吡啶-6,7-二胺，得到本步的标题化合物(2.5g，收率：97.6％)。
MS m/z(ESI):250.1[M+H]+。
第四步：2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶的制备
将N-(7-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基)戊酰胺(2.5g,8.48mmol)加入乙醇(30mL)中，室温下加入氢氧化钠(1.7g,42.4mmol)，升温至50℃搅拌6小时。向反应体系中加入水(150mL)淬灭反应，用稀盐酸调节pH＝6，并用乙酸乙酯(150mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠溶液(60mL)洗涤两次，饱和食盐水(60mL)洗涤两次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(1.5g，收率：76.5％)。
MS m/z(ESI):232.0[M+H]+。
第五步：7-溴-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶的制备
采用中间体制备例1的合成路线，将第五步反应原料(4-(2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩[3,2-b]吡啶-1-基)丁基)氨基甲酸叔丁酯替换为2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶，得到本步的标题化合物(1.4g，收率：65.7％)。
MS m/z(ESI):310.0[M+H]+。
第六步：7-溴-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-羧酸叔丁酯和7-溴-2-丁基-3H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯混合物的制备
将7-溴-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶(1g,3.20mmol)和4-二甲氨基吡啶(40mg,0.32mmol)溶解于四氢呋喃(10mL)中，室温下依次加入三乙胺(0.65g,6.40mmol)和二碳酸二叔丁酯(1.1g,4.8mmol)，升温至40℃搅拌12小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用二氯甲烷(60mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(30mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝3/1(v/v))，得到本步标题化合物所示的混合物(1.0g，收率：76.7％)。
MS m/z(ESI):410.0[M+H]+。
第七步：7-溴-1-(叔丁氧羰基)-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶5-氧化物和7-溴-3-(叔丁氧羰基)-2-丁基-3H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶5-氧化物混合物的制备
将7-溴-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-羧酸叔丁酯和7-溴-2-丁基-3H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯的混合物(1.0g,2.43mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入间氯过氧苯甲酸(0.98g,4.86mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用二氯甲烷(60mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和亚硫酸钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和食盐水(45mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步标题化合物所示的混合物(1.0g，收率：90.9％)。
MS m/z(ESI):426.0[M+H]+。
第八步：7-溴-2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-羧酸叔丁酯和7-溴-2-丁基-4-(叔丁基氨基)-3H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯混合物的制备
将7-溴-1-(叔丁氧羰基)-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶5-氧化物和7-溴-3-(叔丁氧羰基)-2-丁基-3H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶5-氧化物的混合物(1.0g,2.34mmol)、叔丁胺(0.85g,11.7mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入对甲苯磺酰氯(0.89g,4.68mmol)，缓慢升温至室温搅拌12小时。向反应体系中加入水(100mL)，二氯甲烷(60mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(45mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝5/1(v/v))，得到本步标题化合物所示的混合物(0.6g，收率：53.1％)。
MS m/z(ESI):481.2[M+H]+。
第九步：4-(2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的制备
将7-溴-2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-羧酸叔丁酯和7-溴-2-丁基-4-(叔丁基氨基)-3H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-3-羧酸叔丁酯混合物(1g,2.1mmol)加入1,4-二氧六环(20mL)和水(2mL)的混合溶液中，再加入4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(0.85g,2.73mmol)和碳酸钾(0.6g,4.2mmol)。置换氮气三次，加入1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁二氯化钯(76mg,0.1mmol)，微波加热至90℃反应2小时。反应完全后，冷却至室温，用水稀释反应。再用二氯甲烷萃取，合并有机相后用盐水洗涤，有机相浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1(v/v))得到本步的标题化合物(0.8g，收率：80.0％)。
MS m/z(ESI):484.3[M+H]+。
第十步：4-(2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的制备
氮气下，向4-(2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(0.8g,1.66mmol)的甲醇(20mL)溶液中加入10％钯碳(50mg)，置换氢气三次，室温搅拌24小时。反应完毕后，过滤除去钯碳，滤液浓缩后所得固体真空干燥，得到本步的标题化合物(0.78g，收率：97.5％)。
MS m/z(ESI):486.3[M+H]+。
第十一步：N-(叔丁基)-2-丁基-7-(哌啶-4-基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-4-胺 (Int2)的制备
向4-(2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(0.78g,1.61mmol)的甲醇(10mL)溶液中加入氯化氢的1,4-二氧六环溶液(2mL,4M,8mmol)，室温反应12小时。反应完毕后，反应液浓缩所得固体真空干燥，得到本步的标题化合物(0.57g，收率：91.9％)。
MS m/z(ESI):386.2[M+H]+。
中间体制备例3：化合物Int3的制备
第一步：化合物Int3-2的制备
向化合物Int3-1(2g,3.41mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入三乙胺(0.69g,6.82mmol)，反应液在冰水浴冷却下加入甲基磺酰氯(0.58g,5.12mmol)，然后室温下搅拌过夜。反应完全后，用二氯甲烷稀释反应。再依次用碳酸钠溶液和盐水洗涤，有机相浓缩得到本步的标题化合物(2.2g，收率：95.6％)。
MS m/z(ESI):682.4[M+NH4]+。
第二步：化合物Int3-3的制备
向化合物Int2(1g,2.59mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(15mL)溶液中加入化合物Int3-2(2.2g,3.37mmol)和N,N-二异丙基乙基胺(0.88g,6.74mmol)，反应混合物在90℃下反应24小时。反应完毕后，用水稀释，二氯甲烷萃取，合并有机相后用盐水洗涤，有机相浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v))得到本步的标题化合物(1.2g，收率：37.5％)。
MS m/z(ESI):954.4[M+H]+。
第三步：化合物Int3的制备
向化合物Int3-3(1.2g,1.26mmol)的1,4-二氧六环(10mL)溶液中加入氯化氢的1,4-二氧六环溶液(3.2mL,4M,12.6mmol)，反应混合物在90℃下反应12小时。反应完全后，反应液浓缩得到本步的标题化合物粗品(1g，收率：90.9％)。
MS m/z(ESI):842.4[M+H]+。
中间体制备例4：6-(2,5-二氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己酰胺的制备
将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(631.58mg,2.05mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，加入炔丙胺(124.12mg,2.25mmol)和三乙胺(414.87mg,4.1mmol)，25℃搅拌12小时，浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v))得到本步的标题化合物(256mg，收率：50.2％)。
MS m/z(ESI):249.1[M+H]+。
中间体制备例5：化合物Int5的制备
第一步：化合物Int5-2的制备
将N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(384mg,0.83mmol)和26-叠氮-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧六氧烷-1-胺(435mg,0.99mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，在冰浴下加入1-羟基苯并三唑(167.58mg,1.24mmol)、N,N-二异丙基乙胺(320.43mg,2.48mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(238mg,1.24mmol)，20℃搅拌3小时，将反应液滴入水中，二氯甲烷萃取，有机相干燥，浓缩，得到本步的标题化合物(0.69g，收率：78.4％)。
MS m/z(ESI):884.4[M+H]+。
第二步：化合物Int5-3的制备
将化合物Int5-2(0.69g,0.78mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，滴加三氟乙酸(10mL)，室温搅拌2小时，浓缩，二氯甲烷(20mL)稀释，有机相用碳酸氢钠溶液洗，干燥，浓缩，得到本步的标题化合物(0.6g，收率：98％)。
MS m/z(ESI):784.4[M+H]+。
第三步：化合物Int5-4的制备
将化合物Int1(136mg,211mmol)和化合物Int5-3(182mg,233mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，在冰浴下加入1-羟基苯并三唑(43.2mg,0.32mmol)、N,N-二异丙基乙胺(81.6mg,0.63mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(61.3mg,0.32mmol)，20℃搅拌3小时，将反应液滴入水中，二氯甲烷萃取，有机相干燥，浓缩，得到本步的标题化合物(0.23g，收率：95.8％)。
MS m/z(ESI):1408.6[M+H]+。
第四步：化合物Int5-5的制备
将化合物Int5-4(0.23g,0.16mmol)溶于二氯甲烷(2mL)和三乙基硅烷(0.52mL)中，滴加三氟乙酸(1mL)，室温搅拌1小时，浓缩，二氯甲烷(20mL)稀释，有机相用碳酸氢钠溶液洗，干燥，浓缩，得到本步的标题化合物(0.15g，收率：78.9％)。
MS m/z(ESI):1166.5[M+H]+。
第五步：化合物Int5的制备
将化合物Int5-5(0.15g,0.13mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，加入MC-VC-PABC-MMAE(0.17g,0.13mmol)和N,N-二异丙基乙胺(50.3mg,0.39mmol)，室温搅拌1小时，加入氯化铵的水溶液(10mL)，用二氯甲烷(10mL)萃取三次，有机相干燥， 浓缩得到的粗品用制备薄层硅胶板纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v))，得到本步的标题化合物(150mg，收率：47.0％)。
MS m/z(ESI):1241.7[M/2+H]+。
中间体制备例6：化合物Int6的制备
第一步：化合物Int6-1的制备
将化合物Int5-3(192mg,0.244mmol)和N-叔丁氧羰基-七聚乙二醇-羧酸(110.53mg,0.222mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，在冰浴下加入1-羟基苯并三唑(45mg,0.333mmol)、N,N-二异丙基乙胺(85.9mg,0.666mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(63.8mg,0.333mmol)，20℃搅拌6小时，将反应液滴入水(10mL)中，二氯甲烷(10mL)萃取三次，有机相干燥，浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v))，得到本步的标题化合物(145mg，收率：51.6％)。
MS m/z(ESI):1263.6[M+H]+。
第二步：化合物Int6-2的制备
将化合物Int6-1(145mg,0.11mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，滴加三氟乙酸(1mL)，室温搅拌2小时，浓缩，二氯甲烷(10mL)稀释，有机相用碳酸氢钠溶液洗，干燥，浓缩，得到本步的标题化合物(130mg，收率：97％)。
MS m/z(ESI):1163.6[M+H]+。
第三步：化合物Int6-3的制备
将化合物Int1(65mg,0.10mmol)和化合物Int6-2(130mg,0.11mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，在冰浴下加入1-羟基苯并三唑(20.3mg,0.15mmol)、N,N-二异丙基乙胺(38.7mg,0.3mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(28.8mg,0.15mmol)，20℃搅拌3小时，将反应液滴入水(10mL)中，二氯甲烷(10mL)萃取三次，有机相干燥，浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v))，得到本步的标题化合物(110mg，收率：60.8％)。
MS m/z(ESI):1787.8[M+H]+。
第四步：化合物Int6-4的制备
将化合物Int6-3(110mg,0.06mmol)溶于二氯甲烷(2mL)和三乙基硅烷(0.4mL)中，滴加三氟乙酸(1mL)，室温搅拌1小时，浓缩，二氯甲烷(20mL)稀释，有机相用碳酸氢钠溶液洗，干燥，浓缩，得到本步的标题化合物(95mg，收率：100％)。
MS m/z(ESI):1545.7[M+H]+。
第五步：化合物Int6的制备
将化合物Int6-4(95mg,0.06mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(25mL)中，加入MC-VC-PABC-MMAE(79mg,0.06mmol)和N,N-二异丙基乙胺(23.2mg,0.18mmol)，室温搅拌1小时，加入氯化铵的水溶液(10mL)，用二氯甲烷(10mL)萃取三次，有机相干燥，浓缩得到的粗品用制备薄层硅胶板纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝8/1(v/v))，得到本步的标题化合物(73mg，收率：41.4％)。
MS m/z(ESI):1431.3[M/2+H]+。
中间体制备例7：化合物Int7的制备
第一步：化合物Int7-2的制备
将壬己二醇单甲醚(2g,4.43mmol)和对甲苯磺酰氯(1.07g,5.32mmol)加入二氯甲烷(10mL)中，降温至0～10℃，加入氢氧化钾(1.26g,22.17mmol)后，25℃反应12小时。反应液浓缩得到的剩余物用硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v))，得到本步的标题化合物(2.5g，收率：91.9％)。
MS m/z(ESI)：583.5[M+H]+。
第二步：化合物Int7的制备
依次将化合物Int7-2(1.30g,2.12mmol)、2,5,8,11,14,17,20,23,26-九氧杂二十八烷-28-胺(1g,2.22mmol)、N,N-二异丙基乙胺(828.80mg,6.35mmol,1.06mL)和碘化钾(35.48mg,211.63μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中，70℃反应24小时。反应液浓缩得到的剩余物用硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝19/1(v/v))，得到本步的标题化合物(1.5g，收率：71.9％)。
MS m/z(ESI)：838.3[M+H]+。
中间体制备例8：化合物Int8的制备
第一步：化合物Int8-2的制备
将化合物Int8-1(155mg,131.07μmol)和N-叔丁氧羰基-七聚乙二醇-羧酸(68.65mg,131.07μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，向其中加入N,N-二异丙基乙胺(42.78mg,327.68μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(75.53mg,196.61μmol)，25℃反应5小时。反应液浓缩得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v))，得到本步的标题化合物(193mg，收率：87.3％)。
MS m/z(ESI):1603.0[M+H]+。
第二步：化合物Int8的制备
氮气保护下依次将化合物Int8-2(165mg,97.79μmol)和溴化锌(139.08mg,586.72μmol)加入无水二氯甲烷(2mL)中，25℃反应2小时。浓缩反应液得到本步标题化合物的粗品，直接用于下一步。
MS m/z(ESI):1502.9[M+H]+。
中间体制备例9：化合物Int9的制备
第一步：化合物Int9-2的制备
向化合物Int9-1(1g,19.5mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入戴斯-马丁氧化剂(1.23g,29.3mmol)，室温搅拌过夜。二氯甲烷稀释反应液，依次加入饱和硫代硫酸钠溶液(10mL)和碳酸氢钠溶液(10mL)，搅拌20分钟，分液，二氯甲烷萃取两次，合并有机相，用盐水洗涤，有机相浓缩得到的粗品用硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝12/1(v/v))，得到本步的标题化合物(0.9g，收率：90.9％)。
MS m/z(ESI):512.3[M+H]+。
第二步：化合物Int9-3的制备
向化合物Int2(0.5g,1.29mmol)的二氯乙烷(10mL)溶液中依次加入化合物Int9-2(0.86g,1.68mmol)、冰醋酸(0.16g,2.60mmol)和氰基硼氢化钠(0.42g,6.45mmol)，室温反应12小时。反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，合并有机相后用盐水洗涤，有机相浓缩得到的粗品用硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v))，得到本步的标题化合物(0.6g，收率：52.6％)。
MS m/z(ESI):825.5[M+H]+。
第三步：化合物Int9的制备
向化合物Int9-3(0.6g,0.68mmol)的1,4-二氧六环(4mL)溶液中加入氯化氢的1,4-二氧六环溶液(1.7mL,4M,6.8mmol)，70℃反应12小时。反应液浓缩得到的粗品用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝15％-25％)，得到本步的标题化合物(0.3g，收率：61.2％)。
MS m/z(ESI):725.4[M+H]+。
中间体制备例10：化合物Int10的制备
第一步：化合物Int10-1的制备
依次将化合物Int9(186mg,243.74μmol)、(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(131mg,292.49μmol)、N,N-二异丙基乙胺(66.32mg,487.48μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(136.58mg,341.24μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(270mg，收率：92.9％)。
MS m/z(ESI):1132.6[M+H]+。
第二步：化合物Int10-2的制备
将化合物Int10-1(340mg,285.23μmol)和三氟乙酸(2mL)加入二氯甲烷(6mL)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到的剩余物用硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝4/1(v/v))，得到本步的标题化合物(250mg，收率：77.4％)。
MS m/z(ESI):1076.6[M+H]+。
第三步：化合物Int10-3的制备
依次将化合物Int10-2(150mg,132.40μmol)、VC-PABC-MMAE(156.57mg,132.40μmol)、N,N-二异丙基乙胺(25.93mg,198.60μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(61.02mg,158.88μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(250mg，收率：82.2％)。
MS m/z(ESI):1091.1[M/2+H]+。
第四步：化合物Int10的制备
将化合物Int10-3(250mg,8.86μmol)和哌啶(37.45mg,435.44μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(185mg，收率：82.4％)。
MS m/z(ESI):980.2[M/2+H]+。
中间体制备例11：化合物Int11的制备
第一步：化合物Int11-1的制备
将化合物Int8(114mg,72.06μmol)和N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(37.43mg,72.06μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，向其中加入 N,N-二异丙基乙胺(23.52mg,180.16μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(41.53mg,108.09μmol)，25℃下反应5小时。反应液浓缩得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝50/1(v/v))，得到本步的标题化合物(110mg，收率：70.4％)。
MS m/z(ESI):1953.1[M+H]+。
第二步：化合物Int11-2的制备
将化合物Int11-1(100mg,46.07μmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，加入二乙胺(67.40mg,921.47μmol)，20℃下反应10小时。反应液浓缩得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v))，得到本步的标题化合物(40mg，收率：42.8％)。
MS m/z(ESI):1731.1[M+H]+。
第三步：化合物Int11-3的制备
将化合物Int11-2(100mg,54.88μmol)和化合物Int3(46.64mg,54.88μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，向其中加入N,N-二异丙基乙胺(10.75mg,82.31μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(25.29mg,65.85μmol)，25℃下反应5小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(60mg，收率：40.7％)。
MS m/z(ESI):1277.8[M/2+H]+。
第四步：化合物Int11的制备
氮气保护下依次将化合物Int11-3(45mg,7.04μmol)和溴化锌(6.68mg,28.18μmol)加入无水二氯甲烷(2mL)中，25℃下反应2小时。浓缩反应液得到本步标题化合物的粗品，直接用于下一步。
MS m/z(ESI):1227.8[M/2+H]+。
中间体制备例12：化合物Int12的制备
第一步：化合物Int12-2的制备
将化合物Int3(150mg,169.23μmol)和N-叔丁氧羰基赖氨酸甲酯盐酸盐(46.37mg,169.23μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，然后依次加入N,N-二异丙基乙胺(44.18mg,338.46μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(78.01mg, 203.08μmol)，25℃反应2小时。减压浓缩反应液得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝6/1(v/v))，得到本步的标题化合物(160mg，收率：95.8％)。
MS m/z(ESI):1084.6[M+H]+。
第二步：化合物Int12的制备
将化合物Int12-2(185mg,162.08μmol)溶于四氢呋喃(1mL)、甲醇(1mL)和水(1mL)的混合溶剂中，加入一水合氢氧化锂(28.63mg,648.31μmol)，25℃反应3小时。反应液浓缩，加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)，所得溶液用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(160mg，收率：87.6％)。
MS m/z(ESI):1070.6[M+H]+。
中间体制备例13：化合物Int13的制备
第一步：4-(((6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
将7-氯-6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶(1.0g,4.67mmol)和4-(氨甲基)四氢-1(2H)-吡啶甲酸苄酯(1.38g,5.60mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中加入N,N-二异丙基乙胺(1.08g,8.4mmol)，缓慢升温至室温搅拌6小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用乙酸乙酯(50mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(1.91g,收率：96.3％)。
MS m/z(ESI):427.0[M+H]+。
第二步：4-(((6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
将4-(((6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(1.91g,4.47mmol)完全溶于无水乙醇(30mL)中，加入水(5mL)。冰水浴降温，0℃下向反应液中加入保险粉(0.8g,45mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。将反应液倒入水(100mL)中，搅拌析出固体，过滤，并用水洗涤固体，干燥后得到本步的标题化合物(1.5g,收率：84.2％)。
MS m/z(ESI):397.1[M+H]+。
第三步：4-(((6-戊酰胺基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
将4-(((6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(1.5g,3.78mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.97g,7.57mmol)溶于四氢呋喃(20mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢滴加正戊酰氯(0.68g,5.67mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。向反应体系中加入水(10mL)淬灭反应，将体系浓缩尽可能除去四氢呋喃，向所得剩余物中加入水(50mL)，并用乙酸乙酯(30mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(1.63g,收率：90％)。
MS m/z(ESI):481.1[M+H]+。
第四步：4-((2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
将4-(((6-戊酰胺基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(1.63g,3.38mmol)和邻氯苯甲酸(260mg,1.7mmol)加入到甲苯(50mL)中，升温至溶剂回流并分水反应搅拌4小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：100％乙酸乙酯)，得到本步的标题化合物(1.39g,收率：89.3％)。
MS m/z(ESI):463.1[M+H]+。
第五步：4-((7-溴-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
将4-((2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(1.1g,2.37mmol)完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺(9mL)和冰醋酸(3mL)的混合溶剂中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入N-溴代丁二酰亚胺(0.63g,3.55mmol)，缓慢升温至室温搅拌24小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用乙酸乙酯(30mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)洗涤三次，饱和食盐水(50mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/1(v/v))，得到本步的标题化合物(0.87g，收率：68.5％)。
MS m/z(ESI):541.1[M+H]+。
第六步：4-((2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
将4-((7-溴-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(0.87g,1.61mmol)、三甲基硼氧六环(50wt.％四氢呋喃溶液,2.0g,8.05mmol)、碳酸钾(0.67g,4.83mmol)和1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(0.23g,0.32mmol)依次加入1,4-二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶剂中，反应体系经氮气鼓泡5分钟后，于微波下升温至100℃搅拌2小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：100％乙酸乙酯)，得到本步的标题化合物(0.54g,收率：71.0％)。
MS m/z(ESI):477.1[M+H]+。
第七步：1-((1-((苄氧基)羰基)哌啶)-4-基)甲基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-5-氧化物的制备
将4-((2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(0.5g,1.04mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入间氯过氧苯甲酸(0.42g,2.05mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用二氯甲烷(20mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和亚硫酸钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和食盐水(30mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(0.52g,收率：100％)。
MS m/z(ESI):493.2[M+H]+。
第八步：4-((4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯的制备
将1-((1-((苄氧基)羰基)哌啶)-4-基)甲基)-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-5-氧化物(0.52g,1.04mmol)溶于二氯甲烷(10mL)和氨水(5mL)的混合溶剂中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入对甲苯磺酰氯(0.4g,2.09mmol)，缓慢升温至室温搅拌12小时。向反应体系中加入水(100mL)，二氯甲烷(20mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(30mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/甲醇＝20/1(v/v))，得到本步的标题化合物(230mg,收率：45％)。
MS m/z(ESI):492.2[M+H]+。
第九步：2-丁基-7-甲基-1-(哌啶-4-基甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-4-胺(Int13)的制备
将4-((4-氨基-2-丁基-7-甲基-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)甲基)哌啶-1-羧酸苄酯(150mg,0.31mmol)加入三氟醋酸(6mL)中，升温至50℃搅拌3小时。浓缩除去溶剂，依次向剩余物中加入二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(体积比为4:1,10mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)，室温搅拌5分钟后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经制备高效液相色谱制备纯化，得到本步的标题化合物(22mg,收率：19.9％)。
MS m/z(ESI):358.1[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.24(s,1H),6.99-6.98(m,1H),6.11(br,2H),4.14(d,J＝8.0Hz,2H),3.26-3.23(m,2H),2.88-2.76(m,4H),2.57-2.55(m,3H),2.19-2.12(m,1H),1.87-1.76(m,2H),1.68-1.62(m,2H),1.56-1.39(m,4H),0.96(t,J＝8.0Hz,3H)。
中间体制备例14：化合物Int14的制备
第一步：化合物Int14-1的制备
将化合物Int3-1(1g,1.7mmol)和戴斯马丁氧化剂(1.08g,2.56mmol)加入二氯甲烷(15mL)中，25℃反应10小时。向反应液加入饱和硫代硫酸钠溶液(5mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)，搅拌至澄清，再加入二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v))，得到本步的标题化合物(900mg，收率：91.3％)。
MS m/z(ESI):585.5[M+H]+。
第二步：化合物Int14-2的制备
将化合物Int14-1(472.48mg,799.99μmol)、化合物Int13(191mg,533.33μmol)、氰基硼氢化钠(99.08mg,1576.7μmol)和冰乙酸(51.72mg,853.33μmol)依次加入1,2-二氯乙烷(6mL)和甲醇(3mL)的混合溶剂中，25℃反应4小时。反应液浓缩得到的粗品溶于甲醇(3mL)中，用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝15％-25％)，得到本步的标题化合物(250mg，收率：50.6％)。
MS m/z(ESI):926.5[M+H]+。
第三步：化合物Int14的制备
将化合物Int14-2(250mg,269.83μmol)溶于盐酸二氧六环溶液(6mL,4M)中，25℃反 应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(203mg，收率：86.5％)。
MS m/z(ESI):870.4[M+H]+。
中间体制备例15：化合物Int15的制备
第一步：化合物Int15-1的制备
将化合物Int9-2(390.27mg,794.96μmol)、化合物Int13(200mg,529.98μmol)、氰基硼氢化钠(159.79mg,2.52mmol)和冰乙酸(7.88mg,1.51mmol)依次加入1,2-二氯乙烷(6mL)和甲醇(3mL)的混合溶剂中，25℃反应4小时。反应液浓缩得到的粗品溶于甲醇(3mL)中，用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(330mg，收率：76.8％)。
MS m/z(ESI):853.5[M+H]+。
第二步：化合物Int15的制备
将化合物Int15-1(330mg,386.82μmol)溶于盐酸二氧六环溶液(6mL,4M)中，25℃下反应5小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(250mg，收率：86.2％)。
MS m/z(ESI):753.4[M+H]+。
中间体制备例16：化合物Int16的制备
第一步：化合物Int16-2的制备
依次将化合物Int16-1(270mg,428.06μmol)、对氨基苄醇(106.50mg,856.13μmol)和2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(213.60mg,856.13μmol)加入无水甲醇(1mL)和无水二氯甲烷(3mL)中，室温搅拌过夜。反应液浓缩得到的剩余物用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(130mg，收率：40.62％)。
MS m/z(ESI):673.3[M+H]+。
第二步：化合物Int16-3的制备
依次将化合物Int16-2(125mg,167.21μmol)、二(对硝基苯)碳酸酯(77.07mg,250.81μmol)和N,N-二异丙基乙胺(54.47mg,418.02μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，室温搅拌5小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝65％-75％)，得到本步的标题化合物(95mg，收率：64.42％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.14(br,1H),8.31(d,J＝8Hz,2H),8.12(d,J＝8Hz,1H),7.90(d,J＝4Hz,2H),7.76-7.72(m,2H),7.65(d,J＝8Hz,2H),7.58(d,J＝8Hz,2H),7.48-7.39(m,5H),7.32(t,J＝8Hz,2H),6.76(br,1H),5.24(s,2H),4.38-4.22(m,4H),3.92(t,J＝8Hz,1H),2.88(d,J＝4Hz,2H),2.01-1.96(m,1H),1.68-1.59(m,2H),1.40-1.24(m,15H),0.89-0.85(m,6H)
MS m/z(ESI):838.3[M+H]+。
第三步：化合物Int16-4的制备
依次将一甲基澳瑞他汀E(77mg,101.88μmol)、化合物Int16-3(94.85mg,101.88μmol)、1-羟基苯并三唑(2.09mg,15.28μmol)和N,N-二异丙基乙胺(26.55mg,203.77μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，35℃搅拌5小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝50％-60％)，得到本步的标题化合物(65mg，收率：42.78％)。
MS m/z(ESI):1416.8[M+H]+。
第四步：化合物Int16-5的制备
将化合物Int16-4(30mg,19.06μmol)和无水溴化锌(21.68mg,95.29μmol)加入无水二氯甲烷(2mL)中，35℃搅拌2小时。反应液用乙酸乙酯(10mL)稀释，饱和食盐水(3mL*2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到本步的标题化合物(31mg，收率：98.84％)。
MS m/z(ESI):1316.8[M+H]+。
第五步：化合物Int16-6的制备
依次将化合物Int3(20mg,21.38μmol)、化合物Int16-5(31.0mg,21.38μmol)、N,N-二异丙基乙胺(5.57mg,42.75μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(9.85mg,25.65μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温搅拌1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝40％-50％)，得到本步的标题化合物(29mg,收率：57.04％)。
MS m/z(ESI):1070.6[M/2+H]+。
第六步：化合物Int16的制备
将化合物Int16-6(29mg,12.19μmol)和哌啶(2.10mg,24.38μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温搅拌2小时。反应液浓缩后，加入甲基叔丁基醚(5mL)，超声5分钟后，静置，过滤，固体干燥得到本步的标题化合物(22mg，收率：94.06％)。
MS m/z(ESI):959.6[M/2+H]+。
中间体制备例17：化合物Int17的制备
第一步：化合物Int17-1的制备
依次将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(85.29mg,200.46μmol)、N,N-二异丙基乙胺(45.2mg,346.26μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(103.94mg,270.22μmol)和化合物Int15(150mg,182.24μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(170mg，收率：79.8％)。
MS m/z(ESI):1160.6[M+H]+。
第二步：化合物Int17的制备
将化合物Int17-1(170mg,138.15μmol)溶于无水二氯甲烷(6mL)和三氟乙酸(3mL)的混合溶剂中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(133mg，收率：86.3％)。
MS m/z(ESI):1104.6[M+H]+。
中间体制备例18：化合物Int18的制备
第一步：化合物Int18-1的制备
依次将化合物Int15(60mg,79.78μmol)、(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(叔丁氧基)-4-氧代丁酸(32.78mg,79.78μmol)、N,N-二异丙基乙胺(25.73mg,199.46μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(36.38mg,95.73μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温搅拌1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-40％)，得到本步的标题化合物(52mg，收率：56.94％)。
MS m/z(ESI):1146.7[M+H]+。
第二步：化合物Int18-2的制备
依次将化合物Int18-1(50mg,43.60μmol)和48％氢溴酸水溶液(0.5mL)加入乙腈(1 mL)中，室温搅拌3小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(35mg，收率：73.42％)。
MS m/z(ESI):1090.6[M+H]+。
第三步：化合物Int18-3的制备
依次将化合物Int18-2(35mg,32.09mmol)、VC-PABC-MMAE(36.04mg,32.09μmol)、N,N-二异丙基乙胺(10.34mg,80.22μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(14.63mg,38.50μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温搅拌2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝40％-45％)，得到本步的标题化合物(63mg，收率：89.31％)。
MS m/z(ESI):1098.1[M/2+H]+。
第四步：化合物Int18的制备
将化合物Int18-3(63mg,28.7μmol)和哌啶(4.82mg,57.40μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温搅拌2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(28mg，收率：49.45％)。
MS m/z(ESI):1973.2[M+H]+。
中间体制备例19：化合物Int19的制备
第一步：化合物Int19-1的制备
依次将(S)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-(叔丁氧基)-4-氧代丁酸(35.52mg,86.33μmol)、N,N-二异丙基乙胺(14.16mg,109.56μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(38.88mg,102.25μmol)和化合物Int15(65mg,86.33μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(50mg，收率：53.2％)。
MS m/z(ESI):1146.6[M+H]+。
第二步：化合物Int19-2的制备
将化合物Int19-1(50mg,43.18μmol)溶于无水二氯甲烷(3mL)和三氟乙酸(1.5mL)的混合溶剂中，25℃反应4小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(45mg，收率：89.2％)。
MS m/z(ESI):1090.5[M+H]+。
第三步：化合物Int19-3的制备
依次将化合物Int19-2(41.53mg,38.09μmol)、N,N-二异丙基乙胺(6.82mg,52.37μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(18.07mg,47.05μmol)和VC-PBAC-MMAE(42.8mg,38.09μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-25％)，得到本步的标题化合物(52mg，收率：65.4％)。
MS m/z(ESI):1098.1[M/2+H]+。
第四步：化合物Int19的制备
将化合物Int19-3(52mg,23.69μmol)和哌啶(6.52mg,76.54μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(31mg，收率：82.9％)。
MS m/z(ESI):658.4[M/3+H]+。
中间体制备例20：化合物Int20的制备
依次将VC-PABC-MMAE(150mg,133.52μmol)、N,N-二异丙基乙胺(22.43mg,173.58μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(66mg,173.58μmol)和N6-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(62.56mg,133.52μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝60％-70％)，得到本步的标题化合物(170mg，收率：85.1％)。
MS m/z(ESI):1573.9[M+H]+。
中间体制备例21：化合物Int21的制备
第一步：化合物Int21-1的制备
依次将化合物8-3(86mg,72.3μmol)、N,N-二异丙基乙胺(12.15mg,94μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(35.74mg,94μmol)和GGFG-Dxd(60.8mg,72.3μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(60mg，收率：43.4％)。
MS m/z(ESI):1006.5[M/2+H]+。
第二步：化合物Int21的制备
将化合物Int21-1(60mg,29.82μmol)和二乙胺(10.46mg,141.64μmol)加入N,N-二甲 基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝15％-25％)，得到本步的标题化合物(45mg，收率：88.8％)。
MS m/z(ESI):1789.9[M+H]+。
中间体制备例22：化合物Int22的制备
第一步：化合物Int22-1的制备
依次将化合物Int14(280mg,321.84μmol)、N,N-二异丙基乙胺(68.42mg,524.08μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(114.8mg,350μmol)和N-叔丁氧羰基赖氨酸甲酯盐酸盐(92mg,350μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(300mg，收率：83.8％)。
MS m/z(ESI):1112.6[M+H]+。
第二步：化合物Int22-2的制备
将化合物Int22-1(300mg,269.68μmol)溶于甲醇(6mL)和水(2mL)的混合溶剂中，然后加入氢氧化锂(56.58mg,1348.4μmol)，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(280mg，收率：94.5％)。
MS m/z(ESI):1098.6[M+H]+。
第三步：化合物Int22-3的制备
将化合物Int22-2(280mg,254.93μmol)溶于无水二氯甲烷(6mL)和三氟乙酸(3mL)的混合溶剂中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(180mg,收率：74.5％)。
MS m/z(ESI):998.6[M+H]+。
第四步：化合物Int22的制备
将化合物Int22-3(180mg,178.51μmol)和9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯(91.24mg,267.76μmol)溶于无水二氯甲烷(3mL)中，然后加入N,N-二异丙基乙胺(46.14mg,357.02μmol)，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(180mg，收率：82.9％)。
MS m/z(ESI):1220.6[M+H]+。
中间体制备例23：化合物Int23的制备
第一步：6-硝基-N-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-胺的制备
将7-氯-6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶(2g,9.34mmol)和4-氨甲基四氢吡喃(1.29g,11.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中加入N,N-二异丙基乙胺(1.81g,14mmol)，缓慢升温至室温搅拌6小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用乙酸乙酯(50mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(2.52g，收率：92.3％)。
MS m/z(ESI):294.1[M+H]+。
第二步：N7-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻吩并[3,2-b]吡啶-6,7-二胺的制备
将6-硝基-N-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻吩并[3,2-b]吡啶-7-胺(2.52g,8.53mmol)溶于四氢呋喃(50mL)和甲醇(50mL)的混合溶剂中，加入10％钯碳(0.2g)，氢气置换三次，将反应体系在室温下搅拌12小时，抽滤，甲醇(30mL)洗涤滤饼，滤液浓缩，得到本步的标题化合物(2.1g，收率：93.7％)。
MS m/z(ESI):264.1[M+H]+。
第三步：N-(7-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基)戊酰胺的制备
将N7-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)噻吩并[3,2-b]吡啶-6,7-二胺(2.1g,7.98mmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.1g,15.9mmol)溶于四氢呋喃(40mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢滴加正戊酰氯(1.45g,11.97mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。向反应体系中加入水(10mL)淬灭反应，将体系浓缩尽可能除去四氢呋喃，向所得剩余物中加入水(50mL)，并用乙酸乙酯(30mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(50mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(2.8g，收率：100％)。
MS m/z(ESI):348.1[M+H]+。
第四步：2-丁基-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶的制备
将N-(7-(((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)氨基)噻吩并[3,2-b]吡啶-6-基)戊酰胺(2.8g,7.98mmol)加入乙醇(30mL)中，室温下加入氢氧化钠(1.3g,31.9mmol)，升温至50℃搅拌6小时。向反应体系中加入水(150mL)淬灭反应，用稀盐酸调节pH＝6，并用乙酸乙酯(100mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠溶液(60mL)洗涤两次，饱和食盐水(60mL)洗涤两次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到本步的标题化合物(1.9g，收率：72.2％)。
MS m/z(ESI):330.1[M+H]+。
第五步：7-溴-2-丁基-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶的制备
将2-丁基-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶(1.9g,5.75mmol)完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)和冰醋酸(6mL)的混合溶剂中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入N-溴代丁二酰亚胺(1.54g,8.63mmol)，缓慢升温至室温搅拌24小时。将反应液倒入水(100mL)中，并用乙酸乙酯(30mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)洗涤三次，饱和食盐水(50mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/1(v/v))，得到本步的标题化合物(1.64g，收率：70％)。
MS m/z(ESI):408.0[M+H]+。
第六步：7-溴-2-丁基-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-5-氧化物的制备
将7-溴-2-丁基-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶(1.64g,4.0mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入间氯过氧苯甲酸(1.63g,8.0mmol)，缓慢升温至室温搅拌4小时。将反应液倒入水(100mL)中， 并用二氯甲烷(30mL)萃取三次，合并有机相，饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和亚硫酸钠水溶液(30mL)洗涤两次，饱和食盐水(30mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，得到标题化合物(1.7g，收率：100％)。
MS m/z(ESI):424.0[M+H]+。
第七步：7-溴-N-(叔丁基)-2-丁基-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-4-胺的制备
将7-溴-2-丁基-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-5-氧化物(1.7g,4.0mmol)和叔丁胺(0.73g,20mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，冰水浴降温，0℃下向反应液中缓慢分批加入对甲苯磺酰氯(1.53g,8.0mmol)，缓慢升温至室温搅拌12小时。向反应体系中加入水(100mL)，二氯甲烷(30mL)萃取三次，合并有机相，饱和食盐水(30mL)洗涤三次，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝5/1(v/v))，得到本步的标题化合物(1.1g，收率：57.3％)。
MS m/z(ESI):479.0[M+H]+。
第八步：4-(2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯的制备
将7-溴-N-(叔丁基)-2-丁基-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-4-胺(0.8g,1.71mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(0.8g,2.56mmol)、碳酸钾(4.73g,3.4mmol)和1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(62mg,0.08mmol)加入到1,4-二氧六环(10mL)和水(2mL)的混合溶剂中。反应体系经氮气鼓泡5分钟后，升温至100℃搅拌2小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/3(v/v))，得到本步的标题化合物(0.5g，收率：50.5％)。
MS m/z(ESI):582.3[M+H]+。
第九步：4-(2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的制备
将4-(2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)-3,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(0.5g,0.86mmol)、甲酸铵(1.08g,17.2mmol)和10％钯炭(20mg,0.019mmol)依次加入无水乙醇(10mL)中，缓慢升温至80℃搅拌12小时。将反应体系冷却至室温后，抽滤，乙醇(15mL)洗涤滤饼，滤液浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v))，得到本步的标题化合物(0.40g， 收率：79.7％)。
MS m/z(ESI):584.3[M+H]+。
第十步：2-丁基-7-(哌啶-4-基)-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-4-胺(Int23)的制备
将4-(2-丁基-4-(叔丁基氨基)-1-((四氢-2H-吡喃-4-基)甲基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(0.3g,0.51mmol)溶于甲醇(3mL)中，室温下加入浓盐酸(0.5mL)，升温至50℃搅拌4小时。将反应体系冷却至室温后，浓缩除去溶剂，所得剩余物经制备高效液相色谱纯化，得到本步的标题化合物(0.19g,收率：87.1％)。
MS m/z(ESI):428.3[M+H]+。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ:7.11(s,1H),4.23(d,J＝7.6Hz,2H),3.95-3.92(m,2H),3.47-3.44(m,2H),3.15-3.08(m,2H),2.98-2.94(m,2H),2.31-2.15(m,3H),2.02-1.86(m,4H),1.57-1.49(m,5H),1.37-1.26(m,4H),1.03(t,J＝7.6Hz,3H)。
中间体制备例24：化合物Int24的制备
第一步：化合物Int24-1的制备
依次将化合物Int14-1(472.48mg,799.99μmol)、化合物Int23(250mg,533.33μmol)、氰基硼氢化钠(99.08mg,1576.7μmol)和冰乙酸(51.72mg,853.33μmol)加入1,2-二氯乙烷(6mL)和甲醇(3mL)的混合溶剂中，25℃反应4小时。反应液浓缩得到的粗品溶于甲醇(3mL)中，用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(475mg，收率：89.4％)。
MS m/z(ESI):996.6[M+H]+。
第二步：化合物Int24-2的制备
将化合物Int24-1(475mg,476.76μmol)溶于盐酸二氧六环溶液(6mL,4M)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(400mg，收率：99.3％)。
MS m/z(ESI):940.6[M+H]+。
第三步：化合物Int24-3的制备
依次将化合物Int24-2(280mg,297.81μmol)、N,N-二异丙基乙胺(116.63mg,893.44μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(160.13mg,416.94μmol)和(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-赖氨酸叔丁酯(133.08mg,313.48μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(248mg，收率：61.8％)。
MS m/z(ESI):1346.7[M+H]+。
第四步：化合物Int24的制备
将化合物Int24-3(94.74mg,70.34μmol)溶于无水二氯甲烷(4mL)和三氟乙酸(2mL)的混合溶剂中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(70mg，收率：81.2％)。
MS m/z(ESI):1290.7[M+H]+。
中间体制备例25：化合物Int25的制备
第一步：化合物Int25-1的制备
依次将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(37.29mg,87.65μmol)、N,N-二异丙基乙胺(14.16mg,109.56μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(38.88mg,102.25μmol)和化合物Int15(55mg,73.04μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(80mg，收率：99.4％)。
MS m/z(ESI):1160.6[M+H]+。
第二步：化合物Int25-2的制备
将化合物Int25-1(50mg,43.09μmol)溶于无水二氯甲烷(3mL)和三氟乙酸(1.5mL)的混合溶剂中，25℃反应4小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(45mg，收率：62.2％)。
MS m/z(ESI):1104.6[M+H]+。
第三步：化合物Int25-3的制备
将化合物Int25-2(45mg,40.74μmol)、N,N-二异丙基乙胺(7.58mg,58.07μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(20.81mg,54.19μmol)和VC-PABC-MMAE(45.78mg,40.74μmol)，加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反 应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(30mg，收率：35.1％)。
MS m/z(ESI):1105.2[M/2+H]+。
第四步：化合物Int25的制备
将化合物Int25-3(30mg,13.44μmol)和二乙胺(4.58mg,53.76μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(25mg，收率：93.6％)。
MS m/z(ESI):994.1[M/2+H]+。
中间体制备例26：化合物Int26的制备
第一步：化合物Int26-1的制备
依次将化合物N-叔丁氧羰基-七聚乙二醇-羧酸(450mg,895.34μmol)、N,N-二异丙基乙胺(466.66mg,3.58mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(412.4mg,1.07mmol)和化合物Int23(419.69mg,895.34μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(6mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝55％-65％)，得到本步的标题化合物(800mg，收率：98.5％)。
MS m/z(ESI):907.5[M+H]+。
第二步：化合物Int26-2的制备
将化合物Int26-1(800mg,881.87μmol)溶于盐酸二氧六环溶液(6mL,4M)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(610mg，收率：90.2％)。
MS m/z(ESI):807.5[M+H]+。
第三步：化合物Int26-3的制备
依次将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(276.97mg,644.45μmol)、N,N-二异丙基乙胺(209.93mg,1610μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(296.84mg,773.34μmol)和化合物Int26-2(604mg,644.45μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(747.9mg，收率：95.6％)。
MS m/z(ESI):1214.6[M+H]+。
第四步：化合物Int26-4的制备
将化合物Int26-3(460mg,378.75μmol)溶于无水二氯甲烷(6mL)和三氟乙酸(3mL)的混合溶剂中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(400mg，收率：91.2％)。
MS m/z(ESI):1158.6[M+H]+。
第五步：化合物Int26-5的制备
将化合物Int26-4(113.74mg,91.19μmol)、N,N-二异丙基乙胺(23.24mg,178.03μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(51.28mg,133.52μmol)和VC-PABC-MMAE(95mg,84.56μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝55％-65％)，得到本步的标题化合物(170mg,收率：93.5％)。
MS m/z(ESI):1132.2[M/2+H]+。
第六步：化合物Int26的制备
将化合物Int26-5(170mg,75.09μmol)和二乙胺(27.74mg,375.47μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝55％-65％)，得到本步的标题化合物(110mg，收率：71.9％)。
MS m/z(ESI):1021.2[M/2+H]+。
中间体制备例27：化合物Int27的制备
第一步：化合物Int27-1的制备
将化合物Int26-4(440mg,379.83μmol)、N,N-二异丙基乙胺(98.18mg,759.66μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(173.31mg,455.8μmol)和GGFG-Dxd(319.38mg,379.83μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(6mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(250mg，收率：35.0％)。
MS m/z(ESI):991.2[M/2+H]+。
第二步：化合物Int27的制备
将化合物Int27-1(205mg,103.47μmol)和二乙胺(36.31mg,491.49μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(160mg，收率：93.1％)。
MS m/z(ESI):586.9[M/3+H]+。
中间体制备例28：化合物Int28的制备
第一步：化合物Int28-2的制备
将七甘醇单甲醚(1g,2.91mmol)和戴斯马丁氧化剂(1.87g,4.36mmol)加入二氯甲烷(15mL)中，25℃反应10小时。向反应液加入饱和硫代硫酸钠溶液(5mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)，搅拌至澄清，再加入二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝15/1(v/v))，得到本步的标题化合物(890mg，收率：90.4％)。
MS m/z(ESI):339.2[M+H]+。
第二步：化合物Int28的制备
将化合物Int28-2(600mg,1.78mmol)、氰基硼氢化钠(143.5mg,2.26mmol)和冰乙酸(137.13mg,2.26mmol)加入1,2-二氯乙烷(6mL)和甲醇(4mL)的混合溶剂中，25℃搅拌均匀，然后将2,5,8,11,14,17,20-七氧杂二十二烷-22-胺(592.33mg,1.74mmol)溶解于1,2-二氯乙烷(6mL)中，用恒压滴液漏斗3小时内滴入上述体系中。滤液浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝17/3(v/v))，得到本步的标题化合物(650mg，收率：65.2％)。
MS m/z(ESI):662.3[M+H]+。
中间体制备例29：化合物Int29的制备
第一步：化合物Int29-1的制备
将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(496.25mg,1.17mmol)、N,N-二异丙基乙胺(188.43mg,1.39mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲 基脲六氟磷酸酯(554.36mg,1.39mmol)和化合物Int28(650mg,982.14μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(650mg，收率：65.8％)。
MS m/z(ESI):1069.6[M+H]+。
第二步：化合物Int29-2的制备
将化合物Int29-1(235.79mg,220.51μmol)溶于盐酸二氧六环溶液(5mL,4M)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(180mg，收率：84.8％)。
MS m/z(ESI):1013.5[M+H]+。
第三步：化合物Int29-3的制备
将化合物Int29-2(151.82mg,149.85μmol)、N,N-二异丙基乙胺(25.18mg,194.8μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(62.67mg,164.83μmol)和GGFG-Dxd(126mg,149.85μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(160mg，收率：61.2％)。
MS m/z(ESI):1835.8[M+H]+。
第四步：化合物Int29的制备
将化合物Int29-3(160mg,87.16μmol)和二乙胺(63.74mg,871.6μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(145mg,收率：596.7％)。
MS m/z(ESI):1613.8[M+H]+。
中间体制备例30：化合物Int30的制备
将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(400mg,930.73μmol)、N,N-二异丙基乙胺(243mg,1.86mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(500.45mg,1.3mmol)和炔丙胺(77.67mg,1.4mmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应3小时。反应液浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石 油醚/乙酸乙酯＝3/2(v/v))，得到本步的标题化合物(420mg，收率：97.7％)。
MS m/z(ESI):463.2[M+H]+。
中间体制备例31：化合物Int31的制备
第一步：化合物Int31-1的制备
将4-羟甲基-1-环己羧酸(125.94mg,788.14μmol)、N,N-二异丙基乙胺(292.42mg,2.26mmol,373.94μL)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(315.45mg,788.14μmol)和化合物Int23(350mg,754.2μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应3小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(380mg，收率：93.4％)。
MS m/z(ESI):568.3[M+H]+。
第二步：化合物Int31-2的制备
将化合物Int31-1(325mg,503.19μmol)溶于无水吡啶(5mL)中，在1小时内分批次加入甲基磺酰氯(65.43mg,1006.39μmol)，加完后25℃下反应3小时。反应液浓缩后，加入N,N-二甲基甲酰胺(4mL)稀释，直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝60％-70％)，得到本步的标题化合物(325mg，收率：82.5％)。
MS m/z(ESI):646.3[M+H]+。
第三步：化合物Int31-3的制备
将化合物Int31-2(325mg,503.19μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，再加入叠氮化钠(65.43mg,1006.39μmol)，80℃反应4小时。向反应液中加入水(20mL)，乙酸乙酯(20mL*3)萃取，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩得到本步的标题化合物(260mg，收率：91.9％)。
MS m/z(ESI):593.3[M+H]+。
第四步：化合物Int31-4的制备
将化合物Int31-3(230.69mg,389.16μmol)、化合物Int30(180mg,389.16μmol)、抗坏血酸钠(154.19mg,778.32μmol)和无水硫酸铜(291.5mg,1170μmol)加入水(0.25mL)、二甲基亚砜(2mL)和四氢呋喃(1mL)的混合溶剂中，0℃反应3小时。反应液浓缩得到的剩余物用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(405mg，收率：98.8％)。
MS m/z(ESI):1055.5[M+H]+。
第五步：化合物Int31-5的制备
将化合物Int31-4(190mg,180.04μmol)溶于无水二氯甲烷(6mL)和三氟乙酸(2mL)的混合溶剂中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到的剩余物用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(150mg，收率：84.7％)。
MS m/z(ESI):999.6[M+H]+。
第六步：化合物Int31-6的制备
将化合物Int31-5(24.77mg,24.79μmol)、N,N-二异丙基乙胺(4.16mg,32.22μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(11.31mg,29.75μmol)和化合物Int29(40mg,24.79μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液 直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(50mg，收率：81.8％)。
MS m/z(ESI):1297.6[M/2+H]+。
第七步：化合物Int31的制备
将化合物Int31-6(50mg,19.26μmol)和二乙胺(6.76mg,91.52μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(25mg，收率：57.6％)。
MS m/z(ESI):1186.6[M/2+H]+。
中间体制备例32：化合物Int32的制备
第一步：化合物Int32-2的制备
将化合物Int32-1(75mg,138.75μmol)、N,N-二异丙基乙胺(26.9mg,208.12μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(65.58mg,180.36μmol)和甲磺酸依喜替康(73.75mg,138.75μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(115mg，收率：91.1％)。
MS m/z(ESI):958.3[M+H]+。
第二步：化合物Int32的制备
将化合物Int32-2(115mg,120.04μmol)和二乙胺(42.13mg,570.2μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(75mg，收率：89.4％)。
MS m/z(ESI):736.3[M+H]+。
中间体制备例33：化合物Int33的制备
第一步：化合物Int33-1的制备
将化合物Int26-4(75.54mg,61.78μmol)、N,N-二异丙基乙胺(15.97mg,123.56μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(30.54mg,80.32μmol)和化合物Int32(50mg,67.96μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(85mg，收率：77.2％)。
MS m/z(ESI):1875.9[M+H]+。
第二步：化合物Int33的制备
将化合物Int33-1(85mg,45.3μmol)和二乙胺(15.9mg,215.2μmol)加入N,N-二甲基甲 酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(70mg，收率：98.3％)。
MS m/z(ESI):1653.8[M+H]+。
中间体制备例34：化合物Int34的制备
第一步：化合物Int34-2的制备
将化合物Int34-1(800mg,1.67mmol)和哌啶(287.11mg,3.34mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中，室温反应2小时。反应液浓缩后，加入甲基叔丁基醚(20mL)，超声5分钟后，静置，过滤，固体干燥得到本步的标题化合物(315mg，收率：73.47％)
MS m/z(ESI):253.1[M+H]+。
第二步：化合物Int34-3的制备
将化合物Int34-2(90mg,321.09μmol)、N2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-缬氨酸)-N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(202.53mg,321.09μmol)、N,N-二异丙基乙胺(104.60mg,802.72μmol)、1-羟基苯并三唑(49.23mg,353.20μmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(77.43mg,401.36μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，室温反应3小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝50％-55％)，得到本步的标题化合物(142mg，收率：47.43％)。
MS m/z(ESI):802.4[M+H]+。
第三步：化合物Int34-4的制备
将化合物Int34-3(142mg,159.37μmol)、甲酸铵(50.75mg,796.84μmol)和10％钯碳(15mg)加入无水甲醇(4mL)中，室温反应3小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝30％-35％)，得到本步的标题化合物(101mg，收率：80.13％)。
MS m/z(ESI):712.4[M+H]+。
第四步：化合物Int34-5的制备
将化合物Int34-4(95mg,133.46μmol)、甲磺酸依喜替康(70.94mg,133.46μmol)、N,N-二异丙基乙胺(43.04mg,333.66μmol)和双(2-氧代-3-恶唑烷基)次磷酰氯(50.85mg,200.20μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应3小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(105mg，收率：69.67％)。
MS m/z(ESI):1129.5[M+H]+。
第五步：化合物Int34的制备
将化合物Int34-5(105mg,92.98μmol)和哌啶(15.83mg,185.97μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝27％-33％)，得到本步的标题化合物(46mg，收率：54.54％)。
MS m/z(ESI):907.4[M+H]+。
中间体制备例35：化合物Int35的制备
第一步：化合物Int35-2的制备
将(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-丙氨酸-D-丙氨酸(537.38mg,1.33mmol)、N,N-二异丙基乙胺(345.07mg,3.67μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(641.18mg,16.84mmol)和化合物Int35-1(300mg,1.33mmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(6mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(400mg，收率：52.9％)。
MS m/z(ESI):567.3[M+H]+。
第二步：化合物Int35-3的制备
将化合物Int35-2(400mg,635.32μmol)溶于盐酸二氧六环溶液(4mL,4M)中，25℃反应3小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(310mg，收率：95.6％)。
MS m/z(ESI):511.2[M+H]+。
第三步：化合物Int35-4的制备
氮气保护下依次将化合物Int35-3(350mg,651.27μmol)、四乙酸铅(437.51mg,976.91μmol)、醋酸铜(13.13mg,64.13μmol)和冰乙酸(59.26mg,976.91μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(6mL)中，60℃反应0.5小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(285mg，收率：83.4％)。
MS m/z(ESI):547.2[M+Na]+。
第四步：化合物Int35-5的制备
将化合物Int35-4(280mg,533.76μmol)和乙醇酸苄酯(373.47mg,2.14mmol)加入二氯甲烷(6mL)和三氟乙酸(2mL)混合溶剂中，25℃反应0.5小时。反应液浓缩得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝7/3(v/v))，得到本步的标题化合物(30mg，收率：98.1％)。
MS m/z(ESI):653.3[M+Na]+。
第五步：化合物Int35-6的制备
将化合物Int35-5(160mg,237.84μmol)、10％钯碳(28.89mg)和醋酸铵(89.99mg,1430μmol)加入甲醇(6mL)中，25℃反应3小时。反应液垫硅藻土过滤，滤液浓缩得到本步的标题化合物(30mg，收率：23.3％)。
MS m/z(ESI):541.2[M+H]+。
第六步：化合物Int35-7的制备
将化合物Int35-6(30mg,55.49μmol)、N,N-二异丙基乙胺(11.09mg,85.84μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(22.85mg,60.08μmol)和甲磺酸依喜替康(32.45mg,61.05μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(45mg，收率：89.1％)。
MS m/z(ESI):958.4[M+H]+。
第七步：化合物Int35的制备
将化合物Int35-7(39.8mg,41.55μmol)和二乙胺(15.35mg,207.74μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝55％-65％)，得到本步的标题化合物(30mg，收率：98.1％)。
MS m/z(ESI):736.2[M+H]+。
实施例1-1：化合物C-1的制备
将化合物Int5(50mg,0.02mmol)溶于DMSO(6mL)和水(0.6mL)中，氮气保护下，加入6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己酰胺(5.99mg,0.024mmol)、抗坏血酸钠(5.94mg,0.03mmol)和无水硫酸铜(6.4mg,0.04mmol)，室温搅拌1小时，加水和乙酸乙酯萃取，有机相干燥，浓缩得到的粗品经制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(15mg，收率：27.2％)。
MS m/z(ESI):1365.7[M/2+H]+。
实施例1-2：化合物C-2的制备
采用实施例1-1的合成路线，将反应原料6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己酰胺替换为6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)六-5-炔酰胺，得到本步的标题化合物(3mg，收率：5.6％)。
MS m/z(ESI):1394.2[M/2+H]+。
实施例1-3：化合物C-3的制备
采用实施例1-1的合成路线，将反应原料化合物Int5替换为化合物Int6，6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-(丙-2-炔-1-基)己酰胺替换为6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)六-5-炔酰胺，得到本步的标题化合物(5mg，收率：8％)。
MS m/z(ESI):1583.8[M/2+H]+。
实施例1-4：化合物C-4的制备
采用实施例1-1的合成路线，将反应原料化合物Int5替换为化合物Int6，得到本步的标题化合物(10mg，收率：6％)。
MS m/z(ESI):1555.3[M/2+H]+。
实施例1-5：化合物C-5的制备
第一步：化合物5-1的制备
采用化合物Int5的合成路线，将反应原料MC-VC-PABC-MMAE替换为MC-GGFG-Dxd，得到本步的标题化合物(30mg，收率：21.3％)。
MS m/z(ESI):1100.5[M/2+H]+。
第二步：化合物C-5的制备
将化合物5-1(30mg,0.014mmol)溶于DMSO(3mL)和水(0.3mL)中，氮气保护下，加入6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-N-(丙-2-炔-1-基)六-5-炔酰胺(4.99mg,0.016mmol)、抗坏血酸钠(4.16mg,0.021mmol)和无水硫酸铜(4.5mg,0.028mmol)，室温搅拌1小时，加水和乙酸乙酯萃取，有机相干燥，浓缩得到的粗品经制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(3mg，收率：8.8％)。
MS m/z(ESI):1252.0[M/2+H]+。
实施例1-6：化合物C-6的制备
依次将化合物Int11(20mg,7.74μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(2.17mg,7.74μmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.52mg,11.61μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)中，25℃下反应3小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(0.64mg，收率：3％)。
MS m/z(ESI):1303.3[M/2+H]+。
实施例1-7：化合物C-7的制备


第一步：化合物7-1的制备
将化合物Int12(115mg,102.07μmol)和化合物Int7(135.06mg,153.11μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，依次加入N,N-二异丙基乙胺(27.77mg,204.14μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(61.29mg,153.11μmol)，0℃反应1小时。反应液浓缩得到的粗品用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝40％-50％)，得到本步的标题化合物(125mg，收率：58.3％)。
MS m/z(ESI):945.6[M/2+H]+。
第二步：化合物7-2的制备
氮气保护下将化合物7-1(125mg,59.51μmol)溶于氯化氢的1,4-二氧六环溶液(2mL,4M)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到的剩余物用二氯甲烷(15mL)溶解后再次减压浓缩除去溶剂，反复三次，得到本步的标题化合物(140mg，收率：90.4％)。
MS m/z(ESI):895.6[M/2+H]+。
第三步：化合物7-3的制备
依次将化合物7-2(95mg,50.41μmol)、(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(135.06mg,153.11μmol)、N,N-二异丙基乙胺(13.72mg,100.82μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(30.27mg,75.62μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝40％-50％)，得到本步的标题化合物(120mg，收率：97.5％)。
MS m/z(ESI):1099.0[M/2+H]+。
第四步：化合物7-4的制备
将化合物7-3(110mg,45.05μmol)和三氟乙酸(2mL)溶于二氯甲烷(6mL)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到的剩余物用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(76mg，收率：74.8％)。
MS m/z(ESI):1071.1[M/2+H]+。
第五步：化合物7-5的制备
依次将化合物7-4(60mg,26.62μmol)、VC-PABC-MMAE(43.19mg,34.60μmol)、N,N-二异丙基乙胺(5.21mg,39.92μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(14.31mg,37.26μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(65mg，收率：71.5％)。
MS m/z(ESI):1623.5[M/2+H]+。
第六步：化合物7-6的制备
依次将化合物7-5(65mg,19.02μmol)和哌啶(3.27mg,129.16μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(55.6mg，收率：91.8％)。
MS m/z(ESI):1008.6[M/3+H]+。
第七步：化合物C-7的制备
依次将化合物7-6(58mg,18.22μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(5.10mg,18.22μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.57mg,27.32μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)中，25℃反应3小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(28.33mg，收率：46.5％)。
MS m/z(ESI):1587.9[M/2+H]+。
实施例1-8：化合物C-8的制备

第一步：化合物8-2的制备
依次将化合物Int7(300mg,340.08μmol)、(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(228.47mg,425.47μmol)、N,N-二异丙基乙胺(92.53mg,680.17μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(204.22mg,510.13μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到的剩余物用硅胶柱层析色谱法纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝9/1(v/v))，得到本步的标题化合物(371mg，收率：78.8％)。
MS m/z(ESI):1245.7[M+H]+。
第二步：化合物8-3的制备
将化合物8-2(350mg,252.91μmol)和三氟乙酸(2mL)加入二氯甲烷(6mL)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到的剩余物用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(250mg，收率：74.8％)。
MS m/z(ESI):1189.6[M+H]+。
第三步：化合物8-4的制备
依次将化合物8-3(105mg,83.87μmol)、VC-PABC-MMAE(110.85mg,83.87μmol)、N,N-二异丙基乙胺(19.71mg,150.96μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(45.11mg,117.44μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(170mg，收率：79.5％)。
MS m/z(ESI):1147.7[M/2+H]+。
第四步：化合物8-5的制备
将化合物8-4(156mg,64.58μmol)和哌啶(11.11mg,129.16μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(125mg，收率：88.7％)。
MS m/z(ESI):1036.7[M/2+H]+。
第五步：化合物8-6的制备
依次将化合物8-5(120.05mg,55.03μmol)、化合物Int12(62mg,55.03μmol)、N,N-二异丙基乙胺(10.78mg,82.54μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(25.36mg,66.02μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应1小时。反应液直 接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(170mg，收率：89.0％)。
MS m/z(ESI):1562.6[M/2+H]+。
第六步：化合物8-7的制备
氮气保护下依次将化合物8-6(160mg,48.64μmol)和溴化锌(46.12mg,194.67μmol)加入无水二氯甲烷(2mL)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到的剩余物用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝30％-40％)，得到本步的标题化合物(140mg，收率：90.4％)。
MS m/z(ESI):1512.4[M/2+H]+。
第七步：化合物C-8的制备
依次将化合物8-7(80mg,125.13μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(7.04mg,25.13μmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.92mg,37.69μmol,6.29μL)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)中，25℃反应3小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(19.4mg，收率：23.1％)。
MS m/z(ESI):1587.9[M/2+H]+。
实施例1-9：化合物C-9的制备
依次将化合物Int10(50mg,24.24μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(20.38mg,72.72μmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.75mg,36.36μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(11mg，收率：20.2％)。
MS m/z(ESI):1055.5[M/2+H]+。
实施例1-10：化合物C-10的制备
依次将化合物Int10(60mg,29.09μmol)、6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(9.44mg,09.09μmol)和N,N-二异丙基乙胺(45.70mg,43.63μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(11mg，收率：16.3％)。
MS m/z(ESI):1076.6[M/2+H]+。
实施例1-11：化合物C-11的制备
依次将化合物Int10(60mg,29.09μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸盐(22.38mg,58.18μmol)、N,N-二异丙基乙胺(5.7mg,43.63μmol)和1-羟基苯并三唑(5.09mg,14.55μmol))加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(4mg，收率：5.8％)。
MS m/z(ESI):1105.1[M/2+H]+。
实施例1-12：化合物C-14的制备
第一步：化合物C-14的制备
依次将化合Int16(22mg,10.32μmol)、6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(4.82mg,15.48μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.36mg,25.80μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-30％)，得到本步的标题化合物(12.73mg，收率：54.31％)。
MS m/z(ESI):1056.1[M/2+H]+。
实施例1-13：化合物C-15的制备
第一步：化合物15-1的制备
依次将化合物Int12(50mg,42.04μmol)、VC-PABC-MMAE(52.48mg,42.04μmol)、N,N-二异丙基乙胺(13.70mg,105.11μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(19.37mg,50.45μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)中，室温反应1.5小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(41mg，收率：40.34％)。
MS m/z(ESI):1088.2[M/2+H]+。
第二步：化合物15-2的制备
将化合物15-1(38mg,15.72μmol)和无水溴化锌(17.88mg,78.59μmol)加入无水二氯甲烷(3mL)中，室温反应5小时。反应液浓缩得到的粗品用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(30mg，收率：82.76％)。
MS m/z(ESI):1038.1[M/2+H]+。
第三步：化合物C-15的制备
依次将化合物15-2(30mg,13.01μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(5.25 mg,19.51μmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.54mg,19.51μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应1.5小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-40％)，得到本步的标题化合物(9.81mg,收率：31.52％)。
MS m/z(ESI):1113.7[M/2+H]+。
实施例1-14：化合物C-16的制备
依次将化合物Int25(25mg,12.58μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(10.05mg,37.74μmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.34mg,17.92μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(8mg，收率：31.3％)。
MS m/z(ESI)：1069.6[M/2+H]+。
实施例1-15：化合物C-17的制备
第一步：化合物17-2的制备
依次将VC-PABC-MMAE(60mg,53.41μmol)、N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(25mg,53.41μmol)、N,N-二异丙基乙胺(17.2mg,133.52μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(24.35mg,64.09μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应1小时。将反应体系倒入冰水中(10mL)，乙酸乙酯萃取(5mL*3)，合并有机相并用饱和食盐水反洗(3mL*2)，无水硫酸钠干燥有机相，有机相浓缩得到本步的标题化合物(82mg，粗品)。
MS m/z(ESI):1574.0[M+H]+。
第二步：化合物17-3的制备
依次将化合物17-2(82.00mg,粗品)和哌啶(8.07mg,93.78μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(41mg，两步总收率：56.75％)。
MS m/z(ESI):1351.9[M+H]+。
第三步：化合物17-4的制备
依次将化合物17-3(41.00mg,30.32μmol)、化合物Int3(25.52mg,30.32μmol)、N,N-二异丙基乙胺(9.78mg,75.81μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(17.28mg,45.48μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-50％)，得到本步的标题化合物(35mg，收率：53.06％)。
MS m/z(ESI):1088.2[M/2+H]+。
第四步：化合物17-5的制备
将化合物17-4(35mg,16.09μmol)和无水溴化锌(14.28mg,64.36μmol)加入二氯甲烷(2mL)中，室温反应3小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-30％)，得到本步的标题化合物(25mg，收率：74.87％)。
MS m/z(ESI):1038.2[M/2+H]+。
第五步：化合物C-17的制备
依次将化合物17-5(25mg,12.05μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(4.37mg,16.26μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.12mg,24.10μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝30％-45％)，得到本步的标题化合物(11.1mg，收率：41.38％)。
MS m/z(ESI):1113.7[M/2+H]+。
实施例1-16：化合物C-18的制备
依次将化合物Int16(16mg,8.34μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(4.57mg,12.51μmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.15mg,16.68μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中，室温反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-40％)，得到本步的标题化合物(2.87mg，收率：15.87％)。
MS m/z(ESI):1084.6[M/2+H]+。
实施例1-17：化合物C-19的制备
第一步：化合物19-1的制备
依次将化合物Int17(25mg,22.64μmol)、N,N-二异丙基乙胺(4.21mg,32.26μmol)、 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(9.91mg,25.81μmol)和GGFG-Dxd(20.09mg,22.64μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法C，洗脱梯度：A％＝15％-25％)，得到本步的标题化合物(38mg，收率：91.7％)。
MS m/z(ESI):964.0[M/2+H]+。
第二步：化合物19-2的制备
将化合物19-1(31mg,16.08μmol)和二乙胺(6.85mg,80.4μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝50％-60％)，得到本步的标题化合物(20mg，收率：72.9％)。
MS m/z(ESI):852.8[M/2+H]+。
第三步：化合物C-19的制备
依次将化合物19-2(20mg,11.73μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(6.25mg,23.46μmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.18mg,16.72μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(15mg，收率：72.5％)。
MS m/z(ESI):928.4[M/2+H]+。
实施例1-18：化合物C-20的制备
依次将化合物Int18(28mg,14.19μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(5.66mg,21.28μmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.75mg,21.28μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-35％)，得到本步的标题化合物(7.64mg，收率：25.34％)。
MS m/z(ESI):1062.6[M/2+H]+。
实施例1-19：化合物C-21的制备
依次将化合物Int19(23.15mg,11.73μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(6.25mg,23.46μmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.18mg,16.72μmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(12mg，收率：50.7％)。
MS m/z(ESI):1062.7[M/2+H]+。
实施例1-20：化合物C-22的制备
第一步：化合物22-2的制备
将九甘醇(1.2g,2.9mmol)和对甲苯磺酰氯(250.52mg,2.9mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，再加入氢氧化钾(324.89mg,5.79mmol)，25℃反应10小时。反应液浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝30/1(v/v))，得到本步的标题化合物(1.1g，收率：66.7％)。
MS m/z(ESI):586.4[M+NH4]+。
第二步：化合物22-3的制备
将化合物22-2(460mg,808.9μmol)和N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸乙酯(242mg,970.67μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(6mL)中，再加入碘化钾(13.43mg,80.89μmol)和N,N-二异丙基乙胺(150mg,1152.68μmol)，25℃反应10小时。反应液浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝5/1(v/v))，得到本步的标题化合物(320mg，收率：64.5％)。
MS m/z(ESI):646.1[M+H]+。
第三步：化合物22-4的制备
将化合物22-3(220mg,337.26μmol)和戴斯马丁氧化剂(216.66mg,505.89μmol)加入二氯甲烷(15mL)中，25℃反应10小时。向反应液中加入饱和硫代硫酸钠溶液(5mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)，搅拌至澄清，再加入二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，所得剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1(v/v))，得到本步的标题化合物(185mg，收率：85.2％)。
MS m/z(ESI):644.3[M+H]+。
第四步：化合物22-5的制备
依次将化合物22-4(146.31mg,227.26μmol)、化合物Int13(65mg,181.81μmol))、氰基硼氢化钠(31.56mg,502.2mmol)和冰乙酸(31.4mg,518.16mmol)加入1,2-二氯乙烷(4mL)和甲醇(2mL)的混合溶剂中，25℃反应4小时。反应液浓缩得到的粗品溶于甲醇(3mL)中，用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(109mg，收率：63.8％)。
MS m/z(ESI):985.5[M+H]+。
第五步：化合物22-6的制备
将化合物22-5(100mg,101.49μmol)溶于甲醇(4mL)中，加入氢氧化锂(21.31mg,507.46μmol)的水溶液(1mL)，25℃反应4小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(85mg，收率：87.5％)。
MS m/z(ESI):957.5[M+H]+。
第六步：化合物22-7的制备
依次将化合物22-6(65mg,67.91μmol)、N,N-二异丙基乙胺(12.63mg,96.76μmol,16.15μL)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(34.69mg,90.31μmol)和 VC-PABC-MMAE(76.28mg,67.91μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝30％-45％)，得到本步的标题化合物(85mg，收率：63.9％)。
MS m/z(ESI):1031.6[M/2+H]+。
第七步：化合物22-8的制备
将化合物22-7(38mg,18.42μmol)和溴化锌(31.85mg,140.01μmol)加入无水二氯甲烷(2mL)中，25℃反应4小时。反应液浓缩得到的粗品用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(30mg，收率：87.0％)。
MS m/z(ESI):981.5[M/2+H]+。
第八步：化合物C-22的制备
依次将化合物22-8(30mg,15.28μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(8.94mg,24.46μmol)和N,N-二异丙基乙胺(2.84mg,21.75μmol,3.64μL)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(20mg，收率：62.2％)。
MS m/z(ESI):1106.6[M/2+H]+。
实施例1-21：化合物C-23的制备
第一步：化合物23-1的制备
依次将化合物Int17(51mg,46.19μmol)、VC-PABC-MMAE(51.88mg,46.19μmol)、N,N-二异丙基乙胺(24.37mg,187.03μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(19.14mg,49.88μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应1.5小时。将反应体系倒入冰水(10mL)中，乙酸乙酯萃取(5mL*3)，合并有机相并用饱和食盐水反洗(3mL*2)，无水硫酸钠干燥有机相，有机相浓缩得到本步的标题化合物(86mg，收率：84.27％)。
MS m/z(ESI):1105.2[M/2+H]+。
第二步：化合物23-2的制备
将化合物23-1(86mg,38.93μmol)和哌啶(5.36mg,62.27μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-25％)，得到本步的标题化合物(47mg，收率：60.79％)。
MS m/z(ESI):1987.2[M+H]+。
第三步：化合物C-23的制备
依次将化合物23-2(47mg,23.66μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶 -5-基)六-5-炔酸酯(12.99mg,35.49μmol)和N,N-二异丙基乙胺(5.55mg,42.57μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中，室温反应1.5小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-35％)，得到本步的标题化合物(37.38mg，收率：70.60％)。
MS m/z(ESI):1119.1[M/2+H]+。
实施例1-22：化合物C-24的制备
依次将化合物Int25(28.80mg,14.49μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(5.88mg,14.49μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.78mg,28.98μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-35％)，得到本步的标题化合物(13.57mg,收率：41.83％)。
MS m/z(ESI):1119.1[M/2+H]+。
实施例1-23：化合物C-25的制备
依次将化合物Int19(24.7mg,12.52μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(5.08mg,12.52μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.26mg,25.03μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-35％)，得到本步的标题化合物(17.16mg,收率：61.66％)。
MS m/z(ESI):1112.1[M/2+H]+。
实施例1-24：化合物C-26的制备
第一步：化合物26-1的制备
将化合物Int20(87mg,55.27μmol)和溴化锌(95.56mg,420.09μmol)加入无水二氯甲烷(3mL)中，25℃反应3小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(61mg，收率：78.8％)。
MS m/z(ESI):1473.8[M+H]+。
第二步：化合物26-2的制备
依次将化合物Int14(21.25mg,24.42μmol)、N,N-二异丙基乙胺(4.54mg,34.81μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(12.48mg,32.49μmol)和化合物26-1(36mg,24.42μmol)，加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-35％)，得到本步的标题化合物(45mg，收率：83.4％)。
MS m/z(ESI):1163.2[M/2+H]+。
第三步：化合物26-3的制备
将化合物26-2(40mg,17.03μmol)和二乙胺(6.29mg,85.13μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(30mg,收率：83.8％)。
MS m/z(ESI):1052.3[M/2+H]+。
第四步：化合物C-26的制备
依次将化合物26-3(20mg,9.50μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(5.56mg,15.21μmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.77mg,13.67μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(8mg,收率：37.6％)。
MS m/z(ESI):1177.2[M/2+H]+。
实施例1-25：化合物C-27的制备
第一步：化合物27-1的制备
将化合物Int20(85mg,53.46μmol)和二乙胺(19.75mg,267.32μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(73mg，收率：98.6％)。
MS m/z(ESI):1351.8[M+H]+。
第二步：化合物27-2的制备
依次将化合物Int14(55.52mg,63.81μmol)、N,N-二异丙基乙胺(10.32mg,79.07μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(28.34mg,73.8μmol)和化合物27-1(75mg,55.48μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应1小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-40％)，得到本步的标题化合物(38mg，收率：32.7％)。
MS m/z(ESI):1102.2[M/2+H]+。
第三步：化合物27-3的制备
将化合物27-2(38mg,17.24μmol)和溴化锌(29.81mg,131.05μmol)加入无水二氯甲烷(3mL)中，25℃反应3小时。反应液浓缩得到的粗品用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(61mg，收率：78.8％)。
MS m/z(ESI):701.8[M/3+H]+。
第四步：化合物C-27的制备
依次将化合物27-3(20mg,9.50μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(5.56mg,15.21μmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.77mg,13.67μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(6mg,收率：28.2％)。
MS m/z(ESI):1177.2[M/2+H]+。
实施例1-26：化合物C-28的制备

第一步：化合物28-1的制备
将化合物Int22(10.23mg,8.38μmol)、N,N-二异丙基乙胺(1.62mg,12.57μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3.82mg,10.04μmol)和化合物Int21(15mg,8.38μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(16mg，收率：67.2％)。
MS m/z(ESI):1496.3[M/2+H]+。
第二步：化合物28-2的制备
将化合物28-1(16mg,5.35μmol)和二乙胺(1.88mg,25.40μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-35％)，得到本步的标题化合物(14mg，收率：99.5％)。
MS m/z(ESI):1385.2[M/2+H]+。
第三步：化合物C-28的制备
依次将化合物28-2(14mg,5.05μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(2.95mg,8.08μmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.94mg,7.22μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(1.61mg，收率：11.4％)。
MS m/z(ESI):1510.3[M/2+H]+。
实施例1-27：化合物C-29的制备

第一步：化合物29-1的制备
依次将化合物Int22(16.25mg,13.31μmol)、N,N-二异丙基乙胺(2.06mg,15.81μmol,2.64μL)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(5.26mg,713.71μmol)和化合物8-5(23mg,11.1μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(16mg，收率：46.3％)。
MS m/z(ESI):1092.0[M/3+H]+。
第二步：化合物29-2的制备
将化合物29-1(16mg,4.88μmol)和二乙胺(1.71mg,23.21μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合 物(9mg，收率：63.5％)。
MS m/z(ESI):1017.9[M/3+H]+。
第三步：化合物C-29的制备
依次将化合物29-2(9mg,2.95μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(1.72mg,4.71μmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.55mg,4.2μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(4.59mg，收率：48.9％)。
MS m/z(ESI):1101.3[M/3+H]+。
实施例1-28：化合物C-30的制备
依次将化合物Int18(27.90mg,14.14μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(5.22mg,14.14μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.68mg,28.27μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应3小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-35％)，得到本步的标题化合物(7.88mg，收率：25.07％)。
MS m/z(ESI):1112.1[M/2+H]+。
实施例1-29：化合物C-31的制备
第一步：化合物31-1的制备
依次将化合物Int9-2(727.61mg,1347.36μmol)、化合物Int23(400mg,853.33μmol)、氰基硼氢化钠(99.08mg,1576.7μmol)和冰乙酸(51.72mg,853.33μmol)加入1,2-二氯乙烷(6mL)和甲醇(3mL)的混合溶剂中，25℃反应4小时。反应液浓缩得到的粗品溶于甲醇(3mL)中，用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-35％)，得到本步的标题化合物(600mg，收率：76.2％)。
MS m/z(ESI):923.5[M+H]+。
第二步：化合物31-2的制备
将化合物31-1(180mg,194.97μmol)加入盐酸二氧六环溶液(6mL,4M)中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(150mg，收率：93.3％)。
MS m/z(ESI):823.6[M+H]+。
第三步：化合物31-3的制备
依次将(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(85.29mg,200.46μmol)、N,N-二异丙基乙胺(45.2mg,346.26μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(103.94mg,270.22μmol)和化合物31-2(150mg,182.24μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(170mg，收率：79.8％)。
MS m/z(ESI):1230.6[M+H]+。
第四步：化合物31-4的制备
将化合物31-3(170mg,138.15μmol)溶于无水二氯甲烷(6mL)和三氟乙酸(3mL)的混合溶剂中，25℃反应2小时。反应液浓缩得到本步的标题化合物(133mg，收率：86.3％)。
MS m/z(ESI):1174.6[M+H]+。
第五步：化合物31-5的制备
依次将化合物31-4(132.05mg,112.44μmol)、N,N-二异丙基乙胺(23.24mg,178.03μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(51.28mg,133.52μmol)和VC-PABC-MMAE(105.26mg,93.69μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝55％-65％)，得到本步的标题化合物(110mg，收率：54.2％)。
MS m/z(ESI):1140.2[M/2+H]+。
第六步：化合物31-6的制备
将化合物31-5(80mg,35.09μmol)和二乙胺(12.19mg,166.68μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝55％-65％)，得到本步的标题化合物(50mg，收率：72.9％)。
MS m/z(ESI):686.4[M/3+H]+。
第七步：化合物C-31的制备
依次将化合物31-6(50mg,24.31μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(7.76mg,29.16μmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.52mg,34.63μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(21.5mg，收率：41.3％)。
MS m/z(ESI):1104.6[M/2+H]+。
实施例1-30：化合物C-32的制备

第一步：化合物32-1的制备
依次将化合物Int24(31.38mg,22.31μmol)、N,N-二异丙基乙胺(3.77mg,28.88μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(9.61mg,25.03μmol)和化合物8-5(42mg,20.26μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(38mg,收率：59.0％)。
MS m/z(ESI):1672.5[M/2+H]+。
第二步：化合物32-2的制备
将化合物32-1(38mg,11.36μmol)和二乙胺(3.95mg,53.96μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(12mg,收率：61.2％)。
MS m/z(ESI):1041.3[M/3+H]+。
第三步：化合物C-32的制备
依次将化合物32-2(10mg,3.21μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(1.02mg,3.84μmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.6mg,4.56μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(6.18mg,收率：35.6％)。
MS m/z(ESI):1637.0[M/2+H]+。
实施例1-31：化合物C-33的制备

第一步：化合物33-1的制备
依次将化合物Int24(39.66mg,27.94μmol)、N,N-二异丙基乙胺(6.93mg,53.07μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(15.93mg,33.48μmol)和化合物Int21(50mg,27.94μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(66mg，收率：81.2％)。
MS m/z(ESI):1531.3[M/2+H]+。
第二步：化合物33-2的制备
将化合物33-1(66mg,21.55μmol)和二乙胺(7.56mg,102.37μmol)加入N,N-二甲基甲 酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(22mg，收率：37.8％)。
MS m/z(ESI):1420.3[M/2+H]+。
第三步：化合物C-33的制备
依次将化合物33-2(14mg,4.93μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(2.88mg,7.88μmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.92mg,7.02μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(6.28mg,收率：43.4％)。
MS m/z(ESI):1545.3[M/2+H]+。
实施例1-32：化合物C-34的制备
第一步：化合物34-1的制备
依次将化合物Int24(85mg,65.86μmol)、N,N-二异丙基乙胺(14.85mg,113.76μmol)、 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(29.6mg,77.83μmol)和GGFG-Dxd(50.34mg,59.87μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝15％-25％)，得到本步的标题化合物(66mg，收率：54.9％)。
MS m/z(ESI):1057.0[M/2+H]+。
第二步：化合物34-2的制备
将化合物34-1(65mg,30.76μmol)和二乙胺(4.5mg,61.51μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(36mg，收率：65.1％)。
MS m/z(ESI):946.0[M/2+H]+。
第三步：化合物C-34的制备
依次将化合物34-2(36mg,19.03μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(10.43mg,28.56μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.54mg,27.13μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(8.47mg，收率：21.9％)。
MS m/z(ESI):1071.0[M/2+H]+。
实施例1-33：化合物C-35的制备
依次将化合物Int26(113.67mg,55.68μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基) 嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(22.27mg,60.95μmol)和N,N-二异丙基乙胺(11.63mg,89.08μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(55mg，收率：53.9％)。
MS m/z(ESI):1146.1[M/2+H]+。
实施例1-34：化合物C-36的制备
依次将化合物Int27(90mg,51.17μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(23.02mg,63.01μmol)和N,N-二异丙基乙胺(12.02mg,92.1μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(27mg,收率：29.2％)。
MS m/z(ESI):1005.0[M/2+H]+。
实施例1-35：化合物C-37的制备
依次将化合物Int31(12mg,5.05μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(2.4mg,6.58μmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.25mg,9.61μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(1.67mg，收率：13.3％)。
MS m/z(ESI):1311.6[M/2+H]+。
实施例1-36：化合物C-38的制备
依次将化合物Int31(12mg,5.05μmol)、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(1.75 mg,6.58μmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.25mg,9.61μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(1.92mg，收率：15.8％)。
MS m/z(ESI):1262.1[M/2+H]+。
实施例1-37：化合物C-39的制备
依次将化合物Int33(70mg,42.33μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(20.1mg,55.02μmol)和N,N-二异丙基乙胺(7.87mg,60.31μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(2.53mg，收率：7.1％)。
MS m/z(ESI):1903.8[M+H]+。
实施例1-38：化合物C-40的制备
第一步：化合物40-1的制备
将化合物Int26-3(250mg,205.84μmol)和二乙胺(73.14mg,1mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(175mg，收率：85.7％)。
MS m/z(ESI):992.6[M+H]+。
第二步：化合物40-2的制备
依次将丁二酸单甲酯(26.47mg,200.35μmol)、N,N-二异丙基乙胺(52.71mg,407.85μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(62.03mg,163.14μmol)和化合物40-1(142mg,143.11μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(120mg，收率：79.8％)。
MS m/z(ESI):1106.6[M+H]+。
第三步：化合物40-3的制备
将化合物40-2(145mg,131.06μmol)溶于甲醇(5mL)中，加入氢氧化锂(15.06mg,622.53μmol)的水溶液(2mL)，25℃反应4小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(100mg，收率：73.5％)。
MS m/z(ESI):1092.6[M+H]+。
第四步：化合物40-4的制备
依次将化合物40-3(50mg,47.16μmol)、N,N-二异丙基乙胺(12.63mg,96.76μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(119.84mg,52.18μmol)和4-哌啶甲酸甲酯(6.55mg,47.16μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(50mg，收率：94.4％)。
MS m/z(ESI):1217.7[M+H]+。
第五步：化合物40-5的制备
将化合物40-4(50mg,41.06μmol)溶于无水二氯甲烷(3mL)和三氟乙酸(1mL)的混合溶剂中，25℃反应4小时。反应液浓缩得到的粗品用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝40％-55％)，得到本步的标题化合物(40mg，收率：88.3％)。
MS m/z(ESI):1161.6[M+H]+。
第六步：化合物40-6的制备
依次将化合物40-5(42mg,36.16μmol)、N,N-二异丙基乙胺(12.63mg,96.76μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(15.68mg,41.23μmol)和VC-PABC-MMAE(40.63mg,36.16μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液浓缩得到的粗品用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝20％-30％)，得到本步的标题化合物(60mg，收率：77.1％)。
MS m/z(ESI):1133.7[M/2+H]+。
第七步：化合物40-7的制备
将化合物40-6(60mg,26.47μmol)溶于甲醇(3mL)中，加入氢氧化锂(3.04mg,125.73μmol)的水溶液(1mL)，25℃反应4小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝35％-45％)，得到本步的标题化合物(40mg，收率：70.6％)。
MS m/z(ESI):1126.7[M/2+H]+。
第八步：化合物C-40的制备
依次将化合物40-7(10mg,4.44μmol)、五氟苯酚(1.62mg,8.8μmol)和N,N'-二环己基碳二亚胺(1.83mg,8.88μmol)加入无水二氯甲烷(2mL)中，25℃反应3小时。反应液浓缩得到的粗品用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(3mg，收率：29.4％)。
MS m/z(ESI):1209.7[M/2+H]+。
实施例1-39：化合物C-41的制备

第一步：化合物41-1的制备
依次将化合物Int26-4(50mg,41.85μmol)、化合物Int34(37.95mg,41.85μmol)、N,N-二异丙基乙胺(13.63mg,104.61μmol)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(19.27mg,50.21μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝40％-48％)，得到本步的标题化合物(43mg，收率：50.19％)。
MS m/z(ESI):1024.0[M/2+H]+。
第二步：化合物41-2的制备
将化合物41-1(40mg,19.54μmol)和哌啶(3.33mg,39.07μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液浓缩后，加入甲基叔丁基醚(5mL)，超声5分钟后，静置，过滤，固体干燥得到本步的标题化合物(28mg，收率：70.67％)。
MS m/z(ESI):1824.9[M+H]+。
第三步：化合物41-3的制备
依次将化合物41-2(28mg,15.34μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(8.41mg,23.01μmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.00mg,30.68μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝35％-40％)，得到本步的标题化合物(30mg，收率：94.22％)。
MS m/z(ESI):1038.0[M/2+H]+。
第四步：化合物C-41的制备
将化合物41-3(30mg,13.01μmol)和无水溴化锌(11.72mg,52.04μmol)加入无水二氯甲烷(2mL)中，室温反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法A，洗脱梯度：A％＝25％-35％)，得到本步的标题化合物(4.65mg，收率：16.80％)。
MS m/z(ESI):1974.9[M+H]+。
实施例1-40：化合物C-42的制备
第一步：化合物42-1的制备
依次将化合物Int26-4(51.95mg,44.85μmol)、N,N-二异丙基乙胺(11.09mg,85.84μmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(22.85mg,60.08μmol)和化合物Int35(30mg,40.77μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中，0℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-50％)，得到本步的标题化合物(56mg，收率：73.2％)。
MS m/z(ESI):1875.8[M+H]+。
第二步：化合物42-2的制备
将化合物42-1(57mg,30.38μmol)和二乙胺(11.22mg,151.91μmol)加入N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，25℃反应2小时。反应液直接用反相柱层析纯化(制备方法B，洗脱梯度：A％＝45％-55％)，得到本步的标题化合物(30mg，收率：59.7％)。
MS m/z(ESI):827.4[M/2+H]+。
第三步：化合物C-42的制备
依次将化合物42-2(30mg,18.14μmol)、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)六-5-炔酸酯(8.62mg,23.58μmol)和N,N-二异丙基乙胺(3.55mg,27.21μmol)加入无水N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中，0℃反应2小时。反应液用制备高效液相色谱仪纯化，得到本步的标题化合物(11mg，收率：31.8％)。
MS m/z(ESI):952.4[M/2+H]+。
二、免疫刺激抗体药物偶联物(iADC)的制备
实施例2-1 Trastuzumab-C-7
用1M磷酸溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.59，得9.5mg/mL的Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，21℃反应4小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5倍摩尔当量的化合物C-7的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时，4℃放置过夜，用NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-7的盐酸组氨酸缓冲液(2.4mg/mL,1.5mL)，于-40℃储存。
实施例2-2 Trastuzumab-C-8
用1M磷酸溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.55，得9.5mg/mL的Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，21℃反应4小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5倍摩尔当量的化合物C-8的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时，4℃放置过夜，用NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-8的盐酸组氨酸缓冲液(2.3mg/mL,1.5mL)，于-40℃储存。
实施例2-3 Trastuzumab-C-9
用1M磷酸溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.55，得9.5mg/mL的Trastuzumab单抗缓冲溶液为。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，21℃反应4小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5倍摩尔当量的化合物C-9的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时，4℃放置过夜，用NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-9的盐酸组氨酸缓冲液(3.8mg/mL,2.5mL)，于-40℃储存。
实施例2-4 Trastuzumab-C-10
用1M磷酸溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.53，得9.5mg/mL的Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，21℃反应4小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5倍摩尔当量的化合物C-10的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时，4℃放置过夜，用NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-10的盐酸组氨酸缓冲液(3.4mg/mL,2.5mL)，于-40℃储存。
实施例2-5 Trastuzumab-C-11
用1M磷酸溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.59，得9.5mg/mL的Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，21℃反应4小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5倍摩尔当量的化合物C-11的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时，4℃放置过夜， 用NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-10的盐酸组氨酸缓冲液(4.0mg/mL,2.5mL)，于-40℃储存。
实施例2-6 Trastuzumab-C-15
用1M磷酸氢二钠溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.56，再用pH＝6.5-6.6磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至10mg/mL，得Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，室温反应2小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5.5倍摩尔当量的化合物C-15的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时后，用NAP-10，NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-15的盐酸组氨酸缓冲液(3.4mg/mL,2.5mL)，于4℃储存。
实施例2-7 Trastuzumab-C-16
用1M磷酸氢二钠溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.54，再用pH＝6.5-6.6磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至10mg/mL，得Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，室温反应2小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5倍摩尔当量的化合物C-16的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时后，用NAP-10，NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-16的盐酸组氨酸缓冲液(3.1mg/mL,2.5mL)，于4℃储存。
实施例2-8 Trastuzumab-C-17
用1M磷酸氢二钠溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.57，再用pH＝6.5-6.6磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至10mg/mL，得Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，室温反应2小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5倍摩尔当量的化合物C-17的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时后，用NAP-10，NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-17的盐酸组氨酸缓冲液(3.5mg/mL,2.5mL)，于4℃储存。
实施例2-9 Trastuzumab-C-20
用1M磷酸氢二钠溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.55，再用pH＝6.5-6.6磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至10mg/mL，得Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，室温反应2小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5.5倍摩尔当量的化合物C-20的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时后，用NAP-10，NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-20的盐酸组氨酸缓冲液(3.0mg/mL,2.5mL)，于4℃储存。
实施例2-10 Trastuzumab-C-21
用1M磷酸氢二钠溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.55，再用pH＝6.5-6.6磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至10mg/mL，得Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，室温反应2小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5.5倍摩尔当量的化合物C-21的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时后，用NAP-10，NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-21的盐酸组氨酸缓冲液(3.2mg/mL,2.5mL)，于4℃储存。
实施例2-11 Trastuzumab-C-22
用1M磷酸氢二钠溶液调节Trastuzumab单抗储备液使其pH＝6.55，再用pH＝6.5-6.6磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至10mg/mL，得Trastuzumab单抗缓冲溶液。向所得Trastuzumab单抗缓冲溶液加入0.1M EDTA，同时加入TCEP(2.5eq,10mM)，摇匀，室温反应2小时后，向其中加入Trastuzumab单抗5.5倍摩尔当量的化合物C-22的DMSO溶液(10mM)，摇匀，室温反应2小时后，用NAP-10，NAP-5凝胶柱纯化，并用pH＝6.0-6.1盐酸组氨酸缓冲溶液洗涤，收集滤液，得到Trastuzumab-C-22的盐酸组氨酸缓冲液(3.8mg/mL,2.5mL)，于4℃储存。
三、免疫刺激抗体药物偶联物(iADC)的药物/抗体比值：DAR值的测定
LC-MS测定iADC分子量，计算药物/抗体比DAR值。
色谱测定条件：
液相色谱柱：Thermo MAbPac RP 3.0*100mm；
流动相A：0.1％FA/H2O；流动相B：0.1％FA/ACN；
流速：0.25ml/min；样品室温度：8℃；柱温：60℃；进样量：1μl；
质谱测定条件：
质谱型号：AB Sciex Triple TOF 5600+；
GS1 35；GS2 35；CUR 30；TEM 350；ISVF 5500；DP 250；CE 10；Accumulation time 0.5s；
m/z 600-4000；Time bins to sum 40。
CE-SDS计算抗体药物偶联物Trastuzumab-C-7的DAR值：4.42；Trastuzumab-C-8的DAR值：3.56；Trastuzumab-C-9的DAR值：3.53；Trastuzumab-C-10的DAR值：3.3；Trastuzumab-C-11的DAR值：2.3；Trastuzumab-C-15的DAR值：3.58；Trastuzumab-C-16的DAR值：2.84；Trastuzumab-C-17的DAR值：3.37；Trastuzumab-C-20的DAR值：3.53；Trastuzumab-C-21的DAR值：2.89；Trastuzumab-C-22的DAR值：3.38。
生物学测试
实验例1：免疫刺激抗体药物偶联物(immunomodulatory antibody drug conjugate,iADC)对HER2阳性肿瘤细胞和HER2阴性肿瘤细胞的增殖抑制作用
实验步骤：
1.收集对数生长期的HER2阳性肿瘤细胞HCC1954(康诺泰)和NCI-N87(ATCC)，以及HER2阴性肿瘤细胞NCI-H358(南京科佰)，并计数。
2.将三种肿瘤细胞分别接种于96孔板(康宁)中，每孔2000个细胞(HCC1954或NCI-H358)或3000个细胞(NCI-N87)，体积80μL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜使细胞贴壁(18～24h)。
3.按照试验设计进行梯度浓度配制5×药物工作液。取出96孔细胞板，从化合物板中转20μL工作液加到细胞板中。细胞板置于37℃5％CO2培养箱中培养72h。
4.测板：取出细胞板，在显微镜下观察细胞状态。观察结束后，按照2.0试剂盒(诺唯赞)说明书，细胞板加检测液，并通过PHERA Star FS获得原始数据。
5.计算抑制率(Inhibition Rate,IR％)＝1-(实验孔发光均值/DMSO对照孔发光均值)*100％。使用Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析与作图，以细胞存活率与药物浓度的对数经四参数拟合曲线，计算IC50值。
实验结果：
按照上述方法测定各iADC对三种肿瘤细胞的增殖抑制作用，如表1所示：
表1.iADC对三种肿瘤细胞的增殖抑制作用
结果表明：各iADC对HCC1954和NCI-N87细胞(HER2阳性)有很强的增殖抑制作用，对NCI-H358细胞(HER2阴性)的增殖抑制作用明显减弱，表明各iADC对HER2阳性细胞杀伤具有选择性。
实验例2：免疫刺激抗体药物偶联物(immunomodulatory antibody drug conjugate,iADC)在肿瘤细胞存在的情况下刺激外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF-α能力的测定
实验步骤：
1.收集表达HER2的对数生长期的HCC1954肿瘤细胞(康诺泰)，用PBS清洗两遍，并用RPMI1640+10％热灭活FBS完全培养基重悬细胞调整细胞密度为2×105个/mL，将HCC1954肿瘤细胞接种于96孔板(康宁)中，每孔1×104个细胞。
2.复苏PBMC(赛笠生物)，用RPMI1640+10％热灭活FBS完全培养基重悬细胞，调整密度为6×105个/mL，加入接种了肿瘤细胞的96孔板中，每孔3×104个PBMC细胞。
3.将100μL不同浓度待测药物加入孔板中,使其终浓度分别为500nM、166.7nM、55.6nM、18.52nM、6.17nM、2.06nM、0.69nM，空白孔加入100μL RPMI1640+10％热灭活FBS完全培养基。
4.放在5％CO2，37℃培养箱中培养，培养24小时后，各孔取50μL上清检测，根据human TNF-αELISA检测试剂盒(Invitrogen)步骤孵育一抗抗体及HRP标记的二抗，显色，并读取450nm波长下的吸光度。使用Graphpad Prism软件根据标准曲线，计算出TNF-α的浓度。
实验结果：
按照上述方法测定各免疫刺激抗体药物偶联物iADC在HCC1954肿瘤细胞存在的情况下刺激人外周血单个核细胞(PBMC)分泌TNF-α的能力，结果如表2所示：
表2.体外HCC1954肿瘤细胞和PBMC共孵育体系中iADC刺激TNF-α的分泌结果
结果表明：各iADC在体外HCC1954肿瘤细胞和PBMC共孵育体系下均能有效刺激PBMC分泌TNF-α。
除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的各种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。

Claims (33)

  1. 一种如式(I)所示的抗体药物偶联物：
    其中，
    Ab为靶向基团；
    M为和靶向基团连接的接头部位；
    X为连接M和Aa的连接子；
    Aa选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段；
    L1为共价键或连接Aa和D1的连接子；
    L2为连接Aa和D2的连接子；
    D1选自细胞毒性药物片段；
    D2选自TLR激动剂片段；
    m选自1到10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
  2. 权利要求1所述的抗体药物偶联物中，Ab为靶向细胞表面受体或肿瘤表面抗原的靶向基团。
  3. 权利要求1或2所述的抗体药物偶联物中，Ab为抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、鼠源抗体、人源化抗体、全人抗体或包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白。
  4. 权利要求1-3任一项所述的抗体药物偶联物中，Ab为抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv和scFv。
  5. 权利要求1-4任一项所述的抗体药物偶联物中，所述抗体或其抗原结合片段选自抗-Her-2抗体、抗-EGFR抗体、抗-VEGFR抗体、抗-PD-L1抗体、抗-PD-1抗体、抗-CTLA-4抗体和抗-Trop-2抗体。
  6. 权利要求1-5任一项所述的抗体药物偶联物中，M为共价键或选自以下结构：
    其中，各a独立地选自1-5的整数，b选自1-3的整数，并且M的1位置与Ab相连，2位置与X相连。
  7. 权利要求1-6任一项所述的抗体药物偶联物中，M为共价键或选自以下结构：
  8. 权利要求1-7任一项所述的抗体药物偶联物中，X为共价键或选自C1-6亚烷基、-NH-(CH2)c-C(O)-、
    其中，各c独立地选自1-10的整数；X的3位置与M相连，4位置与Aa相连。
  9. 权利要求1-8任一项所述的抗体药物偶联物中，Aa选自氨基酸片段和由两个或 两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Gly、Phe、Ala、Val、Ser、Thr、His、Trp、Cys、Asp、Glu、Lys、Tyr和Arg，任选地，各氨基酸独立地被C1-6烷基或聚乙二醇亲水结构单元修饰；
    优选地，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数。
  10. 权利要求1-9任一项所述的抗体药物偶联物中，Aa选自下述氨基酸的片段和由它们中的两个或多个任意组合形成的肽片段：Gly、Phe、Ala、Val、Cys、Asp、Glu、Lys和Arg，并且各氨基酸各自独立地任选地被C1-6烷基或聚乙二醇亲水结构单元修饰；
    优选地，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数。
  11. 权利要求1-10任一项所述的抗体药物偶联物，Aa选自以下结构：

    其中，各R7独立地选自H、C1-6烷基和聚乙二醇亲水结构单元；各R8独立地选自羟基和聚乙二醇亲水结构单元；5位置与X相连，6位置与L1和L2中的一个相连，7位置与L1和L2中的另一个相连；优选地，5位置与X相连，6位置与L1相连，7位置与L2相连；
    优选地，所述聚乙二醇亲水结构单元选自其中各c独立地选自1-10的整数。
  12. 权利要求1-11任一项所述的抗体药物偶联物中，L1为共价键或选自不可断裂连接子和可断裂连接子，其中，可断裂连接子被病理环境中存在的酶切割，所述酶选自蛋白酶、磷酸酶、焦磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和硫酸酯酶。
  13. 权利要求1-12任一项所述的抗体药物偶联物中，L1为共价键或-La-Lb-Lc-，其中：
    La为共价键或选自C1-6亚烷基、-NH-(CH2)c-C(O)-、
    其中，各c独立地选自1-10的整数；
    Lb为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
    优选地，Lb为共价键或选自以下结构：
    其中，R9选自H、乙酰基、芴氧羰基、三苯甲基和聚乙二醇亲水结构单元；优选地，所述聚乙二醇亲水结构单元为其中各c独立地选自1-10的整数；
    Lc为共价键、-NH-CH2-或选自以下结构：
  14. 权利要求1-13任一项所述的抗体药物偶联物中，L1为共价键或选自以下结构：

    其中，位置8与Aa相连，位置9与D1相连；
    优选地，L1为：
  15. 权利要求1-14任一项所述的抗体药物偶联物中，L2选自不可断裂连接子和可断裂连接子，其中，可断裂连接子被病理环境中存在的酶切割，所述酶选自蛋白酶、磷酸酶、焦磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶和硫酸酯酶。
  16. 权利要求1-15任一项所述的抗体药物偶联物中，L2为-Ld-Le-Lf-，其中：
    Ld为共价键或选自由下述的一个或多个组成的二价结构：C1-6亚烷基、-C(O)-(CH2)d-NH-、 其中，各d独立地选自1-12的整数；
    Le为共价键或选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段，其中所述氨基酸选自Val、Cit、Glu、Lys、Arg、Phe、Leu、Gly、Ala和Asn；
    优选地，Le为共价键或选自以下结构：
    其中，各R10独立地选自H、乙酰基、芴氧羰基、三苯甲基和聚乙二醇亲水结构单元；优选地，所述聚乙二醇亲水结构单元为各d独立地选自1-10的整数；
    Lf为共价键、-NH-CH2-或选自以下结构：
  17. 权利要求1-16任一项所述的抗体药物偶联物中，L2选自以下结构：
    其中，位置10同Aa相连，位置11同D2相连；
    优选地，L2为：
  18. 权利要求1-17任一项所述的抗体药物偶联物中，D1选自细胞毒性药物片段，所述细胞毒性药物选自微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂和拓扑异构酶抑制剂，所述微管蛋白抑制剂包括海兔毒素(dolastatin)、澳瑞他汀(auristatin)类、美登素(maytansine)类、微管溶素(Tubulysins)类和隐粘菌素(cryptomycins)类，所述DNA损伤剂包括 PBD类、杜卡霉素(duocarmycin)类和卡齐霉素(calicheamicin)类，所述拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱及其衍生物。
  19. 权利要求1-18任一项所述的抗体药物偶联物中，所述微管蛋白抑制剂选自海兔毒素10、MMAE、MMAF、美登素、DM1、DM3和DM4，所述拓扑异构酶抑制剂选自喜树碱、SN-38、依喜替康、拓扑替康、贝洛替康、10-羟基喜树碱、9-氨基喜树碱、阿霉素、表柔比星和PNU-159682。
  20. 权利要求1-19任一项所述的抗体药物偶联物中，D1选自以下结构：
  21. 权利要求1-20任一项所述的抗体药物偶联物中，D2为TLR激动剂片段，其中所述TLR激动剂选自TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂和TLR9激动剂。
  22. 权利要求1-21任一项所述的抗体药物偶联物中，D2为TLR激动剂片段，所述TLR激动剂选自TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR7/8激动剂。
  23. 权利要求1-22任一项所述的抗体药物偶联物中，D2为TLR激动剂片段，所述TLR激动剂为式(II)所示化合物：
    其中，
    X1选自N和C；
    X2选自N和C；
    且X1和X2中至少一个选自N；
    X3选自O、S和N；
    X4选自O、S、N和CR4；
    R1选自C1-6烷基和-C1-6亚烷基-O-C1-6烷基；
    R2选自氢和式-L3-L4-L5-L6；
    L3选自共价键和C1-6亚烷基；
    L4选自共价键、C3-10环烷基、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代；
    L5选自共价键、-O-、-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-NR5-、-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-、-O-C(O)-NR5-、-NR5-C(O)-O-、-NR5-C(O)-NR5-、-S(O)r-NR5-、-NR5-S(O)r-和-NR5-S(O)r-NR5-；
    L6选自氢、C1-6烷基、-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)n-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代；
    R3选自氢和式-L7-L8-L9-L10；
    L7选自共价键和C1-6亚烷基；
    L8选自共价键、C3-10环烷基、3-12元杂环基、C6-10芳基和5-10元杂芳基，所述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基和-C1-6亚烷基-NH2的基团所取代；
    L9选自共价键、-O-、-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-O-、-NR6-、-C(O)-NR6-、-NR6-C(O)-、-O-C(O)-NR6-、-NR6-C(O)-O-、-NR6-C(O)-NR6-、-S(O)p-NR6-、-NR6-S(O)p-和-NR6-S(O)p-NR6-；
    L10选自氢、C1-6烷基、-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基和-C1-6亚烷基-(O-CH2CH2)q-O-C1-6烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自氢、卤素、羟基、-NH2、-NH-C(O)-O-C1-6烷基、C1-6烷氧基、羧基和-C(O)-O-C1-6烷基的基团所取代；
    R4选自氢、卤素、氰基、羟基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷氧基和C3-10环烷基；
    各R5独立地选自氢和C1-6烷基；
    各R6独立地选自氢和C1-6烷基；
    各r独立地为1或2；
    各n独立地选自1-25的整数；
    各p独立地为1或2；
    各q独立地选自1-25的整数；
    D2通过式(II)中的R2或R3与L2相连。
  24. 权利要求1-23任一项所述的抗体药物偶联物中，D2选自以下结构：

  25. 权利要求1-24任一项所述的抗体药物偶联物选自以下结构：














    各m独立地选自1-10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
    优选地，所述Ab为曲妥珠单抗；
    优选地，所述抗体药物偶联物的DAR值为2.0-5.0，例如2.0-2.5，2.0-3.0，2.0-3.5，2.0-4.0，2.0-4.5，2.0-5.0，2.5-3.0，2.5-3.5，2.5-4.0，2.5-4.5，2.5-5.0，3.0-3.5，3.0-4.0，3.0-4.5，3.0-5.0，3.5-4.0，3.5-4.5，3.5-5.0，4.0-4.5，4.0-5.0，或4.0-5.0。
  26. 式(III)的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶 型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药：
    其中，
    M1为和靶向基团连接的接头部位的前体，其中所述靶向基团如权利要求1-25中任一项所定义；
    X为连接M和Aa的连接子；
    Aa选自氨基酸片段和由两个或两个以上氨基酸形成的肽片段；
    L1为共价键或连接Aa和D1的连接子；
    L2为连接Aa和D2的连接子；
    D1选自细胞毒性药物片段；
    D2选自TLR激动剂片段；
    优选地，X、Aa、L1、L2、D1和D2如权利要求1-25中任一项所定义。
  27. 权利要求26所述的化合物，M1选自以下结构：
    其中，各a独立地选自1-5的整数，b选自1-3的整数，Ma为羧基的活化基团(例如，五氟苯氧基)；
    优选地，M1为共价键或选自以下结构：
  28. 权利要求26或27所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药选自以下结构：















  29. 一种药物组合物，其含有权利要求1-25任一项所述的抗体药物偶联物和任选的权利要求26-28任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药，以及一种或多种药用辅料。
  30. 权利要求26-28任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、 互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药在制备抗体药物偶联物(例如，权利要求1-25任一项所述的抗体药物偶联物)中的用途。
  31. 权利要求1-25任一项所述的抗体药物偶联物、权利要求26-28任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药、或权利要求29所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症(例如HER2阳性癌症，例如HER2阳性胃癌、乳腺癌或非小细胞肺癌)的药物中的用途。
  32. 权利要求1-25任一项所述的抗体药物偶联物、权利要求26-28任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药、或权利要求29所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防癌症(例如HER2阳性癌症，例如HER2阳性胃癌、乳腺癌或非小细胞肺癌)。
  33. 一种治疗和/或预防癌症(例如HER2阳性癌症，例如HER2阳性胃癌、乳腺癌或非小细胞肺癌)的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗和/或预防有效量的权利要求1-25任一项所述的抗体药物偶联物、权利要求26-28任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、互变异构体、多晶型物、溶剂合物、N-氧化物、同位素标记的化合物、代谢物或前药、或权利要求29所述的药物组合物。
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